CN105663086A - 一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法 - Google Patents

一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105663086A
CN105663086A CN201610220564.5A CN201610220564A CN105663086A CN 105663086 A CN105663086 A CN 105663086A CN 201610220564 A CN201610220564 A CN 201610220564A CN 105663086 A CN105663086 A CN 105663086A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanoparticle
responsive type
vaccine
preparation
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610220564.5A
Other languages
English (en)
Inventor
宗莉
张文晶
陈玉林
姜雷
王佳佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Pharmaceutical University
Original Assignee
China Pharmaceutical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Pharmaceutical University filed Critical China Pharmaceutical University
Priority to CN201610220564.5A priority Critical patent/CN105663086A/zh
Publication of CN105663086A publication Critical patent/CN105663086A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及一种药剂学领域的pH敏感型口服蛋白疫苗的制备技术。所述的口服蛋白疫苗是由pH敏感型材料包覆的甘露糖化壳聚糖纳米粒。本发明通过离子交联法制备包载抗原的甘露糖化壳聚糖纳米粒，再通过静电结合作用将pH敏感型材料包覆并固化于甘露糖化壳聚糖纳米粒表面，制备条件温和，方法简便，无需有使用机溶剂，在制备过程中最大程度保护药物的活性。本发明所制备的纳米粒在酸性条件下可以保持颗粒完整性，有效保护蛋白免受胃酸的破坏。

Description

一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其涉及一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法。
背景技术
口服免疫能够产生有效的局部黏膜免疫和机体系统免疫，是一种有效的免疫途径。但是，口服递送蛋白抗原要面对诸多挑战，一是经口服蛋白抗原需要克服胃内酸降解和胃肠道内蛋白酶的降解，二是免疫系统对抗原摄取量低的问题。
为了增加机体免疫细胞对抗原的摄取，我们利用了甘露糖受体在巨噬细胞和树突状细胞等抗原提呈细胞表面大量表达这一特点，发明了一种简便的甘露糖化壳聚糖(MCS)的制备方法(中国专利，CN102477107B，授权日：2013年10月9日)。用甘露糖基修饰壳聚糖，能选择性提高抗原提呈细胞对疫苗的摄取、提高靶向效率，增强疫苗的免疫效果。我们制备了MCS抗肿瘤DNA疫苗，结果表明该疫苗经粘膜免疫具有显著的效果(Molecularpharmaceutics.2013，10：2904-14)，说明MCS用于粘膜免疫可以靶向APC并增加其对抗原的摄取。
蛋白疫苗在胃肠道中容易失活和降解是口服疫苗有效性的最大阻碍。而将MCS纳米粒用于疫苗的口服给药时，也存在这一问题。由于其在胃部酸性环境会破坏形成的纳米粒结构，从而导致包载的蛋白在胃内突释及水解。因此，本发明选择了pH敏感型材料包覆壳聚糖纳米粒，由于pH敏感型材料在胃内pH条件下不溶，可保护MCS纳米粒在酸性环境中的稳定性。常用的pH敏感型材料如丙烯酸树脂类(Molecules，2013，18(6)：6734-6747.)、海藻酸盐(JournalofDrugTargeting，2011，20(1)：76-84.)等，但是已报道的制备方法多为乳化法，涉及有机溶剂以及较为剧烈的制备条件，在制备过程中对蛋白药物可能产生破坏，影响其活性。发明所采用的聚合物为甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯(商品名：EudragitL100)，利用静电作用将pH敏感型聚合物包覆于MCS纳米粒上。这种聚电性纳米粒结构较为致密，比较一些“包裹”技术，没有蛋白泄露问题。另外，在纳米粒外巧妙的包覆一薄层肠溶衣，在胃中可以有效保护蛋白结构完整性。且本发明所述疫苗为纳米级颗粒，比较大粒径的微粒系统在肠道派尔氏集合淋巴结的摄取效果更佳。
目前未见用该方法制备pH敏感型MCS纳米粒作为口服蛋白疫苗的相关文献和专利。
发明内容
本发明的目的是克服目前口服蛋白疫苗存在的胃肠道稳定性低和体内吸收差的问题，提供一种pH敏感型的口服蛋白疫苗的制备方法。
本发明提供的pH敏感型口服蛋白疫苗，是用聚合物材料MCS制备包覆蛋白抗原的纳米粒，再利用pH敏感型材料对纳米粒进行包覆，使载有蛋白抗原的纳米粒具有pH敏感性。
本发明制备的疫苗经口服后，能够在通过胃部时保护蛋白抗原不被酸和酶降解破坏，进入小肠后，具有pH敏感性的衣膜溶解，通过MCS的甘露糖配体与抗原提呈细胞表面的甘露糖受体结合，通过糖类识别机制，借助受体介导的抗原提呈细胞主动靶向作用，增加机体免疫系统对抗原的摄取，有效激活免疫应答，增强抗原特异性抗体。
本发明提供一种制备前述纳米粒的方法，采用的材料为甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(Eudragit)，该共聚物在pH大于6的条件下溶解，其羧基荷负电，在pH小于6的条件下不溶。本发明利用静电结合作用自组装形成纳米粒，再通过调节pH的方法将pH敏感型材料固化在纳米粒表面，形成致密的衣膜。该过程无需有使用机溶剂，制备条件温和，有利于保护蛋白药物的活性。本发明所述的纳米粒能够抵抗胃肠道环境中低pH以及酶等对蛋白抗原的破坏，因而可以作为口服蛋白疫苗的载体。
具体制备方法如下：
精密称取一定量的MCS，加入醋酸溶液中，配制为一定浓度的甘露糖化壳聚糖溶液。另外配制一定浓度三聚磷酸钠、蛋白药物和pH敏感型聚合物溶液。取MCS溶液，室温下磁力搅拌，滴加蛋白药物溶液，搅拌5min，再滴加入三聚磷酸钠溶液，维持搅拌30min，即形成MCS纳米粒混悬液。将上述MCS纳米粒混悬液滴加入pH敏感型聚合物溶液中，持续磁力搅拌20min，用HCl溶液调节混悬液的pH值，固化纳米粒，室温搅拌20min，即得pH敏感型口服蛋白疫苗。pH敏感型口服蛋白疫苗的透射电镜图见图1。
以牛血清白蛋白(albuminfrombovineserum，BSA)为模型蛋白抗原，按上述方法制备BSA/MCS/EudragitL100纳米粒(BSA/MCS/EduNPs)以及BSA/MCS纳米粒(BSA/MCSNPs)在酸中的释放结果如图2所示。由图2可见，BSA/MCS纳米粒在0.1MHCl溶液中释放速度很快，2h内的累积释放超过70％，而BSA/MCS/Edu纳米粒在0.1MHCl中72h的累积释放小于10％，表明包覆EudragitL100的BSA/MCS/Edu纳米粒在胃中可以保持颗粒完整性，有效保护蛋白免受胃酸的破坏。
采用SDS-PAGE凝胶电泳考察考察BSA/MCS/EudragitL100纳米粒在人工胃液中蛋白结构的影响。将纳米粒置于人工胃液(含1％胃蛋白酶的0.1MHCl)中释放蛋白2h，离心分离纳米粒和上清液(上清液A)，将收集的纳米粒再置于pH6.8的磷酸盐缓冲液中释放蛋白，离心分离收集上清液(上清液B)，用SDS-PAGE凝胶电泳考察蛋白结构的完整性，结果如图3所示。条带1和条带2分别是BSA/MCS/Edu纳米粒经释放得到的上清液A和上清液B，条带3和条带4分别是BSA/MCS纳米粒经释放得到的上清液A和上清液B。由凝胶电泳图可见，BSA/MCS/Edu纳米粒与人工胃液共孵育2h，上清液中几无蛋白，表明纳米粒的结构完整，蛋白仍然包裹于纳米粒中，纳米粒在磷酸盐缓冲液中释放出蛋白。而BSA/MCS纳米粒与人工胃液共孵育2h，上清液中释放大量蛋白，表明纳米粒结构被破坏。实验结果证明，BSA/MCS/Edu纳米粒能够在胃液中有效保护蛋白结构的完整性。
本发明所述的甘露糖化壳聚糖分子量为5～500kDa。
本发明所述的pH敏感型共聚物包括但不限于丙烯酸树脂类共聚物、纤维素衍生物等。
本发明所述的口服蛋白疫苗是由pH敏感型共聚物包裹的载有蛋白抗原的甘露糖化壳聚糖纳米粒，粒径范围在200～800nm，zeta电位在10～20mV。
附图说明
图1为本发明制备的pH敏感型口服蛋白疫苗透射电镜图；
图2为本发明制备的pH敏感型口服蛋白疫苗与其他载体在酸中的体外释放曲线；
图3为本发明制备的pH敏感型口服蛋白疫苗及其他载体的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果。
具体实施方式
实施例1：纳米粒的制备
取2mg/mL的MCS溶液，室温下磁力搅拌，滴加牛血清白蛋白(BSA)溶液，搅拌5min，再滴加入1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，维持搅拌30min，即形成包载有BSA的MCS纳米粒混悬液。将上述BSA/MCS纳米粒混悬液滴加入2mg/mL的EudragitL100溶液中，持续磁力搅拌20min，室温搅拌20min，即得BSA/MCS/Edu纳米粒。
实施例2：纳米粒的制备
取2mg/mL的MCS溶液，室温下磁力搅拌，滴加BSA溶液，搅拌5min，再滴加入1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，维持搅拌30min，即形成包载有BSA的MCS纳米粒混悬液。将上述BSA/MCS纳米粒混悬液滴加入2mg/mL的EudragitL100溶液中，持续磁力搅拌20min，用HCl溶液调节pH至5.5，室温搅拌20min，即得BSA/MCS/Edu纳米粒。
实施例3：纳米粒的制备
取1mg/mL的MCS溶液，室温下磁力搅拌，滴加BSA溶液，搅拌5min，再滴加入1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，维持搅拌30min，即形成包载有BSA的MCS纳米粒混悬液。将上BSA/MCS纳米粒混悬液滴加入1mg/mL的EudragitL100溶液中，持续磁力搅拌20min，用HCl溶液迅速调节pH至5.0，室温搅拌20min，即得BSA/MCS/Edu纳米粒。

Claims (5)

1.一种pH敏感型口服蛋白疫苗，其特征是该疫苗通过pH敏感型材料对载有蛋白多肽抗原的甘露糖化壳聚糖纳米粒进行包裹，使甘露糖化壳聚糖纳米粒具有pH敏感性，在疫苗通过胃部时保护纳米粒不被低pH环境和胃蛋白酶破坏，并在肠道中pH敏感型材料溶解，暴露出的甘露糖化壳聚糖纳米粒通过甘露糖配体靶向树突细胞、巨噬细胞等抗原提呈细胞，增加免疫细胞对蛋白抗原的摄取。
2.根据权利要求1所述的pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述疫苗的制备方法包括如下步骤：①用的甘露糖化壳聚糖溶液、蛋白抗原溶液、三聚磷酸钠溶液制备载蛋白抗原甘露糖化壳聚糖纳米粒；②将甘露糖化壳聚糖溶液与pH敏感型聚合物溶液混合，通过静电作用结合在纳米粒表面，接着迅速调节pH值，固化纳米粒，冷冻干燥后即为所述纳米粒。
3.权利要求2中所述的pH敏感型材料包括但不限于丙烯酸树脂类共聚物、纤维素衍生物、海藻酸盐等。
4.根据权利要求2方法制备的pH敏感型口服蛋白疫苗的粒径为200～800nm，zeta电位在10～20mV。
5.根据权利要求2方法制备的pH敏感型口服蛋白疫苗的包封率为70～95％。
CN201610220564.5A 2016-04-07 2016-04-07 一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法 Pending CN105663086A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610220564.5A CN105663086A (zh) 2016-04-07 2016-04-07 一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610220564.5A CN105663086A (zh) 2016-04-07 2016-04-07 一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105663086A true CN105663086A (zh) 2016-06-15

Family

ID=56308812

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610220564.5A Pending CN105663086A (zh) 2016-04-07 2016-04-07 一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105663086A (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070029982A (ko) * 2005-09-12 2007-03-15 재단법인서울대학교산학협력재단 만노스화 키토산 유도체 및 이를 이용한 유전자 전달체
CN101831005A (zh) * 2010-04-27 2010-09-15 中国药科大学 pH敏感型壳聚糖衍生物及其在药剂学中的应用
CN102380103A (zh) * 2011-10-28 2012-03-21 复旦大学 甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用
CN102477107A (zh) * 2010-11-29 2012-05-30 中国药科大学 一种甘露糖化壳聚糖的简便制备方法
CN102485772A (zh) * 2010-12-01 2012-06-06 吉林大学 壳聚糖微球作为基因疫苗载体的制备方法及应用
CN102526742A (zh) * 2012-03-05 2012-07-04 中国药科大学 具有溶酶体逃逸能力的功能性纳米载体及其制备方法
CN103800289A (zh) * 2014-02-26 2014-05-21 蒋鸥 治疗恶性肿瘤的甘露糖化壳聚糖与唑来磷酸复合物纳米颗粒药物的制备方法
CN104623685A (zh) * 2015-02-11 2015-05-20 中国药科大学 一种肿瘤间质pH敏感型靶向树状聚合物及其制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070029982A (ko) * 2005-09-12 2007-03-15 재단법인서울대학교산학협력재단 만노스화 키토산 유도체 및 이를 이용한 유전자 전달체
CN101831005A (zh) * 2010-04-27 2010-09-15 中国药科大学 pH敏感型壳聚糖衍生物及其在药剂学中的应用
CN102477107A (zh) * 2010-11-29 2012-05-30 中国药科大学 一种甘露糖化壳聚糖的简便制备方法
CN102485772A (zh) * 2010-12-01 2012-06-06 吉林大学 壳聚糖微球作为基因疫苗载体的制备方法及应用
CN102380103A (zh) * 2011-10-28 2012-03-21 复旦大学 甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用
CN102526742A (zh) * 2012-03-05 2012-07-04 中国药科大学 具有溶酶体逃逸能力的功能性纳米载体及其制备方法
CN103800289A (zh) * 2014-02-26 2014-05-21 蒋鸥 治疗恶性肿瘤的甘露糖化壳聚糖与唑来磷酸复合物纳米颗粒药物的制备方法
CN104623685A (zh) * 2015-02-11 2015-05-20 中国药科大学 一种肿瘤间质pH敏感型靶向树状聚合物及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
崔子寅: "甘露糖受体介导的多糖重组抗原铜绿假单胞菌疫苗的研制及其免疫分子机制", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》 *
郑爱萍 等: "胸腺五肽pH-敏感壳聚糖纳米粒的制备、体外释放及生物活性", 《中国药学杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Preparation of alginate coated chitosan microparticles for vaccine delivery
Mitra et al. Chitosan microspheres in novel drug delivery systems
Wang et al. Manufacturing techniques and surface engineering of polymer based nanoparticles for targeted drug delivery to cancer
Lengyel et al. Microparticles, microspheres, and microcapsules for advanced drug delivery
Borges et al. Preparation of coated nanoparticles for a new mucosal vaccine delivery system
Sahil et al. Microsphere: A review
Leonard et al. Hydrophobically modified alginate hydrogels as protein carriers with specific controlled release properties
Takka et al. Evaluation of chitosan/alginate beads using experimental design: formulation and in vitro characterization
CA1267851A (en) Coated transplants and method for making same
Nair et al. Application of chitosan microspheres as drug carriers: a review
CN102250365B (zh) 一种pH敏感的还原响应性纳米凝胶及其制备方法
CN109432048B (zh) 一种血小板膜包裹载药多孔纳米颗粒及其制备方法
JPH04225915A (ja) 微粒子形態のポリ電解質コンプレックスおよび少くとも一つの活性物質を含む薬学的組成物
CN108578357A (zh) 一种具有核-壳结构的蛋白质-多糖自组装纳米凝胶及其制备方法与应用
CN110432377A (zh) 一种大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶及其制备方法和应用
CN105168180A (zh) 一种基于酵母微囊的口服靶向载体系统及其制备方法
Swain et al. Modified alginate beads for mucoadhesive drug delivery system: an updated review of patents
NO843481L (no) Fremgangsmaate for innkapsling av et kjernemateriale i en semipermeabel membran
Fasquelle et al. Importance of the phospholipid core for mucin hydrogel penetration and mucosal cell uptake of maltodextrin nanoparticles
CN102416024A (zh) 一种噬菌体口服微球制剂及其制备方法
Grabnar et al. Physicochemical characterization of protein-loaded pectin-chitosan nanoparticles prepared by polyelectrolyte complexation
CN101259400A (zh) 一种核壳结构纳米微囊的制备方法
Ahmadi et al. De-esterified tragacanth microspheres loaded into eudragit S-100 coated capsules for colon-targeted delivery
CN105663086A (zh) 一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法
WO1993008766A1 (en) Transplant protective coating

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160615

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication