CN108743536B - 一种囊泡型球形核酸及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种囊泡型球形核酸及其制备方法与应用，本发明囊泡型球形核酸采用PNIPAM‑S‑S‑Py聚合物与官能化核酸药物反应得到二嵌段复合物，工艺简单，适于大规模生产。本发明囊泡型球形核酸具有特定囊泡结构，稳定性好、均一性好、生物相容性好、肿瘤靶向性、细胞内还原敏感、可降解，能够将核酸药物高效递送到特定靶细胞。本发明囊泡型球形核酸能够用作药物载体，载药效率高，能够同时有效递送核酸药物与其他药物，具有协同治疗效果。

Description

一种囊泡型球形核酸及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及核酸药物技术领域，具体而言，涉及一种囊泡型球形核酸及其制备方法与应用。
背景技术
核酸药物是各种具有不同功能的寡聚核糖核苷酸(RNA)或寡聚脱氧核糖核苷酸(DNA)，主要在基因水平上发挥作用,目前在肿瘤、炎症、病毒感染等人类基因相关疾病的治疗中展现出良好的应用潜能。
但核酸药物在进入人体后会易被人体细胞影响、清除，不能起到预期效果。以siRNA为例，裸siRNA自身具有电负性、分子量大、极性强、半衰期短，以及容易被内源酶降解和肾小球滤过等问题，siRNA进入生物体内后，易被血液或细胞中核糖核酸酶降解，而导致半衰期较短；进入体内的siRNA易被由网状细胞、内皮细胞以及巨嗤细胞组成的网状内皮系统(reticulo endothelial system,RES)捕获，致使到达靶细胞的数量非常有限；或者到达靶细胞后易被胞内溶酶体等清除；此外，进入细胞内的siRNA是否能够从溶酶体中逃逸出来，并从载体中成功释放也是影响其治疗效果的关键问题。
球形核酸SNA是DNA和RNA的一种新型球形聚集形式，对人体无毒，并在人体试验中取得成功。球形核酸药物可基于三维球形核酸结构特殊性质，通过释放核酸的治疗潜能，用于治疗多种靶器官组织病变。SNA新药先导项目适应症，涉及炎症性疾病、遗传性疾病和肿瘤。SNA除了进行基因、蛋白表达的检测和调控。在细胞生物学和早期诊断方面，也都表现出了良好的应用潜能。
然而相关技术中的球形核酸只能用于输送核酸类药物，并不能同时携带化学药物和/或蛋白类药物，如何同时有效递送核酸药物与化学药物和/或蛋白类药物，是目前球形核酸无法解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种囊泡型球形核酸的制备方法，该方法工艺简单，适于大规模生产。
本发明的第二目的在于提供一种采用上述的囊泡型球形核酸的制备方法制备得到的囊泡型球形核酸，所述的囊泡型球形核酸具有特定囊泡结构，稳定性好、均一性好、生物相容性好、肿瘤靶向性、细胞内还原敏感、可降解，能够将核酸药物高效递送到特定靶细胞。
本发明的第三目的在于提供一种上述的囊泡型球形核酸的应用，所述的囊泡型球形核酸能够用作药物载体，载药效率高，能够同时有效递送核酸药物与其他药物，具有协同治疗效果。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种囊泡型球形核酸的制备方法，包括：
将PNIPAM-S-S-Py聚合物与官能化核酸药物反应得到二嵌段复合物，该二嵌段复合物能够形成囊泡型球形核酸。
具体地，二嵌段复合物在高于临界转换温度LCST的条件下能够形成囊泡型球形核酸(通过自组装形成囊泡型球形核酸)。
即，本发明的囊泡型球形核酸的制备方法，包括：
将PNIPAM-S-S-Py聚合物与官能化核酸药物反应得到二嵌段复合物；
将该二嵌段复合物置于高于临界转换温度LCST的条件下，形成囊泡型球形核酸；
进一步地，将该二嵌段复合物置于生理温度条件下，形成囊泡型球形核酸。
本发明囊泡型球形核酸采用PNIPAM-S-S-Py聚合物与官能化核酸药物反应得到二嵌段复合物，工艺简单，适于大规模生产。
可选地，所述PNIPAM-S-S-Py聚合物与官能化核酸药物反应得到二嵌段复合物包括：
将PNIPAM-S-S-Py聚合物和官能化核酸药物在溶剂中，反应得到二嵌段复合物。
可选地，所述官能化核酸药物包括巯基化核酸药物。
可选地，所述核酸药物包括siRNA、miRNA、Antisense RNA和Antisense DNA中的一种或多种，优选包括巯基siRNA。
可选地，所述溶剂包括有机溶剂中的一种或多种，优选包括二甲基亚砜。
可选地，所述PNIPAM-S-S-Py聚合物和官能化核酸药物的物质的量比为10-30：1，优选为20：1。
可选地，反应体系的pH为5.5-6.5，优选为6。
可选地，反应温度为35-40℃，优选为37℃。
可选地，所述反应时间为36-60h，优选为48h。
可选地，所述PNIPAM-S-S-Py聚合物的制备方法包括：
将PNIPAM聚合物与二硫吡啶半胱氨盐酸盐反应得到PNIPAM-S-S-Py聚合物。
可选地，所述PNIPAM聚合物与二硫吡啶半胱氨盐酸盐反应得到PNIPAM-S-S-Py聚合物包括：
将PNIPAM聚合物、二硫吡啶半胱氨盐酸盐、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺和三乙胺在溶剂中反应，得到PNIPAM-S-S-Py聚合物。
可选地，所述PNIPAM聚合物、二硫吡啶半胱氨盐酸盐、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，三乙胺的质量比为1：2-4：3-5：3-5：6-10，优选为1：3：4：4：8。
可选地，将PNIPAM聚合物经N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺活化处理后，加入二硫吡啶半胱氨盐酸盐、三乙胺，反应得到PNIPAM-S-S-Py聚合物。
可选地，所述活化处理包括：
将PNIPAM聚合物和N-羟基琥珀酰亚胺在冰浴条件下溶解于溶剂中，二环己基碳二亚胺溶解于溶剂中并逐滴滴加，然后将进行活化。
可选地，所述活化温度为10-40℃，优选为常温。
可选地，所述活化时间为15-25h，优选为20h。
可选地，所述反应温度为10-40℃，优选为常温。
可选地，所述反应时间为18-30h，优选为24h。
可选地，所述PNIPAM聚合物的制备方法包括：
NIPAM和RAFT经聚合反应得到PNIPAM聚合物。
可选地，所述NIPAM和RAFT经聚合反应得到PNIPAM聚合物包括：
将NIPAM单体、RAFT试剂和引发剂在溶剂中进行聚合反应，得到PNIPAM聚合物。
可选地，所述引发剂包括偶氮类引发剂中的一种或多种，优选包括偶氮二异丁腈。
可选地，所述NIPAM单体、RAFT试剂和引发剂的质量比为80-200：1：0.1-0.3，优选为200：1：0.2，150：1：0.2和80：1：0.2。
可选地，所述溶剂包括有机溶剂中的一种或多种，优选包括二恶烷。
可选地，所述聚合反应的反应温度为65-75℃，优选为70℃。
可选地，所述聚合反应的反应时间为12-36h，优选为24h。
一种囊泡型球形核酸，所述囊泡型球形核酸采用上述的一种囊泡型球形核酸的制备方法制备得到。
本发明囊泡型球形核酸具有特定囊泡结构，稳定性好、均一性好、生物相容性好、肿瘤靶向性、细胞内还原敏感、可降解，能够将核酸药物高效递送到特定靶细胞。
上述的一种囊泡型球形核酸的应用，所述囊泡型球形核酸用作药物载体。
本发明囊泡型球形核酸能够用作药物载体，载药效率高，能够同时有效递送核酸药物与其他药物，具有协同治疗效果。
可选地，所述囊泡型球形核酸用作化学和/或蛋白药物载体；
可选地，所述化学药物包括亲水性化学药物和/或疏水性化学药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明囊泡型球形核酸采用PNIPAM-S-S-Py聚合物与官能化核酸药物反应得到二嵌段复合物，经自组装后制备得到囊泡型球形核酸，工艺简单，适于大规模生产。本发明囊泡型球形核酸具有特定囊泡结构，稳定性好、均一性好、生物相容性好、肿瘤靶向性、细胞内还原敏感、可降解，能够将核酸药物高效递送到特定靶细胞。本发明囊泡型球形核酸能够用作药物载体，载药效率高，能够同时有效递送核酸药物与其他药物，具有协同治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3所得PNIPAM聚合物的核磁图。
图2a为本发明实施例3所得PNIPAM-S-S-Py聚合物的核磁图；图2b为图2a的局部放大图。
图3为本发明实施例1-3所得不同聚合物分子量的纳米颗粒(即囊泡型球形核酸)粒径数据图。
图4为本发明实施例1-3所得囊泡型球形核酸粒径及形貌检测结果图，其中图4a为本发明实施例1-3所得囊泡型球形核酸的凝胶电泳图，图4b为本发明实施例3所得囊泡型球形核酸的动态光散射粒径测量结果图，图4c为本发明实施例3所得囊泡型球形核酸的透射电镜照片。
图5为本发明实施例3所得囊泡型球形核酸还原敏感及药物释放性能检测结果图，其中图5a为凝胶电泳图，图5b为动态光散射粒径测量结果图，图5c为累积药物释放曲线，图5d为本发明实施例3所得囊泡型球形核酸经10mM DTT处理24h后的透射电镜照片。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一种囊泡型球形核酸的制备方法，包括：
将PNIPAM-S-S-Py聚合物与官能化核酸药物反应得到二嵌段复合物，该二嵌段复合物能够形成囊泡型球形核酸。
本发明囊泡型球形核酸采用PNIPAM-S-S-Py聚合物与官能化核酸药物反应得到二嵌段复合物，该二嵌段复合物在高于临界转换温度LCST的条件下经自组装即可形成囊泡型球形核酸，工艺简单，适于大规模生产。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述PNIPAM-S-S-Py聚合物与官能化核酸药物反应得到二嵌段复合物包括：
将PNIPAM-S-S-Py聚合物和官能化核酸药物在溶剂中，反应得到二嵌段复合物。
本发明可采用各类能够与PNIPAM-S-S-Py聚合物反应得到二嵌段复合物的官能化核酸药物，本发明一种优选的具体实施方式中，所述官能化核酸药物包括巯基化核酸药物。
本发明可采用各类核酸药物，本发明一种优选的具体实施方式中，所述核酸药物包括siRNA、miRNA、Antisense RNA和Antisense DNA中的一种或多种，优选包括巯基siRNA。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述溶剂包括有机溶剂中的一种或多种，优选包括二甲基亚砜。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述PNIPAM-S-S-Py聚合物和官能化核酸药物的物质的量比为10-30：1，优选为20：1。
采用特定PNIPAM-S-S-Py聚合物和官能化核酸药物的物质的量比，有助于促进二者充分反应，得到二嵌段复合物。
本发明一种优选的具体实施方式中，反应体系的pH为5.5-6.5，优选为6。
本发明一种优选的具体实施方式中，反应温度为35-40℃，优选为37℃。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述反应时间为36-60h，优选为48h。
采用特定反应条件，有助于进一步促进PNIPAM-S-S-Py聚合物和官能化核酸药物进行反应，得到二嵌段复合物。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述PNIPAM-S-S-Py聚合物的制备方法包括：
将PNIPAM聚合物与二硫吡啶半胱氨盐酸盐反应得到PNIPAM-S-S-Py聚合物。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述PNIPAM聚合物与二硫吡啶半胱氨盐酸盐反应得到PNIPAM-S-S-Py聚合物包括：
将PNIPAM聚合物、二硫吡啶半胱氨盐酸盐、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺和三乙胺在溶剂中反应，得到PNIPAM-S-S-Py聚合物。
本发明PNIPAM-S-S-Py聚合物可采用PNIPAM聚合物、二硫吡啶半胱氨盐酸盐、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和三乙胺反应制备得到。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述PNIPAM聚合物、二硫吡啶半胱氨盐酸盐、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，三乙胺的质量比为1：2-4：3-5：3-5：6-10，优选为1：3：4：4：8。
本发明一种优选的具体实施方式中，将PNIPAM聚合物经N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺活化处理后，加入二硫吡啶半胱氨盐酸盐、三乙胺，反应得到PNIPAM-S-S-Py聚合物。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述活化处理包括：
将PNIPAM聚合物和N-羟基琥珀酰亚胺在冰浴条件下溶解于溶剂中，二环己基碳二亚胺溶解于溶剂中并逐滴滴加，然后将进行活化。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述活化温度为10-40℃，优选为常温。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述活化时间为15-25h，优选为20h。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述反应温度为10-40℃，优选为常温。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述反应时间为18-30h，优选为24h。
采用特定反应条件，有助于进一步促进PNIPAM聚合物、二硫吡啶半胱氨盐酸盐、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和三乙胺进行反应，得到PNIPAM-S-S-Py聚合物。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述PNIPAM聚合物的制备方法包括：
NIPAM和RAFT经聚合反应得到PNIPAM聚合物。
本发明PNIPAM聚合物可采用NIPAM和RAFT进行聚合制备得到。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述NIPAM和RAFT经聚合反应得到PNIPAM聚合物包括：
将NIPAM单体、RAFT试剂和引发剂在溶剂中进行聚合反应，得到PNIPAM聚合物。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述引发剂包括偶氮类引发剂中的一种或多种，优选包括偶氮二异丁腈。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述NIPAM单体、RAFT试剂和引发剂的质量比为80-200：1：0.1-0.3，优选为200：1：0.2，150：1：0.2和80：1：0.2。
采用不同的NIPAM单体、RAFT试剂和引发剂的质量比，能够得到不同分子量和聚合度的PNIPAM聚合物。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述溶剂包括有机溶剂中的一种或多种，优选包括二恶烷。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述聚合反应的反应温度为65-75℃，优选为70℃。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述聚合反应的反应时间为12-36h，优选为24h。
采用特定反应条件，有助于促进NIPAM单体和RAFT试剂进行反应，得到PNIPAM-S-S-Py聚合物。
一种囊泡型球形核酸，所述囊泡型球形核酸采用上述的一种囊泡型球形核酸的制备方法制备得到。
本发明囊泡型球形核酸具有特定囊泡结构，稳定性好、均一性好、生物相容性好、肿瘤靶向性、细胞内还原敏感、可降解，能够将核酸药物高效递送到特定靶细胞。
因为PNIPAM聚合物具有温度敏感性的特征，当温度小于LCST(Lower CriticalSolution Temperature低临界溶解温度/最低共溶温度)时，聚合物游离存在于溶液中，温度大于LCST时，聚合物不溶于水。因此，在生理温度条件下，一端亲水(siRNA)和一端疏水(PNIPAM)的二嵌段聚合物会形成囊泡型球形核酸纳米粒子。当温度大于LCST时，形成一个中空的囊泡型球形核酸纳米颗粒(囊泡型球形核酸的外部和内部分布着亲水性的siRNA，壳体本身由疏水的PNIPAM形成)。基于PNIPAM聚合物的上述性质，本发明囊泡型球形核酸可以通过控制温度的方式，在其中空囊泡内部填充其他药物，比如各类化学药物和/或蛋白类药物。
上述的一种囊泡型球形核酸的应用，所述囊泡型球形核酸用作药物载体。
本发明囊泡型球形核酸能够用作药物载体，载药效率高，能够同时有效递送核酸药物与其他药物，具有协同治疗效果。
本发明一种优选的具体实施方式中，所述囊泡型球形核酸用作化学药物载体；
本发明一种优选的具体实施方式中，所述化学药物包括亲水性化学药物和/或疏水性化学药物和/或蛋白类药物。
实施例1-3
一种囊泡型球形核酸的制备方法，包括：
1.NIPAM经RAFT聚合作用形成PNIPAM聚合物：
1.1 NIPAM(异丙基丙烯酰胺)(sigma)单体，RAFT(可逆加成-断裂链转移聚合Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization)试剂(百灵威科技)，引发剂AIBN(偶氮二异丁晴)(阿拉丁)在特定比例下(实施例1-3依次分别为80：1：0.1、150：1：0.2和200：1：0.3)发生聚合反应(实施例1-3的反应温度依次分别为65℃、75℃和70℃，实施例1-3的反应时间依次分别为36h、12h和24h)生成PNIPAM聚合物(实施例1-3所得PNIPAM聚合物的分子量Mn依次分别约为7000、13000、19000，依次分别记为7k、13k和19k)。
以19K聚合物合成过程为例：
准备一个25mL或者50mL反应管，经由双排管先通入N2净化30min以除去空气。
将NIPAM(异丙基丙烯酰胺)(1g，8.837mmol),RAFT试剂(17.84mg，0.0442mmol),引发剂AIBN(1.45mg，0.0088mmol),加入到15mL1,4-dioxane中。
通过双排管抽真空将反应溶液中的氧气排净(2-3次)。再通N2。
接下来将反应体系在70℃二甲基硅油中(油浴)反应24h。
接着将反应体系迅速冷却并暴露在空气中，用适量的THF,10mL(四氢呋喃)(国药)溶解，并在冰正己烷中进行沉淀(3次)。过滤，真空干燥，得到PNIPAM聚合物。
7k和13k聚合物的合成可参照上述过程进行相关参数条件的调整。
Figure BDA0001712762140000121
所得PNIPAM聚合物具有如下核磁结构：
Figure BDA0001712762140000122
图1为本发明实施例3所得PNIPAM聚合物的核磁图。
经过这一反应过程，实施例1-3依次分别得到了聚合度DP＝65,分子量Mn约为7000，聚合度DP＝120,分子量Mn约为13000，聚合度DP＝170,分子量Mn约为19000的不同分子量大小的PNIPAM聚合物。聚合效率(Polymerization ratio)达到85％以上。
2.PNIPAM聚合物与2-(2-pyridyldithio)ethylamine hydrochloride(二硫吡啶半胱氨盐酸盐)反应生成PNIPAM-S-S-Py聚合物。
PNIPAM聚合物、二硫吡啶半胱氨盐酸盐、二环己基碳二亚胺(Alfa Aesar)和N-羟基琥珀酰亚胺(Alfa Aesar)，三乙胺(三乙胺，Sigma-Aldrich)按质量比(实施例1-3依次分别为1：2：3：3：6，1：4：5：5：10和1：3：4：4：8)称取备料；将PNIPAM聚合物和N-羟基琥珀酰亚胺，在冰浴条件下0-4℃溶解于90mL二氯甲烷中，将二环己基碳二亚胺溶解于10mL二氯甲烷中并逐滴滴加，滴加完成后将反应液置于常温活化(实施例1-3的活化时间依次分别为15h、25h和20h)，加入二硫吡啶半胱氨盐酸盐和三乙胺，常温下反应(实施例1-3的反应时间依次分别为18h、30h和24h)，得到PNIPAM-S-S-Py聚合物。
以19K PNIPAM-S-S-Py聚合物合成过程为例：
按照1：3：4：4：8的比例。
首先称取PNIPAM-COOH(0.5g，0.0263mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(12.11mg，0.1053mmol)加入到90mL冰浴下二氯甲烷中，充分溶解。
将二环己基碳二亚胺(21.72mg，0.1053mmol)溶解于10mL二氯甲烷中并逐滴滴加到反应瓶中，滴加完成后将反应液置于常温活化20h。
加入二硫吡啶半胱氨盐酸盐(17.56mg 0.0789mmol)和三乙胺(21.30mg，0.2105mmol)，常温下反应24h。
用旋转蒸发仪将反应液浓缩至5-10mL，接着在冰乙醚中进行沉淀(3次)，过滤，真空干燥，既得PNIPAM-S-S-Py聚合物。
7k PNIPAM-S-S-Py和13k PNIPAM-S-S-Py聚合物的合成可参照上述过程进行相关参数条件的调整。
Figure BDA0001712762140000141
所得PNIPAM-S-S-Py聚合物具有如下核磁结构：
Figure BDA0001712762140000142
图2a和图2b为本发明实施例3所得PNIPAM-S-S-Py聚合物的核磁图。
经过该反应过程，实施例1-3依次分别得到了聚合度DP＝65,分子量Mn约为7000，聚合度DP＝120,分子量Mn约为13000，聚合度DP＝170,分子量Mn约为19000的不同分子量大小的PNIPAM-S-S-Py聚合物。结合效率(Conjunction ratio)达到83％以上。
3.合成PNIPAM-S-S-Py聚合物与siRNA的二嵌段复合物。
Figure BDA0001712762140000151
将PNIPAM-SS-Py聚合物与巯基siRNA(实施例1-3中PNIPAM-S-S-Py聚合物和siRNA的物质的量比依次分别为10：1、30：1和20：1)加入到100μL DMSO(二甲基亚砜)中，加入冰醋酸调节pH(实施例1-3依次分别调节pH为5.5、6.5和6)，反应(实施例1-3的反应温度依次分别为35℃、40℃和37℃，实施例1-3的反应时间依次分别为60h、36h和48h)得到二嵌段复合物。
以19K PNIPAM-S-S-Py聚合物与siRNA的二嵌段复合物的合成过程为例：
将1mg siRNA-SH加入到200μL DEPC水中，配成浓度为5mg/mL的溶液。然后将siRNA-SH溶液(10μL，50μg，3.79nmol)和19K PNIPAM-SS-py(1.44mg，75.8nmol)加入到100μL DMSO。
在37℃条件下恒温摇床反应48h。透析将DMSO除去。
在37℃条件下，15000rpm离心20mins，去上清，得到底部沉淀。
常温下，用异丙醇提取siRNA，去除上清液，底部沉淀溶于DEPC水，既得纯净球形核酸(PNIPAM(19K)-S-S-siRNA)。
7k PNIPAM-S-S-Py和13k PNIPAM-S-S-Py聚合物与siRNA的二嵌段复合物的合成可参照上述过程进行相关参数条件的调整。
对本发明各实施例所得囊泡型球形核酸进行检测，结果表明：
(1)本发明囊泡型球形核酸具有良好的均一性。纳米颗粒具有良好的结构稳定性，纳米粒子具有可控性，不同聚合物分子量(PNIPAM)的纳米颗粒粒径如图3所示。
表1本发明各实施例所得囊泡型球形核酸分子量Mn检测结果
Figure BDA0001712762140000161
表2本发明各实施例所得囊泡型球形核酸性能检测结果
Figure BDA0001712762140000162
(2)采用本发明实施例3所得19k囊泡型球形核酸装载Doxorubicin·HCL(盐酸阿霉素，DOX)，采用Self-assembly(自组装)的方法进行药物装载。
在DEPC水溶液中，按照预设的载药量DLC比例(10％和20％)。将一定质量的DOX(10％，4.743μg；20％，10.673μg)加入到0.5mL PNIPAM(19K)-S-S-siRNA二嵌段聚合物溶液中(PNIPAM(19K)–S-S-siRNA浓度:85.38ng/μL)，向体系中通入N2 10min，赶出溶液中氧气。先在常温，避光条件下震荡2h使之充分混合均匀。接着将温度升高的生理温度37℃。震荡5个小时。即形成囊泡型球形核酸纳米颗粒。最后，在避光条件下用37℃ddH2O透析除去未被装载的游离药物分子。
本发明囊泡型球形核酸具有一个很大的空腔，具有良好的药物装载能力。在理论载药量分别为10％-20％时，载药率能达到40％左右。装载药物后纳米粒子粒径有一个微微变大的过程。该种球形核酸纳米颗粒可以装载亲水性、疏水性或同时输送亲水性和疏水性抗癌药物。
表3本发明实施例3所得囊泡型球形核酸载药性能测试结果
Figure BDA0001712762140000171
(3)本发明囊泡型球形核酸具有很好的可降解性，囊泡型球形核酸纳米颗粒可用于药物的缓释释放。体外实验中，在生理温度37℃条件下，经10mM DTT处理24h(图5b中曲线1、2、3、4依次表示不经DTT或PBS处理、经10mM DTT处理6h、经10mM DTT处理24h、经PBS处理24h)，期间纳米粒子发生溶胀解离，Free siRNA释放出来(图5a中，①、②和③依次分别表示Free siRNA、本发明实施例3所得囊泡型球形核酸和DTT处理后的本发明实施例3所得囊泡型球形核酸释放的游离的Free siRNA)，24小时内纳米粒子粒径明显增大，同时并有siRNA释放(图5b，图5d)。
体外药物缓释释放实验中，在生理温度37℃条件下，实验组用10mM DTT处理，对照组用PBS缓冲液处理。分别在0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，48h取样，计算累积药物释放量。纳米颗粒装载的药物不断被释放出来，在48小时内，药物释放率达到80％(图5c)。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。

Claims (34)

1.一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，包括：
将PNIPAM-S-S-Py聚合物与官能化核酸药物在有机溶剂中反应得到二嵌段复合物，即为一种囊泡型球形核酸；
所述官能化核酸药物为巯基siRNA；
所述PNIPAM-S-S-Py聚合物的制备方法包括：将PNIPAM聚合物、二硫吡啶半胱氨盐酸盐、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺和三乙胺在溶剂中反应，得到PNIPAM-S-S-Py聚合物；
所述PNIPAM聚合物的制备方法包括：将NIPAM单体、RAFT试剂和引发剂在有机溶剂中进行聚合反应，得到PNIPAM聚合物；所述引发剂包括偶氮类引发剂中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述PNIPAM-S-S-Py聚合物与官能化核酸药物进行反应的有机溶剂包括二甲基亚砜。
3.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述PNIPAM-S-S-Py聚合物和官能化核酸药物的物质的量比为10-30：1。
4.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述PNIPAM-S-S-Py聚合物和官能化核酸药物的物质的量比为20：1。
5.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，反应体系的pH为5.5-6.5。
6.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，反应体系的pH为6。
7.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，反应温度为35-40℃。
8.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，反应温度为37℃。
9.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述反应时间为36-60h。
10.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述反应时间为48h。
11.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述PNIPAM聚合物、二硫吡啶半胱氨盐酸盐、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，三乙胺的质量比为1：2-4：3-5：3-5：6-10。
12.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述PNIPAM聚合物、二硫吡啶半胱氨盐酸盐、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，三乙胺的质量比为1：3：4：4：8。
13.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，将PNIPAM聚合物经N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺活化处理后，加入二硫吡啶半胱氨盐酸盐、三乙胺，反应得到PNIPAM-S-S-Py聚合物。
14.根据权利要求13所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述活化处理包括：
将PNIPAM聚合物和N-羟基琥珀酰亚胺在冰浴条件下溶解于溶剂中，二环己基碳二亚胺溶解于溶剂中并逐滴滴加，然后将进行活化。
15.根据权利要求14所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述活化的温度为10-40℃。
16.根据权利要求14所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述活化的温度为常温。
17.根据权利要求14所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述活化的时间为15-25h。
18.根据权利要求14所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述活化的时间为20h。
19.根据权利要求14所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为10-40℃。
20.根据权利要求14所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为常温。
21.根据权利要求14所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为18-30h。
22.根据权利要求14所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为24h。
23.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述引发剂包括偶氮二异丁腈。
24.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述NIPAM单体、RAFT试剂和引发剂的质量比为80-200：1：0.1-0.3。
25.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述NIPAM单体、RAFT试剂和引发剂的质量比为200：1：0.2，150：1：0.2和80：1：0.2。
26.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述将NIPAM单体、RAFT试剂和引发剂进行反应的有机溶剂包括二恶烷。
27.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述聚合反应的反应温度为65-75℃。
28.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述聚合反应的反应温度为70℃。
29.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述聚合反应的反应时间为12-36h。
30.根据权利要求1所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法，其特征在于，所述聚合反应的反应时间为24h。
31.一种囊泡型球形核酸，其特征在于，所述囊泡型球形核酸采用权利要求1-30任一所述的一种囊泡型球形核酸的制备方法制备得到。
32.如权利要求31所述的一种囊泡型球形核酸的应用，其特征在于，所述囊泡型球形核酸用作制备药物载体。
33.根据权利要求32所述的一种囊泡型球形核酸的应用，其特征在于，所述囊泡型球形核酸用作制备化学药物载体。
34.根据权利要求33所述的一种囊泡型球形核酸的应用，其特征在于，所述化学药物包括亲水性化学药物和/或疏水性化学药物。
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