CN114948880B - 一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法，属于食品与医药领域，具体方案包括以下步骤：步骤一、将咖啡酸苯乙酯和积雪草酸共同溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，得到溶液A；步骤二、将溶液A加入到聚乙烯醇水溶液Ⅰ中，超声处理，形成乳液B；步骤三、将乳液B逐滴加入聚乙烯醇水溶液Ⅱ中，并于室温下搅拌得到悬液C；步骤四、将悬液C离心分离，洗涤沉淀物，得到咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型。本发明制备的咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型呈球状，具有水溶性好、稳定性强、在模拟胃肠消化环境中能够缓释、体外抗癌活性强等优点，可以有效地解决脂溶性天然小分子咖啡酸苯乙酯在食品与医药领域中水溶性差和生物利用度低等问题。

Description

一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法
技术领域
本发明属于食品与医药领域，具体涉及一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法。
背景技术
咖啡酸苯乙酯(CAPE)是一种从蜂胶中提取的天然多酚类化合物，由于其毒性低和生物活性高等优点，被广泛应用于食品和生物行业。CAPE具有广泛的药理活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗菌等，但其作为脂溶性多酚化合物的代表，水溶性较差，生物利用度低，在生物体内容易被降解。以上缺点使这类脂溶性活性物质难以在体内充分发挥生物活性，阻碍了其实际应用的进程。为解决疏水性小分子水溶性差、生物利用度低等问题，现有研究主要将目光聚焦于化学改性、脂质体包裹等方向。虽然这些方法在一定程度上解决了小分子的水溶性问题，但是化学改性副作用较大，安全性不足；脂质体装载率较低，其重量远远大于芯材，在生物体内降解和代谢过程中可能会给身体带来额外的负担。
天然小分子是指从天然产物中提取的分子量较小的活性化合物，具有生物安全性好、稳定性强、毒性低等优点。其中天然萜类化合物（如齐墩果酸、熊果酸、松香酸、积雪草酸等）独特的多羟基结构使其可以通过自组装或共组装（依靠分子间氢键或疏水作用力）形成不同形状和大小的纳米颗粒，可用于递送疏水性化合物。由于这些反应不涉及化学键的改变，因此无预期之外的副产物产生。并且相比于脂质体、蛋白质等递送体系，天然小分子自组装或共组装体系还具有装载率高、安全性好等优点。积雪草酸(ASA)是从天然草药积雪草中提取的五环三萜化合物，具有抗炎、抗肿瘤、创面愈合等药理活性，并且对神经和肝脏细胞具有保护作用。积雪草酸特殊的多羟基结构使其可以通过自组装或与其他小分子共组装的方式形成外部亲水，内部疏水的纳米结构，进而提升它们的水溶性和生物利用度。
因此，为了有效地改善CAPE的水溶性、稳定性和生物利用度，通过绿色制备技术，依靠小分子间的非共价键作用制备一种亲水性的CAPE纳米稳定剂型是非常有吸引力的。然而，迄今为止，还未有相关报道涉及CAPE通过小分子共组装形成纳米稳定剂型以改善其体内生物活性，因此这方面的研究具有重要意义。
发明内容
本发明为了解决CAPE体内稳定性差、生物利用度低及现有药物运载体系的不足的问题，提供一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型(ASA-CAPE NPs)的制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将咖啡酸苯乙酯和积雪草酸共同溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，得到溶液A，其中，所述积雪草酸和咖啡酸苯乙酯的质量比为1:0.1-1:0.5，所述积雪草酸与二氯甲烷和甲醇的混合溶剂的质量体积比为5 mg/ml，二氯甲烷与甲醇的体积比为9:1；
步骤二、将溶液A加入到聚乙烯醇水溶液Ⅰ中，搅拌均匀，使用超声细胞破碎仪超声处理，形成乳液B，聚乙烯醇水溶液Ⅰ的浓度为0.025 g/ml，其中溶液A与聚乙烯醇水溶液Ⅰ的体积比为1:3；
步骤三、将乳液B逐滴加入聚乙烯醇水溶液Ⅱ中，并于室温下搅拌得到悬液C，其中，聚乙烯醇水溶液Ⅱ的浓度为0.003 g/ml，乳液B与聚乙烯醇水溶液Ⅱ的体积比为2:15；
步骤四、将悬液C离心分离，洗涤沉淀物，得到咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型。
进一步的，步骤一中，所述积雪草酸和咖啡酸苯乙酯的质量比为1:0.45。
进一步的，步骤二中，超声细胞破碎仪的功率为40 W，在超声的过程中，开5 s，关5s，依次交替进行共处理1 min。
进一步的，步骤二中，通过涡旋1 min使溶液A与聚乙烯醇水溶液Ⅰ充分混合。
进一步的，步骤三中，400 rmp搅拌16 h，将乳液B与聚乙烯醇水溶液Ⅱ混合均匀。
进一步的，步骤四中，离心的转速为12000 rmp，时间为30 min，温度为4 ℃。
进一步的，步骤四中，使用蒸馏水洗涤沉淀物若干次。
相比于现有技术，本发明具有如下优点：
有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优势：
1、本发明制备的CAPE纳米稳定缓释剂型ASA-CAPE NPs主要依靠小分子间的氢键作用力和疏水作用力等非共价作用力，不涉及化学改键。
2、本发明制备的CAPE纳米稳定缓释剂型ASA-CAPE NPs呈圆球状，粒径小于300nm，且在模拟胃肠消化过程中可以缓释，降低CAPE在胃肠环境中的降解。同时该CAPE纳米稳定缓释剂型ASA-CAPE NPs具有水溶性好、热稳定性和贮藏稳定性强的优点，满足食品与医药领域一般产品的加工与储备要求。
3、本发明制备的CAPE纳米稳定缓释剂型ASA-CAPE NPs相比于一般的多糖、蛋白质等药物传递体系，具有装载率高的优点。
附图说明
图1为ASA-CAPE NPs的制备过程示意图；
图2为不同CAPE添加量对ASA-CAPE NPs的粒径、PDI、包封率和装载率的影响结果图；
图3为ASA、CAPE及ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE的质量比为1:0.45）的微观形貌图，放大倍数：2000倍，其中（a）为ASA的形貌图，（b）为CAPE的形貌图，（c）为ASA-CAPE NPs的形貌图；
图4为ASA、CAPE与ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE的质量比为1:0.45）的傅里叶红外转换光谱(FT-IR)图谱；
图5为ASA、CAPE及ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE的质量比为1:0.45）与水溶液的接触角示意图；
图6为ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE的质量比为1:0.45）的热稳定性及储藏稳定性结果图；
图7为ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE的质量比为1:0.45）在模拟胃肠消化过程中CAPE的缓释结果图；
图8为ASA、CAPE及ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE的质量比为1:0.45）对小鼠肝癌Hepatoma-22（H22）细胞的增殖抑制效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
具体实施方式一
本发明提供一种天然小分子CAPE与ASA共组装的纳米稳定缓释剂型ASA-CAPENPs的制备方法，用以解决CAPE水溶性差、生物利用度低、降解快的问题，该方法制备的纳米稳定缓释剂型主要通过CAPE与ASA分子间氢键及疏水作用力结合，依靠非共价键共组装而成。该方法制备的CAPE纳米稳定缓释剂型具有水溶性好、稳定性强、在模拟胃肠消化环境中能够缓释、体外抗癌活性强等优点，可以有效地解决脂溶性天然小分子CAPE在食品与医药领域中水溶性差和生物利用度低等问题。
具体方案如下：
一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将咖啡酸苯乙酯和积雪草酸共同溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，涡旋使其充分溶解得到溶液A，其中，所述积雪草酸和咖啡酸苯乙酯的质量比为1:0.1-1:0.5，所述积雪草酸与二氯甲烷和甲醇的混合溶剂的质量体积比为5 mg/ml，二氯甲烷与甲醇的体积比为9:1；
步骤二、将溶液A加入到聚乙烯醇水溶液Ⅰ中，涡旋1 min，使用超声细胞破碎仪超声处理1 min，形成乳液B，其中，聚乙烯醇水溶液Ⅰ的浓度为0.025 g/ml，其中溶液A与聚乙烯醇水溶液Ⅰ的体积比为1:3；
步骤三、将乳液B逐滴加入聚乙烯醇水溶液Ⅱ中，并于室温下400 rmp搅拌16 h得到悬液C，其中，聚乙烯醇水溶液Ⅱ的浓度为0.003 g/ml，乳液B与聚乙烯醇水溶液Ⅱ的体积比为2:15；
步骤四、将悬液C 在12000 rmp、4 ℃的条件下离心分离30 min，蒸馏水洗涤沉淀物若干次，得到咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型ASA-CAPENPs。
优选的，步骤一中，所述积雪草酸和咖啡酸苯乙酯的质量比为1:0.45，在该添加比例条件下所制备的ASA-CAPE NPs具有水溶性好、稳定性强、胃肠缓释的优点并且表现出更强的H22细胞增殖抑制活性。
进一步的，步骤二中，超声细胞破碎仪的功率为40W，在超声的过程中，开5 s，关5s，依次交替进行。
CAPE纳米稳定缓释剂型ASA-CAPE NPs在最优添加比例条件下制备的纳米颗粒可以在胃肠模拟环境中缓慢释放，可以有效提升CAPE的胃肠消化稳定性和口服利用度。
实施例1
一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、 取ASA 5 mg和一定质量的CAPE共同溶于1.0 mL二氯甲烷和甲醇(V/V=9/1)的混合溶液中，涡旋使其充分溶解，得到溶液A；
步骤二、将1 mL溶液A加入到3 mL 0.025 g/ml的聚乙烯醇水溶液Ⅰ中，涡旋1 min，随后使用超声细胞破碎仪超声处理1 min（5 s开，5 s关，交替进行，功率40 W），形成乳液B；
步骤三、将乳液B逐滴加入30 mL 0.003 g/ml的聚乙烯醇水溶液Ⅱ中，并于室温下，400 rmp搅拌16 h，得到悬液C；
步骤四、将悬液C在12000 rmp、4 ℃条件下离心30 min，沉淀物用蒸馏水洗涤三次，得到咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型ASA-CAPENPs，可将洗涤后的ASA-CAPE NPs悬浮于少量去离子水中，冷冻干燥后保存，用于后续检测。
按照上述方法，分别在步骤一中加入0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25 mg的CAPE，其他步骤均相同。以制备CAPE与ASA的比例为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％的纳米稳定缓释剂型。
1.1粒径、PDI、包封率和装载率
1.1.1 Z-average Size及PDI检测方法：
取ASA-CAPE NPs悬液适量加入去离子水稀释，涡旋1 min，使用超声清洗仪超声处理15 min使粒子分散均匀。随后用0.8 μm滤器进行过滤，除去杂质及细菌。
预处理之后的纳米颗粒溶液加入检测皿中，用Zetasizer Nano仪器进行粒度分析，检测其Z-average size及PDI。
1.1.2包封率及装载率检测方法：
取不同CAPE添加量制备的ASA-CAPE NPs冻干粉1 mg，溶于1 mL二甲基亚砜溶液中，破坏其粒子结构。随后用0.2 μm的滤器进行过滤，去除未被破坏的粒子。取适量过滤后的溶液通过高效液相色谱检测纳米颗粒ASA-CAPE NPs中CAPE的含量。取实施例1步骤四中离心后的上清液，按同样的色谱条件检测上清液中未被包封的CAPE含量。根据下列公式计算不同CAPE添加量制备的ASA-CAPE NPs对CAPE的装载率。
高效液相色谱条件：A相为含0.5％甲酸的甲醇（V/V），B相为含0.5％甲酸（V/V）的5mmol/L的乙酸铵溶液，A:B比例为8:2，流速1 mL/min，进样量为10 μL。
包封率测定：
包封率=(CAPE初始重量-未被包封的CAPE重量)/CAPE的初始重量×100％。
装载率测定：
装载率=纳米颗粒ASA-CAPE NPs中CAPE的重量/纳米颗粒ASA-CAPE NPs的重量×100％。
根据图2数据可知，不同ASA与CAPE添加比例对形成纳米稳定缓释剂型ASA-CAPENPs的粒径、PDI、包封率和装载率会产生影响。ASA与CAPE添加比为1:0.45时，制备的纳米颗粒综合指标最优。
1.2纳米颗粒ASA-CAPE NPs的显微结构分析
将ASA、CAPE及ASA-CAPE NPs冻干粉均匀黏附在导电胶上，用洗耳球吹去未黏附粉末，在粉末表面喷涂一层薄金，增强导电性。通过扫描电子显微镜（SEM, ZEISS Gemini300）观察它们的微观形貌。
由图3所示，图（a）、（b）、（c）分别为ASA、CAPE和ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE添加比为1:0.45）的微观形貌。ASA呈现疏松多孔状结构，CAPE呈现较大的片状结构，ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE添加比为1:0.45）呈现出规则的球状结构，其粒径小于300 nm。球状结构和较小的尺寸可能使ASA-CAPE NPs更容易透过细胞屏障，具有更易被机体吸收利用的优势，可以在一定程度上解决CAPE与ASA生物利用度低的问题。
1.3傅里叶转换红外光谱（FT-IR）分析
取ASA、CAPE粉末及ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE添加比为1:0.45）冻干粉分别与溴化钾粉末按照1:100的质量比放入研钵中，用杵仔细按同一方向缓慢研磨，直至研磨均匀，将粉末放入压片装置中，压片3 min左右，得到透明均一，无裂痕的压片，将压片放入傅里叶转换红外光谱仪器（Perkin-Elmer, USA）中进行检测，并用红外分析软件OMNIC 8.0对结果进行分析。
如图4所示，FT-IR图谱中，形成ASA-CAPE NPs之后，CAPE分子中-OH基团特征吸收峰，ASA分子中-OH和C=O基团的特征吸收峰发生位移。证明ASA-CAPE NPs主要由ASA与CAPE分子通过分子间氢键结合而成。并且形成ASA-CAPE NPs之后，CAPE的特征吸收峰被掩盖，证明CAPE被包裹于ASA-CAPE NPs的内部。
1.4接触角测量
将ASA、CAPE和ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE添加比为1:0.45）粉末分别均匀涂抹在20×20×2 mm大小的玻片上，置于接触角测量仪测定接触角，测试时保持水滴大小前后一致。
如图5所示，与ASA及CAPE相比，ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE添加比为1:0.45）与水溶液的接触角更小，其亲水性更强，证明该方法制备的CAPE纳米稳定缓释剂型ASA-CAPENPs可以改善疏水性小分子的亲水能力，进而增强其被细胞摄取的能力，提升其生物利用度。
1.5纳米颗粒稳定性检测
1.5.1 热稳定性
将ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE添加比为1:0.45）加入去离子水中制备为悬浮液，将悬浮液分为4组，分别在4、25、37、65 ℃条件下孵育2 h，然后恢复至室温，随后检测其粒径和PDI。
1.5.2 贮藏稳定性
将ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE添加比为1:0.45）悬浮于去离子水中，在4 ℃冰箱中保存，检测60d内纳米颗粒的粒径和PDI变化，评价其储藏稳定性。
如图6所示，ASA-CAPE NPs在不同温度下孵育2 h及在4℃条件下储藏60 d，其粒径和PDI未显著增加，证明该方法制备的CAPE纳米稳定剂型具有良好的热稳定性和储藏稳定性，可以满足一般食品与药物的生产及储备要求。
1.6 ASA-CAPE NPs在模拟胃肠消化过程中CAPE的缓释效果
1.6.1 模拟胃肠液配制
模拟胃液：100 mg NaCl，160 mg胃蛋白酶溶于50 mL去离子水中，用0.1 M的HCl调节pH至4.0。
模拟肠液：704 mg NaCl，544 mg KH2PO4，160 mg胰酶，400 mg胆汁盐溶于80 mL去离子水中，用0.1 M的NaOH调节pH至7.4。
模拟胃肠释放介质液配制：模拟胃肠液与乙醇1:1(V/V)混合。
1.6.2 实验步骤
取3 mL ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE添加比为1:0.45）悬液（提前测定CAPE含量）与3mL模拟胃液混合，装入透析袋（2000 Da截留），将透析袋浸入60 mL的胃液释放介质液2 h。然后向透析袋中加入6 mL的模拟肠液，并将透析袋转移至120 mL的模拟肠液释放介质液中4 h，实验全程于震荡培养箱中孵育，温度37 ℃，振荡速度120 rmp。
每30 min从模拟胃肠释放介质液中取1 mL液体，并替换1 mL新的介质液，通过高效液相色谱检测CAPE的释放量。
如图7所示，ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE添加比为1:0.45）经过6 h的模拟胃肠消化之后，只有一部分CAPE被缓慢释放。该结果证明本发明制备的CAPE纳米稳定缓释剂型ASA-CAPE NPs可以在胃肠消化环境中缓慢释放，达到缓释效果，对CAPE具有保护作用，并且可以有效提升CAPE的口服利用度。
1.7 ASA-CAPE NPs对H22细胞的增殖抑制活性
将生长良好的H22细胞铺于96孔板中（5000细胞/孔），在37 ℃细胞培养箱中培养12 h，然后取10 μL不同浓度的ASA、CAPE、ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE添加比为1:0.45）溶液加入对应的孔中（ASA-CAPE NPs浓度以CAPE当量计算）培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃培养箱中孵育2 h，用酶标仪检测各孔450 nm波长下的吸光值，计算细胞活力。
进一步地，上述实验步骤中ASA溶于含1%DMSO的PBS缓冲液中，CAPE溶于含5%乙酸乙酯的PBS缓冲液中，ASA-CAPE NPs用PBS缓冲液稀释至所需浓度（其浓度以CAPE当量计算）。
如图8所示，ASA未表现出对H22细胞的增殖抑制效果，CAPE单独作用于H22细胞时，对细胞增殖抑制活性显著低于同等CAPE当量下ASA-CAPE NPs（ASA与CAPE添加比为1:0.45）的作用效果。该结果证明ASA-CAPE NPs可以显著增强CAPE对H22细胞的增殖抑制能力，具有更好的体外抗癌活性。
以上对本发明的具体实施例做了详细的描述。其目的是让此领域研发人员能够了解本发明内容。本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种等效变化或更改，都应该包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将咖啡酸苯乙酯和积雪草酸共同溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，得到溶液A，其中，所述积雪草酸和咖啡酸苯乙酯的质量比为1:0.1-1:0.5，所述积雪草酸与二氯甲烷和甲醇的混合溶剂的质量体积比为5mg/ml，二氯甲烷与甲醇的体积比为9:1；
步骤二、将溶液A加入到聚乙烯醇水溶液Ⅰ中，搅拌均匀，使用超声细胞破碎仪超声处理，形成乳液B，聚乙烯醇水溶液Ⅰ的浓度为0.025g/ml，其中溶液A与聚乙烯醇水溶液Ⅰ的体积比为1:3；
步骤三、将乳液B逐滴加入聚乙烯醇水溶液Ⅱ中，并于室温下搅拌得到悬液C，其中，聚乙烯醇水溶液Ⅱ的浓度为0.003g/ml，乳液B与聚乙烯醇水溶液Ⅱ的体积比为2:15；
步骤四、将悬液C离心分离，洗涤沉淀物，得到咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型。
2.根据权利要求1所述的一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法，其特征在于：步骤一中，所述积雪草酸和咖啡酸苯乙酯的质量比为1:0.45。
3.根据权利要求1所述的一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法，其特征在于：步骤二中，超声细胞破碎仪的功率为40W，在超声的过程中，开5s，关5s，依次交替进行共处理1min。
4.根据权利要求1所述的一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法，其特征在于：步骤二中，通过涡旋1min使溶液A与聚乙烯醇水溶液Ⅰ充分混合。
5.根据权利要求1所述的一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法，其特征在于：步骤三中，400rmp搅拌16h，将乳液B与聚乙烯醇水溶液Ⅱ混合均匀。
6.根据权利要求1所述的一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法，其特征在于：步骤四中，离心的转速为12000rmp，时间为30min，温度为4℃。
7.根据权利要求1所述的一种咖啡酸苯乙酯纳米稳定缓释剂型的制备方法，其特征在于：步骤四中，使用蒸馏水洗涤沉淀物若干次。
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Jiacheng Wang等.Exploration of the Natural Active Small-Molecule Drug-Loading Process and Highly Efficient Synergistic Antitumor Efficacy.《ACS Applied Materials &amp Interfaces》.2020,第12卷第6827−6839页，尤其是第6827页摘要，第6835页右栏第2-3段，第6836页左栏第2段. *

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