CN109568601A - 一种蛋白多肽类药物双重微球及其制备方法和胰岛素双重微球 - Google Patents

一种蛋白多肽类药物双重微球及其制备方法和胰岛素双重微球 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种蛋白多肽类药物双重微球及其制备方法，该方法包括：S1、将蛋白多肽类药物与壳聚糖在弱酸性溶剂中进行药物包载，得到纳米粒溶液，依次经膜过滤、减压干燥，得到包载药物的壳聚糖纳米粒；S2、在偶联剂作用下，将所述包载药物的壳聚糖纳米粒与聚乳酸进行接枝反应，得到蛋白多肽类药物双重微球。本发明还提供了一种胰岛素双重微球，由上述方法制备得到。本发明制备的胰岛素双重微球使用更安全、患者更耐受、效果更长效、药效更稳定，且明显减少了突释。

Description

一种蛋白多肽类药物双重微球及其制备方法和胰岛素双重 微球
技术领域
本发明涉及医药制剂技术领域，尤其涉及一种蛋白多肽类药物双重微球及其制备方法和胰岛素双重微球。
背景技术
胰岛素是蛋白质大分子药物，稳定性差，生物利用度低，不易通过口服等途径直接吸收，所以目前注射给药仍然是胰岛素主要的给药途径。然而，胰岛素注射给药途径需要频繁给药，这对于慢性病患者来说，不仅不方便，而且很痛苦，病人的顺应性差。在实际应用的过程中，注射给药还容易出现注射部位硬结、皮下脂肪萎缩等不良反应。另外，有研究称，注射给药这种方式与正常生理状态下体内胰岛素的分泌情况存在着较大的差异。胰岛素经注射给药后直接进入体循环；而在正常的生理状态下，胰岛分泌的胰岛素先进入肛门静脉系统，大部分为肝脏所摄取；胰岛素以口服途径给药最接近正常生理状态下的分泌模式。因此，无论从服用的方便程度上，还是从代谢的模式上看，口服途径都是胰岛素最为理想的给药方式。
但是，胰岛素分子量大，不易透过胃肠粘膜吸收，在胃肠道内容易被酶、酸碱降解等特点，给其口服长效制剂的研究带来极大的困难和挑战。目前，寻找长效缓释的胰岛素新剂型已成为研究热点。
蛋白多肽类药物分子量大，导致其存在稳定性差、生物利用度低、体内生物半衰期短、极易被生物体内的酶分解等缺点，使蛋白类药物在治疗领域也受到了极大的限制。近年来，研究者将脂质体、微球、纳米粒等新型制剂技术广泛应用于多肽和蛋白类药物的研究中。其中，微球是指药物溶解或分散在辅料中形成的微小球状实体，一般粒径在1～250微米。微球的粒径较小，可以富集在胃肠道的派尔集合淋巴结中，并且粒径小也有利于肠上皮细胞的转运吸收。将蛋白多肽类药物包裹在微球中，一方面可以防止胃肠道的酸性环境和消化酶对药物的降解作用，另一方面，可以利用载体材料达到长效释药或者靶向治疗的目的。因此，关于蛋白多肽类药物口入微球给药系统的研究从未间断过。
以往，口服胰岛素微球制剂研究多采用壳聚糖(CS)-聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)双重微球包载胰岛素，但是，多数包封率较低、突释效应明显。包封率、突释率是评价一个微球的较重要的两个指标，较低的包封率不能达到预定的治疗剂量，而较高的突释率则会产生严重的毒副作用。虽然减少突释可采用制备低包封率的微球的方法实现，但是降低包封率却往往不能达到治疗剂量。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种蛋白多肽类药物双重微球及其制备方法和胰岛素双重微球，本发明制备的蛋白多肽类药物双重微球具有较高的包封率，突释效应大大降低，并且效果长效。
本发明提供一种蛋白多肽类药物双重微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、将蛋白多肽类药物与壳聚糖在弱酸性溶剂中进行药物包载，得到纳米粒溶液，依次经膜过滤、减压干燥，得到包载药物的壳聚糖纳米粒；
S2、在偶联剂作用下，将所述包载药物的壳聚糖纳米粒与聚乳酸进行接枝反应，得到蛋白多肽类药物双重微球。
本发明实施例的目的之一是制备一种使用更安全、患者更耐受、效果更长效、药效更稳定且突释明显减少的蛋白多肽类药物制剂，例如胰岛素制剂。
首先，本发明实施例将胰岛素等蛋白多肽类药物与壳聚糖(CS)制备成壳聚糖纳米粒，具有较高的包封率。在本发明的实施例中，所述蛋白多肽类药物的分子量一般在5000Da以上；具体地，所述的药物可为胰岛素这种蛋白质大分子药物，但并不仅限于此。另外，本发明对所述蛋白多肽类药物的形态没有特殊限制，可以为原料药，也可以为微球等制剂形式。
本发明实施例可将蛋白多肽类药物与壳聚糖先后溶于弱酸性溶剂中，进行药物包载。其中，壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，主要来源于虾壳或蟹壳，是一种天然的碱性生物高分子材料，其无毒，具有良好的生物相容性、生物可降解性和生物粘附性。在本发明实施例中，所述壳聚糖主要为脱乙酰度≥85％的材料。
具体地，本发明一些实施例将胰岛素与壳聚糖先后溶于pH为4～6的弱酸性溶剂中，优选搅拌0.5h～12h，可在4-20℃下形成胰岛素纳米球溶液。其中，所述胰岛素与壳聚糖(CS)的质量比可为0.0005-0.1：1。本发明对胰岛素的化学结构等没有特殊限制，可以为动物胰岛素，也可以为胰岛素类似物，例如：所述的胰岛素可为猪胰岛素、牛胰岛素、重组人胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素等胰岛素及其类似物。所述的弱酸性溶剂可为醋酸、盐酸、磷酸等，最好为醋酸。
包载得到纳米球溶液后，本发明实施例采用膜过滤系统对其进行膜过滤，本发明意外发现，这用于纳米粒的富集有着优异的表现。本发明采用膜过滤技术，不仅操作简单，而且不引入有机溶剂等有毒副作用的试剂，不影响或破坏蛋白质的活性，适用于所有蛋白质多肽类药物。所述的膜过滤系统一般包括中空纤维、超滤膜等，往往用于对目的蛋白的纯化。而本发明在制剂过程中应用这种膜过滤技术，不仅对目的微球起到了富集的作用，同时还可减少微球突释的效应。
本发明实施例具体采用5～30KD截留分子量的双重膜过滤，可处理4-8个循环；优选为：先采用5～10KD分子量的膜，用交换液对所述纳米球溶液进行处理，收集回流液；再采用20～30KD分子量的膜对收集的回流液进行处理，收集得到纳米球透过液。其中，所提到的交换液可为蒸馏水、纯化水、双蒸水、注射用水及实验所需要交换的其他缓冲体系。具体地，本发明一些实施例为了将未包载在纳米球中的胰岛素去除，采用5-10KD分子量的膜过滤系统，用交换液对混合物进行处理，弃掉透过液，收集回流液；再利用30KD分子量的膜过滤系统对收集的回流液进行处理，弃掉聚合过多的大分子胰岛素纳米球回流液，收集符合预定要求分子量的纳米球透过液。
本发明实施例采用双重膜过滤系统对纳米粒进行富集后，对收集的透过液进行离心沉淀，弃掉上清液，洗涤，之后减压干燥，得到包载药物的壳聚糖纳米粒粉末，例如胰岛素-壳聚糖(CS)纳米粒固体粉末。本发明利用减压干燥的方式进行干燥处理，有利于控制微球突释。
制备得到壳聚糖纳米固体粉末后，本发明实施例通过偶联剂将聚乳酸(PLLA)接枝到壳聚糖(CS)上，形成双重微球。其中，所述壳聚糖(CS)与聚乳酸(PLLA)的质量比优选为1～5：1。聚乳酸是以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物，也称为聚丙交酯；聚乳酸英文简称为PLA，PLLA是左旋聚乳酸，工业上提到的聚乳酸通常都是左旋聚乳酸。在本发明中，聚乳酸(PLLA)是一种很好的载药微球聚合物材料，较其他包括聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)在内的接枝物具有更高的结晶性和更低生物降解性，但其延展性过低，导致限制了其作为药物载体的广泛应用。而本发明将聚乳酸接枝于所述壳聚糖纳米粒，可使目的微球粒径小且长效。
在本发明中，所述聚乳酸可选择一定分子量(例如5000-10000Da)的改性或未改性的材料。本发明实施例在偶联剂作用下，将所述包载药物的壳聚糖纳米粒粉末与聚乳酸溶液在弱酸性缓冲溶液中进行接枝反应，得到蛋白多肽类药物双重微球。其中，溶解聚乳酸的有机溶剂可选自乙腈、二氯甲烷、丙酮和甲醇中的一种或多种，优选为乙腈。所述偶联剂可选自三聚磷酸钠、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和尤特奇E100中的一种或多种，优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
本发明实施例将此聚乳酸溶液加入到弱酸性缓冲溶液中，使pH为4～6，向该缓冲体系中加入偶联剂，优选低温搅拌(例如4-20℃下搅拌)，最佳搅拌时间为1h～3h。其中，所提到的缓冲溶液可为醋酸盐、磷酸盐、枸橼酸、组氨酸等缓冲溶液，优选醋酸盐缓冲溶液。所述的偶联剂可为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；偶联剂EDC与NHS的质量比优选为1-3：3-1，偶联剂与聚乳酸的体积质量比为1mL：1g-3g。
本发明实施例将上述制备的壳聚糖纳米粒粉末加入到所述搅拌后的聚乳酸和偶联剂混合溶液中，优选在搅拌的条件下接枝反应，一定时间后，得到蛋白多肽类药物双重微球，例如胰岛素双重微球。其中，可搅拌反应24h～72h得到目标产物，所述反应的温度一般为4-20℃。
所述接枝反应后，本发明优选还包括：将反应得到的混合溶液进行固液分离，取固相减压干燥，得到蛋白多肽类药物双重微球粉末。其中，所述固液分离一般为离心沉淀；弃掉上清后，本发明实施例应用减压干燥，得到蛋白多肽类药物双重微球。
本领域干燥处理有冷冻干燥、减压干燥、喷雾干燥等多种方式，现有研究通常选择冷冻干燥的方式，而本发明优选了减压干燥的方式对微球进行干燥处理，得到目的微球。蛋白制品应避免高温，所以现有技术多数选择冷冻干燥的方式，然而本申请研究得出，冷冻干燥增大了微球的突释量，原因可能是冷冻时微球中的水分固化成结晶态的冰，体积增大，使微球内部形成更大的孔道，促进了药物快速释放。
本发明利用减压干燥法干燥对微球进行干燥，这种方法相较于冷冻干燥法的优点是，其没有固化过程，使得微球表面的孔道减小、微球质地紧密，控制药物从微球内部的孔道中释放，对控制微球突释有着非常优异的表现，进一步解决了现有技术研究过程中遇到的“突释”问题。
在本发明的具体实施例中，所述减压干燥的处理时间可为4h～16h，温度范围为4-20℃。本发明实施例再次采用减压干燥，可得到干燥的聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球。本发明实施例这种利用膜过滤系统和减压干燥方法制备的胰岛素载药微球，工艺简单、易操作，包封率较高，突释效应大大降低，并且聚乳酸(PLLA)的接枝使得微球达到了长效的目的，且长效可达100h，长于市售其他胰岛素制剂产品。
本发明提供了一种蛋白多肽类药物双重微球，由上文所述的制备方法制得。本发明制得的蛋白多肽类药物双重微球主要由蛋白多肽类药物、聚乳酸、壳聚糖组成，其由工艺简单的方法制得，具有较高的包封率。在本发明的实施例中，所述蛋白多肽类药物双重微球的包封率可在30％以上。
本发明通过膜过滤和减压干燥等，使制得的蛋白多肽类药物双重微球的突释效应大大降低。所述蛋白多肽类药物双重微球的主要组成的内容如前所述，在此不再一一赘述。所述蛋白多肽类药物双重微球的粒径可为0.1微米～50微米，大小形状均一。
具体地，本发明还提供了一种胰岛素双重微球，由上文所述的制备方法制得，即上文所述的蛋白多肽类药物为胰岛素。
在本发明中，所述胰岛素双重微球可表示为聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球，主要由胰岛素、聚乳酸、壳聚糖组成。其中，所述胰岛素可为猪胰岛素、牛胰岛素、重组人胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素或地特胰岛素等胰岛素及其类似物。所述胰岛素为双重微球所包载的药物，其可为胰岛素原料药，也可以为胰岛素微球等形式。
在本发明的一些实施例中，在突释现象得以控制并且包封率可接受的条件下，所述胰岛素也可采用微球制剂形式进行后续的包载；例如，先将胰岛素原料药与聚乙二醇等药用辅料，制成胰岛素微球，再将该药物微球与壳聚糖制成壳聚糖纳米粒，最后得到聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球。所述壳聚糖一般为脱乙酰度85％以上的材料，而聚乳酸可为一定分子量的改性或未改性的材料。
本发明所述胰岛素双重微球由上文所述的制备方法制得，具体包括：先将胰岛素药物与壳聚糖(CS)制备成壳聚糖纳米粒，采用双重膜过滤系统对该纳米粒进行富集、洗涤后减压干燥，再通过偶联剂将聚乳酸(PLLA)接枝到壳聚糖(CS)上，所形成的双重微球再次采用减压干燥，得到目的微球。本发明实施例这种利用膜过滤系统和减压干燥方法制备胰岛素载药微球，工艺简单易操作，包封率较高，突释效应大大降低。
在本发明的一些实施例中，制备得到的胰岛素双重微球的包封率可为30～60％；粒径为0.1～50微米。并且，所述胰岛素双重微球的大小形状均一，表面具有许多微小并且相通的空隙，这种空隙有利于药物的缓慢释放；可使药物缓释达到100h以上。也就是说，本发明所述胰岛素双重微球这种胰岛素制剂使用更安全、患者更耐受、效果更长效、药效更稳定，且明显减少了突释。
本发明制备得到的胰岛素载药微球主要利用双重膜过滤系统，除去了未包封的游离胰岛素和聚合度较高的载药材料，使得最终得到的微球粒径均一、包封率高，并且大大降低了突释效应。而以往通常采用制备低包封率的微球或者制备温敏/pH敏感等特异性微球来控制突释，这两种方法并不适用于所有蛋白质多肽类药物，并且低包封率不能达到治疗剂量、温敏/pH敏感等特异性微球往往不能达到长效的目的。
本发明操作简单，不引入有机溶剂等有毒副作用的试剂、不影响/破坏蛋白质的活性的特点适用于所有蛋白质多肽类药物。本发明实施例这种包括中空纤维、超滤膜等在内的膜过滤系统用于解决载药微球突释效应的方法，可以得到更广泛的应用。
附图说明
图1为本发明实施例1所得胰岛素双重微球的SEM照片；
图2为本发明实施例6中的血糖水平-时间曲线图；
图3为本发明实施例6中的释药浓度-时间曲线图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的蛋白多肽类药物双重微球及其制备方法和胰岛素双重微球进行具体地描述。
以下实施例中，所涉及的壳聚糖购自Aladdin公司、脱乙酰度≥85％；聚乳酸为医用PLLA，购自Aladdin公司，分子量5000-10000Da；重组人胰岛素原料药、门冬胰岛素原料药、德谷胰岛素原料药均为自制产品。并且，实施例所用的膜过滤系统为MILLIPORE美国密理博。
实施例1
1、将0.01g重组人胰岛素原料药与20.00g壳聚糖(CS)先后溶于150mL pH为5.0的醋酸溶液中，搅拌0.5h；先用5KD分子量的膜过滤系统(MILLIPORE美国密理博)，以注射用水作为交换液对上述混合物处理4个循环，每次弃掉透过液，收集回流液，再用30KD分子量的膜过滤系统对收集的回流液进行处理，收集符合预定要求分子量的纳米球透过液；最后，对收集的透过液进行离心沉淀30min，弃掉上清液，将所得沉淀物倒入平皿中，于4℃条件下进行减压干燥4h，得到胰岛素-壳聚糖(CS)纳米粒固体粉末。
2、将20.00g分子量为10000Da的聚乳酸溶于乙腈中，再将此溶液加入到150mL pH为5.0醋酸盐缓冲溶液中搅拌均匀，向该缓冲体系中加入20mL(按照密度为1.0×103kg/m3计算)质量比为3:1的偶联剂EDC/NHS，于4℃搅拌1h。
3、将步骤1制备的胰岛素-壳聚糖(CS)纳米粒粉末缓慢加入到步骤2搅拌后的溶液中，于4℃条件下搅拌反应24h，得到目标产物。
4、将步骤3得到的混合溶液进行离心沉淀30min，弃掉上清，将所得沉淀物倒入平皿中，于4℃条件下进行减压干燥4h，得到聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球固体粉末。
5、向制备得到的聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球固体粉末中，加入0.1mol/L的盐酸，搅拌使其溶解后过0.22微米的微孔滤膜，采用反相高效液相方法进样20微升，检测样品中胰岛素的含量。结果显示，所得双重微球的包封率为35％。采用纳米激光粒度分析仪检测粒径分布，约80％以上为937nm。采用红外光谱及核磁共振法检测，微球接枝率为85％。
使用扫描电子显微镜对所得胰岛素双重微球进行观察，取适量样品粉末将其固定于导电胶布上进行离子溅射仪喷金，而后置于扫描电子显微镜(SEM)上观察粉体形态并采集图像，结果如图1所示。从图中可见，所述胰岛素双重微球的大小形状均一，表面具有许多微小并且相通的空隙，利于药物缓慢释放。
实施例2
1、将1.00g门冬胰岛素原料药与20.00g壳聚糖(CS)先后溶于150mL pH为5.0的醋酸溶液中，搅拌8h；先用5KD分子量的膜过滤系统，以注射用水作为交换液对上述混合物处理6个循环，每次弃掉透过液，收集回流液，再用30KD分子量的膜过滤系统对收集的回流液进行处理，收集符合预定要求分子量的纳米球透过液；最后，对收集的透过液进行离心沉淀30min，弃掉上清液，将所得沉淀物倒入平皿中，于4℃条件下进行减压干燥10h，得到胰岛素-壳聚糖(CS)纳米粒固体粉末。
2、将10.00g分子量为10000Da的聚乳酸溶于乙腈中，再将此溶液加入到150mL pH为5.0醋酸盐缓冲溶液中搅拌均匀，向该缓冲体系中加入3.4mL(按照密度为1.0×103kg/m3计算)质量比为1:1的偶联剂EDC/NHS，于4℃搅拌3h。
3、将步骤1制备的胰岛素-壳聚糖(CS)纳米粒粉末缓慢加入到步骤2搅拌后的溶液中，于4℃条件下搅拌反应48h，得到目标产物。
4、将步骤3得到的混合溶液进行离心沉淀30min，弃掉上清，将所得沉淀物倒入平皿中，于4℃条件下进行减压干燥10h，得到聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球固体粉末。
5、向制备得到的聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球固体粉末中，加入0.1mol/L的盐酸，搅拌使其溶解后过0.22微米的微孔滤膜，采用反相高效液相方法进样20微升，检测样品中胰岛素的含量。结果显示，所得双重微球的包封率为37％。采用纳米激光粒度分析仪检测粒径分布，约80％以上为571nm。采用红外光谱及核磁共振法检测，微球接枝率为81％。
实施例3
1、德谷胰岛素微球的制备：将1.00g德谷胰岛素原料药溶于0.1mol/L的盐酸中，搅拌至完全溶解，采用高压匀质机对得到的胰岛素溶液进行反复匀质，至纳米激光粒度分析仪测得粒径分布约80％以上为100nm后，冷冻干燥，得到德谷胰岛素微球粉末。
2、将1.00g所述德谷胰岛素微球与20.00g壳聚糖(CS)先后溶于150mL pH为5.0的醋酸溶液中，搅拌12h；先用10KD分子量的膜过滤系统，以注射用水作为交换液对上述混合物处理8个循环，每次弃掉透过液，收集回流液，再用30KD分子量的膜过滤系统对收集的回流液进行处理，收集符合预定要求分子量的纳米球透过液；最后，对收集的透过液进行离心沉淀30min，弃掉上清液，将所得沉淀物倒入平皿中，于20℃条件下进行减压干燥10h，得到胰岛素-壳聚糖(CS)纳米粒固体粉末。
3、将10.00g分子量为5000Da的聚乳酸溶于乙腈中，再将此溶液加入到150mL pH为5.0醋酸盐缓冲溶液中搅拌均匀，向该缓冲体系中加入7mL(按照密度为1.0×103kg/m3计算)质量比为3:1的偶联剂EDC/NHS，于20℃搅拌3h。
4、将步骤2制备的胰岛素-壳聚糖(CS)纳米粒粉末缓慢加入到步骤3搅拌后的溶液中，于20℃条件下搅拌反应72h，得到目标产物。
5、将步骤4得到的混合溶液进行离心沉淀30min，弃掉上清，将所得沉淀物倒入平皿中，于20℃条件下进行减压干燥10h，得到聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球固体粉末。
6、向制备得到的聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球固体粉末中，加入0.1mol/L的盐酸，搅拌使其溶解后过0.22微米的微孔滤膜，采用反相高效液相方法进样20微升，检测样品中胰岛素的含量。结果显示，所得双重微球的包封率为33％。采用纳米激光粒度分析仪检测粒径分布，约80％以上为300nm。采用红外光谱及核磁共振法检测，微球接枝率为85％。
实施例4
1、德谷胰岛素微球的制备：将1.00g德谷胰岛素原料药溶于100mL0.1mol/L的盐酸中，搅拌至完全溶解，再加入0.1g聚乙二醇(PEG4000)，搅拌28h后，采用高压匀质机对得到的溶液进行反复匀质，至纳米激光粒度分析仪测得粒径分布约80％以上为100nm后，冷冻干燥，得到德谷胰岛素微球粉末。
2、将1.00g所述德谷胰岛素微球与20.00g壳聚糖(CS)先后溶于150mL pH为5.0的醋酸溶液中，搅拌12h；先用10KD分子量的膜过滤系统，以注射用水作为交换液对上述混合物处理8个循环，每次弃掉透过液，收集回流液，再用30KD分子量的膜过滤系统对收集的回流液进行处理，收集符合预定要求分子量的纳米球透过液；最后，对收集的透过液进行离心沉淀30min，弃掉上清液，将所得沉淀物倒入平皿中，于20℃条件下进行减压干燥10h，得到胰岛素-壳聚糖(CS)纳米粒固体粉末。
3、将10.00g分子量为10000Da的聚乳酸溶于乙腈中，再将此溶液加入到150mL pH为5.0醋酸盐缓冲溶液中搅拌均匀，向该缓冲体系中加入10ml(按照密度为1.0×103kg/m3计算)质量比为3:1的偶联剂EDC/NHS，于4℃搅拌3h。
4、将步骤2制备的胰岛素-壳聚糖(CS)纳米粒粉末缓慢加入到步骤3搅拌后的溶液中，于10℃条件下搅拌反应72h，得到目标产物。
5、将步骤4得到的混合溶液进行离心沉淀30min，弃掉上清，将所得沉淀物倒入平皿中，于20℃条件下进行减压干燥10h，得到聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球固体粉末。
6、向制备得到的聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球固体粉末中，加入0.1mol/L的盐酸，搅拌使其溶解后过0.22微米的微孔滤膜，采用反相高效液相方法进样20微升，检测样品中胰岛素的含量。结果显示，所得双重微球的包封率为32％。采用纳米激光粒度分析仪检测粒径分布，约80％以上为452nm。采用红外光谱及核磁共振法检测，微球接枝率为85％。
实施例5
1、将1.00g德谷胰岛素原料药与10.00g壳聚糖(CS)先后溶于150mL pH为5.0的醋酸溶液中，搅拌12h；先用10KD分子量的膜过滤系统，以注射用水作为交换液对上述混合物处理8个循环，每次弃掉透过液，收集回流液，再用30KD分子量的膜过滤系统对收集的回流液进行处理，收集符合预定要求分子量的纳米球透过液；最后，对收集的透过液进行离心沉淀30min，弃掉上清液，将所得沉淀物倒入平皿中，于4℃条件下进行减压干燥16h，得到胰岛素-壳聚糖(CS)纳米粒固体粉末。
2、将2.00g分子量为5000Da的聚乳酸溶于乙腈中，再将此溶液加入到150mL pH为5.0醋酸盐缓冲溶液中搅拌均匀，向该缓冲体系中加入2mL(按照密度为1.0×103kg/m3计算)质量比为1:3的偶联剂EDC/NHS，于4℃搅拌3h。
3、将步骤1制备的胰岛素-壳聚糖(CS)纳米粒粉末缓慢加入到步骤2搅拌后的溶液中，于4℃条件下搅拌反应72h，得到目标产物。
4、将步骤3得到的混合溶液进行离心沉淀30min，弃掉上清，将所得沉淀物倒入平皿中，于4℃条件下进行减压干燥16h，得到聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球固体粉末。
5、向制备得到的聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球固体粉末中，加入0.1mol/L的盐酸，搅拌使其溶解后过0.22微米的微孔滤膜，采用反相高效液相方法进样20微升，检测样品中胰岛素的含量。结果显示，所得双重微球的包封率为39％。采用纳米激光粒度分析仪检测粒径分布，约80％以上为121nm。采用红外光谱及核磁共振法检测，微球接枝率为87％。
各实施例的包封率等检测结果汇总于表1：
表1各实施例检测结果汇总表
备注：接枝率采用红外光谱及核磁共振方法检测；包封率采用高效液相色谱法检测，包封率＝(微球中包封的药物/微球中药物总量)×100％。
实施例6
1、购买诺和诺德生产的德谷胰岛素注射液【批号为FP52301】，作为对照品1；
2、按照专利【CN105001425】实施例1报道的壳聚糖-聚乳酸接枝共聚物的制备方法，将壳聚糖乙酸溶液在室温下滴入经偶联剂活化的聚乳酸溶液中反应36小时，反应结束后经冷冻干燥得到载体材料，再将该载体材料与德谷胰岛素盐酸溶液混合均匀，4℃搅拌反应12h得到混悬液，离心得到沉淀，用注射用水反复洗涤4次后经冷冻干燥，得到德谷胰岛素-壳聚糖-聚乳酸载药微球，作为对照品2；
3、实施例3、4、5制备得到的聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球作为供试品；
4、降糖作用实验方法：
参考河北大学药剂学专业赵娜的硕士毕业论文《胰岛素长效植入制剂的制备及评价》中，2.4.2报道的糖尿病大鼠模型制备方法建立大鼠模型；实验前对模型大鼠禁食不禁水12h，随机分3组，每组5只大鼠，分别为对照品1组、对照品2组和供试品组，对照品2和供试品均参考对照品1的用药剂量，3组大鼠均按照大鼠体重折算给药剂量给药，给药后在3、6、9、12、18、24、36、48、72、96h等时间点眼眶取血，采用葡萄糖氧化酶法测定大鼠的血糖值，绘制血糖水平-时间曲线。
5、双重微球突释情况考察：
将实施例3、4、5及对照品1、2制备得到的双重微球溶解在模拟肠液中，分别在0、0.5、1、2、3、6、9、12、18、24、36、48、72、96h等时间点取样，取样后进行同体积补液，利用反相高效液相方法检测微球中释放出的胰岛素的量，绘制释药浓度-时间曲线。
结果如图2、3所示，从图2中可知，相较于对照品1和对照品2来讲，本发明制备得到的聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球的缓释效果明显、降糖平稳、作用持久。
如图3可直接反应制备得到的双重微球突释情况：在0.5-2小时，按照实施例3、4、5所制备的双重微球并无明显突释现象，而对照品2突释明显；在48小时，按照实施例3、4、5方法所制备的双重微球释药浓度仅达到近50％，而对照品1释药浓度已近90％、对照品2释药浓度也已将近70％；在144小时，按照实施例3、4、5方法所制备的双重微球释药几乎达到终点，而对照品2在72小时时就已完成释药。因此，本发明制备得到的聚乳酸(PLLA)-胰岛素-壳聚糖(CS)双重微球，可载药原料药、原料药微球、PEG载药微球，结构稳定、释药持续无明显的突释现象，持续释药时间大于100h，并且粒径均一。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于使本技术领域的专业技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，是能够实现对这些实施例的多种修改的，而这些修改也应视为本发明应该保护的范围。

Claims (10)

1.一种蛋白多肽类药物双重微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、将蛋白多肽类药物与壳聚糖在弱酸性溶剂中进行药物包载，得到纳米粒溶液，依次经膜过滤、减压干燥，得到包载药物的壳聚糖纳米粒；
S2、在偶联剂作用下，将所述包载药物的壳聚糖纳米粒与聚乳酸进行接枝反应，得到蛋白多肽类药物双重微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白多肽类药物的分子量在5000Da以上。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述膜过滤为5～30KD分子量的双重膜过滤。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述膜过滤具体为：先采用5～10KD分子量的膜用交换液对所述纳米粒溶液进行处理，收集回流液；再采用20～30KD分子量的膜对收集的回流液进行处理，收集得到纳米粒透过液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2具体为：在偶联剂作用下，将所述包载药物的壳聚糖纳米粒与聚乳酸溶液在弱酸性缓冲溶液中进行接枝反应，得到蛋白多肽类药物双重微球。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述聚乳酸溶液中的溶剂选自乙腈、二氯甲烷、丙酮和甲醇中的一种或多种。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述接枝反应后还包括：将反应得到的混合溶液进行固液分离，取固相减压干燥，得到蛋白多肽类药物双重微球粉末。
8.一种蛋白多肽类药物双重微球，由权利要求1～7中任一项所述的制备方法制得，所述蛋白多肽类药物双重微球的包封率在30％以上，粒径为0.1～50微米。
9.一种胰岛素双重微球，由权利要求1～7中任一项所述的制备方法制得，所述蛋白多肽类药物为胰岛素，优选胰岛素为猪胰岛素、牛胰岛素、重组人胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素或地特胰岛素。
10.根据权利要求9所述的胰岛素双重微球，其特征在于，所述胰岛素为原料药形式或微球制剂形式。
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