KR20190032848A - 단백질 약물을 포함하는 코아세르베이트 조성물 및 이를 포함하는 창상 치료제 - Google Patents

단백질 약물을 포함하는 코아세르베이트 조성물 및 이를 포함하는 창상 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 약물, 젤라틴 A, 알긴산 나트륨 및 산(acid)을 포함하는 코아세르베이트 조성물 및 이를 포함하는 창상 치료제를 제공한다.
본 발명의 단백질 약물, 젤라틴 A, 알긴산 나트륨 및 산(acid)을 포함하는 코아세르베이트 조성물은 상처 치료 분야에서 단백질 약물, 특히, 표피생장인자를 상처 부위에 효과적으로 전달하는 상처 치료 물질 전달 시스템으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

단백질 약물을 포함하는 코아세르베이트 조성물 및 이를 포함하는 창상 치료제{Coacervate composition comprising protein drug and wound healing agent comprising the same}
본 발명은 단백질 약물을 포함하는 코아세르베이트 조성물 및 이를 포함하는 창상 치료제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 단백질 약물, 젤라틴 A, 알긴산 나트륨 및 산(acid)을 포함하는 코아세르베이트 조성물 및 이를 포함하는 창상 치료제에 관한 것이다.
상처 치유 과정은 복합 세포 및 생화학적 단계를 거쳐 조직의 회복과 재생으로 이어진다(Traversa, B., Sussman G. The australian journal of wound management 2001;9(4):161-167). 상처에 대한 생리적 및 세포성 반응은 손상 부위의 해부학적 및 기능적 완전성을 완전히 회복시키는 4 단계로 진행된다(Lobamann R., Schultz G., Lehnert H. Diabetes care 2005;28(2):461-471). 즉, 상처 치유 단계는 고전적으로 항상성, 염증(급성기), 증식(육아 및 재상피화) 및 재구성으로 정의된다. 이러한 각 단계는 부분적으로 중복되고 대부분이 사이토카인 및 성장인자에 의해 조정된다. 조직 손상 후 6시간 이내에 혈소판은 호중구, 단핵구 및 과립구와 같은 염증 세포를 유인하는 다양한 성장인자인 사이토카인을 분비한다. 그들은 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)과 프로테아제(protease, 단백질 분해효소)를 방출하여 박테리아에 의한 오염을 통제하고 세포 찌꺼기로부터 상처를 깨끗이 한다. 염증 세포의 농도는 염증 단계의 끝인 48시간 후에 최대에 도달하고, 상처 치료 과정 중의 증식 단계가 중첩된다. 대식세포는 상처 치유 과정이 증식 단계에 도달하도록 기여한다. 이들은 상처 2일 후에 혈소판 유래 성장인자(platellet-derived growth factor, PDGF), 대식세포 혈관신생인자(macrophage angiogenesis factor), TGF-β를 분비한다. PDGF, 대식세포 혈관신생인자 및 안지오텐신은 새로운 혈관 형성을 촉진하여 상처에 특유의 육아 조직을 생성한다. 표피생장인자(epidermal growth factor, EGF), 케라틴세포 성장인자 및 PDGF는 표피 세포가 이동하도록 자극하고, 분화(각질화)하여, 건조 및 감염에 대한 세포 장벽을 갖는 육아 조직을 생성한다. 기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteases, MMP)는 손상된 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질을 제거하여 세포가 이동하여 상처에서 혈관형성(angiogenesis)과 맥관형성(vasculogenesis)을 진행시킨다.
그러나, 당뇨병성 궤양과 같은 만성 상처는 상기 상처 치유 과정으로 진행되지 않는다. 많은 연구에서 기능장애 세포와 성장인자, 프로테아제 및 사이토카인의 불균형으로 설명될 수 있는 상처 치유의 결함이 확인되었다(Lobamann R., Schultz G., Lehnert H. Diabetes care 2005;28(2):461-471).
정상적인 상처 치유와는 달리, 당뇨병 상처와 같은 난치성 상처에서의 염증 반응은 연장되어 나타나며, 그에 상응하여 프로테아제 반응이 증가된다. 정상적인 상처 치유 동안 성장인자, 사이토카인, 단백질 분해효소(프로테아제) 및 세포외 기질(ECM)의 균형잡힌 상호작용과는 대조적으로, 난치성 상처에서는 단백질 분해효소의 수준이 상처 부위에 높게 유지되어, 매트릭스 단백질 및 성장인자의 분해로 인한 상처 치유의 저하로 이어진다. 따라서, 당뇨병성 족부궤양(Diabetic foot ulcer, DFU)과 같은 난치성 상처에서의 효과적인 상처 치유를 위해 성장인자 전달 시스템의 개발이 필요하다.
한편, 표피생장인자(epidermal growth factor, EGF)는 상처 치유에 중요한 역할을 한다. EGF는 코헨(Corhen)에 의해 마우스 악하선(submaxillary gland)에서 최초로 단리된 53개 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드이다. EGF는 표피 세포, 섬유아세포 및 내피 세포의 증식 및 이동을 자극하고 표피 재생, 혈관형성 및 육아 조직 형성을 촉진한다. 상처 치유에 대한 EGF의 효능은 급성 상처, 만성 상처 및 화상 상처에서 실험적 및 임상적으로 보고된 바 있다(Lau, H.C., Kim, A. Jounal of pharmaceutical investigation 2016; 46(5):403-423). 성장인자를 사용하는 DFU용 의약품이 다수 시판되고 있다. 예를 들어, 리그라넥스(Regranex)는 재조합 인간 혈소판 유래 성장인자(recombinant human platellet-derived growth factor, PDGF)를 포함하고, 피블라스트(Fiblast)는 재조합 인간 섬유아세포 성장 인자(recombinant human basic fibroblast growth factor, bFGF)를 포함한다. EGF는 한국에서 이지에프(Easyef, 대웅 제약, 서울)로서, 중국 및 남아메리카 일부 국가에서 판매되고 있다. 그러나, 성장인자를 함유한 의약품은 제한된 상처 피복효과와 임상 효능, 상온보관 조건에서의 바람직하지 못한 보관/유통 중의 안정성 및 국소 적용 후 전신 분포로 인한 안전성 문제와 같은 몇 가지 문제에 직면해 있다. 제한된 효능 부분은 상처 부위에 존재하는 다수의 단백질 분해효소에 기인하는데, 성장 인자가 상처 부위에 적용되는 즉시 이들에 의해 분해되기 때문이다. 따라서, EGF의 효능을 향상시키는 한가지 방법은 적절한 약물 전달 시스템에 의해 프로테아제로부터 EGF를 보호하는 것이다. 이에 따라, 연고, 하이드로겔, 나노/미세 입자와 같은 많은 전달 시스템이 EGF의 캡슐화 및 제어 방출용으로 연구되고 있다. 그러나, 이들 시스템에서 낮은 로딩 효율 및 높은 변성율에 대한 문제는 아직 해결되지 않았다(Wu, J., et al., Biomacromolecules 2016;17:2168-2177).
미국 특허공개 제2016/0250375호 (2016.09.01) 국제특허공개 제2016/025911호 (2016.02.18)
본 발명의 발명자들은 단백질 약물을 효과적으로 캡슐화하여 단백질 분해효소의 농도가 높은 난치성 창상 부위에서 단백질 분해효소로부터 단백질 약물을 효과적으로 보호하여, 상처 치유 효율을 극대화할 수 있는 약물 전달 시스템에 대하여 연구하던 중, 음이온성 고분자 전해질과 양이온성 고분자 전해질이 적절한 조건으로 조절된 코아세르베이트 시스템인, 젤라틴 A, 알긴산 나트륨 및 산(acid)을 포함하는 코아세르베이트 조성물에서 코아세르베이트가 효율적으로 형성되어 단백질 약물을 효과적으로 캡슐화할 수 있다는 것을 알아내었다. 또한, 코아세르베이트를 동결건조한 제제는 상처부위 피복 효과 및 지속성 약물방출 효과를 나타내어 상처치유 효과의 개선을 기대할 수 있다.
따라서, 본 발명은 단백질 약물, 젤라틴 A, 알긴산 나트륨 및 산(acid)을 포함하는 코아세르베이트 조성물(특히, 동결건조 제형) 및 이를 포함하는 창상 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따라, 단백질 약물, 젤라틴 A, 알긴산 나트륨 및 산(acid)을 포함하는 코아세르베이트 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 젤라틴 A는 평균 분자량 20 ∼ 25 KDa일 수 있으며, 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 0.2 ∼ 1.2 중량비로 포함될 수 있으며, 상기 산(acid)이 아세트산 5.4 ∼ 16.3 mM 농도일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 코아세르베이트 조성물은 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 1 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 5.4 ∼ 16.3 mM 농도이거나, 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 0.8 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 5.4 ∼ 10.9 mM 농도이거나, 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 0.4 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 5.4 ∼ 8.2 mM 농도일 수 있으며, 바람직하게는 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 1 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 16.3 mM 농도 또는 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 0.4 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 8.2 mM 농도일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단백질 약물은 표피생장인자(epidermal growth factor, EGF), 성장호르몬(Growth hormon, GH) 및 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor, FGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 단백질 약물일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 코아세르베이트 조성물을 포함하는 창상 치료제가 제공된다.
일 구현예에서, 상기 창상은 만성 난치성 창상으로서, 당뇨병성 궤양, 특히, 당뇨병성 족부궤양일 수 있다.
코아세르베이트 시스템을 상처 치유에 적용하기 위하여, 표피생장인자를 단백질 약물로, 알긴산 나트륨을 음이온성 고분자로, 젤라틴 A를 양이온성 고분자로 선정하여, pH, 알긴산 나트륨과 젤라틴 A의 비율, 고분자의 분자량의 조건 변화에 따른 코아세르베이트의 혼탁도, 입자크기, 다분산지수, 제타전위 등의 물리적 특성 변화를 측정함으로써, 혼탁도와 표피생장인자의 포집능을 기준으로 최적의 코아세르베이트 조성을 선정하였다. 이에 따라 얻어진 최적화된 본 발명의 표피생장인자-코아세르베이트 시스템은 단백질 약물, 젤라틴 A, 알긴산 나트륨 및 산(acid)을 포함하는 코아세르베이트 조성물로서, 고 분자량의 젤리틴을 사용한 코아세르베이트 조건의 모든 구간에서 침전이 형성된 반면에, 저 분자량의 젤라틴을 사용한 본 발명의 코아세르베이트 조성물은 고 분자량 사용시와 동일한 조건에서 침전되지 않고 코아세르베이트를 형성하였으며, 높은 표피생장인자 캡슐화 효율을 나타내었다. 또한, 트립신을 이용한 단백질 분해 실험에서 프로테아제로부터 표피생장인자를 효과적으로 보호하였으며, 코아세르베이트 시스템으로부터 표피생장인자가 서방출되는 것이 확인되었고, 세포 증식 및 이동 촉진 효능이 우수하였으며, 창상 동물 모델에서는 상처를 효과적으로 봉합한다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 단백질 약물, 젤라틴 A, 알긴산 나트륨 및 산(acid)을 포함하는 코아세르베이트 조성물은 상처 치료 분야에서 단백질 약물, 특히, 표피생장인자를 상처 부위에 효과적으로 전달하는 상처 치료 물질 전달 시스템으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 각 시료를 다양한 비율의 고분자 및 아세트산 농도(0 mM, 1.1 mM, 2.7 mM)로 제조하여 형성된 고분자 복합체 혼합물의 관찰 결과이다.
도 2는 각 조건에서의 BSA의 SDS-PAGE 결과로서, 각 시료 로딩은 웰 당 20 μL였고, 적색 사각형은 각 코아세르베이션 상태에서 캡슐화된 BSA를 나타낸다.
도 3은 각 조건에서의 EGF의 SDS-PAGE 결과로서, 시료 로딩은 웰 당 20 μL였다.
도 4는 고분자 젤라틴(High molecular weight gelatin A, HWGA)과 저분자 젤라틴(Low molecular weight gelatin A, LWGA)을 사용하는 복합체 상의 비교 결과로서, 다양한 비율의 고분자와 아세트산의 농도로부터 제조된 혼합물의 고분자 복합체 상을 관찰한 결과이다.
도 5는 HWGA:SA로 형성된 응집체와, LWGA:SA로 형성된 균일한 콜로이드를 비교한 광학 현미경(Sometech, Seoul, Koera) 사진이다(3400x, bars = 10μm).
도 6은 웨스턴 블럿팅에 의한 단백질[EGF(A), GH(B), FGF(C)]의 정성분석 결과로서, 각 시료는 웰 당 20 μL을 로딩하였다(P:유리 EGF 100 ug/ml, M:마커, S:코아세르베이트-상등액, C:코아세르베이트-펠렛).
도 7은 웨스턴 블럿팅에 의한 트립신 소화 시험 결과이다(P:유리 EGF, T:트립신-EDTA, M:EGF-혼합물, C:EGF-코아세르베이트).
도 8은 트랜스웰(32 ℃, 150 rpm)을 이용한 시험관내 방출 양상 그래프로서, 유리 EGF, EGF-혼합물 및 EGF-코아세르베이트(LWGA:SA-1:0.4 비율)로부터 EGF의 방출 시험을 수행하였으며 HPLC로 측정하였다.
도 9는 EGF-코아세르베이트가 HDF의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10은 EGF-코아세르베이트가 HDF에서 이동에 미치는 영향을 나타낸 정량분석 결과이다(M: 혼합물, C: 코아세르베이트, VC: 비히클 대조군).
도 11은 EGF-코아세르베이트가 HDF에서 이동에 미치는 영향을 나타낸 사진으로서, 10 ng/mL 유리-EGF, 동결건조 시료(비히클 대조군, EGF-혼합물, EGF-코아세르베이트)가 첨가된 배지에서 8시간 인큐베이션 후 융합성 HDF 단층(confluent HDFs monolayer) 상의 스크래치 상처의 사진이다(기준자 = 500μm).
도 12는 동결건조된 EGF-코아세르베이트 또는 EGF 혼합물의 생체내 시험에의 적용을 나타낸 사진이다.
도 13은 STZ-유도 당뇨병 마우스 모델을 이용하여 생체내 시험에서 창상 상처에 미치는 EGF-코아세르베이트의 효과를 나타낸 것으로서, DPBS(정상, 음성 대조군), 유리-EGF, EGF-혼합물, EGF-코아세르베이트로 처리한 상처의 사진이다.
도 14는 STZ-유도 당뇨병 마우스 모델을 이용하여 생체내 시험에서 창상 상처에 미치는 EGF-코아세르베이트의 효과를 나타낸 것으로서, DPBS(정상, 음성 대조군), 유리-EGF, EGF-혼합물, EGF-코아세르베이트로 처리한 상처의 시간 경과에 따른 상처 봉합 정도를 원래 상처 면적의 %비율로 나타낸 그래프이다.
본 발명은 단백질 약물, 젤라틴 A, 알긴산 나트륨 및 산(acid)을 포함하는 코아세르베이트 조성물을 제공한다.
코아세르베이션(coacervation)은 상보적인 거대분자 종의 상호작용으로부터 용매 친화성이 낮은 거대분자 용액을 형성하는 고밀도 액상의 자발적인 형성이다(Bohidar, H.B. Indian society for surface science and technology 2008;24:105-124). 양이온 및 음이온 고분자 전해질 유래의 복합 코아세르베이션 반응을 위하여, pH를 조정하여 고분자가 풍부한 상인 액체로부터 각각의 순 전하(net charge)를 중화시킨다.
복합 코아세르베이트는 수용액에서 매우 낮은 계면 에너지로 알려져 있고, 이에 따라 코아세르베이트가 용액에서 다양한 입자를 캡슐화할 수 있게 한다. 코아세르베이트 약물 전달 시스템은 높은 용량의 약물을 캡슐화하고 수성 매질에서 자발적으로 형성된다. 코아세르베이트 상에 단백질 약물이 캡슐화되면 외부 환경으로부터 보호되고 생물학적 활성이 유지될 수 있다. 미립자(microparticle)와 같은 다른 DDS에 비하여 코아세르베이트의 특징적인 장점 중 하나는 코아세르베이션은 신속히 진행되고, 단백질 약물에 유해할 수 있는 유기 용매를 필요로 하지 않는다는 점이다. 천연 고분자뿐만 아니라 합성 고분자가 활성 성분의 마이크로 캡슐화 및 제어 방출에 사용된다. 그러나, 최근에는 비독성 및 생분해성으로 인하여 천연 고분자로 전환되는 추세이다.
본 발명에서는 복합 코아세르베이션을 위한 양이온성 및 음이온성 고분자 전해질로서 젤라틴 A(GA)와 알긴산 나트륨(SA)을 사용하였다. 콜라겐에서 유래된 젤라틴은 의약품 및 제약 제품에 사용되어 왔고, 오랜 기간 임상적으로 사용되어 그 안전성이 증명되었다.
젤라틴에는 두 가지 유형이 있다. 젤라틴 A는 산-경화 조직 유래이고 단백질 100 g 당 78-80 mM의 유리 카복실 군 및 7.0-9.0의 pI를 갖는다. 젤라틴 B는 석회-경화 유래이고 단백질 100 g 당 100-115 mM의 유리 카복실 군 및 4.7-5.2의 pI를 갖는다. 본 발명에서는 낮은 pH 4 ~ 5에서 젤라틴의 순 전하가 양성이어야 하므로 젤라틴 A를 사용한다. 알긴산의 나트륨염(SA)은 높은 음전하 고분자로서 다양한 투여 형태 및 제약 산업에서 광범위하게 사용된다.
본 발명의 조성물에 사용되는 산(acid)은 수용액 중에서 해리하여 수소이온을 생성하고 염기와 중화하여 염을 만드는 물질로서, 약제학적으로 사용되는 통상적인 산이면 가능하며, 예를 들어, 염산, 질산, 황산, 시트르산, 아세트산 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 아세트산이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 GA 및 SA를 사용한 코아세르베이트 제형을 분자량, 고분자 비율 및 반응 pH를 변화시켜 스크리닝함으로써 본 발명의 특정 코아세르베이트 조성물을 도출하였고, 도출된 코아세르베이트 시스템에 대하여 물리적 외형, 균일성, 크기 분포, 단백질 캡슐화 효율 및 트립신 소화 측면에서 특성을 평가하였다. 상처 봉합능 및 장기 안정성을 평가하기 위하여 EGF-코아세르베이트를 동결건조하여 방출 및 생체활성 시험에 사용하였다.
일 구현예에서, 상기 젤라틴 A는 평균 분자량 20 ∼ 25 KDa일 수 있으며, 겔 강도 90 ∼ 110 g일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율은 1 : 0.2 ∼ 1.2 중량비로 포함될 수 있으며, 상기 산(acid)이 아세트산 5.4 ∼ 16.3 mM 농도일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 코아세르베이트 조성물은 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 1 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 5.4 ∼ 16.3 mM 농도이거나, 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 0.8 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 5.4 ∼ 10.9 mM 농도이거나, 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 0.4 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 5.4 ∼ 8.2 mM 농도일 수 있으며, 바람직하게는 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 1 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 16.3 mM 농도 또는 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 0.4 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 8.2 mM 농도일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단백질 약물은 표피생장인자(epidermal growth factor, EGF), 성장호르몬(Growth hormon, GH) 및 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor, FGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 단백질 약물일 수 있다.
상기 단백질 약물은 코아세르베이트 조성물에 대하여 100 ng/g ∼ 100 ug/g 비율로 포함될 수 있으며, SA의 경우 1 ∼ 2.5 mg/g으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 코아세르베이트 조성물을 포함하는 창상 치료제를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 창상은 만성 난치성 창상으로서, 당뇨병성 궤양, 특히, 당뇨병성 족부궤양일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
Ⅰ. 시약 및 방법
1. 시약
겔 강도 300 젤라틴 A(고 분자량, High molecular weight gelatin A, HWGA)(평균 분자량 100 KDa), 겔 강도 90-110 젤라틴 A(저 분자량, Low molecular weight gelatin A, LWGA)(평균 분자량 20-25 KDa) 및 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)은 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 알긴산 나트륨(Sodium alginate, SA), 아세트산 및 아세토니트릴(acetonitrile, ACN)은 대정(경기도)에서 구입하였다. 표피생장인자(Epidermal growth factor, EGF)는 대웅제약에서 제공하였다. 완충액(Dulbecco's phosphate buffered saline, DPBS)은 웰진(Welgene, 경상북도)에서 구입하였고, 배양 배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM)는 하이클론(Hyclone, Logan, USA)에서 구입하였으며, 0.25 % 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA)와 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 집코(Gibco, Paisley, UK)에서 구입하였다. 인간 피부 섬유아세포(Human dermal fibroblast, HDF)는 론자(Lonza, Walkersville, USA)에서 구입하였다. 세포계수 키트-8(Cell counting kit-8, CCK-8)는 도진도(Dojindo, Kumamoto, Japan)에서 구입하였다.
표준 시약(Precision plus protein dual color standard), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인, 30 % 아크릴아미드/비스(acrylamid/Bis) 용액(29:1), 10 % 도데실황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액, 과황산암모늄(ammonium persulfate, APS), 스태킹 겔 버퍼(stacking gel buffer), 분리 버퍼(resolving buffer), 10x 트리스/글라이신/SDS(Tris/Glysine/SDS) 완충액, 10x 트리스/글라이신 완충액, 10x 트리스 완충 식염수(Tris buffered saline, TBS), 테트라메틸에틸렌디아민(tetramethylethylenediamine, TEMED)은 바이오-레드(Bio-rad, 캘리포니아, 미국)에서 구입하였다. 소혈청 알부민(bovine serum albumin, Milliore, Illinois, USA의 BSA), 0.2 μm 멤브레인 필터(membrane filter, PALL, New York, 미국), 바이신코닉산 시험(bicinchoninic acid assay, BCA) 키트 및 강화 화학 발광체(enhanced chemiluminescence, ECL) 웨스턴 블럿팅 기질(Thermo scientific, Rockford, USA) USA), 은 염색 키트(silver staining kit, Biosesang, Gyeonggi-do, South Korea), 2차 항체로서 토끼 항-마우스 HRP(Abcam, Cambridge, UK)를 구입하였다.
2. HWGA 및 SA를 사용한 BSA 코아세르베이트
A. BSA-코아세르베이트의 제조 및 물리적 특성의 측정
BSA-코아세르베이트 제조에 HWGA, SA 및 BSA를 사용하였다. 1 % HWGA(w/w, 10 mg/g) 와 0.5 % SA(w/w, 5 mg/g) 증류수로 제조하여 저장용액으로 사용하였다. 제조 순서로는 먼저, 543.8 mM 아세트산 용액을 증류수로 희석하여 아세트산 최종 농도가 0 mM 또는 1.1 mM 또는 2.7 mM가 되도록 하였다. 그 다음, 코아세르베이트의 최종 고분자 비율이 HWGA:SA = 1:0.1, 1:0.125, 1:0.167, 또는 1:0.25가 되도록 계산하여, 각 희석한 아세트산 용액에 1 % HWGA 저장용액을 필요한 만큼 첨가한 후, BSA 용액(1 mg/ml)을 최종 농도 100 μg/g가 되도록 가하였다. 마지막으로 원하는 HWGA:SA 비율에 맞게 0.5 % SA 저장용액을 첨가한 후 균일하게 섞이도록 하였다. HWGA:SA의 다양한 비율의 코아세르베이트 시료 내 최종 고분자 농도는 9.9, 8.1, 6.3, 또는 5.4 mg/g이었다.
상태는 육안으로 관찰한 후, 상이한 아세트산 농도에서 3개 비율(1:0.125, 1:0.167, 1:0.25)을 사용하여, pH 미터(Thermo scientific, Massachusetts, USA)를 사용한 pH 계산, 450 nm에서의 혼탁도(Microplate reader, molecular Devices, California, USA), 제타전위, 입자 크기 및 PDI(polydispersity index[다분산 지수], Zetasizer Nano-ZS, Malvern instruments, Worcester, UK)를 측정하였다.
B. BSA-코아세르베이트의 캡슐화 효율
BSA-코아세르베이트를 원심분리(14000g, 10분, 4 ℃, x2)에 의해 상등액과 펠렛으로 분리하였다. 이들을 단백질의 정량분석과 정성분석에 사용하였다. 펠렛은 코아세르베이트 상만을 함유한 반면, 상등액은 대부분 유리 단백질 및 고분자였다. 상등액 및 펠렛을 각 튜브에 분리하고, 상등액과 동일한 부피의 PBS에 펠렛을 용해시켰다. 상기 각 시료를 BCA 분석 및 SDS-PAGE에 사용하였다. BSA-코아세르베이트의 캡슐화 효율을 측정하기 위하여, 시료를 정량분석용 BCA 분석 키트로 분석하였고, 562 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 검출하였다. BCA 분석은 각각의 단백질 농도를 검출할 수 없기 때문에 각 시료 중의 BSA 포함 전체 단백질을 동정하였다. 다양한 조건에서 코아세르베이트 중의 BSA만의 캡슐화 효율과 비교하기 위하여, 은 염색을 이용한 10 % SDS PAGE를 정성분석용으로 이용하였다. 20 μL의 각 시료를 5x 시료 완충액(Bio solution, Seoul, Korea)과 혼합하고 100 ℃에서 10분간 변성시켰다. 이후 다음 두 단계를 수행하였다: ① 30분 동안 80V, ② 100분 동안 100V. 완료 후, 은 염색 키트에 기재된 방법에 따라 은 염색을 수행하였다.
3. HWGA 및 SA를 이용한 EGF -코아세르베이트
HWGA, SA 및 EGF를 EGF-코아세르베이트의 제조에 사용하였다. pH, 혼탁도, 제타전위, 입자 크기 및 PDI를 측정하기 위하여 최종 아세트산 농도는 3가지 조건(0 mM, 1.1 mM, 2.7 mM)으로, HWGA:SA 비율을 3개 비율(1:0.125, 1:0.167, 1:0.25)로 선정하여 제조하였다. 다양한 조건 중에서 BSA-코아세르베이트에서의 우수한 입자 품질과 펠렛 중의 높은 양의 BSA를 나타내는 두 조건에 대하여 EGF-코아세르베이트의 상등액과 펠렛의 정량 및 정성분석을 측정하였다. 상기 분석 방법은 SDS-PAGE 겔 %를 제외하고는 2.B에서와 동일하였다. 이때 EGF는 BSA(66 KDa)보다 분자량이 적으므로(6.4 KDa) 15 % SDS-PAGE를 사용하였다.
분석 후, EGF의 캡슐화 효율을 증가시키기 위하여 EGF-코아세르베이트의 조건을 변화시켰다. 최종 고분자의 농도는 5 mg/g으로 고정하였으며, HWGA:SA의 비율을 1:1, 1:0.8, 1:0.4로 변경하고, 아세트산의 농도는 최종 아세트산 농도가 0 mM, 2.7 mM, 5.4 mM, 8.2 mM, 10.9 mM, 13.6 mM 및 16.3 mM가 되도록 543.8 mM 아세트산 용액을 각 조건의 양 만큼 처리하였다. 제조 순서로는 고분자 농도를 동일하게 고정하기 위하여 최종 아세트산 농도가 상기 7가지 조건이 되도록 543.8 mM 아세트산을 각 조건에 맞게 증류수로 희석한 후, 0.1% HWGA 저장용액 2.5 mg을 첨가하였다. 그 다음, EGF 용액(1 mg/ml)을 최종 농도 100 μg/g가 되도록 가하였다. 마지막으로 0.5% SA 저장용액 1 mg 또는 2 mg 또는 2.5 mg만큼 첨가하였다. 물리적 특성을 측정하는 방법은 혼탁도를 제외하고는 2.A에 기재된 방법과 동일하다. 혼탁도는 자외선 분광 광도계(Shimadzu, Kyoto, Japan)로 1 mL 일회용 큐벳을 사용하여 측정하였다.
4. LWGA 및 SA를 이용한 EGF -코아세르베이트
A. EGF -코아세르베이트의 물리적 특성
LWGA 및 SA를 사용한 EGF-코아세르베이트의 조건은 섹션 2.B에 기재된 비율 및 아세트산의 농도와 동일하였다. 각 시료를 제조한 후, 시료의 형성을 관찰하였다. 물리적 특성의 측정 방법은 2.B와 동일하다.
B. 선정된 EGF -코아세르베이트의 캡슐화 효율
LWGA를 사용한 EGF-코아세르베이트을 분석한 후, 균일한 콜로이드(PDI 0.4 이하)를 형성하면서 450 nm에서의 1.5 이상의 흡광도를 나타내는 EGF-코아세르베이트의 조건을 선정하였다. EGF-코아세르베이트의 상등액 및 펠렛의 정량분석 및 정성분석을 위하여 8개 조건의 EGF-코아세르베이트를 선정하였다. 상등액과 펠렛의 단백질 정량분석 방법은 3.A에서와 동일하였다. EGF의 정성분석은 웨스턴 블럿팅으로 수행하였다. 3.A와 같은 방법으로 SDS-PAGE를 수행한 후 아크릴 아미드 젤의 단백질을 PVDF 막 100V로 90분간 옮겼다. 실온(RT)에서 1시간 동안 5% BSA(TBST 완충액-TBS 완충액 중 0.05 % tween20)으로 블로킹한 후, 4 ℃에서 1차 항체(인간 EGF 항체)를 밤새 결합시켰다. 상기 막을 서양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)-접합 2차 항체(토끼 항-마우스 HRP, Rabbit anti-mouse HRP)로 RT에서 1시간 동안 처리하였다. 표지된 단백질 밴드를 ECL 웨스턴 블럿팅 기질과 반응시켜 화상 이미지 분석기(image quant las 4000; GE healthcare, Little chalfont, UK)로 측정하였다.
C. GH -코아세르베이트 및 FGF -코아세르베이트의 제조
성장호르몬(Growth hormon, GH) 및 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor, FGF)에 대하여도 상기 조성으로 각 시료를 제조한 후, 시료의 형성을 관찰하고 물리적 특성을 측정하였다.
5. 최적화된 EGF -코아세르베이트의 트립신 소화 시험
펠렛 중 EGF의 캡슐화 효율 결과로 선정된, LWGA 이용 EGF-코아세르베이트를 하기 최적화된 조건으로 제조하여 트립신 소화 시험을 수행하였다.
(1) 유리 EGF(EGF 10 μg)
(2) 1:1 비율의 EGF 혼합물(EGF 10 μg, LWGA 250 μg, SA 250 μg, 아세트산 무첨가)[비교예 1]
(3) 1:1 비율의 EGF-코아세르베이트(EGF 10 μg, LWGA 250 μg, SA 250 μg, 아세트산 16.3 mM)[실시예 1]
(4) 1:0.4 EGF-혼합물(EGF 10 μg, LWGA 250 μg, SA 100 μg, 아세트산 무첨가)[비교예 2]
(5) 1:0.4 EGF-코아세르베이트(EGF 10 μg, LWGA 250 μg, SA 100 μg, 8.2 mM 아세트산)[실시예 2]
상기 시료를 튜브에 첨가하여 원심분리하였다. 0.04 % 트립신-EDTA를 시료에 첨가하여, 37 ℃, 1시간 또는 2시간 동안 0.04 % 트립신-EDTA와 인큐베이션하였다. 소화 용액에 남아있는 EGF의 정성분석은 4.B에서 수행된 웨스턴 블럿팅과 동일한 방법으로 수행하였다.
6. 동결건조 시료의 제조
상처 봉합능 및 장기 저장성을 향상시키기 위하여 동결건조를 수행하였다. 동결건조 시료 제조 후, EGF-코아세르베이트의 방출 양상 및 생체활성을 측정하기 위하여 시험관내 방출 시험 및 생체활성 시험을 수행하였다.
A. 시험관내 방출 시험용 시료의 제조
EGF-혼합물 및 EGF-코아세르베이트를 LWGA:SA-1:0.4(LWGA 2.5 ㎎, SA 1 ㎎ 및 EGF 100 μg)로 아세트산 무첨가 및 8.2 mM의 아세트산 조건으로 제조하였다. 동결건조 후 -80 ℃에 보관하였다.
B. 시험관내 세포 증식 및 이동 시험을 위한 시료의 제조
LWGA:SA-1:1 혼합물(LWGA 250 g, SA 250 μg, 아세트산 무첨가), LWGA:SA-1:1 코아세르베이트(LWGA 250 μg, SA 250 μg, 아세트산 16.3 mM), LWGA:SA-1:0.4 혼합물(LWGA 250 μg, SA 100 μg, 아세트산 무첨가) 및 LWGA:SA-1:0.4 코아세르베이트(LWGA 250 μg, SA 100 μg, 아세트산 8.2 mM); LWGA:SA-1:1 EGF-혼합물(EGF 10 ng, LWGA 250 μg, SA 250 μg, 아세트산 무첨가)[비교예 1], LWGA:SA-1:1 EGF-코아세르베이트(EGF 10 ng, LWGA 250 μg, SA 250 μg, 아세트산 16.3 mM)[실시예 1], LWGA:SA-1:0.4 EGF 혼합물(EGF 10 ng, LWGA 250 μg, SA 100 μg, 아세트산 무첨가)[비교예 2] 및 LWGA:SA-1:0.4 EGF-코아세르베이트(EGF 10 ng, LWGA 250 μg, SA 100 μg, 아세트산 8.2 mM)[실시예 2]를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 그 후, 시료를 동결시키기 위하여 -80 ℃에 두었다. 동결된 시료를 동결건조기(Operon, Gyeonggi-do, Korea)에서 동결건조하였다. 동결건조된 시료는 사용할 때까지 -20 ℃에 보관하였다.
C. 생체내 시험용 시료의 제조
LWGA:SA-1:0.4 EGF-혼합물(EGF 1 μg, LWGA 250 μg, SA 100 μg, 아세트산 무첨가)[비교예 2] 및 LWGA:SA-1:0.4 EGF-코아세르베이트(EGF 1 ug, LWGA 250 μg, SA 100 μg, 아세트산 8.2 mM)[실시예 2]을 96 웰 플레이트에 각각 첨가하였다. 그 후, 시료를 동결시키기 위하여 -80 ℃에 두었다. 냉동 시료를 동결건조기에서 동결건조시켰다. 동결건조된 시료는 사용할 때까지 -20 ℃에 보관하였다.
7. 시험관내 방출 시험
상기 각 시료를 트랜스웰(Transwell) 인서트에 넣고, 시료 수화를 위하여 70 μL DW를 첨가하고, 24 웰 플레이트에 700 μL DPBS를 넣었다. 1 mg/g EGF의 용액을 70 μL만큼 취하여 트랜스 웰 인서트에 넣고 700 μL DPBS의 24 웰 플레이트를 담갔다. 각 샘플링 시점(1, 2, 4, 6, 8 시간) 마다의 시료를 제조한 후, 32 ℃, 150 rpm으로 인큐베이션하였다. 각 샘플링 시점 이후에 24 웰 플레이트에서 방출 배지를 취하여 E-튜브로 옮기고 종료 시점까지 4 ℃에 저장하였다. 방출이 완료된 후 시료의 EGF를 0.45 μm 주사기 필터로 여과하고 고속액체 크로마토그래피(HPLC, Knauer, 베를린, 독일) 및 HPLC 컬럼(00G-4167-E0 Jupiter 5 μm C4 300A 250 x 4.6 mm, phenomenex, torrance, USA)을 이용하여 계산하였다. 이동상은 용액 A(DW 중 0.1 % TFA) 및 용액 B(ACN 중 0.1 % TFA)를 혼합하여 사용하였다.
8. 시험관내 세포활성 연구
A. 세포 증식 분석
세포 증식 및 이동 능력을 비교하기 위한 인간 피부 섬유아세포(Human dermal fibroblasts, HDFs)를 DMEM, 10 % FBS에서 배양하였다. 세포를 6회 계대배양 시점에 100 π 디쉬에서 80 % 밀집도에 도달할 때까지 배양하였다. 세포를 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 분리한 후, 24 웰 플레이트에 웰 당 1x104 세포를 접종하였다. 세포를 37 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 다음 군[양성 대조군(10 % FBS 1 mL), 음성 대조군(1 % FBS 1 mL), EGF(1 % FBS 중 10 ng/mL EGF 1 mL)]을 제외하고, DMEM에 1 % FBS를 함유한 배지를 웰 당 800 μL로 대체하였다. 동결건조 시료를 트랜스웰 인서트에 넣고 1 % FBS가 함유된 200 μL 배지를 인서트에 첨가하였다. 인서트를 웰에 넣은 후 37 ℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. HDF의 증식은 CCK-8 분석에 의해 측정하였다. 모든 결과는 450 nm에서 측정하였고 음성 대조군으로 표준화하였다.
B. 세포 이동 분석
HDF를 7회 계대배양 시점에 100π 디쉬에 80 % 밀집도에 도달할 때까지 배양하였다. 24 웰 플레이트에서 웰의 중앙에 표시한 후, 0.1 % 젤라틴 용액을 첨가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 DPBS로 1회 세척하여 젤라틴으로 코팅된 24 웰 플레이트를 준비하였다. 세포를 0.25 % 트립신-EDTA를 사용하여 분리한 후, 코팅된 플레이트에 웰 당 9 × 104 세포를 접종하였다. 세포를 밤새 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 200 μL 피펫 팁을 사용하여 세포를 스크래치하고 잔해를 제거하기 위하여 웰을 DPBS로 2회 세척하였다. 0.5 % FBS가 함유된 1 mL 배지를 웰 당 첨가하고 스크래치 0시간 시점을 측정하기 위하여 현미경(Leica, Wetzlar, Germany)으로 사진을 찍었다. 다음 군[양성 대조군(10 % FBS DMEM 1 mL), 음성 대조군(0.5 % FBS DMEM 1 mL), EGF(10 ng/mL EGF 0.5 % FBS DMEM 1 mL)]을 제외하고는 0.5 % FBS를 함유한 배지를 웰 당 800 μL로 대체하였다. 동결건조 시료를 트랜스웰 인서트에 넣고 DMEM에 1 % FBS가 함유된 200 μL 배지를 인서트에 첨가하였다. 세포를 37 ℃에서 8시간 동안 인큐베이션한 후 스크래치된 부분을 찍었다. 스크래치 폭은 이미지-프로 플러스 소프트웨어(Image-Pro Plus software, Media Cybernetics, USA)를 사용하여 측정하였고, 하기 계산식 1에 의해 계산하였다.
[계산식 1]
상처 면적의 배수 = {(A0 - At) / A0} / 음성 대조군의 결과값
(식에서 A0는 원래의 상처 면적이고, At는 8시간 후에 상처 면적이다.)
9. 생체내 연구
A. 스트렙토조토신 ( STZ )-유도 당뇨병 마우스 모델
6주령 수컷 C57BL/6 마우스(대부분의 비교군에서 n = 5)를 실험에 사용하였다. 모든 동물 실험은 차의과대학의 기관동물케어 및 사용위원회(IACUC No:170028)의 규정에 따라 수행하였다. 모든 마우스는 실험 전 일주일 동안 통풍이 잘되는 방의 환경에 순응하도록 하였다. 스트렙토조토신(Streptozocin, Tocris, Bristol, UK)을 투여하기 전 12-14시간 동안 금식시킨 후, 마우스에 100 mM 구연산염 완충액(pH 4.5) 중의 스트렙토조토신(Streptozocin, Tocris, Bristol, UK)을 100 mg/kg, 2 회 복강 내 주사하여 STZ 당뇨병을 유도한 후에, 12시간 동안 금식시켜 실험하였다. STZ 처리 후의 혈당치를 아큐첵 활성 키트(Accu-check active kit, Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 3-4일마다 측정하였다. 일반적으로 250 mg/dL보다 높은 혈당치를 갖는 마우스가 당뇨 유발 모델로 사용된다. 이에 따라, 본 실험에서는 일정 용량의 STZ 처리 2주 후에 250 mg/dL 이상의 혈당치를 갖는 마우스를 선별하여 상처 치유 평가에 사용하였다.
B. 마우스 피부 상처 치유의 분석
실험 동물은 5개 군으로 분류하였다. 1군(정상)은 대조군(당뇨병이 없는 마우스), 2군(음성 대조군), 3군(유리 EGF), 4군(1:0.4 EGF-혼합물), 5군(1:0.4 EGF-코아세르베이트)은 당뇨병 마우스 군이었다. 케타민/럼푼(ketamine/rompun, 3:1) 칵테일을 복강 내 투여하여 약하게 마취한 상태에서, 마우스 6개체의 세척된 등 피부를 면도하고 70 % 에탄올로 닦았다. 이 후 생검 펀치(biopsy punch, Kai medical, Oyana, japan)를 이용하여 각 마우스의 등에 창상(full thickness wound, 전층 두께의 상처, 직경 5 mm)을 만들었다. 1군(정상)과 2군(음성)은 DPBS를 대조군으로 처리하였다. 3군은 1 μg/10 μL의 유리 EGF를 투여하였다. 4군은 동결건조된 LWGA:SA-1:0.4 EGF-혼합물을 투여하였다. 5군은 동결건조된 LWGA:SA-1:0.4 EGF-코아세르베이트를 투여하였다. 1군, 2군 및 3군은 각 시료 10 μL를 상처에 적용하였다. 4군 및 5군은 각 동결건조 시료를 상처에 도포하고 시료의 수화를 위하여 5 μL DW를 첨가하였다. 상처를 만든 후 시료를 2회(0일, 3일) 처리하였다. 각 마우스는 음식과 물을 구비한 개별적 공간에 유지시켰다. 상처 면적을 기준으로 상처 봉합률을 계산하기 위하여 수술 후 각 시점(0, 3, 5, 7, 10, 12, 14일)의 상처 사진을 촬영하였다. 상처 면적은 하기 계산식 2에 의해 계산하였다.
[계산식 2]
상처 부위(%) = {(A0 - At) / A0} × 100
(식에서 A0는 원래의 상처 면적이고, At는 각 시점의 상처 면적이다.)
Ⅱ. 결과
1. HWGA , SA 및 BSA 간의 상호작용
A. BSA-코아세르베이트의 물리적 특성
젤라틴 A 및 알긴산 나트륨의 비율을 1:0.25(HWGA:SA-1:0.25)로 하여 실험을 시작하였다. 동일한 비율의 고분자에서 pH가 감소하면 혼탁도가 증가하고 균일한 코아세르베이트가 형성되었다. 침전을 발생시키지 않고 코아세르베이션을 형성하는 pH를 pHc로 정의하였다. 그러나, SA의 비율이 감소함에 따라, 동일한 아세트산 농도에서 액상 코아세르베이트 상(phase)이 아닌 고체 침전 상이 나타났다. 침전 상에서는 응집된 형태의 불균일한 입자가 보였다(도 1 참조).
HWGA:SA-1:0.1 비율을 제외한 군에서, 입자 품질 평가 지표에 사용되는 제타전위, 입자 크기 및 PDI를 측정하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타난 바와 같이, SA의 비율 및 pH가 낮을수록 제타전위가 0에 가깝고 입자 크기가 커졌다. 조건의 PDI가 0.4보다 낮게 측정되었을 때, 균일한 코아세르베이트가 형성되었다.
HWGA:SA 비율 1:0.25 1:0.167 1:0.125
아세트산
(mM)		 0 1.1 2.7 0 1.1 2.7 0 1.1a 2.7b
혼탁도 0.01 0.01 1.07 0.01 0.01 1.65 0.01 1.30 -
pH 6.10 5.13 4.81c 6.01 5.26 4.89c 5.96 5.30 4.96
제타전위 -27.4 -22.4 -21.6 -24.5 -18.8 -12.4 -16.90 -12.7 -
입자크기 500.2 108.3 314.5 510.8 569.2 574.2 815.7 1306.5 -
PDI 0.911 0.978 0.135 0.778 1 0.359 0.825 1 -
a: 반응 혼합물이 몇개의 큰 입자로 혼탁해짐
b: 광범위한 응집이 나타남
c: 각 반응 조건에서 코아세르베이션이 일어나는 pHc
B. BSA-코아세르베이트의 캡슐화 효율
BCA 분석법을 이용한 단백질의 정량분석 결과, 아세트산의 농도가 높을수록 각 비율에서의 펠렛의 단백질 함량이 상등액에서보다 높았다(표 2 참조). SDS-PAGE에서, PDI가 0.4 미만이고 혼탁도가 1 이상인 코아세르베이트(HWGA:SA-1:0.25, 2.7 mM 아세트산 및 HWGA:SA-1:0.167, 2.7 mM 아세트산)는 다른 경우보다 캡슐화 효율이 높았다. HWGA:SA-1:0.125, 2.7 mM 아세트산 시료도 높은 캡슐화 효율을 보였으나 고체 침전물이었다(도 2 참조).
HWGA:SA 비율 1:0.25 1:0.167 1:0.125
아세트산(mM) 1.1 2.7 1.1 2.7 1.1 2.7
펠렛의 단백질(%) 2.46 78.71c 11.83 93.16c 72.19 95.21
상등액의 단백질(%) 90.55 34.53 91.01 18.69 47.48 10.50
a: 총 단백질 양(BSA + 젤라틴)에 상대적임.
c: 각 반응 조건에서 코아세르베이션이 일어나는 pHc
2. HWGA , SA 및 EGF 간의 상호작용
A. BSA-코아세르베이트의 동일 조건에서 EGF의 낮은 캡슐화 효율
BSA-코아세르베이트 시스템과의 동일한 조건에서, EGF-코아세르베이트의 물리적 특성은 BSA-코아세르베이트의 조건과 유사하였다. 동일 비율의 고분자에서 pH가 감소하면 혼탁도가 증가하고 균일한 코아세르베이트가 형성되었다. 그러나 동일한 아세트산 농도에서 SA의 비율이 낮아지면 액체-코아세르베이트 상이 아닌 고체-침전 상을 형성하였다. SA의 비율 및 pH가 낮을수록, 제타전위가 0에 가깝고 입자 크기가 더 컸다. 혼탁도가 1 이상이고 PDI가 0.4 이하인 것은 균일하고 높은 캡슐화 효율을 나타내는 BSA-코아세르베이트의 조건과 동일하였다(표 3 참조). EGF 복합 상을 갖는 HWGA 및 SA의 측정 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
HWGA:SA 비율 1:0.25 1:0.167 1:0.125
아세트산 (mM) 0 1.1 2.7 0 1.1 2.7 0 1.1a 2.7b
혼탁도 0.01 0.01 1.34c 0.01 0.01 1.71c 0.01 1.24 -
pH 6.12 5.11 4.74 6.07 5,20 4.86 5.94 5.27 4.91
제타전위 -34.2 -27.0 -21.4 -20.6 -18.0 -14.5 -16.5 -15.4 -
입자크기 380.3 174.9 371.0 497.5 514.7 683.3 704.5 1333.0 -
PDI 0.913 0.955 0.200 0.738 1 0.395 0.775 0.570 -
a: 반응 혼합물이 몇개의 큰 입자로 혼탁해짐
b: 광범위한 응집이 나타남
c: 각 반응 조건에서 코아세르베이션이 일어나는 pHc
실험 조건 중, EGF의 캡슐화 효율을 측정하기 위하여 2개 조건([HWGA:SA-1:0.25, 2.7 mM 아세트산] 및 [HWFA:SA-1:0.167, 2.7 mM 아세트산])을 선정하였다. BCA 분석에 의해 측정된 펠렛 중의 총 단백질 양은 HWGA:SA-1:0.25, 2.7 mM 아세트산 및 HWGA:SA-1:0.167, 2.7 mM 아세트산의 경우에 있어서 각각 76.06 %와 80.59 %였다(표 4 참조). 그러나, SDS-PAGE 결과에서는 펠렛 중 EGF가 상등액보다 낮은 것으로 나타났다(도 3 참조). 하기 표 4에 각 조건에서의 단백질의 BCA 분석 결과를 나타내었다.
HWGA:SA 비율 1:0.25 1:0.167
상등액의 단백질 (%)a 39.53 25.78
펠렛의 단백질 (%)a 76.06c 80.59c
a: 총 단백질 양(BSA + 젤라틴)에 상대적임.
c: 각 반응 조건에서 코아세르베이션이 일어나는 pHc
B. EGF를 포함하는 HWGA 및 SA 기반의 변형된 코아세르베이트 제형
보다 넓은 범위에서 코아세르베이트의 형성 여부를 측정하기 위하여, HWGA 및 SA의 비율을 1:1, 1:0.8, 1:0.4로 고정하고, 아세트산의 농도를 0 mM, 2.7 mM, 5.4 mM, 8.2 mM , 10.9 mM, 13.6 mM 및 16.3 mM로 설정하였다. EGF-코아세르베이트의 최적 조건을 선정하기 위하여 각 조건의 혼탁도, 제타전위, 입자 크기 및 PDI를 측정하여 평가하였다. HWGA:SA 코아세르세이트의 물리적 특성을 최적화하기 위하여, 상이한 농도의 아세트산에서 HWGA 및 SA를 시험하였다. 혼탁도가 거의 0인 0 mM 아세트산 군은 투명한 용액 상태였으며, HWGA:SA-1:1, 5.4 mM과 HWGA:SA-1:0.8, 5.4 mM, HWGA:SA-1:0.4, 2.7 mM에서는 균일한 혼탁액을 확인하였다. 그러나 그 외의 시료는 모두 응집되었고 PDI는 0.4보다 높았다 (표 5 참조). 균일한 코아세르세이트뿐만 아니라 EGF의 높은 캡슐화 효율을 얻을 수 있는 코아세르세이트 조건을 보다 넓은 조건에서 최적화하기 위해서는 고분자의 비율 및 pH 외의 다른 요인을 고려해야 한다. 하기 표 5에 HWGA 및 SA를 사용한 변형된 제형의 측정 결과를 나타내었다. 이들은 다양한 비율의 고분자와 아세트산 농도로 제조되었다.
HWGA:SA 1:1
아세트산
(mM)		 0 2.7 5.4 c 8.2 10.9 13.6 16.3
pH 6.23 4.84 4.58 4.42 4.30 4.21 4.14
혼탁도 0.05 0.13 1.62 1.90 1.97 1.97 1.91
제타전위 -52.73 -38.90 -39.37 -37.40 -36.63 -41.93 -39.47
Z-평균
(d.nm)		 563.10 375.43 722.53 2315.33 1114.67 1158.87 1272.67
PDI 1 0.98 0.28 0.65 0.60 0.58 0.44
HWGA:SA 1:0.8
아세트산
(mM)		 0 2.7 5.4 c 8.2 10.9 13.6 16.3
pH 6.10 4.83 4.57 4.40 4.29 4.21 4.14
혼탁도 0.04 0.12 1.66 1.93 2.02 1.99 1.98
제타전위 -52.70 -39.30 -37.03 -36.63 -33.63 -39.13 -38.03
Z-평균
(d.nm)		 551.77 328.03 641.07 1090.00 730.33 921.73 967.33
PDI 1 1 0.18 0.48 0.42 0.74 0.55
HWGA:SA 1:0.4
아세트산
(mM)		 0 2.7 c 5.4 8.2 10.9 13.6 16.3
pH 5.97 4.82 4.55 4.36 4.26 4.17 4.09
혼탁도 0.03 1.68 2.09 2.00 1.99 1.90 1.73
제타전위 -51.60 -26.80 -30.07 -27.30 -25.05 -34.33 -23.47
Z-평균
(d.nm)		 521.50 726.60 2130.67 3650.00 7481.00 1474.33 2373.33
PDI 0.85 0.38 1 1 0.73 0.63 0.84
c: 각 반응 조건에서 코아세르베이션이 일어나는 pHc
이들은 다양한 비율의 고분자와 아세트산 농도로 제조되었다. 균일한 코아세르세이트(PDI 0.4 이하)의 조건과 높은 혼탁도(1.5 이상)는 진하게 표시하였다.
3. LWGA를 이용한 EGF -코아세르베이트 제형
A. LWGA를 이용한 균일한 EGF -코아세르베이트 상의 평가
보다 넓은 구간에서 코아세르베이트를 형성하는 조건을 선정하기 위하여, HWGA 대신에 저분자 젤라틴 A(겔 강도 90-110(약 20-25 KDa), LWGA)를 사용하여 코아세르베이트를 제조하였다.
LWGA 및 SA를 사용한 농도 조건은 2.B에 기재된 내용과 같다. 다양한 비율의 고분자와 아세트산의 농도로 제조된 혼합물의 고분자 복합체 상을 관찰한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, HWGA 및 SA 사용시에 고체 침전을 형성하는 일부 조건에서 LWGA 및 SA를 사용하면 액상 코아세르베이트를 생성함을 알 수 있다. 또한, HWGA:SA로 형성된 응집체와 LWGA:SA로 형성된 균일한 콜로이드의 광학 현미경 사진을 도 5에 나타내었다.
다양한 조건들 중에서, 균일하면서도 PDI가 0.4 이하이고 혼탁도가 1.5 이상인 고 혼탁도 조건의 코아세르베이트를 코아세르베이트 조건의 우수한 특성으로서 선택하였다. pH가 낮을수록 제타전위는 0에 가까워졌다(표 6 참조). 이러한 결과에 기초하여, 선택된 조건에서 EGF의 캡슐화 효율을 측정하기 위한 정성 및 정성분석을 수행하였다. LWGA 및 SA를 사용한 변형된 제형의 측정 결과를 하기 6에 나타내었다.
LWGA:SA 1:1
아세트산
(mM)		 0 2.7 5.4c 8.2 c 10.9 c 13.6 c 16.3 c
pH 6.00 4.82 4.55 4.38 4.31 4.22 4.14
혼탁도 0.04 0.06 1.25 1.78 1.87 1.90 1.94
제타전위 -42.13 -35.70 -36.23 37.30 35.80 36.63 35.70
Z-평균
(d.nm)		 334.17 527.27 864.17 807.87 639.17 955.00 914.13
PDI 0.95 0.77 037 0.31 0.21 0.39 0.30
LWGA:SA 1:0.8
아세트산
(mM)		 0 2.7 5.4c 8.2 c 10.9 c 13.6 16.3
pH 6.06 4.82 4.53 4.39 4.27 4.20 4.12
혼탁도 0.04 0.07 1.43 1.82 1.86 1.88 1.97
제타전위 -41.30 -36.80 -36.40 -34.23 -35.90 -25.53 -22.87
Z-평균
(d.nm)		 497.80 693.13 673.27 601.33 659.93 1112.23 5348.67
PDI 0.75 0.68 0.30 0.25 0.21 0.49 0.40
LWGA:SA 1:0.4
아세트산
(mM)		 0 2.7c 5.4 c 8.2 c 10.9 13.6 16.3
pH 6.00 4.78 4.52 4.34 4.25 4.14 4.07
혼탁도 0.03 1.32 1.91 2.01 1.97 1.88 1.69
제타전위 -34.97 -25.00 -24.37 -22.30 -22.27 -21.57 -16.47
Z-평균
(d.nm)		 699.27 923.60 364.40 1191.00 2688.67 2422.67 1810.67
PDI 0.94 0.50 0.14 0.33 0.94 0.59 0.49
c: 각 반응 조건에서 코아세르베이션이 일어나는 pHc
이들은 다양한 비율의 고분자와 아세트산 농도로 제조되었다. 균일한 코아세르세이트(PDI 0.4 이하)의 조건과 높은 혼탁도(1.5 이상)는 진하게 표시하였다.
B. EGF -코아세르베이트의 선정된 조건에서의 높은 캡슐화 효율
캡슐화 효율을 측정하기 위하여 PDI가 0.4이고 혼탁도가 1.5 이상인 8개 조건(LWGA:SA-1:1, 8.2 mM, 10.9 mM, 13.6 mM, 16.3 mM 아세트산, LWGA:SA-1:0.8, 8.2 mM, 10.9 mM 아세트산, LWGA:SA- 1:0.4, 5.4 mM, 8.2 mM 아세트산)을 선정하였다. BCA 분석에서 아세트산 농도가 높을수록(pH가 낮을수록), 각 펠렛에서 단백질의 캡슐화 효율이 높아졌다(표 7 참조). BCA 분석에 기초한 EGF의 정량분석 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
LWGA:SA 비율 1:1 1:0.8 1:0.4
아세트산(mM) 8.2 10.9 13.6 16.3 8.2 10.9 5.4 8.2
상등액의 단백질(%)a 57.79 43.99 37.02 30.67 48.63 35.83 44.97 31.05
펠렛의 단백질(%)a 60.96 77.24 83.51 86.37 69.17 80.57 75.83 86.73
a: 총 단백질 양(BSA + 젤라틴)에 상대적임.
웨스턴 블럿팅에 의한 EGF의 정성분석 결과 아세트산의 농도가 높을수록 각 펠렛에서의 EGF의 봉입 효율이 높은 것으로 나타났다. LWGA:SA-1:1 제형 중 16.3 mM 아세트산 조건에서 EGF의 봉입 효율이 가장 높았으며, LWGA:SA-1:0.8 및 LWGA:SA-1:0.4 제형 중에서, LWGA:SA-1:0.4 8.2 mM 아세트산 조건이 캡슐화 효율 측면에서 가장 우수하였다(도 6(A) 참조).
C. GH -코아세르베이트의 물리적 특성 및 캡슐화 효율
성장호르몬(Growth hormon, GH)으로 코아세르베이트를 제조하여 그 형성 여부 및 물리적 특성의 측정 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
비율 LWGA:SA=1:0.2 LWGA:SA=1:0.4 LWGA:SA=1:0.8 LWGA:SA=1:1
육안관찰 Coacervate Precipitate Coacervate Coacervate Coacervate Coacervate Coacervate Coacervate
아세트산
(mM)		 2.7 5.4 5.4 8.2 8.2 10.9 13.6 16.3
pH 4.90 4.66 4.76 4.58 4.57 4.47 4.37 4.29
Z-평균 (d.nm) 721.7 2399.7 637.1 711.2 670.8 754.1 656.9 510.7
PDI 0.581 0.456 0.366 0.191 0.216 0.281 0.213 0.146
제타전위 -15.30 -12.17 -25.17 -13.4 -33.73 -28.80 -35.27 -36.20
혼탁도 1.676 0.956 1.936 1.955 1.944 1.987 1.896 2.016
표 8에 나타난 바와 같이, LWGA:SA=1:0.2(아세트산 2.7 mM) 제형은 육안상 균질하게 보였으나, PDI값이 0.4 이상으로 측정되어 다분산되어 있음을 확인할 수 있다(실험 경험 상 추정함).
LWGA:SA=1:0.2(아세트산 5.4 mM) 제형은 육안상으로도 균질하지 못하고 응집되었음을 알 수 있었고, PDI값도 역시 좋지 못하였으며, Z-평균 크기도 2399.7로 크게 측정되었으며, 혼탁도는 침전물이 아래로 가라앉음으로 인하여 다른 시료들에 비하여 낮은 것으로 측정되었다.
그러나, LWGA:SA=1:0.4(아세트산 5.4, 8.2 mM), LWGA:SA=1:0.8(아세트산 8.2, 10.9 mM), LWGA:SA=1:1(아세트산 13.6, 16.3 mM)의 경우 혼탁도 1.5 이상, PDI값은 0.4 이하로 많은 양의 코아세르베이트가 나노 단위의 입자로 균질하게 제조되었음을 확인하였다.
성장호르몬(GH)의 캡슐화 효율을 측정한 결과, 모든 구간에서 코아세르베이트 내로 잘 포집되었음을 확인하였다(도 6(B) 참조).
D. FGF -코아세르베이트의 물리적 특성
섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor, FGF)으로 코아세르베이트를 제조하여 그 형성여부 및 물리적 특성의 측정 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
LWGA:SA비율 1:1 1:0.8
아세트산 (mM) 2.2 3.3 4.4 2.4
pH 4.84 4.69 4.59 4.79
혼탁도 (450nm) 1.375 1.610 1.740 1.586
제타전위 -34.57 -27.17 -33.93 -27.03
Z-평균 (d.nm) 1822.7 2095.0 1609.3 3512.3
PDI 0.294 0.257 0.254 0.322
표 9에 나타난 바와 같이, bFGF의 경우, LWGA:SA=1:1, 1:0.8에서만 코아세르베이트를 형성하였으며, 코아세르베이트를 형성하는 균질한 구간 4개에서 물리적 특성 및 캡슐화 효율을 측정하였다.
섬유아세포성장인자(FGF)의 캡슐화 효율을 측정한 결과, LWGA:SA=1:1 조건에서 아세트산 농도가 높을수록 코아세르베이트 포집능이 높아짐을 확인하였고, EGF와 유사하게 최대 70~80% 수준으로 포집된 것을 확인하였다(1:1 - 4.4mM)(도 6(C) 참조).
4. 트립신 소화로부터의 EGF의 보호 효능 평가
8개 조건 중 EUC의 캡슐화 효율이 상대적으로 높은 2개 조건(LWGA:SA-1:1, 16.3 mM 아세트산[실시예 1] 및 LWGA:SA-1:0.4, 8.2 mM 아세트산[실시예 2])을 선정하여 코아세르베이트가 EGF를 프로테아제로부터 보호하는지 여부를 확인하였다. 1시간에서 2시간 동안 37 ℃, 100 rpm에서 417 μg/mL 트립신-EDTA로 인큐베이션한 후, 유리-EGF와 EGF-혼합물에서 EGF를 거의 소화시켰다. 그러나, EGF-코아세르베이트 중의 EGF는 2시간까지 보호되었다(도 7 참조).
5. EGF -코아세르베이트로부터의 시험관내 방출
상처가 치유되는 동안에 지속적인 방식으로 국소적 전달을 용이하게 하기 위하여 EGF-코아세르베이트 및 EGF 혼합물을 동결건조시켰다. 동결건조된 시료가 트랜스웰과 접촉하면, 즉시 수화되어 필름이 형성된다(도 12 참조). 도 8에 나타난 바와 같이, EGF-코아세르베이트는 동결건조 EGF-혼합물 및 유리 EGF 용액과 비교하여 동결건조된 EGF-코아세르베이트로부터 서방출을 보였다.
6. 최적화된 EGF -코아세르베이트의 세포 생체활성 촉진
A. 세포 증식 분석
코아세르베이트의 2개 상이한 조건에서 유리-EGF, 제형 대조군(제형 조성이 동일하나, 약물은 포함되어 있지 않음), EGF-혼합물, EGF-코아세르베이트가 HDF의 세포 증식 능력에 미치는 영향을 세포 계수 키트-8 분석에 의해 측정하였다. 10 ng/mL 유리-EGF는 음성 대조군과 비교하여 HDF의 증식에 유의한 영향을 미치지 않았다. 그러나, EGF-혼합물 및 EGF-코아세르베이트는 음성 대조군 및 유리 EGF와 비교하여 HDF의 증식 활성을 유의적으로 증가시켰다(도 9 참조).
B. 세포 이동 분석
유리-EGF, 제형 대조군(제형 조성이 동일하나, 약물은 포함되어 있지 않음), EGF-혼합물, EGF-코아세르베이트(2개 상이한 조건의 코아세르베이트)가 HDA의 세포 이동 능력에 미치는 영향을 스크래치 분석에서 시험관내 상처 봉합을 유도하는 활성으로 측정하였다. 10 ng/mL 유리-EGF는 음성 대조군과 비교하여 HDF에서 유의적인 이동 효과를 나타냈다. 동일한 농도에서, EGF-코아세르베이트는 음성 대조군 및 유리-EGF 및 EGF 혼합물과 비교하여도 HDF의 이동 활성을 유의적으로 증가시켰다(도 10 및 도 11 참조).
7. 최적화된 EGF -코아세르베이트의 상처 치유 촉진
유리-EGF, EGF-혼합물 및 EGF-코아세르세이트가 상처 봉합에 미치는 영향을 당뇨병 유발 마우스 모델을 사용하여 창상 상처에서 조사하였다. 효능 시험을 위하여 선정된 2개 조건 중 LWGA:SA-1:0.4, 8.2 mM 아세트산 EGF-코아세르베이트('최적화된 EGF-코아세르베이트'라 지칭함)가 LWGA:SA-1:1, 16.3 mM 아세트산 EGF-코아세르베이트보다 높은 캡슐화 효율을 나타냈으므로, 생체내 시험용으로 선정하였다. 상처는 정상 및 음성 대조군에 DPBS를 투여하였다. 유리-EGF 군의 경우 1 μg/10 μL EGF-혼합물 및 EGF-코아세르베이트 군의 경우 1 μg EGF/동결건조물질 만큼 투여하였다. 동결건조된 EGF-혼합물과 EGF-코아세르베이트를 상처 부위에 도포하고 5 μL DW로 적시었다(도 12 참조). 시료는 상처 후 0일 및 3일에 2회 처리하였다. 상처 부위는 14일 동안 관찰하였다(n = 5). EGF-코아세르베이트로 처리된 상처의 봉합은 시험 기간 내내 음성 대조군, 유리-EGF, EGF-혼합물에 비해 효과적으로 가속화되었다. 7일 후, EGF-코아세르베이트의 상처는 당뇨병 유발 군이 아닌 정상군과 거의 동일하였다. 정상 및 EGF-코아세르베이트 군은 상처 봉합이 12일 이내로 가속화되었다(도 13 및 도 14 참조).
Ⅲ. 결론
본 발명에서는 천연 고분자를 이용한 EGF-코아세르베이트 시스템이 만성 상처에서 증가된 프로테아제에 의한 단백질 분해로부터 EGF를 보호함으로써 상처 치유 과정을 향상시키는지 여부를 확인하였다. 이를 확인하는 과정에서 젤라틴 A 및 알긴산 나트륨을 기본으로 하는 EGF-코아세르베이트 전달 시스템의 코아세르베이션 조성물 및 반응 조건을 성공적으로 도출하였다. 최적화된 EGF-코아세르베이트에 캡슐화된 EGF는 트립신 소화로부터 보호되었다. 코아세르베이트-기반으로 전달된 EGF는 시험관내 HDF 증식 및 이동 시험뿐만 아니라 생체내 당뇨병 마우스 상처 모델에서도 유리 EGF보다 우수한 활성을 나타내었다. 이러한 결과에 근거하여 DFU와 같은 만성 상처에서 상처 치유 과정을 가속화시키는 잠재적인 EGF 전달 시스템으로 EGF-코아세르베이트를 제안한다.

Claims (14)

  1. 단백질 약물, 젤라틴 A, 알긴산 나트륨 및 산(acid)을 포함하는 코아세르베이트 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 젤라틴 A가 평균 분자량 20 ∼ 25 KDa인 것을 특징으로 하는 코아세르베이트 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 0.2 ∼ 1.2 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 코아세르베이트 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 산(acid)이 아세트산 5.4 ∼ 16.3 mM 농도인 것을 특징으로 하는 코아세르베이트 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 1 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 5.4 ∼ 16.3 mM 농도인 것을 특징으로 하는 코아세르베이트 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 0.8 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 5.4 ∼ 10.9 mM 농도인 것을 특징으로 하는 코아세르베이트 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 0.4 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 5.4 ∼ 8.2 mM 농도인 것을 특징으로 하는 코아세르베이트 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 1 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 16.3 mM 농도인 것을 특징으로 하는 코아세르베이트 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 젤라틴 A : 알긴산 나트륨의 비율이 1 : 0.4 중량비이고, 상기 산(acid)이 아세트산 8.2 mM 농도인 것을 특징으로 하는 코아세르베이트 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 단백질 약물이 표피생장인자(epidermal growth factor, EGF), 성장호르몬(Growth hormon, GH) 및 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor, FGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 단백질 약물인 것을 특징으로 하는 코아세르베이트 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 코아세르베이트 조성물을 포함하는 창상 치료제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 창상이 만성 난치성 창상인 것을 특징으로 하는 창상 치료제.
  13. 제11항에 있어서, 상기 창상이 당뇨병성 궤양인 것을 특징으로 하는 창상 치료제.
  14. 제11항에 있어서, 상기 창상이 당뇨병성 족부궤양인 것을 특징으로 하는 창상 치료제.
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