CN102380103B - 甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米粒技术领域，具体为一种甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用。本发明的纳米粒由荷正电的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐和荷负电的离子交联剂经聚电解质作用生成，同时包载荷负电的蛋白质多肽类药物或核酸药物。其中甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐由壳聚糖的氨基依次经季铵化、甘露糖配体和巯基化修饰而成。该纳米粒的制备过程无需使用有机溶剂，可有效提高药物稳定性。该纳米粒可主动靶向小肠上皮细胞、M细胞和巨噬细胞，有效提高口服药物的小肠吸收并改善核酸药物的转染效率，效果显著优于现有壳聚糖类纳米粒。
Description
技术领域
本发明属于纳米粒技术领域，具体涉及一种甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
纳米粒是指粒径为10-1000 nm之间的固态胶体粒子，其可提高药物溶解性和稳定性，延长体内循环时间，且具有良好的缓控释效果，已广泛应用于蛋白质多肽药物和核酸药物给药系统。现有技术公开了多种纳米粒制备方法，包括溶剂挥发法、表面聚合法、乳液聚合法等方法制备纳米粒，使用的有机溶剂、加热和剧烈机械作用均可能造成生物大分子药物活性降低甚至失活。荷正电的聚合物与荷负电的离子交联剂通过静电作用自组装形成纳米粒，同时包载荷负电的药物，制备过程无需使用有机溶剂及加热、剧烈震荡等手段，可有效保持药物活性，适于制备生物大分子纳米给药载体（Mao
et al., J Pharm Sci 2006,95:1035-48）。
近年来，壳聚糖及其衍生物由于其无毒、生物可降解和生物相容，已被广泛应用于工业、食品、医药和化妆品等领域。壳聚糖衍生物N,N,N-三甲基壳聚糖季胺盐（Trimethyl chitosan，TMC）在中性条件下荷正电，溶解性好，用于口服给药时，黏膜黏附性好且可促进亲水性大分子药物经细胞旁路转运和吸收；用于基因传释系统时，可增强细胞黏附并促进细胞摄取和转染。巯基化聚合物用于口服给药时，可紧密结合于黏膜，延长所载药物滞留时间，提高局部药物浓度，促进药物吸收，并发挥促渗作用；用于基因传释系统时，可通过与细胞膜糖蛋白形成二硫键促进细胞摄取，提高转染效率。
靶向给药即运用载体将药物选择性地传输、浓集并释放于病变的靶器官、靶组织或靶细胞，以降低其对正常组织的毒副作用，提高药物利用率。纳米粒表面偶联特异性的靶向分子（特异性的配体、单克隆抗体等），通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，可实现主动靶向治疗。通过糖类识别机制实现细胞特异靶向给药已经引起人们极大的兴趣。其中甘露糖受体（MR）尤为重要。甘露糖修饰的壳聚糖（MC）可通过甘露糖受体介导的胞吞作用促进pDNA转染树突状细胞，CT-26荷瘤BALB/c小鼠瘤内注射MC/DNA复合物可引起肿瘤血管增生抑制、肿瘤细胞周期停滞和细胞凋亡，显著抑制CT-26肿瘤的生长和转移 （Kim et al., Mol Cancer Ther
2006,5:1723-32）。可是，上述甘露糖修饰的药物载体无黏膜黏附性，限制其作为口服给药载体的应用，且与壳聚糖相比，MC在巨噬细胞的转染效率提高低于1.5倍，并未有效发挥甘露糖的主动靶向作用。我们发明了一种巯基化壳聚糖季铵盐自组装纳米粒（中国专利，200910054537.5，公开日：2011年1月12日），其可有效促进胰岛素的口服吸收和提高质粒的体内外转染。但由于其不具有靶向特异性基团，无法更有效提高小肠上皮细胞、位于小肠Peyer’s结中M细胞和巨噬细胞的摄取，降低吸收和转染效率，从而限制其作为口服给药载体的有效使用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用。
本发明第一方面，提供甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒。该纳米粒由荷正电的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐和荷负电的离子交联剂经聚电解质作用生成，同时包载荷负电的蛋白质多肽药物或核酸药物。其中：
所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐为壳聚糖的氨基依次经季铵化修饰、甘露糖修饰和巯基化修饰所得的共聚物，其中壳聚糖重均分子量为30-1,000
kDa，季铵化度为15-60%（摩尔百分数）（根据1H NMR计算而得，方法参见Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83），甘露糖修饰物为甘露吡喃异硫氰酸苯酯，甘露糖修饰度为10-50%（根据1H NMR计算而得，方法参见Int J
Pharm 2009,375:133-9），巯基化修饰物为半胱氨酸或巯基乙酸，游离巯基修饰率为40-200
μmol/g，二硫键修饰率为60-300
μmol/g。
在本发明的优选例中，所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐为甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸，其具有下式结构：
在另一优选例中，所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐为甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸，其具有下式结构：
所述离子交联剂为三聚磷酸钠、硫酸镁、γ-聚谷氨酸、透明质酸、丙烯酸树脂中的一种或几种。
所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与离子交联剂的质量比为2:1-15:1，优选的质量比为5:1-10:1。
所述的蛋白质多肽药物选自下组：胰岛素、降钙素、干扰素、抗利尿激素、奥曲肽、布舍瑞林、亮丙瑞林、依诺肝素、红细胞生长素、血红蛋白、白蛋白、细胞色素、各种生长因子、白介素、集落刺激因子、TNF-α人鼠嵌合单克隆抗体Infliximab（英夫利昔）、抗原或抗体。
所述的核酸药物选自DNA、RNA、寡聚核苷酸或多核苷酸中的一种。
所述的DNA为质粒DNA。
所述的质粒DNA可以表达蛋白质或转录成小分子干扰RNA。
所述的RNA为siRNA、shRNA或microRNA中的一种。
所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的平均粒径为50-1000 nm，优选的平均粒径为80-200
nm。
所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的Zeta电势为10-40
mV，优选的Zeta电势为15-30
mV。
所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的包封率为60-100%，优选的包封率为80-100%。
本发明第二方面，提供所述甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
（1）甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐、离子交联剂和蛋白质多肽药物或核酸药物溶于水；
（2）将甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和蛋白质多肽药物或核酸药物的混合溶液中，其中甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与一种或多种离子交联剂的质量比为2:1-15:1，一种或多种离子交联剂与蛋白质多肽药物或核酸药物的质量比为1:5-15:1；
（3）室温静置，荷正电的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂、蛋白质多肽药物或核酸药物经聚电解质作用形成纳米粒。
其中，所述甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐的制备的具体步骤如下：
（1）按照文献报道方法（Eur J
Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成壳聚糖季铵盐，反应时间为45-180 min，所得壳聚糖季铵盐以Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；其中反应45、120和180 min所得壳聚糖季铵盐的季铵化度分别为15%、30%和60%；
（2）将壳聚糖季铵盐和甘露吡喃异硫氰酸苯酯分别溶于水和DMSO，壳聚糖季铵盐和甘露吡喃异硫氰酸苯酯的质量比为1:1-25:1，调节pH至8.5-9.5，室温反应6-24 h，超滤，冷冻干燥，得甘露糖修饰壳聚糖季铵盐；
（3）将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐和半胱氨酸或巯基乙酸溶于水，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐和半胱氨酸或巯基乙酸的质量比为32:1-1:5，加入终浓度为50-500 mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐（EDAC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），调节pH至3.0-5.0，室温反应2-8 h，透析，冷冻干燥，得甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸或甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸。
壳聚糖季铵盐的反应时间为45-180 min。反应时间过短，季铵化度较低，降低促渗粘附效果；反应时间过长，季铵化度过高，不易在氨基进一步修饰甘露糖和巯基基团。
壳聚糖季铵盐和甘露吡喃异硫氰酸苯酯的质量比为1:1-25:1。质量比过低，甘露糖修饰率较低，使主动靶向效率降低；质量比过高时，甘露糖修饰率较高，不易在氨基修饰巯基基团，且影响其制得纳米粒的稳定性。
本发明第三方面，提供所述甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在口服给药系统中的应用。
在一优选例中，提供了甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在口服给药系统中的应用。所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒粒径为80-200
nm，具有良好的小肠上皮细胞和巨噬细胞的黏附力，且显著高于巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒。所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒可同时显著提高小肠转运量和小肠上皮细胞、M细胞及巨噬细胞的摄取量。
另一优选例中，提供了甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在口服给药系统中的应用。所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒粒径为600-1000
nm，具有良好的小肠上皮细胞和巨噬细胞的黏附力，且显著高于巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒。所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒可显著提高在肠道炎症部位聚集的巨噬细胞摄取量，同时避免小肠上皮细胞的非特异性摄取。所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒可显著提高用于局部抗炎治疗的蛋白质多肽类药物或核酸药物的药物功效。
本发明第四方面，提供甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在基因传释系统中的应用。
在一优选例中，提供了包载TNF-α siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒在基因传释系统中的应用。所述的包载TNF-α siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒具有良好的细胞黏附能力，且显著高于包载TNF-α siRNA的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒。所述的包载TNF-α siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒可显著提高Caco-2细胞和巨噬细胞对TNF-α siRNA的摄取。所述的包载TNF-α siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒可显著提高TNF-α siRNA在巨噬细胞的基因沉默效率，且其基因转染效率显著高于常用转染试剂Lipofectamine
TM2000。
本发明的主要优点在于：
（1）甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒中甘露糖配体协同壳聚糖季铵盐和巯基化聚合物的作用，可更有效发挥甘露糖的主动靶向作用。细胞转染研究中基因沉默效率为70%时，巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的给药量为每孔0.4 μg
siRNA，而甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的给药量为每孔0.002 μg siRNA，降低200倍。
（2）甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒协同壳聚糖季铵盐、甘露糖主动靶向和巯基化聚合物在口服给药系统中的优势。其中季铵基团和巯基基团可分别通过静电吸引和形成分子间二硫键的作用提高与细胞膜和荷负电且富含半胱氨酸残基的黏蛋白的亲和力，从而具有更好的细胞黏附和黏膜黏附能力。此外壳聚糖季铵盐和巯基化聚合物可分别通过正电性和抑制酪氨酸磷酸酶活性打开小肠上皮紧密连接，促进亲水性药物的小肠吸收。甘露糖基团修饰可通过主动靶向作用提高小肠上皮细胞、M细胞和巨噬细胞的摄取，促进药物小肠转运和吸收，提高口服生物利用度。
（3）甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒协同壳聚糖季铵盐、甘露糖主动靶向和巯基化聚合物在基因传释系统中的优势。其中季铵基团和巯基基团可分别可通过静电吸引和形成分子间二硫键的作用提高与细胞膜的亲和力，改善细胞黏附能力，提高细胞摄取。此外巯基基团修饰形成的二硫键在细胞质中较高浓度谷胱甘肽作用下会还原成游离巯基，促进甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的胞内解离，释放核酸药物，改善转染效率。甘露糖基团修饰可通过主动靶向作用提高巨噬细胞对核酸药物的摄取，进一步提高基因转染效率。
（4）制备本发明的离子交联纳米粒的过程简便，无需使用有机溶剂，可有效防止药物失活。
（5）药物包载于甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒后，可有效屏蔽其酶切位点，提高药物的抗酶解能力。对于蛋白质多肽药物而言，可有效抑制蛋白水解酶，如肠腔中的胰蛋白酶、糜蛋白酶和缩肽酶，刷状缘膜囊中的外肽酶和细胞液中的溶菌酶对药物的降解，保持药物在转运和吸收过程中的生物活性。对于核酸药物而言，可有效抑制核酸酶，如脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）对药物的降解，保护药物在细胞外液和细胞内液中免受降解，发挥其生物功效。
（6）本发明的纳米粒粒径合适，易于被细胞摄取。对于粒径为80-200
nm的纳米粒而言，其可同时提高正常小肠上皮细胞、Peyer’s结处M细胞和巨噬细胞对纳米粒的摄取，促进药物经胞内途径和淋巴途径的吸收，发挥全身作用。对于粒径为600-1000 nm的纳米粒而言，其可在提高巨噬细胞对纳米粒摄取的同时降低正常小肠上皮细胞对其非特异性摄取，发挥局部作用，降低药物不良反应。
（7）负电荷的离子交联剂和药物可以部分屏蔽甘露糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐毒性的正电荷，所制得的纳米粒安全性好。
术语：
“TMC”指壳聚糖季铵盐。
“TMC-Cys”壳聚糖季铵盐-半胱氨酸聚合物。
“TMC-TGA”壳聚糖季铵盐-巯基乙酸聚合物
“Man-TMC”指甘露糖修饰壳聚糖季铵盐。
“Man-TMC-Cys”指甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸聚合物。
“Man-TMC-TGA”指甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸聚合物。
“Man-TMC-Cys(m,n)”指壳聚糖分子量为m（kDa）、季铵化度为n（%）的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸聚合物。
术语“Man-TMC-TGA(m,n)”指壳聚糖分子量为m（kDa）、季铵化度为n（%）的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸聚合物。
附图说明
图1为载siRNA的Man-TMC-Cys(200,30)纳米粒（实施例71）的扫描电镜图，图中的标尺为200 nm。
图2为载siRNA的Man-TMC-Cys(200,30)纳米粒（实施例71）在小鼠体液中的稳定性电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，浓度为质量体积百分数（w/v）。
实施例1 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为30 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至8.5，室温反应6 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取160 mg Man-TMC溶于8 mL水，5 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为50 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例2 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取125 mg Man-TMC溶于8 mL水，5 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为100 mM的EDAC和NHS，调节pH至3.0，室温反应2 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例3 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.5，室温反应24 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，5 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为200 mM的EDAC和NHS，调节pH至4.0，室温反应8 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例4 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为500 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，10 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例5 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为1000 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，20 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为400 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例6 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，100 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为500 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例7 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至8.5，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，200 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例8 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，500 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例9 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，200 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.5，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，200 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例10 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，100 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，200 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例11 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，80 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，200 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例12 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，50 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，200 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例13 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，16 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，200 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例14 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为30 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应6 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取160 mg Man-TMC溶于8 mL水，5 mg巯基乙酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为50 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例15 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为100 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至8.5，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取125 mg Man-TMC溶于8 mL水，5 mg巯基乙酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为100 mM的EDAC和NHS，调节pH至3.0，室温反应2 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例16 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应24 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，5 mg巯基乙酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为200 mM的EDAC和NHS，调节pH至4.0，室温反应8 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例17 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为500 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，10 mg巯基乙酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例18甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为1000 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.5，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，20 mg巯基乙酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为400 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例19甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，100 mg巯基乙酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为500 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例20甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至8.5，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，200 mg半胱氨酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例21甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，400 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，500 mg巯基乙酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例22甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，200 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.5，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，200 mg巯基乙酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例23甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，100 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，200 mg巯基乙酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例24甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，80 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，200 mg巯基乙酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例25甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，50 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，200 mg巯基乙酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例26甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）合成TMC，壳聚糖重均分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂纯化，冷冻干燥；称取400 mg TMC溶于160
mL水，16 mg甘露吡喃异硫氰酸苯酯溶于40 mL二甲基亚砜（DMSO），混合，调节pH至9.0，室温反应12 h，超滤（MWCO 10 kDa），所得Man-TMC冷冻干燥；称取100 mg Man-TMC溶于8 mL水，200 mg巯基乙酸溶于2 mL水，混合，加入终浓度分别为300 mM的EDAC和NHS，调节pH至5.0，室温反应5 h，反应产物以pH 5.0 HCl溶液（MWCO
3500 Da）4 ℃透析5天，冷冻干燥。
实施例27载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，胰岛素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按TPP和胰岛素质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至TPP和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与TPP的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例28载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，胰岛素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按TPP和胰岛素质量比为10:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至TPP和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与TPP的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例29载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，胰岛素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按TPP和胰岛素质量比为5:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至TPP和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与TPP的质量比为10:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例30载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，胰岛素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按TPP和胰岛素质量比为1:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至TPP和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与TPP的质量比为15:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例31载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，胰岛素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按TPP和胰岛素质量比为1:5混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至TPP和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与TPP的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例32载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，胰岛素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按TPP和胰岛素质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至TPP和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与TPP的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例33载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
硫酸镁溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按硫酸镁和胰岛素质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至硫酸镁和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与硫酸镁的质量比为2:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的硫酸镁经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例34 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
硫酸镁溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按硫酸镁和胰岛素质量比为10:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至硫酸镁和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与硫酸镁的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的硫酸镁经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例35载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
硫酸镁溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按硫酸镁和胰岛素质量比为5:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至硫酸镁和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与硫酸镁的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的硫酸镁经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例36载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
硫酸镁溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按硫酸镁和胰岛素质量比为5:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至硫酸镁和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与硫酸镁的质量比为15:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的硫酸镁经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例37载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
γ-聚谷氨酸溶于水，胰岛素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，γ-聚谷氨酸和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按γ-聚谷氨酸和胰岛素质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至γ-聚谷氨酸和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与γ-聚谷氨酸的质量比为2:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的γ-聚谷氨酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例38 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
γ-聚谷氨酸溶于水，胰岛素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，γ-聚谷氨酸和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按γ-聚谷氨酸和胰岛素质量比为10:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至γ-聚谷氨酸和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与γ-聚谷氨酸的质量比为4:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的γ-聚谷氨酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例39 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
γ-聚谷氨酸溶于水，胰岛素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，γ-聚谷氨酸和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按γ-聚谷氨酸和胰岛素质量比为5:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至γ-聚谷氨酸和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与γ-聚谷氨酸的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的γ-聚谷氨酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例40 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
γ-聚谷氨酸溶于水，胰岛素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，γ-聚谷氨酸和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按γ-聚谷氨酸和胰岛素质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至γ-聚谷氨酸和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与γ-聚谷氨酸的质量比为4:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的γ-聚谷氨酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例41 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
透明质酸溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，透明质酸和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按透明质酸和胰岛素质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至透明质酸和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与透明质酸的质量比为2:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的透明质酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例42 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
透明质酸溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，透明质酸和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按透明质酸和胰岛素质量比为10:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至透明质酸和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与透明质酸的质量比为4:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的透明质酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例43 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
透明质酸溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，透明质酸和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按透明质酸和胰岛素质量比为5:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至透明质酸和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与透明质酸的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的透明质酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例44 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
透明质酸溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，透明质酸和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按透明质酸和胰岛素质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至透明质酸和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与透明质酸的质量比为4:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的透明质酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例45 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH中并调节pH至7.0，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，透明质酸和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按丙烯酸树脂和胰岛素质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至丙烯酸树脂和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与丙烯酸树脂的质量比为2:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例46 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH中并调节pH至7.0，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，透明质酸和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按丙烯酸树脂和胰岛素质量比为10:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至丙烯酸树脂和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与丙烯酸树脂的质量比为4:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例47 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH中并调节pH至7.0，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，透明质酸和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按丙烯酸树脂和胰岛素质量比为5:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至丙烯酸树脂和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与丙烯酸树脂的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例48 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）和透明质酸溶于水，丙烯酸树脂溶于pH
8.0 NaOH中并调节pH至7.0，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，三聚磷酸钠、透明质酸、丙烯酸树脂和胰岛素的浓度均为1
mg/mL，按三聚磷酸钠/透明质酸/丙烯酸树脂/胰岛素质量比为5:5:5:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至离子交联剂和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与各离子交联剂质量总和的质量比为6:1。室温静置30
min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例49 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）、γ-聚谷氨酸和透明质酸溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，三聚磷酸钠、γ-聚谷氨酸、透明质酸和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按三聚磷酸钠/γ-聚谷氨酸/透明质酸/胰岛素质量比为5:5:5:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至离子交联剂和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与各离子交联剂质量总和的质量比为6:1。室温静置30
min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例50 载胰岛素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
硫酸镁、γ-聚谷氨酸和透明质酸溶于水，胰岛素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁、γ-聚谷氨酸、透明质酸和胰岛素的浓度均为1
mg/mL，按硫酸镁/γ-聚谷氨酸/透明质酸/胰岛素质量比为5:5:5:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至离子交联剂和胰岛素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与各离子交联剂质量总和的质量比为6:1。室温静置30
min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例51 载依诺肝素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，依诺肝素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和依诺肝素的浓度均为1
mg/mL，按TPP和依诺肝素质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至TPP和依诺肝素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与TPP的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载依诺肝素。
实施例52 载依诺肝素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，依诺肝素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和依诺肝素的浓度均为1
mg/mL，按TPP和依诺肝素质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至TPP和依诺肝素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与TPP的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载依诺肝素。
实施例53 载依诺肝素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
硫酸镁溶于水，依诺肝素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁和依诺肝素的浓度均为1 mg/mL，按硫酸镁和依诺肝素质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至硫酸镁和依诺肝素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与硫酸镁的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的硫酸镁经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载依诺肝素。
实施例54 载依诺肝素的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
硫酸镁溶于水，依诺肝素溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁和依诺肝素的浓度均为1 mg/mL，按硫酸镁和依诺肝素质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至硫酸镁和依诺肝素混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与硫酸镁的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的硫酸镁经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载依诺肝素。
实施例55载Infliximab（英夫利昔）的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，Infliximab溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和Infliximab的浓度均为1
mg/mL，按TPP和Infliximab质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至TPP和Infliximab混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与TPP的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载Infliximab。
实施例56 载Infliximab（英夫利昔）的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，Infliximab溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和Infliximab的浓度均为1
mg/mL，按TPP和Infliximab质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至TPP和Infliximab混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与TPP的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载Infliximab。
实施例57 载Infliximab（英夫利昔）的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
硫酸镁溶于水，Infliximab溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁和Infliximab的浓度均为1
mg/mL，按硫酸镁和Infliximab质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至硫酸镁和Infliximab混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与硫酸镁的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的硫酸镁经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载Infliximab。
实施例58 载Infliximab（英夫利昔）的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
硫酸镁溶于水，Infliximab溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁和Infliximab的浓度均为1
mg/mL，按硫酸镁和Infliximab质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至硫酸镁和Infliximab混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与硫酸镁的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的硫酸镁经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载Infliximab。
实施例59 载pDNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，pDNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和pDNA的浓度均为1 mg/mL，按TPP和pDNA质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至TPP和pDNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与TPP的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例60 载pDNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，pDNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和pDNA的浓度均为1 mg/mL，按TPP和pDNA质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至TPP和pDNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与TPP的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例61 载pDNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
硫酸镁溶于水，pDNA溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁和pDNA的浓度均为1 mg/mL，按硫酸镁和pDNA质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至硫酸镁和pDNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与硫酸镁的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的硫酸镁经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例62 载pDNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
硫酸镁溶于水，pDNA溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁和pDNA的浓度均为1 mg/mL，按硫酸镁和pDNA质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至硫酸镁和pDNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与硫酸镁的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的硫酸镁经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例63 载pDNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
γ-聚谷氨酸溶于水，pDNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，γ-聚谷氨酸和pDNA的浓度均为1 mg/mL，按γ-聚谷氨酸和pDNA质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至γ-聚谷氨酸和pDNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与γ-聚谷氨酸的质量比为4:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的γ-聚谷氨酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例64 载pDNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
γ-聚谷氨酸溶于水，pDNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，γ-聚谷氨酸和pDNA的浓度均为1 mg/mL，按γ-聚谷氨酸和pDNA质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至γ-聚谷氨酸和pDNA混合溶液中，甘露糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐与γ-聚谷氨酸的质量比为4:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的γ-聚谷氨酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例65 载pDNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
透明质酸溶于水，pDNA溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，透明质酸和pDNA的浓度均为1 mg/mL，按透明质酸和pDNA质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至透明质酸和pDNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与透明质酸的质量比为2:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的透明质酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例66 载pDNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
透明质酸溶于水，pDNA溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，透明质酸和pDNA的浓度均为1 mg/mL，按透明质酸和pDNA质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至透明质酸和pDNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与透明质酸的质量比为2:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的透明质酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例67 载pDNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH中并调节pH至7.0，pDNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，丙烯酸树脂和pDNA的浓度均为1 mg/mL，按丙烯酸树脂和pDNA质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至丙烯酸树脂和pDNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与丙烯酸树脂的质量比为2:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例68 载pDNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH中并调节pH至7.0，pDNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，丙烯酸树脂和pDNA的浓度均为1 mg/mL，按丙烯酸树脂和pDNA质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至丙烯酸树脂和pDNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与丙烯酸树脂的质量比为2:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例69 载pDNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）和透明质酸溶于水，丙烯酸树脂溶于pH
8.0 NaOH中并调节pH至7.0，pDNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，三聚磷酸钠、透明质酸、丙烯酸树脂和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按三聚磷酸钠/透明质酸/丙烯酸树脂/pDNA质量比为5:5:5:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至离子交联剂和pDNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与各离子交联剂质量总和的质量比为6:1。室温静置30
min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例70 载pDNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
硫酸镁、γ-聚谷氨酸和透明质酸溶于水，pDNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁、γ-聚谷氨酸、透明质酸和pDNA的浓度均为1 mg/mL，按硫酸镁/γ-聚谷氨酸/透明质酸/pDNA质量比为5:5:5:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至离子交联剂和pDNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与各离子交联剂质量总和的质量比为6:1。室温静置30
min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例71 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，siRNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和siRNA的浓度均为1 mg/mL，按TPP和siRNA质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至TPP和siRNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与TPP的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例72 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）溶于水，siRNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和siRNA的浓度均为1 mg/mL，按TPP和siRNA质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至TPP和siRNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与TPP的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例73 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
硫酸镁溶于水，siRNA溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁和siRNA的浓度均为1 mg/mL，按硫酸镁和siRNA质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至硫酸镁和siRNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与硫酸镁的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的硫酸镁经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例74 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
硫酸镁溶于水，siRNA溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，硫酸镁和siRNA的浓度均为1 mg/mL，按硫酸镁和siRNA质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至硫酸镁和siRNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与硫酸镁的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的硫酸镁经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例75 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
γ-聚谷氨酸溶于水，siRNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，γ-聚谷氨酸和siRNA的浓度均为1 mg/mL，按γ-聚谷氨酸和siRNA质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至γ-聚谷氨酸和siRNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与γ-聚谷氨酸的质量比为4:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的γ-聚谷氨酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例76 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
γ-聚谷氨酸溶于水，siRNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，γ-聚谷氨酸和siRNA的浓度均为1 mg/mL，按γ-聚谷氨酸和siRNA质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至γ-聚谷氨酸和siRNA混合溶液中，甘露糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐与γ-聚谷氨酸的质量比为4:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的γ-聚谷氨酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例77 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
透明质酸溶于水，siRNA溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，透明质酸和siRNA的浓度均为1 mg/mL，按透明质酸和siRNA质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至透明质酸和siRNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与透明质酸的质量比为2:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的透明质酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例78 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
透明质酸溶于水，siRNA溶于pH
2.0 HCl中并调节pH至7.0，透明质酸和siRNA的浓度均为1 mg/mL，按透明质酸和siRNA质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至透明质酸和siRNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与透明质酸的质量比为2:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的透明质酸经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例79 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH中并调节pH至7.0，siRNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，丙烯酸树脂和siRNA的浓度均为1 mg/mL，按丙烯酸树脂和siRNA质量比为15:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至丙烯酸树脂和siRNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与丙烯酸树脂的质量比为2:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例80 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸纳米粒的制备
丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH中并调节pH至7.0，siRNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，丙烯酸树脂和siRNA的浓度均为1 mg/mL，按丙烯酸树脂和siRNA质量比为15:1混合。实施例24的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸溶液滴加至丙烯酸树脂和siRNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与丙烯酸树脂的质量比为2:1。室温静置30 min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-巯基乙酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例81 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒的制备
三聚磷酸钠（TPP）和透明质酸溶于水，丙烯酸树脂溶于pH
8.0 NaOH中并调节pH至7.0，siRNA溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，三聚磷酸钠、透明质酸、丙烯酸树脂和胰岛素的浓度均为1 mg/mL，按三聚磷酸钠/透明质酸/丙烯酸树脂/siRNA质量比为5:5:5:1混合。实施例12的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶于水，浓度为1 mg/mL，搅拌下将甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸溶液滴加至离子交联剂和siRNA混合溶液中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与各离子交联剂质量总和的质量比为6:1。室温静置30
min，荷正电的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例82 甘露糖修饰壳聚糖季铵盐的甘露糖修饰度测定
1H NMR测定甘露糖修饰壳聚糖季铵盐的甘露糖修饰度（%）。甘露糖修饰壳聚糖季铵盐（实施例1、9、10、11、12、13，季铵化度为30%）溶于氘水（D2O），AVANCE
DMX500型核磁共振仪测定1H NMR图谱，按下式计算甘露糖修饰壳聚糖季铵盐的甘露糖修饰度（MD，mol%）：
其中[CH]为化学位移 7.2
ppm处甘露吡喃异硫氰酸苯酯苯环上4个氢的峰面积，[CH3]为化学位移2.0
ppm处甘露糖修饰壳聚糖季铵盐中乙酰基（–NH–CO-CH3）上甲基氢的峰面积，DD为 壳聚糖的脱乙酰度。
如表1所示，Man-TMC的甘露糖修饰度为10-50%。
表1 Man-TMC的甘露糖修饰度
| Sample | 甘露糖修饰度（MD，%） |
| Man-TMC(30,30) 实施例1 | 52.5 |
| Man-TMC(200,30) 实施例9 | 41.8 |
| Man-TMC(200,30) 实施例10 | 29.4 |
| Man-TMC(200,30) 实施例11 | 18.9 |
| Man-TMC(200,30) 实施例12 | 15.2 |
| Man-TMC(200,30) 实施例13 | 10.1 |
实施例83 甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐游离巯基和二硫键的测定
标准曲线制作：
精密称取半胱氨酸 174 mg，置100
mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度；量取2.5
mL，置25 mL量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，得1 μmol/mL贮备液；分别精密量取上述贮备液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，得浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2、0.3 μmol/mL的标准溶液。分别精密量取0.5 mL，加入0.5 mL Ellman’s试剂（以0.5 mol/L pH 8.0
PBS配制的0.3 mg/mL DTNB溶液），室温、避光反应2 h，以不加Cys标准溶液管为对照，测定450 nm处的吸光值。以浓度（μmol/mL）对吸光值（A）进行线性回归。
游离巯基（-SH）含量测定：
量取250 μL
Man-TMC-Cys（实施例1-7，季铵化度为30%）或Man-TMC-TGA溶液（实施例14-20，季铵化度为30%）（4 mg/mL），加入250 μL 0.5 mol/L PBS （pH 8.0）和500 μL Ellman’s试剂，室温、避光反应2 h，测定450 nm处的吸光值。根据标准曲线计算巯基（-SH）含量，结果以每1 g Man-TMC-Cys含巯基的量（μmol）表示（μmol/g）。
二硫键（-S-S-）含量测定：
量取0.5 mL Man-TMC-Cys（实施例1-7，季铵化度为30%）或Man-TMC-TGA溶液（实施例14-20，季铵化度为30%）溶液（4 mg/mL），加入0.5 mL 0.05
mol/L PBS （pH 8.0），室温放置30
min；加0.6 mL 3% NaBH4溶液，37 °C水浴2 h；加0.5 mL 1 mol/L
HCl溶液和0.1 mL丙酮，涡旋1 min，室温放置10 min；加入1 mL 1 mol/L PBS（pH 8.0）和0.2 mL Ellman’s试剂，室温放置20
min，以不加Man-TMC-Cys溶液管为对照，测定450 nm处的吸光值。根据标准曲线计算二硫键（-S-S-）含量，结果以每1 g Man-TMC-Cys含二硫键的量（μmol）表示（μmol/g）。
表2 Man-TMC-Cys上-SH和-S-S-的含量
实施例84载胰岛素的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径、Zeta电势和包封率
粒径、Zeta电势：
Zetasizer Nano-ZS型电位及粒度测定仪测定载胰岛素的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例27-50，季铵化度为30%）的粒径和Zeta电势。粒径测定参数如下：He-Ne激光（波长633 nm），散射角θ=173°，测定温度25 °C。Zeta电势测定参数如下：He-Ne激光（波长635 nm），散射角θ=14°，测定温度25 ℃。
胰岛素包封率：
取载胰岛素的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例27-50，季铵化度为30%）溶液1 mL，13,300 rpm离心30 min，取上清液500 μL，Lowry法测定胰岛素含量。按下式计算胰岛素包封率：
包封率（%）=
(A-B)×100/A
其中A为胰岛素投料量（mg）；B为离心后上清液中的胰岛素含量（mg）。
如表3所示，载胰岛素的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径为100-1000
nm，Zeta电势为10-30
mV，胰岛素的包封率均高于80%。
表3 载胰岛素的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒粒径、Zeta电势和包封率
实施例85 载pDNA的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径、Zeta电势和包封率
粒径、Zeta电势：
Zetasizer Nano-ZS型电位及粒度测定仪测定载pDNA的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例59-70，季铵化度为30%）的粒径和Zeta电势。粒径测定参数如下：He-Ne激光（波长633 nm），散射角θ=173°，测定温度25 °C。Zeta电势测定参数如下：He-Ne激光（波长635 nm），散射角θ=14°，测定温度25 ℃。
pDNA包封率：
取载pDNA的甘露糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例75-86，季铵化度为30%）溶液1 mL，13,300 rpm离心30 min，取上清液500 μL，Hochest 33258试剂测定pDNA含量。按下式计算pDNA包封率：
包封率（%）=
(A-B)×100/A
其中A为pDNA投料量（mg）；B为离心后上清液中的pDNA含量（mg）。
如表4所示，载pDNA的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径为100-200 nm，Zeta电势为10-30 mV，pDNA的包封率均高于60%。
表4载pDNA的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒粒径、Zeta电势和包封率
| Sample | 粒径（nm） | Zeta电势（mV） | 包封率（%） |
| 实施例59 | 195.3±21.4 | 24.1±4.1 | 60.3±3.4 |
| 实施例60 | 167.2±14.1 | 22.9±5.2 | 69.2±1.8 |
| 实施例61 | 108.1±4.9 | 30.4±2.5 | 82.3±2.0 |
| 实施例62 | 103.1±5.3 | 10.4±2.9 | 70.5±2.9 |
| 实施例63 | 109.2±4.6 | 20.6±5.3 | 71.4±1.5 |
| 实施例64 | 196.2±5.2 | 24.4±3.9 | 72.9±2.2 |
| 实施例65 | 109.3±5.0 | 22.3±5.1 | 72.3±4.2 |
| 实施例66 | 117.4±6.2 | 25.8±3.4 | 76.4±9.2 |
| 实施例67 | 103.2±5.8 | 29.8±5.0 | 80.5±1.3 |
| 实施例68 | 104.2±6.9 | 23.5±2.9 | 74.2±8.4 |
| 实施例69 | 200.1±4.7 | 19.3±1.6 | 77.6±3.9 |
| 实施例70 | 104.2±5.1 | 22.4±4.0 | 82.3±5.9 |
实施例86 载siRNA的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径、Zeta电势和包封率
粒径、Zeta电势：
Zetasizer Nano-ZS型电位及粒度测定仪测定载siRNA的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例71-81，季铵化度为30%）的粒径和Zeta电势。粒径测定参数如下：He-Ne激光（波长633 nm），散射角θ=173°，测定温度25 °C。Zeta电势测定参数如下：He-Ne激光（波长635 nm），散射角θ=14°，测定温度25 ℃。
siRNA包封率：
取载siRNA的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例87-98，季铵化度为30%）溶液1 mL，13,300 rpm离心30 min，取上清液500 μL，Pico green试剂测定siRNA含量。按下式计算siRNA包封率：
包封率（%）=
(A-B)×100/A
其中A为pDNA投料量（mg）；B为离心后上清液中的pDNA含量（mg）。
如表5所示，载siRNA的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径为50-100 nm，Zeta电势为20-30 mV，siRNA的包封率均高于70%。
表5 载siRNA的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒粒径、Zeta电势和包封率
| Sample | 粒径（nm） | Zeta电势（mV） | 包封率（%） |
| 实施例71 | 102.3±14.3 | 22.4±3.9 | 74.2±4.4 |
| 实施例72 | 869.3±5.2 | 26.3±4.0 | 78.4±2.9 |
| 实施例73 | 97.8±4.4 | 29.4±2.2 | 79.5±2.0 |
| 实施例74 | 54.2±5.1 | 21.3±2.0 | 71.7±3.6 |
| 实施例75 | 102.4±6.9 | 22.3±1.9 | 75.2±3.9 |
| 实施例76 | 100.4±2.5 | 27.3±1.0 | 76.9±2.5 |
| 实施例77 | 50.4±15.2 | 27.3±3.9 | 79.4±5.5 |
| 实施例78 | 106.4±5.9 | 22.8±2.0 | 77.5±3.9 |
| 实施例79 | 109.3±20.4 | 21.8±3.6 | 72.0±5.2 |
| 实施例80 | 65.2±10.2 | 23.2±1.9 | 79.2±4.4 |
| 实施例81 | 54.5±4.2 | 27.4±3.9 | 78.5±3.9 |
实施例87 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒在小鼠体液中的稳定性
Man-TMC-Cys纳米粒（实施例71，季铵化度为30%，含1 μg NC siRNA）或siRNA溶液（含1 μg NC siRNA），加入等体积小鼠血清、胃液、小肠液、小肠匀浆液或腹腔液，混匀，37 °C孵育一定时间；80 °C水浴5 min终止酶反应，加入40 μL 10 mg∙mL-1肝素钠溶液，室温放置2 h使纳米粒解离；量取一定体积（含100 ng NC siRNA），加至4%低熔点琼脂糖凝胶上样孔中，55 V电泳60 min，EB显色，凝胶成像仪观察siRNA条带并拍照。
如图2所示，与小鼠体液温育后，裸siRNA降解，纳米粒组均可见清晰的siRNA电泳条带，表明纳米粒通过包载siRNA、屏蔽siRNA上的酶切位点可保护siRNA免被小鼠体液中的核酶降解。
实施例88 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒在Caco-2细胞和Raw 264.7细胞的细胞黏附
取对数生长期的Caco-2细胞或Raw
264.7细胞，胰酶消化，3,000 rpm离心5 min收集细胞，加等渗缓冲液（44.4 g∙L-1 葡萄糖，200
mg∙L-1 KCl，2.90 g∙L-1 Na2HPO4
12H2O，200 mg∙L-1 KH2PO4，pH 7.4）洗涤三次，加等渗缓冲液稀释至浓度约为0.5-1×106细胞∙mL-1。量取100 μL Man-TMC-Cys纳米粒或TMC-Cys纳米粒（实施例71，季铵化度为30%），加至1 mL细胞悬液中，37 °C培养2 h，3,000 rpm离心5 min，弃去上清液，加0.2 mol∙L-1 PBS（pH 7.4）重悬沉淀，测定Zeta电势。同法测定未与纳米粒培养细胞的Zeta电势。
Caco-2细胞与Man-TMC-Cys纳米粒和相应TMC-Cys纳米粒共培养后，Zeta电势由-9.98±0.98 mV分别变为6.68±0.84 mV和1.45±0.54 mV；Raw 264.7细胞与Man-TMC-Cys纳米粒和相应TMC-Cys纳米粒共培养后，Zeta电势由-10.26±1.92 mV分别变为7.69±2.15 mV和1.88±0.50 mV。与Man-TMC-Cys纳米粒共培养后细胞的Zeta电势显著高于TMC-Cys纳米粒组，表明Man-TMC-Cys纳米粒的细胞黏附力显著高于TMC-Cys纳米粒。
实施例89 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒在大鼠小肠离体黏膜黏附力
SD雄性大鼠麻醉后处死，剖开腹部，取约15 cm含6-7个Peyer’s结的回肠肠段，将肠段外翻，使黏膜层向外，两端以手术线结扎。以1 mL注射器向封闭肠囊内注入1 mL氧气饱和的Krebs-Ringer缓冲液后，将肠囊置于盛有载FAM-siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒（实施例71，季铵化度为30%）混悬液（含4 μg FAM-siRNA）的玻璃试管内，37℃，100 rpm温育1 h。将肠囊取出后剖开，平铺，测量肠囊表面积。荧光多功能酶标仪测定温育后纳米粒混悬液中FAM-siRNA的含量。生物黏附指数（Bioadhesion
Index， BI）采用以下公式计算：
BI(%)=100×(C1-C2)/(C1×A)
其中，C1为温育前纳米粒混悬液中FAM-siRNA的含量，C2为温育后纳米粒混悬液中FAM-siRNA的含量，A为肠囊表面积。
Man-TMC-Cys(200,30)纳米粒和TMC-Cys(200,30)纳米粒在含Peyer’s结小肠处的BI分别为10.5±2.1 %和4.5±1.8 %，表明甘露糖修饰显著提高纳米粒在小肠Peyer’s结处的黏膜黏附性。
实施例90 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒在SD大鼠小肠的离体转运
取SD大鼠，实验前禁食12小时，可自由饮水。断颈椎处死，沿腹中线打开腹腔，取出回肠，以Kreb’s-Ringer缓冲液清洗干净，剪下约8 cm长的肠段（含3个Peyer’s结或不含Peyer’s结），两端约1 cm处用丝线结扎形成封闭肠环，肠环内注入0.6 mL 纳米粒（实施例71，季铵化度为30%，含4 μg FAM-NC siRNA），以相同浓度的FAM-NC siRNA溶液为对照。肠环置高型称量瓶中，加入6 mL 37 °C、氧气饱和的Kreb’s-Ringer缓冲液，使肠环保持拉伸状态，37 °C、100 rpm振荡培养。分别于15、30、60、90、120、180、240 min取样200 μL，补加37 °C Kreb’s-Ringer缓冲液200 μL。样品12,000 rpm离心5 min，荧光多功能酶标仪测定上清液中FAM-NC siRNA含量。按下式计算计算FAM-NC
siRNA的表观渗透系数Papp。
在含Peyer’s结肠段中，Man-TMC-Cys纳米粒、相应的TMC-Cys纳米粒和裸siRNA的P app 分别为（3.68±0.76）×10-6 cm/s、（5.32±1.04）×10-7 cm/s和（1.04±0.09）×10-8 cm/s；在不含Peyer’s结肠段中Man-TMC-Cys纳米粒、相应的TMC-Cys纳米粒和裸siRNA的P app 分别为（2.21±0.82）×10-6 cm/s、（2.74±0.42）×10-7 cm/s和（1.05±0.06）×10-8 cm/s。纳米粒可显著促进siRNA的小肠转运，含Peyer’s结或不含Peyer’s结肠段中Man-TMC-Cys纳米粒的转运量均显著高于TMC-Cys纳米粒，且含Peyer’s结肠段中siRNA的转运量高于不含Peyer’s结肠段中的转运量，表明甘露糖修饰的纳米粒可通过提高对上皮细胞和M细胞的主动靶向作用促进纳米粒的摄取，从而增加siRNA的小肠转运量。
实施例91 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒在Peyer’s结处的摄取
取SD大鼠，实验前禁食12小时，可自由饮水，称重，按40 mg∙kg-1腹腔注射戊巴比妥钠溶液（0.4%,
w/v）麻醉大鼠，沿腹中线打开腹腔，取出15 cm左右的回肠肠段（约含6-7个Peyer’s结），加生理盐水冲洗至净，两端用丝线结扎成封闭肠环，肠环中注入1 mL纳米粒（实施例71，季铵化度为30%）溶液（含4 μg FAM-siRNA）。将肠环放回腹腔，2 h后处死大鼠，沿结扎线剪开肠环，生理盐水冲洗，纵向剖开，刮去黏液层，剪取含Peyer’s结小肠组织；加入1 mL
RIPA裂解液（50 mmol/L pH 7.4 Tris•HCl，150 mmol/L NaCl，1% NP40，0.1% SDS），匀浆，12,000 rpm离心10
min。荧光多功能酶标仪测定上清液中FAM-siRNA的含量（λex=480 nm, λem=520
nm），Lowry法测定蛋白质含量。摄取量以每1 mg蛋白质含FAM-NC siRNA的量（μg）表示（μg/mg）。
Man-TMC-Cys(200,30)纳米粒在Peyer’s结处的摄取量为6.2±0.4 μg/mg，而相应的TMC-Cys(200,30)纳米粒在Peyer’s结处的摄取量为2.6±0.5 μg/mg，表明甘露糖修饰显著提高纳米粒在Peyer’s结处的吸收。
实施例92载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒在Caco-2细胞的摄取
取生长旺盛的Caco-2细胞，以5×104细胞/孔的密度接种Caco-2细胞至24孔板，37 °C、5% CO2培养24 h；吸弃培养基，加入1 mL无血清DMEM，3孔为一组，按每孔0.4 μg FAM-siRNA分别向每组孔中加入载siRNA的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例71，季铵化度为30%），37 °C、5% CO2培养4 h；吸弃孔中液体，加PBS洗涤三次，加入0.5 mL 0.5% SDS溶液（pH
8.0），室温、避光裂解20 min。荧光多功能酶标仪测定裂解液中FAM-
siRNA的含量（λex=480 nm, λem=520 nm），Lowry法测定蛋白质含量。摄取量以每1 mg蛋白质含FAM-NC siRNA的量（μg）表示（μg/mg）。
Man-TMC-Cys(200,30)纳米粒在Caco-2细胞的摄取量为3.2±0.4 μg/mg，而相应的TMC-Cys(200,30)纳米粒在Caco-2细胞的摄取量为1.2±0.1 μg/mg，表明甘露糖修饰显著提高纳米粒的Caco-2细胞摄取能力。
实施例93 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒在Raw 264.7细胞的摄取
取生长旺盛的Raw 264.7细胞，以5×104细胞/孔的密度接种Raw 264.7细胞至24孔板，37 °C、5% CO2培养24 h；吸弃培养基，加入1 mL无血清DMEM，3孔为一组，按每孔0.4 μg FAM-siRNA分别向每组孔中加入载siRNA的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例71，季铵化度为30%），37 °C、5% CO2培养4 h；吸弃孔中液体，加PBS洗涤三次，加入0.5 mL 0.5% SDS溶液（pH
8.0），室温、避光裂解20 min。荧光多功能酶标仪测定裂解液中FAM-
siRNA的含量（λex=480 nm, λem=520 nm），Lowry法测定蛋白质含量。摄取量以每1 mg蛋白质含FAM-NC siRNA的量（μg）表示（μg/mg）。
Man-TMC-Cys(200,30)纳米粒在Raw 264.7细胞的摄取量为1.2±0.3 μg/mg，而相应的TMC-Cys(200,30)纳米粒在Raw
264.7细胞的摄取量为0.5±0.1 μg/mg，表明甘露糖修饰显著提高纳米粒的Raw
264.7细胞摄取能力。
实施例94 载siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒在Raw 264.7细胞的转染
以2'-O-Me TNF-α siRNA为靶基因，以4×104细胞/孔的密度接种Raw 264.7细胞至24孔板，37 °C、5% CO2培养24 h；更换无血清培养基，加入纳米粒（实施例71，季铵化度为30%），37 °C、5% CO2培养4 h；不加纳米粒的孔为空白对照，加入Lipofectamine2000/siRNA复合物的孔为阳性对照；吸弃孔中液体，每孔加入1 mL含10% 胎牛血清的DMEM培养基，37 °C、5% CO2继续培养20 h（转染总时间为24 h）；孔中加入终浓度为100 ng/mL的LPS，37 °C刺激5 h；吸取上清液，小鼠TNF-α ELISA试剂盒测定TNF-α含量。以空白对照组TNF-α含量为100%，计算各试验组相对百分含量（%）。
Man-TMC-Cys(200,30)纳米粒在Raw 264.7细胞的基因沉默效率为73.4±3.1%时，给药量为每孔0.002 μg siRNA，而相应的TMC-Cys(200,30)纳米粒和Lipofectamine2000/siRNA复合物在Raw
264.7细胞的基因沉默效率分别为70.8±3.5%和74.7±3.1%时，给药量为每孔0.4 μg siRNA。上述结果表明甘露糖修饰显著提高了纳米粒的细胞转染效率，且Man-TMC-Cys(200,30)纳米粒的转染效率优于常用的转染试剂Lipofectamine2000。
实施例95 载TNF-α siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒口服后在急性肝损伤模型小鼠的体内转染
雄性C57BL/6小鼠，实验前禁食12小时，可自由饮水。称重，分别灌胃给予Man-TMC-Cys纳米粒（实施例71，季胺化度30%，给药剂量按siRNA计为50 μg∙kg-1）、相应TMC-Cys纳米粒（给药剂量按siRNA计为50 μg∙kg-1）和0.2
mL生理盐水（空白对照组）。给药后24 h腹腔注射1250 mg∙kg-1 D-半乳糖胺盐酸盐溶液和12.5 μg∙kg-1 LPS构建急性肝损伤模型，2 h后眼眶取血0.2 mL，12,000 rpm离心4 min，精密量取血清10 μL，小鼠TNF-α ELISA试剂盒测定血液TNF-α含量。以空白对照组TNF-α含量为100%，计算各试验组相对百分含量（%）。
Man-TMC-Cys纳米粒和相应的TMC-Cys纳米粒均可显著降低小鼠血清TNF-α浓度，分别降至空白对照组的14.52±2.23 %和55.26±14.55 %，表明甘露糖修饰可提高纳米粒对小肠M细胞和巨噬细胞的主动靶向作用，从而增加siRNA的小肠转运量、促进siRNA转染小肠巨噬细胞并沉默TNF-α；小肠巨噬细胞转运并浸润其他网状内皮系统组织，最终降低全身巨噬细胞中的TNF-α水平，发挥口服RNAi作用。
实施例96 载TNF-α siRNA的甘露糖修饰壳聚糖季铵盐-半胱氨酸纳米粒口服后在葡聚糖硫酸钠诱导溃疡性结肠炎模型小鼠的体内转染
雄性C57BL/6小鼠，称重，随机分为三组。第一组给予3%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液自由饮用7天且于前5天连续每天灌胃给予Man-TMC-Cys纳米粒（实施例72，季胺化度30%，给药剂量按siRNA计为50 μg∙kg-1）；第二组给予3%
DSS溶液自由饮用7天且于前五天连续每天灌胃给予0.2 mL生理盐水（阳性对照组）；第三组给予水自由饮用7天（阴性对照组）。第8天处死小鼠，小鼠TNF-α ELISA试剂盒测定小鼠结肠组织匀浆液中TNF-α含量。
Man-TMC-Cys纳米粒组、阳性对照组和阴性对照组小鼠结肠组织TNF-α含量分别为986.1±482.2、2910.9±648.2和1185.7±379.1 pg/g，Man-TMC-Cys纳米粒可有效降低DSS诱导溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织的TNF-α含量，表明甘露糖修饰可促进纳米粒口服后靶向聚集于结肠炎症部位的巨噬细胞，并转染巨噬细胞、沉默TNF-α，发挥口服RNAi作用。
Claims (10)
1.一种甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于由荷正电的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐和离子交联剂经聚电解质作用生成，同时包载蛋白质多肽药物或核酸药物；其中，所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐为壳聚糖的氨基依次经季铵化修饰、甘露糖修饰和巯基化修饰所得的共聚物，其中壳聚糖重均分子量为30-1,000 kDa；所述季铵化度为15-60%，摩尔百分数；甘露糖修饰物为甘露吡喃异硫氰酸苯酯，所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐的甘露糖修饰度为10-50%，摩尔百分数；巯基化修饰物为半胱氨酸或巯基乙酸，所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐游离巯基修饰率为40-200 μmol/g，二硫键修饰率为60-300 μmol/g。
2.根据权利要求1所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述离子交联剂选自三聚磷酸钠、硫酸镁、γ-聚谷氨酸、透明质酸、丙烯酸树脂的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述蛋白质多肽药物选自胰岛素、降钙素、干扰素、抗利尿激素、奥曲肽、布舍瑞林、亮丙瑞林、红细胞生长素、血红蛋白、白蛋白、细胞色素、白介素、抗原或抗体中的一种；
所述核酸药物选自DNA、RNA、寡聚核苷酸或多核苷酸中的一种。
4.根据权利要求3所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述的DNA为质粒DNA；所述的RNA为siRNA、shRNA或microRNA中的一种。
5.根据权利要求1—4之一所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述纳米粒的平均粒径为50-1000 nm。
6.根据权利要求1--4之一所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述纳米粒的Zeta电势为10-40 mV。
7.根据权利要求1--4之一所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述纳米粒对蛋白质多肽药物或核酸药物的包封率为60-100%。
8.一种如权利要求1—7之一所述甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备方法，其特征在于具体步骤为：
（1）甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐，离子交联剂，蛋白质多肽药物或核酸药物溶于水；
（2）将甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和蛋白质多肽药物或核酸药物的混合溶液中，其中甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与离子交联剂的质量比为2:1-15:1，离子交联剂与蛋白质多肽药物或核酸药物的质量比1:5-15:1；
（3）室温静置，荷正电的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂、蛋白质多肽药物经聚电解质作用形成纳米粒。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐按如下步骤制备：
（1）合成壳聚糖季铵盐，反应时间为45-180 min；所得壳聚糖季铵盐以Cl-型阴离子交换树脂纯化、冷冻干燥；其中反应45、120和180 min所得的壳聚糖季铵盐的季铵化度分别为15%、30%和60%；
（2）壳聚糖季铵盐和甘露吡喃异硫氰酸苯酯分别溶于水和二甲基亚砜中，壳聚糖季铵盐和甘露吡喃异硫氰酸苯酯的质量比为1:1-25:1，调节pH至8.5-9.5，室温反应6-24 h，超滤，冷冻干燥，得甘露糖修饰的壳聚糖季铵盐；
（3）甘露糖修饰壳聚糖季铵盐和半胱氨酸溶于水中，甘露糖修饰壳聚糖季铵盐和巯基化修饰物的质量比为32:1-1:5，加入终浓度为50-500 mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH至3.0-5.0，室温反应2-8 h，透析，冷冻干燥，得甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐。
10.权利要求1—7之一所述的甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在制备口服给药系统或者基因传释系统中的应用。
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