CN104623685A - 一种肿瘤间质pH敏感型靶向树状聚合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤间质pH敏感型靶向树状聚合物及其制备方法，该树状聚合物的通式为CMCS-PAMAM-X，其中，CMCS为羧甲基壳聚糖，PAMAM为5代的阳离子聚酰胺-胺树状大分子，X为阿霉素。其制备方法依次包括CMCS的制备、载药PAMAM内核的制备和pH敏感型靶向树状聚合物的制备三个步骤。本发明的树状聚合物不仅可实现药物至肿瘤组织的靶向递送，降低肿瘤靶向载药递送系统对正常组织的毒副作用，同时还能促进载体跨肿瘤细胞膜转运，增加药物在肿瘤细胞内的累积而提高疗效。

Description

一种肿瘤间质 pH 敏感型靶向树状聚合物及其制备方法

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种肿瘤间质pH敏感型靶向树状聚合物及其制备方法。

背景技术

功能性高分子材料已成为肿瘤靶向给药系统研究的热点。近几年来，大量功能材料被用于制备肿瘤靶向载药递送系统，包括各类脂质体、胶束和微乳等。然而这些靶向载药递送系统仍存在入胞能力差，对难溶性药物增溶能力有限等诸多弊端。阳离子载体聚酰胺-胺（Polyamidoamine，PAMAM）树状聚合物大分子是一种新型高度分支的功能性材料，具有水溶性高、末端官能团可修饰、具有较大的内部疏水空腔等优势。由于PAMAM粒径小（5～10 nm），易于被肿瘤组织的血管截留，具有被动靶向的特性。同时，PAMAM荷正电，易与荷负电的肿瘤细胞膜结合，具备良好的入胞能力，可介导药物在肿瘤部位高效入胞以发挥疗效，被认为是最有前景的肿瘤靶向纳米递药系统之一。然而，未经修饰的PAMAM表面富集正电荷，会导致血细胞被破坏，带来严重的毒副作用，且易被巨噬细胞快速识别并吞噬，使得其应用受到大大限制。因此，很多研究致力于对树状聚合物表面进行修饰以掩盖其正电荷，其中接枝聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）是主要的修饰手段，但该方法在降低载体毒副作用的同时也降低了其入胞能力。为了克服以上矛盾，寻找一种新的可灵活响应的修饰材料显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种肿瘤间质pH敏感型靶向树状聚合物及其制备方法，该树状聚合物不仅可实现药物至肿瘤组织的靶向递送，降低肿瘤靶向载药递送系统对正常组织的毒副作用，同时还能促进载体跨肿瘤细胞膜转运，增加药物在肿瘤细胞内的累积而提高疗效。

一种肿瘤间质pH敏感型靶向树状聚合物，通式为：CMCS-PAMAM-X，其中，CMCS为羧甲基壳聚糖，PAMAM为5代的阳离子聚酰胺-胺树状大分子，X为阿霉素，所述树状聚合物的粒径为50～200 nm。

作为上述发明的进一步改进，所述羧甲基壳聚糖分子量为2～25 kDa，羧化度为50%～70%。

上述肿瘤间质pH敏感型靶向树状聚合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将0.5~10g壳聚糖溶于8~150 mL 50%wt NaOH溶液中，碱化12~24 h后抽滤，所得固体Ⅰ加至2.5倍质量的氯乙酸中，室温下反应6~24 h后抽滤，所得固体Ⅱ加25~500 mL水溶解，用2 M HCl调节溶液pH至7.0，将溶液离心，加100~1000 mL无水乙醇至上清液中，抽滤，用无水乙醇洗涤所得固体Ⅲ，于30～60℃烘干固体Ⅲ，加10～30 mL水溶解，用分子量为500～3500的透析袋在水中透析除杂，冻干48 ~ 96 h，得CMCS；

步骤2，称取5 ~ 100 mg PAMAM溶于1.5 ~ 15 mL超纯水中，得PAMAM水溶液，称取1 ~ 20倍PAMAM摩尔量的盐酸阿霉素溶于300 ~ 3000 μL无水甲醇中，再加入5 ~ 50 μL三乙胺，得阿霉素甲醇溶液，将该溶液滴加到上述PAMAM水溶液中，500 ~ 2000 rpm搅拌避光反应12 ~ 24 h，将反应液离心，取上清液，冷冻干燥得载药PAMAM内核；

步骤3，将步骤2所得5 ~ 100 mg载药PAMAM内核溶于1 ~ 10 mL超纯水中，取100 μL加至1 ~ 10 mL 1mg/mL ~ 10mg/mL的CMCS PBS溶液中，500 ~ 2000 rpm搅拌反应10 ~ 30 min，得靶向树状聚合物，其中PBS溶液pH为7.4，PO₄ ^3-浓度为10 mM。

在正常生理环境（pH 7.4）中，CMCS荷负电，通过静电作用吸附在PAMAM树状聚合物大分子表面，从而降低阳离子聚合物PAMAM的毒性，并防止其被巨噬细胞迅速清除。一旦到达肿瘤间质环境（pH 6.5）中，外层CMCS发生电荷翻转，荷正电，两者电性相斥，CMCS迅速与内核分离，随后，PAMAM恢复高的正电位，促进PAMAM粒子内化至肿瘤细胞，增强阿霉素的抗肿瘤作用。

本发明创造性的通过制备羧化度为50～70%的羧甲基壳聚糖，其与PAMAM结合，能够选择性地在肿瘤间质的pH环境下与PAMAM脱离，从而起到靶向选择的特性。

本发明不仅可实现药物至肿瘤组织的靶向递送，降低肿瘤靶向载药递送系统对正常组织的毒副作用，同时还能促进载体跨肿瘤细胞膜转运，增加药物在肿瘤细胞内的累积而提高疗效。

附图说明

图1为实施例1所选用的壳聚糖和制备的羧甲基壳聚糖的红外光谱图，其中1为壳聚糖；2为羧甲基壳聚糖；

图2为人乳腺癌细胞MCF-7对实施例1所制备靶向树状聚合物和市售阿霉素溶液在pH改变时的摄取情况。

具体实施方式

实施例1

pH敏感型靶向树状聚合物的制备

步骤1，CMCS的制备：将1 g壳聚糖溶于15 mL 50% wt NaOH溶液中，碱化24 h后抽滤，所得固体Ⅰ加至2.5倍重量的氯乙酸中，室温下反24 h后抽滤，所得固体Ⅱ加50 mL水溶解，用2M HCl调节溶液pH至7.0，将溶液离心，加100 mL无水乙醇至上清液中，抽滤，用无水乙醇洗涤所得固体Ⅲ，于30 ℃烘干固体Ⅲ，加10 mL水溶解，用分子量为3500的透析袋在水中透析除杂，冻干72 h，得到白色产物0.89g。

图1为实施例1所选用的壳聚糖和制备的羧甲基壳聚糖的红外光谱图。红外光谱图分析得壳聚糖结构的主要特征峰在3366cm^{− 1}（O-H伸缩），2881cm^{− 1}（C-H拉伸），1663cm^{− 1}（N-H Ⅰ弯曲），1598cm^{− 1}（N-H Ⅱ弯曲），1157cm^{− 1}（桥O伸展），1098 cm^{− 1}（C-O伸缩）。相对于壳聚糖特征峰，羧甲基壳聚糖有更宽的频带中心在3398cm^{− 1}处，显示更强的亲水性，而在1594 cm^{− 1}强峰（N-H Ⅱ弯曲重叠）和1416cm^{− 1}可以分别表明COO-非对称和对称伸缩振动峰，验证了羧甲基基团的引入。此外，在1033cm^{− 1}对应的伯羟基基团的C-O伸缩振动峰消失也表明6位OH上的高羧甲基取代。因此，对红外光谱的结果分析证实了羧甲基壳聚糖的成功制备。

元素分析表明该羧甲基壳聚糖的羧化度为65%。

步骤2，载药PAMAM内核的制备：称取PAMAM G 5.0 10 mg，溶解于1.5 mL超纯水中，称取10倍摩尔当量的盐酸阿霉素溶于300 μL无水甲醇中，加入5 μL三乙胺中和盐酸阿霉素的盐酸，使其成为疏水性的阿霉素，溶解于甲醇当中。随后将阿霉素甲醇溶液滴加到上述PAMAM水溶液中，1000 rpm搅拌避光反应12 h，将反应液离心，取上清液，冷冻干燥72 h得载药PAMAM内核。

步骤3，pH敏感型靶向树状聚合物的制备：将步骤2中所得载药PAMAM内核 10 mg复溶于1 mL超纯水中，取100 μL加入至1 mL 5 mg/mL的羧甲基壳聚糖PBS溶液中，1000 rpm搅拌反应10 min，得靶向树状聚合物，其中PBS溶液pH为7.4，PO₄ ^3-浓度为10 mM。

羧甲基壳聚糖具有良好的生物相容性，同时也是一种两性离子聚合物，当pH改变时，会发生电荷的翻转。通过改变CMCS中羧基和氨基的比例，使其CMCS在正常生理条件下（pH 7.4）荷负电，但当pH下降至弱酸性（pH 6.5）时，CMCS可发生电荷翻转为荷正电。而肿瘤间质的pH值（pH 6.5）略低于正常组织的pH值（pH 7.4），结合这一生理上的pH值差异和CMCS的pH敏感特性，本发明创造性的制备了羧化度为50～70%的CMCS，其刚好能够达到肿瘤间质的pH敏感性，能够在pH 6.5条件下与PAMAM内核分离，促进PAMAM粒子内化至肿瘤细胞，增强阿霉素的抗肿瘤作用。而理论上当羧化度为50～70%时CMCS等电点小于6.5，在pH值为6.5的条件下CMCS荷负电，并不能满足对于肿瘤间质pH的敏感性，不能与PAMAM内核分离。

实施例2

体外细胞摄取试验

以市售阿霉素溶液为对照，进行体外细胞摄取试验，考察实施例1所得pH敏感型靶向树状聚合物的靶向性及促进细胞摄取能力。

将人乳腺癌MCF-7细胞以密度为1×10⁵细胞/孔接种于24孔板中，培养24h。此后，细胞用含有样品（阿霉素溶液和实施例1所得靶向树状聚合物，相同的最终阿霉素浓度为6.95 µg /mL）的新鲜培养基（pH 6.5和pH 7.4）处理4 h（37℃）。细胞孵育4 h后用新鲜PBS冲洗3次，然后用胰酶消化细胞，弃去胰酶后再用PBS制成细胞悬液，1000 r/min离心5 min后弃去上清液，重新加入200 µL PBS分散细胞，应用流式细胞仪观察细胞对药物的摄取能力。

实验结果如图2所示：在pH 6.5培养环境下的MCF-7细胞内平均荧光强度比在pH值为7.4时高1倍，图中 *** 表明p<0.001，靶向树状聚合物在两个pH条件下平均荧光强度有显著性差异。说明本发明所得靶向树状聚合物可在pH 6.5条件下降时迅速恢复正电荷，与带负电荷的细胞膜结合，增强肿瘤细胞摄取。另外，靶向树状聚合物所处理的细胞平均荧光强度是游离阿霉素溶液的16.45倍，说明靶向树状聚合物能更好携带药物入胞。本发明的靶向树状聚合物通过响应肿瘤间质pH，从而减少对正常细胞的毒性以及增强对肿瘤细胞的杀伤力，不仅可实现药物至肿瘤组织的靶向递送，降低肿瘤靶向载药递送系统对正常组织的毒副作用，同时还能促进载体跨肿瘤细胞膜转运，增加药物在肿瘤细胞内的累积而提高疗效。

Claims (3)

1.一种肿瘤间质pH敏感型靶向树状聚合物，其特征在于，通式为：CMCS-PAMAM-X，其中，CMCS为羧甲基壳聚糖，PAMAM为5代的阳离子聚酰胺-胺树状大分子，X为阿霉素，所述树状聚合物的粒径为50~200 nm。

2.根据权利要求1所述的肿瘤间质pH敏感型靶向树状聚合物，其特征在于：所述羧甲基壳聚糖分子量为2～25 kDa，羧化度为50%～70%。

3.权利要求1所述的肿瘤间质pH敏感型靶向树状聚合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，将0.5~10g壳聚糖溶于8~150 mL 50%wt NaOH溶液中，碱化12~24 h后抽滤，所得固体Ⅰ加至2.5倍质量的氯乙酸中，室温下反应6~24 h后抽滤，所得固体Ⅱ加25~500 mL水溶解，用2 M HCl调节溶液pH至7.0，将溶液离心，加100~1000 mL无水乙醇至上清液中，抽滤，用无水乙醇洗涤所得固体Ⅲ，于30～60℃烘干固体Ⅲ，加10～30 mL水溶解，用分子量为500～3500的透析袋在水中透析除杂，冻干48 ~ 96 h，得CMCS；

步骤2，称取5 ~ 100 mg PAMAM溶于1.5 ~ 15 mL超纯水中，得PAMAM水溶液，称取1 ~ 20倍PAMAM摩尔量的盐酸阿霉素溶于300 ~ 3000 μL无水甲醇中，再加入5 ~ 50 μL三乙胺，得阿霉素甲醇溶液，将该溶液滴加到上述PAMAM水溶液中，500 ~ 2000 rpm搅拌避光反应12 ~ 24 h，将反应液离心，取上清液，冷冻干燥得载药PAMAM内核；

步骤3，将步骤2所得5 ~ 100 mg载药PAMAM内核溶于1 ~ 10 mL超纯水中，取100 μL加至1 ~ 10 mL 1mg/mL ~ 10mg/mL的CMCS PBS溶液中，500 ~ 2000 rpm搅拌反应10 ~ 30 min，得靶向树状聚合物，其中PBS溶液pH为7.4，PO₄ ^3-浓度为10 mM。