CN112438988A - 基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体、其制备方法及应用 - Google Patents

基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体、其制备方法及应用。以壳聚糖衍生物为负电性外壳，以PAMAM@DOX为正电性内核，以CMCS为中间分子，基于静电作用自组装构建核/壳药物载体并用于HepG2肝癌细胞药效学评价。该纳米复合物在正常生理环境荷负电，提高肿瘤靶向和高效肿瘤富集；到达肿瘤组织后，实现“由负到正的电荷反转”。联合乳糖酸的主动靶向作用，增加细胞摄取；在内含体/溶酶体酸性环境下，纳米复合物重新暴露PAMAM@DOX内核，并发挥“质子海绵效应”以细胞膜亲和作用，诱导溶酶体逃逸，实现高效的抗肿瘤效果。通过体内外活性评价，证明了该纳米复合物优于单一DOX输运，能够显著提高药物抗癌活性，具有明确的增强治疗效果。

Description

基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及具有pH响应性、肿瘤细胞靶向性的核/壳药物载体，尤其涉及一种基于自组装电荷反转型核/壳药物载体，本发明还涉及所述药物载体的制备方法以及应用方法。属于药物载体、其制备方法及其应用技术领域。
背景技术
癌症(即恶性肿瘤)已经成为人类健康的严重威胁之一。根据世界卫生组织的数据报告，2018年全球恶性肿瘤死亡人数约960万人，是全球第二大死亡原因。
大部分肿瘤治疗药物在体内的非特异性组织分布及快速肾清除率，使得许多本应有效的肿瘤治疗药物无法达到理想的效果。纳米药物载体利用其独特的化学结构和尺寸效应，能够有效调控化疗药物的体内分布过程和起效方式，改变药物在肿瘤组织的分布与蓄积，改善药物的细胞摄取与释放行为，为化疗药物的肿瘤治疗提供了新的机遇。
纳米药物载体的体内递送要经过多个步骤，如纳米载体需要通过血液循环、肿瘤部位富集、肿瘤穿透、肿瘤细胞摄取和肿瘤细胞内释放药物等。然而，每个阶段对纳米载体的要求并不相同，且有时存在矛盾，譬如血液循环与细胞摄取两个阶段存在的“PEG和电荷”矛盾、血液循环与肿瘤穿透之间的“尺寸”矛盾以及细胞外药物保留与细胞内药物释放之间的“稳定性”矛盾等等。
表面电荷反转药物载体，即由亲水性“隐秘”聚合物修饰的中性或负电荷纳米药物载体在血液循环中荷负电，避免网状内皮系统清除，提高药物稳定性和有效肿瘤富集；在肿瘤部位，响应肿瘤微环境(如微酸性、酶异常或氧化还原环境等)，刺激药物载体结构发生变化，进而改变自身性能，发生电荷反转，整体荷正电，从而增强与细胞的亲和力，提高纳米药物载体的肿瘤渗透、细胞摄取以及靶向亚细胞能力。
目前，实现电荷反转的途径主要分为两种，一种是通过自身结构的质子化/去质子化过程来实现电荷反转；另一种途径是发生部分化学键的断裂，脱去电荷屏蔽层，从而裸露之前被屏蔽的正电性结构来实现电荷反转。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体、其制备方法及应用，克服纳米药物载体在药物输送中面临的多重递送屏障，实现更加高效的靶向药物递送及胞内药物释放，已达到改善药物抗肿瘤效果的目的。
本发明采用以下技术方案：
基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体，其特征在于采用如下质量比例的原料制备而成：负电性壳聚糖衍生物CS-LA-DMMA 100份，正电性内核PAMAM@DOX质量为100～1000份，羧甲基壳聚糖中间分子CMCS 400-600份；
其中，负电性壳聚糖衍生物CS-LA-DMMA的化学结构式如下：
Figure BDA0002792711990000021
优选地，所述的负电性壳聚糖衍生物的制备反应式如下：
Figure BDA0002792711990000022
优选地，所述的负电性壳聚糖衍生物(即CS-LA-DMMA)合成方法如下：分子量为2000-500000的壳寡糖通过酰胺反应交联特异性亲和ASPGR的靶向分子乳糖酸，合成CS-LA；CS-LA通过酰胺反应交联pH敏感电荷反转基团DMMA，合成CS-LA-DMMA。
所述的正电性内核PAMAM@DOX(即PAMAM@DOX)优选为第四代氨基末端的树枝状大分子包载广谱抗癌药物阿霉素。
所述的羧甲基壳聚糖中间分子(即CMCS)优选为分子量2000-100000的水溶性羧甲基壳聚糖。
所述的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、用水溶解CS-LA-DMMA得CS-LA-DMMA水溶液；
(2)、用水溶解CMCS，并与CS-LA-DMMA水溶液混合得混合液；
(3)、用水溶解PAMAM@DOX，并调节pH 4～6得PAMAM@DOX水溶液；
(4)、将混合液和PAMAM@DOX水溶液混合均匀得基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体的第二种制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、以DMSO溶解CS-LA-DMMA，得到A组分；
其中，CS-LA-DMMA按照以下步骤制备：
在CS-LA的DMSO溶液中，加入3～5倍摩尔当量的DMMA，并加入1～10倍摩尔当量的三乙胺(Triethylamine,TEA)和DMAP，TEA与DMAP之间的摩尔比为1：2，在室温条件下反应2-12h，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心收集沉淀产物，得CS-LA-DMMA；
其中CS-LA按照以下步骤合成：采用经HCl调节的pH 5.0～pH 6.0的含10mM TEMED的水溶液为溶剂，以LA羧基1.5倍摩尔当量的EDCI和1.2倍摩尔当量的NHS，在室温条件下活化LA羧基两小时，之后加入LA羧基5倍摩尔当量的CS氨基进行酰胺反应，在室温条件下继续反应12-48小时，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心收集沉淀产物，得CS-LA；
(2)、以混合溶剂溶解PAMAM@DOX，得到B组分；所述的混合溶剂由甲醇与DMSO混合而成且甲醇占比10％～35％(体积比)；
其中，PAMAM@DOX按照以下步骤制备：
以PAMAM为基准，将5倍摩尔当量的DOX·HCl溶于甲醇，加入DOX·HCl 3～4倍摩尔当量的TEA，避光搅拌10-24h进行脱盐；之后将此反应液加入PAMAM的水溶液，继续避光搅拌24h进行DOX包埋反应，得到PAMAM@DOX；
(3)、将1～5份的A组分与1份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到的粒径为500～700nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体的第三种制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、以混合溶剂溶解CS-LA-DMMA得到A组分；所述的混合溶剂由DMSO与PBS混合而成且DMSO占比90％～100％(体积比)；
其中，CS-LA-DMMA按照以下步骤制备：
在CS-LA的DMSO溶液中，加入3～5倍摩尔当量的DMMA，并加入1～10倍摩尔当量的三乙胺(Triethylamine,TEA)和DMAP，TEA与DMAP之间的摩尔比为1：2，在室温条件下反应2-12h，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心收集沉淀产物，得CS-LA-DMMA；
其中CS-LA按照以下步骤合成：采用经HCl调节的pH 5.0～pH 6.0的含10mM TEMED的水溶液为溶剂，以LA羧基1.5倍摩尔当量的EDCI和1.2倍摩尔当量的NHS，在室温条件下活化LA羧基两小时，之后加入LA羧基5倍摩尔当量的CS氨基进行酰胺反应，在室温条件下继续反应12-48小时，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心收集沉淀产物，得CS-LA；
(2)、以混合溶剂溶解PAMAM@DOX得到B组分；所述的混合溶剂由DMSO与PBS混合而成且DMSO占比80％～100％(体积比)；
其中，PAMAM@DOX按照以下步骤制备：
以PAMAM为基准，将5倍摩尔当量的DOX·HCl溶于甲醇，加入DOX·HCl 3～4倍摩尔当量的TEA，避光搅拌10-24h进行脱盐；之后将此反应液加入PAMAM的水溶液，继续避光搅拌24h进行DOX包埋反应，得到PAMAM@DOX；
(3)、将2～8份的A组分与1～8份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到粒径为360～590nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体的第四种制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、以DMSO溶解CS-LA-SA得到A组分；
(2)、以混合溶剂PAMAM@DOX得到B组分；所述的混合溶剂由甲醇与DMSO混合而成且甲醇占比25％(体积比)；
其中，PAMAM@DOX按照以下步骤制备：
以PAMAM为基准，将5倍摩尔当量的DOX·HCl溶于甲醇，加入DOX·HCl 3～4倍摩尔当量的TEA，避光搅拌10-24h进行脱盐；之后将此反应液加入PAMAM的水溶液，继续避光搅拌24h进行DOX包埋反应，得到PAMAM@DOX；
(3)、将3～5份的A组分与1份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到粒径为100～120nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
所述的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体，用于HepG2肝癌细胞体外药效学评价。
本发明具有以下优点：
第一、本发明的电荷反转型核/壳药物载体以壳聚糖衍生物作为负电性外壳，不仅使复合物具有良好的生物相容性，同时可以在体内降解，降解产物对人体无毒性，从而解决了合成材料导致的载体生物相容性差、体内毒性等问题。
第二、本发明的壳聚糖衍生物以壳聚糖为骨架，化学交联特异性亲和ASPGR的靶向分子乳糖酸和pH敏感电荷反转基团DMMA，提高了肿瘤靶向性和肿瘤富集，增加了细胞摄取。
第三、本发明的电荷反转型核/壳药物载体以PAMAM@DOX)为正电性内核，在内含体/溶酶体酸性环境诱导下，发挥PAMAM介导的“质子海绵效应”以及PAMAM阳离子电荷驱动的细胞膜亲和作用，诱导溶酶体逃逸，实现了细胞核靶向药物释放。
第四、本发明的电荷反转型核/壳药物载体以羧甲基壳聚糖为中间分子，增加了制剂稳定性，且能够响应肿瘤酸性微环境，实现了“由负到正的电荷反转”。
第五、本发明药物载体主要基于自组装实现电荷反转型核/壳药物载体的制备，制备方式为滴加混合，操作方便，条件温和。
第六、本发明的电荷反转型核/壳药物载体在生理环境荷负电，提高了肿瘤靶向和高效肿瘤富集；进一步响应肿瘤酸性微环境，实现了“由负到正电荷反转”，克服了“电荷困境”，实现了更加高效的靶向药物递送并有效改善了药物的抗肿瘤效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中CS-LA-DMMA的核磁共振氢谱图。
图2为本发明实施例1中CS-LA-DMMA的红外谱图。
图3为本发明实施例2中各个载体紫外谱图。
图4为本发明实施例3中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的电位分布图。
图5为本发明实施例4中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的透射电镜分布图。
图6为本发明实施例5中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的体外释放图。
图7为本发明实施例6中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的细胞毒性图。
图8为本发明实施例7中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的细胞定量摄取图。
图9为本发明实施例8中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的细胞凋亡图。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例进一步说明本发明。
实施例1：CS-LA-DMMA的合成与鉴定
CS-LA的合成：采用经HCl调节的pH 5.0～pH 6.0的含10mM TEMED的水溶液为溶剂，以LA羧基1.5倍摩尔当量的EDCI和1.2倍摩尔当量的NHS，在室温条件下活化LA羧基两小时，之后加入LA羧基5倍摩尔当量的CS氨基进行酰胺反应，在室温条件下继续反应12-48小时，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心(3500rpm，5min)收集沉淀产物，所得沉淀产物干燥备用。
CS-LA-DMMA的合成：在CS-LA的DMSO溶液中，加入3～5倍摩尔当量的DMMA，并加入1～10倍摩尔当量的TEA和DMAP，TEA与DMAP之间的摩尔比为1：2，在室温条件下反应2-12h，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心(3500rpm，5min)收集沉淀产物，所得沉淀产物干燥备用。
CS-LA-DMMA通过核磁共振氢谱和红外光谱鉴定结构。图1 1H-NMR结果可知：在CS-LA-DMMA图谱中，化学位移2.0～2.1ppm，2.6～2.9ppm归属于CS氢的特征峰，化学位移3.5～4.0ppm归属于LA氢的特征峰，化学位移1.6～1.9ppm归属于DMMA甲基氢的特征峰，上述特征峰均有显示，说明CS-LA-DMMA合成成功。
图2FT-IR结果可知：3450cm-1的宽谱带归属于CS中N-H伸缩振动和O-H伸缩振动的重叠峰，1738cm-1归属于LA的羧基信号。在CS-LA图谱中，由于LA的-OH信号增加，3450cm-1峰变宽；同时由于酰胺反应，在1738cm-1处的LA羧基信号峰减弱，说明CS-LA成功合成。与LA-CS图谱相比，在LA-CS-DMMA图谱中，新峰1700cm-1和959cm-1分别归属于DMMA中羧基的伸缩振动ν(C＝O)以及弯曲振动δ(O-H)，说明CS-LA-DMMA成功合成。
实施例2：PAMAM@DOX的制备与鉴定
PAMAM@DOX的制备：以PAMAM为基准，将5倍摩尔当量的DOX·HCl溶于甲醇，加入DOX·HCl3～4倍摩尔当量的TEA，避光搅拌10-24h进行脱盐；之后将此反应液加入PAMAM的水溶液，继续避光搅拌24h进行DOX包埋反应，得到PAMAM@DOX。反应结束后，通过氮气吹干去除甲醇，向反应液中加入去离子水进行沉淀至沉淀产物不再增加，通过离心(8000rpm，2min)去除游离DOX沉淀，上清液经冷冻干燥后，保存备用。
图3紫外-可见图谱结果可知：DOX经PAMAM包埋后，紫外最大吸收波长由477nm(游离DOX)红移至494nm(PAMAM@DOX)。且通过紫外-可见分光光度计检测，DOX的包封率为38.03％，DOX的载药率为14.17％。
实施例3：自组装的电荷反转型核/壳药物载体的制备
将0.2mg实施例1制备的CS-LA-DMMA溶于0.2mL去离子水，并加入0.5mL浓度为2mg/mL的羧甲基壳聚糖水溶液；随后加入经2～2.5μL pH 0.15的经盐酸调节pH为4～6的1mg/mLPAMAM水溶液0.2～2mL，静置即得基于自组装的不同粒径范围的电荷反转型核/壳药物载体。
图3紫外-可见图谱结果可知：负电性外壳CS-LA-DMMA-CMCS在400～800nm无紫外吸收，与正电性内核PAMAM@DOX自组装后，CS-LA-DMMA-CMCS/PAMAM@DOX出现紫外最大吸收波长503nm，证明成功自组装。
表1
Figure BDA0002792711990000061
本发明通过动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)监测粒径。表1为本发明实施例3中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的粒径分布表。由表1可知：复合物粒径随核/壳质量比紧密相关，负电性外壳固定，随着PAMAM@DOX用量增加，复合物粒径增大。
表2
Figure BDA0002792711990000071
实施例3自组装的电荷反转型核/壳药物载体，在4℃条件下储存，评价复合物稳定性。表2为本发明实施例3自组装的电荷反转型核/壳药物载体的稳定性表。由表2可知：用量为0.2，0.5，1.3，1.4mg的PAMAM@DOX形成复合物的粒径在96h内仍然保持良好的稳定性。
图4电荷反转结果可知：CS-LA-DMMA-CMCS/PAMAM@DOX在中性pH7.4条件下，电位为-28.06mV，在模拟肿瘤细胞外(pH 6.8)和细胞内(pH5.0)微环境下，电位分别反转为-1.812mV和+19.49mV；而CS-LA-SA-CMCS/PAMAM@DOX(琥珀酸酐(Succinic anhydride，SA)，CS-LA-SA合成方法同实施例1)由中性pH7.4条件下的-29.55mV反转为pH5.0条件下的6.753mV，以上电位反转结果说明酸性环境诱导的β-羧酸酰胺键水解和氨基质子化，使负电性外壳脱落，重新暴露PAMAM@DOX内核。
实施例4：实施例中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的外观形态
制备自组装的电荷反转型核/壳药物载体后，取10～20μL样品溶液滴加到含有碳支持膜的200目铜网上，恒温干燥，重复操作3～4次，用透射电镜观察样品形态。
图5透射电镜结果可知：在模拟生理(pH7.4)微环境下，CS-DMMA-CMCS/PAMAM@DOX呈现清晰的核/壳结构，而在模拟肿瘤酸性微环境下(pH5.0)，此纳米复合物发生外壳脱落，自组装作用力破坏，使纳米制剂结构膨胀解离，粒径由221.9nm增加至5360nm；而CS-SA-CMCS/PAMAM@DOX在此酸性条件下，基本保持完整均一的结构。
实施例5：实施例中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的体外释放
以pH 5.0、pH 6.8(1％吐温80，W/V)和pH 7.4磷酸盐缓冲液为释放介质，考察核/壳载体的pH响应性体外释放情况。将DOX含量为140μg的PAMAM@DOX、CS-LA-DMMA-CMCS/PAMAM@DOX和CS-LA-SA-CMCS/PAMAM@DOX纳米制剂置于透析袋(MWCO 3.5KDa)中，并浸入pH5.0的35mL PBS、pH 6.8的35mL PBS(1％吐温80，W/V)和pH 7.4的35mL PBS(1％吐温80，W/V)的50mL EP管中。在37℃恒温摇床内振摇，并在预定时间点(2，4，12，24，48，72，96h)进行取样1mL，并补充等体积新鲜介质。取得的样品经0.22μm微孔滤膜过滤，用HPLC法测定样品中DOX浓度，并进行DOX累积释放曲线绘制。
图6体外释放结果可知：随着pH值降低，DOX的释放速度加快。CS-LA-DMMA-CMCS/PAMAM@DOX制剂组在96h，pH 7.4条件下，DOX的累计释放率为43.41±1.93％，在酸性pH 6.8和pH 5.0的条件下，DOX的累计释放率分别为53.78±2.05％和65.08±1.69％。然而，CS-LA-SA-CMCS/PAMAM@DOX制剂组在96h，pH 7.4条件下，DOX的累计释放率为28.12±1.69％，在酸性pH 6.8和pH 5.0的条件下，DOX的累计释放率分别为33.48±1.39％和50.25±1.82％。此结果说明模拟肿瘤酸性微环境诱导DMMA发生电荷反转，使复合物解离，加速药物释放。PAMAM@DOX制剂组在96h，pH 7.4和pH 5.0的条件下，DOX的累计释放率分别为44.34±2.14％和82.25±1.51％，显著高于上述核/壳药物载体制剂组，进一步说明负电性外壳可减小核/壳纳米复合物在模拟正常生理条件下的突释；而在模拟肿瘤酸性微环境诱导下，壳聚糖衍生物发生氨基质子化以及DMMM的“负—正”电荷反转，降低与正电性内化PAMAM@DOX的静电作用，促使负电性外壳脱落，加速药物释放。
实施例6：自组装的电荷反转型核/壳药物载体对人肝癌细胞(HepG2)的体外抑制效果
采用MTT法考察游离DOX、PAMAM@DOX、CS-LA-DMMA-CMCS/PAMAM@DOX以及CS-LA-SA-CMCS/PAMAM@DOX四组不同制剂对HepG2的细胞毒性。对数生长期的HepG2细胞接种于96孔培养板中，接种密度为5×103/mL，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h后，分别加入等量DOX梯度浓度(15、35、40、50、70、85、100、140μM)的药物培养液，其中游离DOX组DOX浓度设置为：0.035、0.085、0.15、0.35、0.85、1.5、3.5、8.5μM，各组药物每个浓度设置6个复孔，同时建立对照组，培养48h后，每孔加入20μL MTT(5mg·mL-1)继续培养4h，弃去孔内液体后，每孔加入150μL DMSO，微型振荡器振荡混匀，酶标仪检测490nm处吸光度(absorbance，A)，根据吸光度A值及下列公式计算细胞存活率。
Figure BDA0002792711990000081
图7MTT结果可知：DOX浓度增加导致细胞存活率下降，表明纳米制剂对HepG2细胞的生长抑制作用呈现浓度依赖性。游离DOX、PAMAM@DOX、CS-LA-DMMA-CMCS/PAMAM@DOX以及CS-LA-SA-CMCS/PAMAM@DOX的IC50值分别为0.3456±0.0388μM，40.07±1.94μM，44.06±2.38μM以及51.04±2.66μM。
实施例7：自组装的电荷反转型核/壳药物载体的细胞定量摄取
取对数生长期的HepG2细胞，以2×105/孔细胞数量接种于6孔板，放入细胞培养箱中，孵育24h。分别加入等量DOX浓度(10μg/mL)的游离DOX、PAMAM@DOX、CS-LA-DMMA-CMCS/PAMAM@DOX以及CS-LA-SA-CMCS/PAMAM@DOX四组不同制剂，每孔2mL，放入细胞培养箱中，37℃、5％CO2条件下，分别孵育2，4，8，12h。孵育完成后，弃去上清液，用1mL浓度为0.01M的PBS洗三次，0.5mL胰酶消化并收集细胞悬液，1000r·min-1离心5min，弃去上清液，细胞沉淀用PBS漂洗，1000r·min-1离心5min，弃去上层液体，0.5mLPBS重悬细胞。用流式细胞仪分析并检测平均荧光强度(Mean fluorescent intensity，MFI)。
图8细胞定量摄取结果可知：MFI随时间延长而增强，提示时间性的细胞摄取。与CS-LA-SA/PAMAM@DOX组相比，PAMAM@DOX组和CS-LA-DMMA/PAMAM@DOX组的MFI增加，表明静电吸附诱导的细胞摄取。
实施例8：自组装的电荷反转型核/壳药物载体的细胞凋亡
取对数生长期的HepG2细胞，以2×105/孔细胞数量接种于6孔板，放入细胞培养箱中，孵育24h。分别加入等量DOX梯度浓度(15、40、75、80、100μM)的PAMAM@DOX、CS-LA-DMMA-CMCS/PAMAM@DOX以及CS-LA-SA-CMCS/PAMAM@DOX三组不同制剂的培养液，游离DOX组中DOX浓度设置为：0.035、0.14、0.35、0.85、1.4μM，阴性对照组加入等量空白培养液，每孔2mL，放入细胞培养箱中，37℃、5％CO2条件下，继续孵育48h。孵育完成后，把细胞培养液吸出至4mLEP管内，PBS洗涤细胞一次，并用400μL胰酶消化细胞，加入上述收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1000g离心5min，弃上清，PBS洗涤细胞沉淀，再次1000g离心5min，弃上清，在收集的细胞中依次加入195μL Annexin V/FITC结合液、5μL Annexin V/FITC、10μL碘化丙啶PI染色液，轻轻混匀后于室温避光的条件下孵育20min，随后用流式细胞仪分析并检测。
图9体外细胞凋亡结果可知：在CS-LA-SA-CMCS/PAMAM@DOX制剂组，细胞凋亡/坏死率基本维持在70％，当DOX浓度从15μM增加至100μM时，细胞凋亡/坏死率从71.78％增加至99.58％，表明浓度依赖性的细胞凋亡/坏死。
实施例9：壳聚糖衍生物CS-LA-DMMA与PAMAM@DOX的自组装
荷相反电荷的壳聚糖衍生物CS-LA-DMMA与PAMAM@DOX直接在水相环境进行自组装，很容易产生絮凝。本发明利用CS-LA-DMMA在甲醇易析出沉淀的性能，定制化设计聚沉包覆法(Coagulation coated method)，使荷负电的CS-LA-DMMA在PAMAM@DOX表面析出，进而自组装为符合粒径要求的纳米粒。
表3
Figure BDA0002792711990000091
Figure BDA0002792711990000101
Figure BDA0002792711990000111
本发明通过DLS监测粒径。表3为本发明实施例9中自组装的电荷反转型核/壳药物载体在有机相环境的粒径分步表。由表3可知：由于DMMA与SA在甲醇中溶解性不同，按照CS-LA-SA处方设计CS-LA-DMMA，粒径不同，比如CS-LA-SA为1mg时，自组装过程出现沉淀，而CS-LA-DMMA为1mg时，自组装的电荷反转型核/壳药物载体的粒径在600nm左右；
(1)CS-LA-DMMA质量：3，4mg时，粒径在200nm左右；1mg时，618nm(0.06)；5mg时，515nm(0.274)，但与CS-LA-SA相比，粒径不稳定；
(2)PAMAM@DOX溶剂中甲醇用量：在CS-LA-DMMA为1mg时，PAMAM@DOX溶剂中(2mL)甲醇用量为0.5mL，粒径为618nm(0.06)，而甲醇用量为0mL，粒径为在微米级别；在CS-LA-SA为2.5mg时，PAMAM@DOX溶剂中(2mL)甲醇用量为0.3mL，粒径为在微米级别，而甲醇用量为0.7mL，粒径为588nm(1.5)；在CS-LA-SA为3mg时，PAMAM@DOX溶剂中(2mL)，甲醇用量为0mL，粒径为在微米级别；甲醇为0.1mL，粒径为1500nm(0.7)；甲醇为0.2mL，粒径为688nm(0.614)；甲醇为0.5mL，粒径为257nm(4.36)，粒径合适，但不稳定；在CS-LA-SA为5mg时，PAMAM@DOX溶剂中(2mL)，甲醇为0.1mL，粒径为4.408×103nm(3.2)；甲醇为0.2mL，粒径为4.758×103nm(2.88)；甲醇为0.5mL，粒径为515nm(0.274)，粒径合适，但不稳定；甲醇为0.7mL，粒径为3.0×103nm(3)。
(3)溶解PAMAM@DOX时溶剂顺序：在CS-LA-SA为3mg时，先用甲醇溶解PAMAM，再混合DMSO，粒径为700～800nm(0.25)；先用DMSO溶解PAMAM，再混合甲醇，粒径为257nm(4.36)，粒径合适，但不稳定。
结论：(1)、以DMSO溶解实施例1制备的CS-LA-DMMA，得到A组分；
(2)、以混合溶剂溶解实施例2制备的PAMAM@DOX，得到B组分；所述的混合溶剂由甲醇与DMSO混合而成且甲醇占比10％～35％(体积比)。
(3)、将1～5份的A组分与1份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到粒径为500～700nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
所述的份指质量份。
表4
Figure BDA0002792711990000121
Figure BDA0002792711990000131
为进一步验证甲醇在聚沉包覆自组装的作用，在保持外壳、内核质量与上述处方基本一致时，在DMSO，不同pH值PBS中进行自组装。本发明通过DLS监测粒径。表4为本发明实施例9中自组装的电荷反转型核/壳药物载体在水相环境的粒径分步表。由表4可知：在DMSO与不同pH值PBS混合溶剂中进行自组装，均呈现“千”数量级的大粒径，甚至出现沉淀。
(1)、与在水相PBS相比，在DMSO中自组装粒径相对较小，比如在CS-LA-DMMA为0.5mg，5mL(0.1PBS7.4+4.9DMSO)时，PAMAM@DOX为2mg，5mL(1DMSO+0.1PBS5.0+3.9DMSO)时，粒径为503.5nm(0.045)，而在2mg，5mL(1DMSO+0.1PBS5.0+0.45PBS5.0+0.45PBS 7.4+3DMSO)时，粒径为微米级别。在CS-LA-DMMA为1mg，2.5mL(0.2PBS7.4+2.3DMSO)时，PAMAM@DOX为0.25mg，2.5mL(0.125DMSO+0.2PBS5.0+2.175DMSO)时，粒径为1.570×103nm(0.232)，在0.25mg，2.5mL(0.125DMSO+2.375DMSO)时，粒径为367.2nm(0.06)。
(2)、PAMAM@DOX质量影响粒径，比如在CS-LA-DMMA为1mg，2.5mL(0.2PBS7.4+2.3DMSO)时，PAMAM@DOX为0.25mg，2.5mL(0.125DMSO+2.375DMSO)时，粒径为367.2nm(0.06)，而在0.5mg，2.5mL(0.25DMSO+2.25DMSO)时，粒径为586.7nm(0.397)。
(3)、CS-LA-DMMA溶剂用量：PAMAM@DOX为2mg，1mL(0.4水+0.6PBS 5.0)时，CS-LA-DMMA为2mg，3mL DMSO，粒径为2.880×103nm(0.46)，而在2mg，5mL DMSO，粒径为1.450×103nm(0.066)。
结论：(1)、以混合溶剂溶解实施例1制备的CS-LA-DMMA得到A组分；所述的混合溶剂由DMSO与PBS混合而成且DMSO占比90％～100％(体积比)；
(2)、以混合溶剂溶解实施例2制备的PAMAM@DOX得到B组分；所述的混合溶剂由DMSO与PBS混合而成且DMSO占比80％～100％(体积比)；
(3)、将2～8份的A组分与1～8份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到粒径为360～590nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
所述的份指质量份。
实施例10：壳聚糖衍生物CS-LA-SA与PAMAM@DOX的自组装
荷相反电荷的壳聚糖衍生物CS-LA-SA与PAMAM@DOX直接在水相环境进行自组装，很容易产生絮凝。本发明利用CS-LA-SA在甲醇易析出沉淀的性能，定制化设计聚沉包覆法(Coagulation coated method)，使荷负电的CS-LA-SA在PAMAM@DOX表面析出，进而自组装为符合粒径要求的纳米粒。
表5
Figure BDA0002792711990000141
Figure BDA0002792711990000151
Figure BDA0002792711990000161
本发明通过DLS监测粒径。表5为本发明实施例10中自组装的电荷反转型核/壳药物载体在水相环境的粒径分步表。由表5可知：聚沉包覆法中，制备粒径稳定合适的纳米粒，需要控制多种因素：
(1)CS-LA-SA质量：3，4，5mg时，粒径在130～170nm范围，1mg时，出现沉淀；
(2)CS-LA-SA所用溶剂：在CS-LA-SA为3mg，2mL时，全部为甲醇，由于CS-LA-SA在甲醇不溶解，自组装纳米粒过程出现沉淀，全部为PBS 7.4，出现大粒径1460nm(0.4)；
(3)PAMAM@DOX溶剂中甲醇用量：在CS-LA-SA为3mg时，PAMAM@DOX溶剂中(2mL)甲醇用量为0.5mL，粒径为120nm(0.02)，而甲醇用量为1mL，粒径为2109nm(3.056)；在CS-LA-SA为5mg时，PAMAM@DOX溶剂中(2mL)甲醇用量为0.5mL，粒径为12h后稳定在138～153nm，而甲醇用量为0mL，粒径由2000nm迅速团聚为微米级别。
结论：(1)、以DMSO溶解CS-LA-SA得到A组分；
(2)、以混合溶剂溶解实施例2的PAMAM@DOX得到B组分；所述的混合溶剂由甲醇与DMSO混合而成且甲醇占比25％(体积比)；
(3)、将3～5份的A组分与1份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到粒径为100～120nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
所述的份指质量份。

Claims (11)

1.基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体，其特征在于采用如下质量比例的原料制备而成：负电性壳聚糖衍生物CS-LA-DMMA 100份，正电性内核PAMAM@DOX质量为100～1000份，羧甲基壳聚糖中间分子CMCS 400-600份；
其中，负电性壳聚糖衍生物CS-LA-DMMA的化学结构式如下：
Figure FDA0002792711980000011
2.如权利要求1所述的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体，其特征在于所述的负电性壳聚糖衍生物的制备反应式如下：
Figure FDA0002792711980000012
3.如权利要求1所述的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体，其特征在于所述的负电性壳聚糖衍生物(即CS-LA-DMMA)合成方法如下：分子量为2000-500000的壳寡糖通过酰胺反应交联特异性亲和ASPGR的靶向分子乳糖酸，合成CS-LA；CS-LA通过酰胺反应交联pH敏感电荷反转基团DMMA，合成CS-LA-DMMA。
4.如权利要求1所述的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体，其特征在于所述的正电性内核PAMAM@DOX(即PAMAM@DOX)为第四代氨基末端的树枝状大分子包载广谱抗癌药物阿霉素。
5.如权利要求1所述的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体，其特征在于所述的羧甲基壳聚糖中间分子(即CMCS)为分子量2000-100000的水溶性羧甲基壳聚糖。
6.权利要求1至5任意一项所述的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体，用于HepG2肝癌细胞体外药效学评价。
7.权利要求1至5中任意一项所述的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、用水溶解CS-LA-DMMA得CS-LA-DMMA水溶液；
(2)、用水溶解CMCS，并与CS-LA-DMMA水溶液混合得混合液；
(3)、用水溶解PAMAM@DOX，并调节pH 4～6得PAMAM@DOX水溶液；
(4)、将混合液和PAMAM@DOX水溶液混合均匀得基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
8.一种基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、以DMSO溶解CS-LA-DMMA，得到A组分；
其中，CS-LA-DMMA按照以下步骤制备：
在CS-LA的DMSO溶液中，加入3～5倍摩尔当量的DMMA，并加入1～10倍摩尔当量的三乙胺(Triethylamine,TEA)和4-二甲氨基吡啶(4-Dimethylaminopyridine,DMAP)，TEA与DMAP之间的摩尔比为1：2，在室温条件下反应2-12h，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心收集沉淀产物，得CS-LA-DMMA；
其中CS-LA按照以下步骤合成：采用经HCl调节的pH 5.0～pH 6.0的含10mM四甲基乙二胺(Tetramethylethylenediamine,TEMED)的水溶液为溶剂，以LA羧基1.5倍摩尔当量的EDCI和1.2倍摩尔当量的NHS，在室温条件下活化LA羧基两小时，之后加入LA羧基5倍摩尔当量的CS氨基进行酰胺反应，在室温条件下继续反应12-48小时，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心收集沉淀产物，得CS-LA；
(2)、以混合溶剂溶解PAMAM@DOX，得到B组分；所述的混合溶剂由甲醇与DMSO混合而成且甲醇占比10％～35％(体积比)；
其中，PAMAM@DOX按照以下步骤制备：
以PAMAM为基准，将5倍摩尔当量的DOX·HCl溶于甲醇，加入DOX·HCl 3～4倍摩尔当量的TEA，避光搅拌10-24h进行脱盐；之后将此反应液加入PAMAM的水溶液，继续避光搅拌24h进行DOX包埋反应，得到PAMAM@DOX；
(3)、将1～5份的A组分与1份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到的粒径为500～700nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
9.一种基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、以混合溶剂溶解CS-LA-DMMA得到A组分；所述的混合溶剂由DMSO与PBS混合而成且DMSO占比90％～100％(体积比)；
其中，CS-LA-DMMA按照以下步骤制备：
在CS-LA的DMSO溶液中，加入3～5倍摩尔当量的DMMA，并加入1～10倍摩尔当量的TEA和DMAP，TEA与DMAP之间的摩尔比为1：2，在室温条件下反应2-12h，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心收集沉淀产物，得CS-LA-DMMA；
其中CS-LA按照以下步骤合成：采用经HCl调节的pH 5.0～pH 6.0的含10mM TEMED的水溶液为溶剂，以LA羧基1.5倍摩尔当量的EDCI和1.2倍摩尔当量的NHS，在室温条件下活化LA羧基两小时，之后加入LA羧基5倍摩尔当量的CS氨基进行酰胺反应，在室温条件下继续反应12-48小时，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心收集沉淀产物，得CS-LA；
(2)、以混合溶剂溶解PAMAM@DOX得到B组分；所述的混合溶剂由DMSO与PBS混合而成且DMSO占比80％～100％(体积比)；
其中，PAMAM@DOX按照以下步骤制备：
以PAMAM为基准，将5倍摩尔当量的DOX·HCl溶于甲醇，加入DOX·HCl 3～4倍摩尔当量的TEA，避光搅拌10-24h进行脱盐；之后将此反应液加入PAMAM的水溶液，继续避光搅拌24h进行DOX包埋反应，得到PAMAM@DOX；
(3)、将2～8份的A组分与1～8份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到粒径为360～590nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
10.一种基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、以DMSO溶解CS-LA-SA得到A组分；
(2)、以混合溶剂PAMAM@DOX得到B组分；所述的混合溶剂由甲醇与DMSO混合而成且甲醇占比25％(体积比)；
其中，PAMAM@DOX按照以下步骤制备：
以PAMAM为基准，将5倍摩尔当量的DOX·HCl溶于甲醇，加入DOX·HCl 3～4倍摩尔当量的TEA，避光搅拌10-24h进行脱盐；之后将此反应液加入PAMAM的水溶液，继续避光搅拌24h进行DOX包埋反应，得到PAMAM@DOX；
(3)、将3～5份的A组分与1份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到粒径为100～120nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
11.按照权利要求8或9或10所述的制备方法制备的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体，用于HepG2肝癌细胞体外药效学评价。
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