CN100544765C - 包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备方法 - Google Patents
包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100544765C CN100544765C CNB2007101935904A CN200710193590A CN100544765C CN 100544765 C CN100544765 C CN 100544765C CN B2007101935904 A CNB2007101935904 A CN B2007101935904A CN 200710193590 A CN200710193590 A CN 200710193590A CN 100544765 C CN100544765 C CN 100544765C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- insulin
- glycolide
- dmf
- microspheres
- nano
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 240
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims abstract description 122
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 118
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 118
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 title claims abstract description 91
- 229920000229 biodegradable polyester Polymers 0.000 title claims description 19
- 239000004622 biodegradable polyester Substances 0.000 title claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 38
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 49
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims abstract description 26
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 25
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 104
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 44
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane-2,5-dione Chemical compound O=C1COC(=O)CO1 RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N lactide Chemical compound CC1OC(=O)C(C)OC1=O JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 claims description 17
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 claims description 17
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 17
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 17
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims description 13
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims description 12
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 11
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 11
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 claims description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- CUNWUEBNSZSNRX-RKGWDQTMSA-N (2r,3r,4r,5s)-hexane-1,2,3,4,5,6-hexol;(z)-octadec-9-enoic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O CUNWUEBNSZSNRX-RKGWDQTMSA-N 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 claims description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 7
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 6
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 claims description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 229920000359 diblock copolymer Polymers 0.000 claims description 2
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 claims 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 abstract description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 3
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 abstract description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 208000035126 Facies Diseases 0.000 abstract 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 abstract 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 38
- 229920005689 PLLA-PGA Polymers 0.000 description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 8
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 7
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 5
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010024604 Lipoatrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013267 controlled drug release Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供了一种包裹纳米胰岛素颗粒并可以缓慢释放胰岛素的生物可降解聚脂微球的制备方法。包括以下要点：(1)采用等电点析出法制备无添加剂的纯胰岛素纳米颗粒，并利用液氮冷冻，冷冻干燥的方法得到胰岛素纳米颗粒固体粉末；(2)将步骤1)中制备的胰岛素纳米颗粒均匀的分散于非水性溶剂N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，同时加入聚酯类聚合物使其在DMF中的溶解。将得到的DMF溶液作为分散相，分散于另一种与DMF不互溶的油性液体中，形成无水参与的双有机相乳液体系；(3)向步骤2)得到的乳液体系中加入第三种有机溶剂，使体系分散相液滴中的DMF扩散出来，得到载有胰岛素的聚酯微球。采用本方法可以制备出毒性残留低，胰岛素含量占微球总质量20-100mg/g，具有0-50天胰岛素控制释放能力的微球。
Description
技术领域
本发明属于聚脂微球制备技术领域，具体地涉及包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备方法。
背景技术
近十年来，生物可降解高分子微球在药物控制释放领域得到了广泛的关注。将其用作小分子药物的载体可以达到提高药物利用率，减少毒副作用的效果。用作蛋白质和多肽类药物的载体可以克服蛋白质和多肽类药物半衰期短，载体内易被破坏的缺点。通过药物的缓慢释放，载药的高分子微球可以减少给药次数，提高病人的顺应性。
胰岛素是一种生物活性多肽，是治疗糖尿病，特别是胰岛素依赖型糖尿病患者的首选药。它对酸、热及酶敏感，口服后易被破坏，生物利用度低，甚至失效，因此临床上以针剂形式给药。许多患者需要终身用药，长期频繁注射胰岛素会给病人身心带来相当大的压力和痛苦，并常出现皮肤红肿、痛痒、感染，以及皮下脂肪萎缩或纤维化增生等副作用。鉴于上述情况，研制使用方便、疗效确切、安全可靠的胰岛素缓释体系，是目前国际、国内的研究热点。用生物降解高分子微球作为包裹纳米胰岛素的载体，实现胰岛素的长效释放，是一种很有效并切实可行的方案。
目前制备生物可降解高分子微球的方法有很多种。包括乳液法(Advanced Drug Delivery Reviews 1997，28，85-96)，纳米沉淀法(DrugDevelopment Research 1998，43，98-104)，共凝聚法(Journal ofPharmaceutical Sciences 1998，87，259-268)，喷雾法(European Journalof Pharmaceutical Sciences 2002，16，305-312)等。由于乳液法工艺简单，对不同溶解性的药物均可适用，因此应用最广。乳液法又包括单乳液法和双乳液法。前者适用于油溶性药物，后者适用于水溶性药物，尤其是蛋白质类药物。但是由于双乳液中存在油水界面，容易使蛋白质和多肽类药物失活，并且外水相的存在容易使水溶性药物穿过中间的有机溶剂层溶解于外水相中而流失，导致包裹效率不高。
利用无水乳液体系制备的微球包裹了蛋白质模型药物牛血清白蛋白颗粒，得到了低突释，高包封率的效果(Journal of Pharmaceutical Sciences2005，94，56-69)。但是该方法采用乙腈作为溶剂，毒性较大，并且没有涉及胰岛素纳米颗粒的包裹。“载有胰岛素的生物降解微球及其制备方法”(中国专利公开号CN1562356A)，提供了一种制备胰岛素纳米颗粒的方法，为进一步的包裹提供了基础，但是其中包裹纳米颗粒的方法和本发明不同。
发明内容
为解决上述已有技术的缺点，本发明的目的提供包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备方法。其技术路线是：
(1)采用等电点析出法制备无添加剂的纯胰岛素纳米颗粒，并利用液氮冷冻，冷冻干燥的方法得到胰岛素纳米颗粒固体粉末。
(2)将步骤1)中制备的胰岛素纳米颗粒均匀的分散于非水性溶剂N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，同时加入聚酯类聚合物使其在DMF中的溶解。将得到的DMF溶液作为分散相，分散于与DMF不互溶的油性液体中，形成无水参与的双有机相乳液体系。
(3)向步骤2)得到的乳液体系中加入第三种有机溶剂，使体系分散相液滴中的DMF扩散出来，得到载有胰岛素的聚酯微球。
本发明提供的包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备方法的步骤和条件如下：
1)胰岛素纳米颗粒的制备：在室温将胰岛素原料药以0.5-2mg/mL的浓度溶解在pH值为2.5-2.7的酸性水中，再向其中滴加NaOH水溶液，使溶液的pH值为5.0-5.4，得到胰岛素纳米颗粒的悬浮液；静置上述悬浮液，待胰岛素纳米颗粒沉淀于下层后，回收上层清液，将下层浓缩的胰岛素纳米颗粒悬浮液置于液氮中冷冻，冷冻干燥，得到纯胰岛素纳米颗粒。纳米颗粒的产率为75-80％。
2)制备乳液体系：将步骤1)制备的纯胰岛素纳米颗粒均匀分散于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并向DMF中加入聚乳酸类共聚物，搅拌使加入的聚合物溶解。加入的胰岛素纳米颗粒占胰岛素与聚合物总质量的2-10％，聚合物在DMF中的浓度为10-30mg/mL。将得到的DMF溶液加入含有司班83的玉米油或大豆油中，玉米油或大豆油的体积是DMF的10倍，司班83与玉米油或大豆油的比例为0.5-3g/100mL，在3000-5000rpm高速剪切下乳化3-5分钟，制备成以DMF为内相，玉米油或大豆油为外相的乳液体系。
所述的聚乳酸类共聚物为：第一种为左旋丙交酯和乙交酯的无规共聚物(PLLGA)，其中左旋丙交酯和乙交酯的摩尔比为4∶1的，共聚物分子量在10k-90k范围；或者，左旋丙交酯和乙交酯的摩尔比为1∶1的，共聚物分子量在10k-50k范围；或者，
第二种为外消旋丙交酯和乙交酯的无规共聚物(PDLGA)，其中外消旋丙交酯和乙交酯的摩尔比为4∶1，共聚物分子量在10k-90k范围；或者，
第三种为PLLGA链段再与聚乙二醇(PEG)链段连接形成的二嵌段共聚物聚乙丙交酯和聚乙二醇的嵌段共聚物(PLLGA-PEG)，其中PLLGA为左旋丙交酯和乙交酯的无规共聚物，左旋丙交酯和乙交酯的摩尔比为4∶1，PLLGA段的分子量在10k-90k范围，PEG段的分子量为5k。
3)包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备：向步骤2)制备的乳液体系内加入体积是步骤2)所用的玉米油或大豆油体积的2-4倍的乙醚并搅拌0.5-4小时，使DMF扩散出来，乳液液滴内的聚合物沉淀出来，形成微球，将得到的悬浮液在室温下离心，弃上清液，依次用乙醇和水洗涤，冷冻干燥，获得包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球。
根据药物和聚合物的投料比不同，可以得到不同载药量的聚酯微球。微球的直径在1-10μm；胰岛素在微球中的质量百分含量(载药量)为20-100mg/g，体外释放实验中微球具有0-50天胰岛素控制释放能力。
本发明的有益效果
用本发明的方法将纳米胰岛素包裹于可生物降解的聚酯微球内，可以在生物体内实现胰岛素的缓慢释放，减少给药次数，提高给药效率。本制备技术的特点是：(1)选用聚乳酸类高分子聚合物作为载体材料，生物相容性好，在生物体内不引起排斥反应，载体材料可以生物降解，使用后不会残留在生物体内；(2)制备载药微球采用的乳液体系没有水的参与，减少了胰岛素流失的机会，使胰岛素的包裹利用率高，胰岛素的包封率可达到100％；(3)不存在水-油界面，胰岛素以固体颗粒形式被包裹，降低了胰岛素变性的几率，保留了较高的活性；(4)胰岛素包裹效果好，制备的可生物降解聚酯微球可长期释放胰岛素。本发明所制备的载有纳米胰岛素的高分子微球的胰岛素释放行为有显著改善。如附图2，3所示，由于采用了新的包裹形式，大大减轻了初期的药物暴释现象，药物的缓释周期最长可达到50天。不同高分子材料制备的载药微球释放速度不同，改变高分子材料可以调节载药微球的释放速度。微球的直径在1-10μm，完全满足皮下注射针剂对悬浮物粒径的要求。
为了证明本发明方法的可行性和有益效果，特设计了以下的试验来评价本方法制备的包裹纳米胰岛素的可生物降解聚酯微球的特性：
(1)为评价本发明的方法对胰岛素的包裹效果，将载有纳米胰岛素的微球在37℃的Tris-HCL缓冲液中测试体外模拟释放实验，并利用NaOH-SDS方法测定微球的载药量。具体试验步骤和结果见实施例2。
(2)为评价本方法的低毒性，采用本发明的方法制备不含有胰岛素的空白微球，通过MTT法评价体外细胞毒性，具体试验步骤和结果参见实施例9。
(3)为评价胰岛素的活性保持，采用本发明的方法制备载有纳米胰岛素的微球，利用傅立叶变换红外光谱法测定微球中的胰岛素α螺旋含量，并与胰岛素原料药的α螺旋含量对比。具体试验步骤和结果参见实施例10。
附图说明
图1：胰岛素纳米颗粒在溶剂DMF中分散后的扫描电镜照片。
图2：不同种类聚乳酸材料制备的包裹胰岛素微球的体外释放行为对照。
图3：同一种类不同分子量聚乳酸材料制备的包裹胰岛素微球的体外释放行为对照。
图4：同一种类不同分子量聚乳酸材料制备的空白微球毒性评价结果。
具体实施方式
特别指出：以下实施例中，聚丙交酯(LA)和乙交酯(GA)无规共聚物PLGA，采用左旋丙交酯单体的，记为PLLGA；采用外消旋丙交酯单体的，记为PDLGA；括号内表示丙交酯单体与乙交酯单体的摩尔比，如果带有-PEG则表示含有分子量为5k的聚乙二醇嵌段。例如：PLLGA(4∶1)10k表示采用左旋丙交酯单体，左旋丙交酯单体与乙交酯单体的摩尔比为4∶1，PLLGA分子量为10k；PLLGA(4∶1)-PEG表示PLGA与聚乙二醇的嵌段共聚物，聚乙二醇段分子量为5k，PLGA段采用左旋丙交酯单体，丙交酯与乙交酯的摩尔比为4∶1。
实施例1：
以不同种类的聚乳酸为材料，采用本发明的方法制备载药微球。
1)胰岛素纳米颗粒的制备：称取100mg胰岛素原料药溶解在100mLpH＝2.5的水中，向其中滴入0.1M的NaOH溶液至pH＝5.3；静置上述悬浮液，待胰岛素纳米颗粒沉淀于下层后除去上层清液，将下层浓缩的胰岛素纳米颗粒悬浊液(约10mL)置于液氮中冷冻凝固，冷冻干燥24h，得到胰岛素纳米颗粒固体粉末；
2)制备乳液体系：称取步骤1)得到的40mg胰岛素纳米颗粒和360mg不同种类的PLGA，向其中加入18mL溶剂DMF，搅拌至聚合物溶解；将此DMF溶液加入含有1.8g司班83的玉米油180mL中，3000rpm高速剪切下乳化3min制备成以DMF为内相、玉米油为外相的双有机相乳液体系；所用的PLGA具体为PLLGA(4∶1)40k，PDLGA(4∶1)50k，PLLGA(1∶1)50k，PLLGA(4∶1)50k-PEG。
3)包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备：向步骤2)的体系内加入540mL乙醚并搅拌2小时，乳液液滴内的聚合物沉淀出来，形成微球；将得到的微球悬浮液在室温下离心，弃清液，依次用乙醇和水洗涤，冷冻干燥，获得包裹胰岛素的生物可降解聚酯微球粉末。
用酸性水溶液溶解胰岛素纳米颗粒后通过BCA试剂盒测得胰岛素纳米颗粒相对于胰岛素原料药的产率为80％。
用NaOH-SDS方法测定微球的载量。将制备的微球定量的放置于NaOH-SDS溶液中，降解12h后得到透明均一溶液，采用BCA试剂盒测定其中胰岛素浓度，通过计算得到载药量。载药量除以胰岛素投料百分含量得到胰岛素的包封率。以各不同聚合物为材料的微球载药量和包封率结果如表1。
表1：
实施例2：
不同种类聚乳酸材料制备的包裹胰岛素微球的体外释放评价。
称取100mg实施例1所制备的载胰岛素微球，置于离心管中，加入10mLTris-HCl缓冲液，37℃下恒温振荡，在一定的时间间隔后离心，取2mL上清液待测，同时加入等体积的新鲜缓冲液，继续振荡。上清液用BCA试剂盒测定胰岛素浓度。测定出的微球释放行为见图1。
实施例3：
以PLLGA(1∶1)30k为材料，采用本发明的方法制备载药微球。
1)胰岛素纳米颗粒的制备：称取100mg胰岛素原料药溶解在200mLpH＝2.7的水中，向其中滴入0.1M的NaOH溶液至pH＝5.4；静置上述悬浮液，待胰岛素纳米颗粒沉淀于下层后除去上层清液，将下层浓缩的胰岛素纳米颗粒悬浊液置于液氮中冷冻凝固，冷冻干燥24h，得到胰岛素纳米颗粒；
2)制备乳液体系：分别称取步骤1)得到的7.4，18.9，40mg胰岛素纳米颗粒和360mg PDLGA(4∶1)10k，向其中加入12mL溶剂DMF，搅拌至聚合物溶解；将此DMF溶液加入含有1.2g司班83的玉米油120mL中，在3000rpm高速剪切下乳化5min制备成以DMF为内相、玉米油为外相的双有机相乳液体系；
3)包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备：向步骤2)的体系内加入480mL乙醚并搅拌4小时，乳液液滴内的聚合物沉淀出来，形成微球；将得到的微球悬浮液在室温下离心，弃清液，依次用乙醇和水洗涤，冷冻干燥，获得包裹胰岛素的生物可降解聚酯微球。
用酸性水溶液溶解胰岛素纳米颗粒后通过BCA试剂盒测得胰岛素纳米颗粒相对于胰岛素原料药的产率为75％。
采用实施例1中的方法测定微球载药量。得到的载药微球性质如表2。
表2：
实施例4：
以不同分子量的PLLGA(4∶1)高分子为材料，采用本发明的方法制备载药微球。
1)胰岛素纳米颗粒的制备：称取200mg胰岛素原料药溶解在100mLpH＝2.6的水中，向其中滴入0.1M的NaOH溶液至pH＝5.0；静置上述悬浮液，待胰岛素纳米颗粒沉淀于下层后除去上层清液，将下层浓缩的胰岛素纳米颗粒悬浊液置于液氮中冷冻凝固，冷冻干燥24h，得到胰岛素纳米颗粒；称取40mg胰岛素纳米颗粒和360mg分子量分别为10k，25k，90k的PLLGA(4∶1)，向其中加入36mL溶剂DMF，搅拌至聚合物溶解；
2)制备乳液体系：分别称取步骤1)得到的40mg胰岛素纳米颗粒和360mg分子量分别为10k，25k，90k的PLLGA(4∶1)，向其中加入36mL溶剂DMF，搅拌至聚合物溶解；将此DMF溶液加入含有3.6g司班83的玉米油360mL中，在3000rpm高速剪切下乳化4min制备成以DMF为内相、玉米油为外相的双有机相乳液体系；
3)包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备：向步骤2)的体系内加入720mL乙醚并搅拌0.5小时，乳液液滴内的聚合物沉淀出来，形成微球；将得到的微球悬浮液在室温下离心，弃清液，依次用乙醇和水洗涤，冷冻干燥，获得包裹胰岛素的生物可降解聚酯微球。
用酸性水溶液溶解胰岛素纳米颗粒后通过BCA试剂盒测得胰岛素纳米颗粒相对于胰岛素原料药的产率为79％。
得到的微球呈球形，直径在1-10μm，采用实施例1中的方法测定微球载药量，结果如表3。对得到的载胰岛素微球进行体外释放评价，具体实施步骤同实施例2，测定出的微球释放行为见图2。
表3：
实施例5：
以不同的乳化速度，采用本发明的方法制备载药微球。在步骤2)中向DMF中加入聚合物PLLGA(4∶1)10k作为材料，并分别采用3000rpm、4000rpm、5000rpm的速度乳化，其余步骤同实施例1。得到的载药微球性质如表4。
表4：
实施例6：
采用大豆油作为乳液体系的外相，采用本发明的方法制备载药微球。在步骤2)中向DMF中加入分子量分别为10k，50k，90k的聚合物PDLGA(4∶1)为材料，并以大豆油作为乳液体系的外相，其余步骤同实施例1。得到的载药微球性质如表5。
表5：
实施例7：
采用不同量的司班83作为乳化剂，采用本发明的方法制备载药微球。在步骤2中向DMF中加入PLLGA(1∶1)10k为材料，向玉米油中分别加入0.9，2.7，5.4g司班83，其余步骤同实施例1。得到的载药微球性质如表6。
表6：
实施例8：
以不同分子量的PLLGA(4∶1)-PEG为材料，采用本发明的方法制备载药微球。在步骤2中向DMF中加入分子量分别为10k，30k，90k的PLLGA(4∶1)-PEG为材料，其余步骤同实施例1。得到的载药微球性质如表7。
表7：
实施例9：
采用本发明的方法制备不载药的空白聚脂微球，体外细胞毒性评价。
分别以PLLGA(4∶1)10k，25k，90k为材料，在步骤1中不加入胰岛素，其余步骤同实施例1，得到不含有胰岛素的空白微球。对上述微球做体外细胞毒性评价，具体步骤为：上皮细胞Vero以10000个/孔的密度种植于96孔板中，培养48小时，在孔内加入不同浓度的微球浸提液，培养24小时，加入MTT溶液使MTT的最终浓度为0.5mg/mL，培养4小时，除去培养液加入DMSO，在酶标仪上读取各孔在490nm处的吸光度(Abs)。没有加入浸提液的细胞作为阴性对照，相对细胞存活率通过公式
存活率(％)＝[Abs]样品/[Abs]对照×100
计算。测定出的各空白微球毒性评价结果见图3。
实施例10：
采用本发明的方法制备载有胰岛素的微球，利用傅立叶变换红外光谱法对微球中的胰岛素活性进行评价。
在步骤1中以不同种类的聚乳酸类高分子为材料，其余步骤同实施例1，制备出载有胰岛素的聚脂类微球。采用高斯拟合对微球的红外光谱的中的酰胺I带分峰拟合，对拟合的峰确定归属后判定微球中胰岛素的二级结构。以α螺旋的含量为判定胰岛素二级结构保持率的标准。测出的胰岛素原料和包裹于微球内的胰岛素α螺旋含量见表7。
表7
Claims (1)
1.包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备方法，其特征在于步骤和条件如下：
1)胰岛素纳米颗粒的制备：在室温将胰岛素原料药以0.5-2mg/mL的浓度溶解在pH值为2.5-2.7的酸性水中，再向其中滴加NaOH水溶液，使溶液的pH值为5.0-5.4，得到胰岛素纳米颗粒的悬浮液；静置上述悬浮液，待胰岛素纳米颗粒沉淀于下层后，回收上层清液，将下层浓缩的胰岛素纳米颗粒悬浮液置于液氮中冷冻，冷冻干燥，得到纯胰岛素纳米颗粒；
2)制备乳液体系：将步骤1)制备的纯胰岛素纳米颗粒均匀分散于N，N-二甲基甲酰胺中，并向N，N-二甲基甲酰胺中加入聚乳酸类共聚物，搅拌使加入的聚合物溶解，加入的胰岛素纳米颗粒占胰岛素与聚合物总质量的2-10％，聚合物在N，N-二甲基甲酰胺中的浓度为10-30mg/mL，将得到的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入含有司班83的玉米油或大豆油中，玉米油或大豆油的体积是N，N-二甲基甲酰胺的10倍，司班83与玉米油或大豆油的比例为0.5-3g/100mL，在3000-5000rpm高速剪切下乳化3-5分钟，制备成以N，N-二甲基甲酰胺为内相，玉米油或大豆油为外相的乳液体系；
所述的聚乳酸类共聚物为：第一种为左旋丙交酯和乙交酯的无规共聚物，其中左旋丙交酯和乙交酯的摩尔比为4∶1的，共聚物分子量在10k-90k范围；或者，左旋丙交酯和乙交酯的摩尔比为1∶1的，共聚物分子量在10k-50k范围；或者，
第二种为外消旋丙交酯和乙交酯的无规共聚物，其中外消旋丙交酯和乙交酯的摩尔比为4∶1，共聚物分子量在10k-90k范围；或者，
第三种为左旋丙交酯和乙交酯的无规共聚物链段再与聚乙二醇链段连接形成的二嵌段共聚物聚乙丙交酯和聚乙二醇的嵌段共聚物，其中，左旋丙交酯和乙交酯的摩尔比为4∶1，左旋丙交酯和乙交酯的无规共聚物段的分子量在10k-90k范围，聚乙二醇段的分子量为5k；
3)包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备：向步骤2)制备的乳液体系内加入体积是步骤2)所用的玉米油或大豆油体积的2-4倍的乙醚并搅拌0.5-4小时，使N，N-二甲基甲酰胺扩散出来，乳液液滴内的聚合物沉淀出来，形成微球，将得到的悬浮液在室温下离心，弃上清液，依次用乙醇和水洗涤，冷冻干燥，获得包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2007101935904A CN100544765C (zh) | 2007-12-20 | 2007-12-20 | 包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2007101935904A CN100544765C (zh) | 2007-12-20 | 2007-12-20 | 包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101199482A CN101199482A (zh) | 2008-06-18 |
| CN100544765C true CN100544765C (zh) | 2009-09-30 |
Family
ID=39514966
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2007101935904A Expired - Fee Related CN100544765C (zh) | 2007-12-20 | 2007-12-20 | 包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100544765C (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0909154D0 (en) | 2008-09-25 | 2009-07-08 | Nanomaterials Tech Pte Ltd | A process for making particles for delivery of drug nanoparticles |
| CN101704992B (zh) * | 2009-10-29 | 2012-08-22 | 无锡中科光远生物材料有限公司 | 可生物降解及吸收的单分散聚酯微球及其制法 |
| CN102397535B (zh) * | 2010-09-15 | 2013-08-28 | 中国科学院生物物理研究所 | 胰岛素结晶微球、其混悬剂、以及制备方法 |
| CN102614498B (zh) * | 2011-01-28 | 2014-12-17 | 四川科伦药物研究有限公司 | 一种胰岛素纳米粒及其制备方法 |
| CN102397258B (zh) * | 2011-11-18 | 2013-04-10 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 胰岛素载药微球及其制备方法 |
| CN102688198B (zh) * | 2012-06-19 | 2015-04-15 | 广州帝奇医药技术有限公司 | 多肽药物缓释微球制剂及其制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1437933A (zh) * | 2003-03-28 | 2003-08-27 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 可生物降解性高分子材料包裹利福平微球的制备方法 |
| CN1562356A (zh) * | 2004-03-19 | 2005-01-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 载有胰岛素的生物降解高分子微球及其制备方法 |
| CN1593649A (zh) * | 2004-07-13 | 2005-03-16 | 于晓玲 | 一种胰岛素口服制剂的制备方法 |
| CN1686086A (zh) * | 2005-04-07 | 2005-10-26 | 上海大学 | 生物可降解聚酯氟尿嘧啶微球及其制备方法 |
| WO2006088473A2 (en) * | 2004-04-23 | 2006-08-24 | Panduranga Rao Koritala | Microcapsules and nanocapsules for the transmucosal delivery of therapeutic and diagnostic agents |
| WO2007025441A1 (en) * | 2005-08-29 | 2007-03-08 | Tuo Jin | Polysaccharide microparticles containing biological agents: there preparation and applications |
-
2007
- 2007-12-20 CN CNB2007101935904A patent/CN100544765C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1437933A (zh) * | 2003-03-28 | 2003-08-27 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 可生物降解性高分子材料包裹利福平微球的制备方法 |
| CN1562356A (zh) * | 2004-03-19 | 2005-01-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 载有胰岛素的生物降解高分子微球及其制备方法 |
| WO2006088473A2 (en) * | 2004-04-23 | 2006-08-24 | Panduranga Rao Koritala | Microcapsules and nanocapsules for the transmucosal delivery of therapeutic and diagnostic agents |
| CN1593649A (zh) * | 2004-07-13 | 2005-03-16 | 于晓玲 | 一种胰岛素口服制剂的制备方法 |
| CN1686086A (zh) * | 2005-04-07 | 2005-10-26 | 上海大学 | 生物可降解聚酯氟尿嘧啶微球及其制备方法 |
| WO2007025441A1 (en) * | 2005-08-29 | 2007-03-08 | Tuo Jin | Polysaccharide microparticles containing biological agents: there preparation and applications |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 载有胰岛素的可生物降解微球的制备与表征. 张雪飞.高等学校化学学报，第26卷第3期. 2005 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101199482A (zh) | 2008-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ribeiro et al. | Microencapsulation of lipophilic drugs in chitosan-coated alginate microspheres | |
| Wang et al. | Microencapsulation using natural polysaccharides for drug delivery and cell implantation | |
| CN100544765C (zh) | 包裹纳米胰岛素的生物可降解聚酯微球制备方法 | |
| CN101926775B (zh) | 包载硫酸长春新碱的双功能纳米粒制剂的制备和应用方法 | |
| US20190091147A1 (en) | Preparation Method for Charge Reversaland Reversibly Crosslinked Redox-Sensitive Nanomicelles | |
| CN105617362B (zh) | 一种新型的胰岛素－磷脂－壳聚糖自组装微粒载体及其制剂 | |
| CN110302175B (zh) | 一种含疏水空腔硫辛酸纳米胶囊及其制备方法和应用 | |
| CN110623918A (zh) | 羧甲基壳聚糖/海藻酸钠纳米水凝胶及其制备方法和应用 | |
| Alcalá-Alcalá et al. | A biodegradable polymeric system for peptide–protein delivery assembled with porous microspheres and nanoparticles, using an adsorption/infiltration process | |
| CN102100663B (zh) | 一种pH敏感型原位凝胶纳米缓释眼药水的制备方法 | |
| CN103585113B (zh) | 一种芹菜素聚乳酸缓释微球及其制备方法 | |
| CN1771912B (zh) | 用于口服给药的蛋白多肽类复合物纳米粒及其制法 | |
| CN114917362A (zh) | 一种脂质纳米粒及其制备方法及用途 | |
| Baviskar et al. | Development and evaluation of N-acetyl glucosamine-decorated vitamin-E-based micelles incorporating resveratrol for cancer therapy | |
| CN1935127A (zh) | 一种以改性聚乳酸材料为囊材的微球制备方法 | |
| Wu et al. | Practically feasible production of sustained-release microspheres of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rhGM-CSF) | |
| CN101658495B (zh) | 一种氢溴酸高乌甲素固体脂质纳米粒及其制备方法 | |
| CN102010513A (zh) | 一种稳定的多糖修饰明胶纳米粒子及其制备方法和应用 | |
| Han et al. | Synthesis and evaluation of hydroxycamptothecin-encapsulated chitosan nanospheres for the treatment of liver cancer | |
| CN114948880B (zh) | 一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法 | |
| Paul et al. | Fatty acid conjugated calcium phosphate nanoparticles for protein delivery | |
| CN101040847B (zh) | 一种采用氢化蓖麻油生产的纳米药物制剂及其制备工艺 | |
| CN111671917B (zh) | 一种石蒜碱纳米粒、其制备方法及应用 | |
| Mali et al. | Formulation and optimization of Paliperidone palmitate biodegradable injectable microspheres using Box-Behnken design | |
| CN106560176B (zh) | 一种载灯盏花素纳米结晶的长效缓释微粒及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: CHANGZHOU INSTITUTE OF ENERGY STORAGE MATERIALS + Free format text: FORMER OWNER: CHANGCHUN INST. OF APPLIED CHEMISTRY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES Effective date: 20140930 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 130022 CHANGCHUN, JILIN PROVINCE TO: 213000 CHANGZHOU, JIANGSU PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20140930 Address after: Changzhou City, Jiangsu province Hehai road 213000 No. 9 Patentee after: Changzhou Institute of Energy Storage Materials & Devices Address before: 130022 Changchun people's street, Jilin, No. 5625 Patentee before: Changchun Institue of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090930 Termination date: 20191220 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |