发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供一种胰岛素载药微球及其制备方法,胰岛素载药微球具有良好的pH敏感性,能够实现胰岛素在肠道中的释放与吸收。
为了解决以上技术问题,本发明提供一种胰岛素载药微球,包括载体和由所述载体包覆的胰岛素,所述胰岛素占所述胰岛素载药微球的质量百分数为4~10%,所述载体为具有式I结构的聚酯酰胺材料,
其中,x为式II结构的重复单元与式III结构的重复单元的摩尔比,x为0~0.5,n为聚合度,
优选的,式I结构的聚酯酰胺材料的分子量为10000~150000。
相应的,本发明还提供一种胰岛素载药微球的制备方法,包括以下步骤:
将胰岛素纳米颗粒置于式I结构的聚酯酰胺材料的N,N-二甲基甲酰胺溶液中,形成混合溶液;
将所述混合溶液加入玉米油中,剪切搅拌后形成乳液;
向所述乳液中加入乙醚,萃取后得到胰岛素载药微球,所述胰岛素纳米颗粒占所述胰岛素载药微球的质量百分数为4~10%,
其中,x为式II结构的重复单元与式III结构的重复单元中的摩尔比,x为0~0.5,n为聚合度。
优选的,所述玉米油与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为(5~20)∶1。
优选的,所述玉米油与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10∶1。
优选的,所述乙醚与所述玉米油的体积比为(3~10)∶1。
优选的,所述玉米油含有司班83,所述司班83与玉米油的质量体积比为0.5~3g∶100mL。
优选的,所述式I结构的聚酯酰胺材料按如下方法制备:
将式IV结构的单体、式V结构的单体和式VI结构的单体进行反应,得到式I结构的聚酯酰胺材料,式I结构的聚酯酰胺材料的分子量为10000~150000,式V和式VI结构的单体的摩尔比为1∶(1~20),
其中,TosOH为对甲苯磺酸。
优选的,所述得到式I结构的聚酯酰胺材料的反应具体为:
将式IV结构的单体、式V结构的单体和式VI结构的单体溶解于二甲基乙酰胺,加入三乙胺溶液后进行缩聚反应;
将缩聚反应的产物溶解于二氯乙酸中,加入氢溴酸的醋酸溶液,搅拌反应后沉降,洗涤,得到式I结构的聚酯酰胺材料。
优选的,所述缩聚反应的温度为60~80℃。
本发明提供一种胰岛素载药微球,包括载体和由所述载体包覆的胰岛素,所述胰岛素占所述胰岛素载药微球的质量百分数为4~10%。与现有技术相比,本发明以侧链同时含有羧基和疏水异丁基基团的聚酯酰胺材料为载体,其中羧基赋予该胰岛素载药微球以肠溶性,在胃液的强酸性环境下,由于羧基的去质子化,聚酯酰胺材料不溶解且微球有一定的收缩作用,从而保护蛋白药物;在小肠的中性条件下,羧基电离使得聚酯酰胺材料逐渐溶解,微球溶蚀,从而释放出包裹的药物。另一方面,疏水异丁基具有调控材料的pH敏感性的作用,同时提高了胰岛素载药微球的疏水性,加强与肠细胞膜的作用,提高了胰岛素的生物利用度。因此,该胰岛素载药微球具有良好的pH敏感性,能够实现胰岛素在肠道中的释放与吸收。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明公开了一种胰岛素载药微球,包括载体和由所述载体包覆的胰岛素,所述胰岛素占所述胰岛素载药微球的质量百分数为4~10%,所述载体为具有式I结构的聚酯酰胺材料,
其中,x为式II结构的重复单元与式III结构的重复单元的摩尔比,x为0~0.5,n为聚合度,
按照本发明,所述式I结构的聚酯酰胺材料的分子量优选为10000~150000,更优选为30000~120000。另外,所述胰岛素占所述胰岛素载药微球的质量百分数优选为4~10%,更优选为5~8%。对于所述式II结构的重复单元与式III结构的重复单元中的摩尔比,x优选为0.05~0.5,更优选为0.1~0.4,更优选为0.2~0.3。
本发明以式I结构的聚酯酰胺材料为载体,其侧链同时含有羧基和疏水异丁基基团,其中,羧基赋予该胰岛素载药微球以肠溶性,在胃液的强酸性环境下,由于羧基的去质子化,聚酯酰胺材料不溶解且微球有一定的收缩作用,从而保护蛋白药物;在小肠的中性条件下,羧基电离使得聚酯酰胺材料逐渐溶解,微球溶蚀,从而释放出包裹的药物。另一方面,疏水异丁基具有调控材料的pH敏感性的作用,同时提高了胰岛素载药微球的疏水性,加强与肠细胞膜的作用,提高了胰岛素的生物利用度。
相应的,本发明还提供一种胰岛素载药微球的制备方法,包括以下步骤:
将胰岛素纳米颗粒置于式I结构的聚酯酰胺材料的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,形成混合溶液;
将所述混合溶液加入玉米油中,剪切搅拌后形成乳液;
向所述乳液中加入乙醚,萃取后得到胰岛素载药微球,所述胰岛素纳米颗粒占所述胰岛素载药微球的质量百分数为4~10%,优选为5~10%,更优选为6~8%,
其中,x为式II结构的重复单元与式III结构的重复单元中的摩尔比,x为0~0.5,优选为0.05~0.5,更优选为0.1~0.4,更优选为0.2~0.3,n为聚合度。
本发明采用的胰岛素纳米颗粒可以利用等电点析出方法自行制备。在上述制备过程中,本发明利用油包油包固体的无水乳液方法将纳米胰岛素包载入该材料微球中,其中,以玉米油为连续相,通过高剪切乳化的方法形成乳液。由于玉米油与其他溶剂的相容性良好,从而适合聚酯酰胺材料的制备,得到的微球表面光滑,粒径在3~15微米之间,包封率较高。
本发明选用式I结构的聚酯酰胺材料作为载体材料,生物相容性好,并且具有pH敏感性,易于功能化。所述式I结构的聚酯酰胺材料按如下方法制备:将式IV结构的单体、式V结构的单体和式VI结构的单体进行反应,得到式I结构的聚酯酰胺材料,式I结构的聚酯酰胺材料的分子量为10000~150000,式V和式VI结构的单体的摩尔比为1∶(1~20),优选为1∶(1~15),更优选为1∶(3~15)。控制单体的投料比可控制制备的聚酯酰胺材料的疏水性和侧链所含羧基密度,例如提高式V结构的单体的百分比即可提高材料和所制备出微球的疏水性。
其中,TosOH为对甲苯磺酸。
进一步的,上述得到式I结构的聚酯酰胺材料的反应具体为:步骤a)将式IV结构的单体、式V结构的单体和式VI结构的单体溶解于二甲基乙酰胺,加入三乙胺溶液后进行缩聚反应;步骤b)将缩聚反应的产物溶解于二氯乙酸中,加入氢溴酸的醋酸溶液,搅拌反应后沉降,洗涤,得到式I结构的聚酯酰胺材料。其中,温度是影响缩聚反应能否顺利进行的重要因素,所述缩聚反应的温度优选为60~80℃,更优选为70~80℃,更优选为80℃;缩聚反应的时间优选为10~40h,优选为20~36h,更优选为24~30h。缩聚反应后,还优选包括:利用冰乙酸乙酯沉降,抽干,得到的缩聚反应产物在索氏提取器中用乙酸乙酯抽提,用于彻底除去对硝基苯酚等杂质。另外,上述步骤b)用于将缩聚反应的产物脱去苄基保护基团得到侧链羧基。在步骤b)中,所述搅拌反应的时间优选为3~8h,更优选为4~6h;所述沉降、洗涤具体为:利用过量丙酮将反应物沉降出来,然后用乙醚和丙酮洗涤除去残余的氢溴酸。
本发明中,式I结构的以侧链同时含有羧基和疏水异丁基基团的聚酯酰胺材料为载体,其中羧基赋予该胰岛素载药微球以肠溶性,在胃液的强酸性环境下,由于羧基的去质子化,聚酯酰胺材料不溶解且微球有一定的收缩作用,从而保护蛋白药物;在小肠的中性条件下,羧基电离使得聚酯酰胺材料逐渐溶解,微球溶蚀,从而释放出包裹的药物。另一方面,疏水异丁基具有调控材料的pH敏感性的作用,同时提高了胰岛素载药微球的疏水性,加强与肠细胞膜的作用,提高了胰岛素的生物利用度。因此,上述方法制备的以式I结构的聚酯酰胺材料为载体的胰岛素载药微球具有明显的pH响应性,符合口服制剂肠溶性的要求,且能最大限度保护胰岛素在到达小肠之前不释放。
在胰岛素载药微球的制备过程中,采用的胰岛素纳米颗粒体积小,可以均匀的分散于DMF中并且不影响聚酯酰胺的溶解。优选的,所述玉米油含有司班83,所述司班83与玉米油的质量体积比为0.5~3g∶100mL,更优选为1g∶100mL。其中,玉米油与N,N-二甲基甲酰胺的体积比优选为(5~20)∶1,更优选为(8~15)∶1,更优选为10∶1。由于玉米油和DMF不互溶,高速剪切搅拌后则形成以DMF为内相、玉米油为外相的乳液体系。因此,该方法以玉米油为连续相,通过高剪切乳化的方法形成乳液。同时,由于玉米油与其他溶剂的相容性良好,从而适合聚酯酰胺材料的制备,得到的微球表面光滑,粒径在3~15微米之间,包封率较高。
得到乳液后,向所述乳液中加入另外一种非水性溶剂乙醚,用于将乳液液滴中的DMF扩散出来,使聚合物沉淀从而使微球固化。所述乙醚与所述玉米油的体积比优选为(3~10)∶1,更优选为(3~8)∶1,更优选为(4~6)∶1。
另外,萃取后还优选包括分离、洗涤和干燥等步骤,即将萃取后的悬浮液在室温下离心,弃上清液,依次用乙醇和水洗涤,冷冻干燥,得到胰岛素载药微球。本发明在胰岛素载药微球的制备过程中只使用低残留溶剂如乙醚、乙醇以及低毒性溶剂如DMF和玉米油等,比传统的双乳溶剂挥发法更环保。
综上所述,本发明提供的胰岛素载药微球的制备方法具有以下特点:(1)以式I结构的聚酯酰胺材料作为载体材料,生物相容性好,并且具有pH敏感性,易于功能化;(2)以式I结构的聚酯酰胺材料作为载体,该胰岛素载药微球具有可控的pH响应释放行为,最大限度的减少了胰岛素在到达肠道之前的损失;(3)采用制备载药微球的乳液体系没有水的参与,不存在水-油界面,药物为纳米级颗粒,胰岛素不易流失,包裹利用率高,微球形貌良好。
本发明采用以下方法评价本方法制备的包载胰岛素的pH敏感的聚酯酰胺微球制剂的特性。
(1)为评价本发明的聚酯酰胺微球对口服胰岛素的具有pH依赖性的控制释放效果,将载有胰岛素的微球在37℃的模拟胃液、模拟肠液和pH为3.0,5.0,7.4的缓冲液中测试体外模拟释放实验,并利用NaOH-SDS方法测定微球的载药量和释放液中胰岛素的含量。
(2)为评价本方法的低毒性,以MTT法评价聚酯酰胺材料和其不含有胰岛素的空白微球的体外细胞毒性。
(3)为评价该口服制剂中胰岛素的体内活性,将本发明制备的胰岛素载药微球给药于糖尿病大鼠,并与胰岛素水溶液和空白微球对比。
实验结果表明,该胰岛素载药微球具有可控的pH敏感性的药物释放行为,在pH为1.2,3.0和5.0的缓冲液中均释放出极少量的胰岛素,而在pH为6.8和7.4的缓冲液中则快速且持续的释放出包载的药物。该制剂在糖尿病大鼠口服给药后,能显著降低大鼠的血糖水平,且持续时间达到8个小时。该制剂毒性残留低,细胞相容性好。
为了进一步说明本发明的技术方案,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。
本发明实施例中采用的试剂均为市购。
实施例1
将式IV结构的单体、式V结构的单体和式VI结构的单缩聚后用氢溴酸脱去苄基保护基团,得到侧链含有大量羧基的聚酯酰胺类高分子材料。
具体实验步骤为:
分别将10毫摩尔、0.5毫摩尔和9.5毫摩尔的式IV结构的单体、式V结构的单体和式VI结构的单体置于带磁力搅拌的圆底烧瓶中,加入干燥二甲基乙酰胺(DMA)溶解,升温至80℃后,缓慢滴加入3.2mL干燥三乙胺溶液,缩聚反应24小时后,用冰乙酸乙酯沉降,抽干;
取1克三种单体缩聚而得的初产物充分溶解于10ml二氯乙酸中,加入2ml氢溴酸的33%浓度的醋酸溶液,室温下搅拌反应4个小时,用过量丙酮将反应物沉降出来,然后用乙醚和丙酮反复洗涤除去残余的氢溴酸,真空烘箱中抽干,得到式I结构的聚酯酰胺材料即PEA5,性能参数如表1所示。
实施例2
分别将10毫摩尔、2毫摩尔和8毫摩尔的式IV结构的单体、式V结构的单体和式VI结构的单体置于带磁力搅拌的圆底烧瓶中,加入干燥DMA溶解后,升温至80℃,缓慢滴加入3.2ml干燥三乙胺溶液,反应24小时后,用冰乙酸乙酯沉降,抽干;
取1克三种单体缩聚而得的初产物充分溶解于10ml二氯乙酸中,加入2ml氢溴酸的33%浓度的醋酸溶液,室温下搅拌反应4个小时,用过量丙酮将反应物沉降出来,然后用乙醚和丙酮反复洗涤除去残余的氢溴酸,真空烘箱中抽干,得到式I结构的聚酯酰胺材料即PEA20,性能参数如表1所示。
表1实施例1和实施例2制备的聚酯酰胺材料的性能参数
实施例3
以实施例1制备的PEA5为载体制备载药微球。
将5ml含有胰岛素的聚酯酰胺的DMF溶液(30mg/ml)加入含有0.5g司盘83的玉米油50mL中,高速剪切4000rpm乳化5min制备成以DMF为内相、玉米油为外相乳液体系;
向该体系中加入150ml的无水乙醚使微球固化,将得到的悬浮液在室温下离心,弃清液,依次用乙醇和水洗涤,冷冻干燥,获得胰岛素载药微球,呈球形,直径在3~12μm,如图1所示。从图1可以看出,本发明制备载药微球的乳液体系没有水的参与,不存在水-油界面,胰岛素不易流失,包裹利用率高,微球形貌良好。
实施例4
以实施例2制备的PEA20为载体制备载药微球。
将5ml含有胰岛素的聚酯酰胺的DMF溶液(30mg/ml)加入含有0.5g司盘83的玉米油50mL中,高速剪切3000rpm乳化5min制备成以DMF为内相、玉米油为外相乳液体系;
向该乳液体系中加入150ml的无水乙醚使微球固化,将得到的悬浮液在室温下离心,弃清液,依次用乙醇和水洗涤,冷冻干燥,获得包载胰岛素的聚酯酰胺微球,得到的微球呈球形,直径为3~12μm,如图2所示。从图2可以看出,本发明制备载药微球的乳液体系没有水的参与,不存在水-油界面,胰岛素不易流失,包裹利用率高,微球形貌良好。
用NaOH-SDS方法测定本实施例制备的胰岛素载药微球的载药量。将制备的微球粉末定量的放置于NaOH-SDS溶液中,降解12h后得到透明均一溶液,采用BCA试剂盒测定其中胰岛素浓度,通过计算得到载药量。载药量除以胰岛素投料百分含量得到胰岛素的包封率。本实施例制备的载药微球的固体收率,微球载药量和包封率如表2所示。
表2实施例4制备的胰岛素载药微球的性能参数
实施例5
胰岛素载药微球在模拟胃肠液中的体外释放评价。
分别称取50mg实施例3和实施例4制备的胰岛素载药微球置于离心管中,加入5mL模拟胃液,37℃下恒温振荡,在一定的时间间隔后离心,取0.5mL上清液,同时加入等体积的新鲜缓冲液,继续振荡;上清液用BCA试剂盒测定胰岛素浓度;两个小时后,高速离心15分钟,将全部上清换为等体积(5ml)的模拟肠液,继续振荡6个小时,测定实施例3和实施例4制备的胰岛素载药微球的微球释放行为。图3为实施例3和实施例4制备的胰岛素载药微球的体外释放曲线,可以看出,本发明制备的胰岛素载药微球具有可控的pH响应释放行为,最大限度的减少了胰岛素到达肠道之前的损失。
实施例6
以不同pH值(pH 1.2,3.0,5.0,7.4)的缓冲液作为介质,采用本发明制备的载药微球进行体外模拟释放实验。称量50mg实施例4制备的载药微球于离心管中,加入5ml的缓冲液,置于37度振荡箱中8个小时。
实施例7
对实施例1制备的聚酯酰胺微球进行体外细胞毒性评价。
具体步骤为:上皮细胞L929以12000个/孔的密度种植于96孔板中,培养48小时,在孔内加入不同浓度的微球溶液,同时以PBS和SDS溶液为阴性和阳性对照,培养24小时,加入MTT溶液使MTT的最终浓度为0.5mg/mL,培养4小时,除去培养液加入二甲基亚砜(DMSO),在酶标仪上读取各孔在490nm处的吸光度(Abs)。没有加入浸提液的细胞作为阴性对照,相对细胞存活率通过公式[Abs]样品/[Abs]对照×100计算。
实施例8
利用糖尿病大鼠的体内降糖实验对实施例4制备的胰岛素载药微球的生物活性进行评价。
将雄性糖尿病大鼠随机分组,过夜禁食但不禁水。然后分别口服给予60U/kg体重的胰岛素水溶液,载药聚酯酰胺微球或与其等质量的实施例1制备的聚酯酰胺微球,监测血糖变化。结果显示,给予胰岛素水溶液或者实施例1制备的聚酯酰胺微球的大鼠血糖并未有明显变化,而口服载药聚酯酰胺微球的大鼠血糖在1个小时后出现明显的降低,在4个小时后血糖降到初始值的57.4%,并且降糖现象持续到口服药后8个小时。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。