CN110432377A - 一种大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及皮克林乳液技术领域，尤其涉及一种大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶及其制备方法和在制备皮克林乳液中的应用。本发明以大豆分离蛋白、壳聚糖为原材料，通过蛋白多糖复合凝聚得到SPI/CS悬浮液；将此悬浮液冷冻干燥，得到再生SPI/CS粉末；将SPI/CS粉末分散于超纯水中，形成SPI/CS悬浮液，随后向上述悬浮液中加玉米油，通过高速分散，得到稳定的皮克林乳液。本发明制备的皮克林乳液，具有制备工艺简单、乳液稳定性强、乳化剂用量少、刺激性和毒害小、对环境友好、不易受体系环境各因素的影响等特点，并可有效地解决植物精油及DHA/EPA等在水中溶解度低和稳定性、生物利用度有限等问题，有助于合理设计基于食品级乳液的输送系统，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及皮克林乳液技术领域，尤其涉及一种大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶及其制备方法和在制备皮克林乳液中的应用。
背景技术
皮克林乳液是一种采用固体颗粒稳定的新型乳液，固体颗粒紧密吸附在油水两相界面，形成包裹层将油滴包裹，以阻止油滴间的聚合，从而阻止液滴之间的碰撞及聚并，使得乳液得以稳定。目前存在大量的生物活性物质，例如植物精油、DHA/EPA等，这些物质易于氧化且在人体内利用度有限，Pickering乳液的坚固界面颗粒层有望成为活性化合物的新型包封或递送载体。将油储存在食品级颗粒稳定的乳液液滴中，通过在油滴周围形成厚的界面，过渡金属(位于水相中)和脂质氢过氧化物(在油相中)之间相互作用的机会将大大降低。
皮克林乳液具有操作简便、使用成本低、可以降低乳化剂的用量、相比表面活性剂刺激性和毒害小、对环境友好、不易受体系环境各因素影响等优点。因此，在工业领域均得到了长足的发展，主要涉及化妆品、印刷、家庭护理、油回收等。目前，皮克林乳液在食品、化妆品、医药及乳液催化剂等领域具有很强的应用前景。
现已证明天然聚合物优于其他类似合成聚合物，壳聚糖(CS)是自然界中仅次于纤维素的第二丰富的生物聚合物，是世界上极少数存在的带正电的天然生物聚合物之一，由于其具有生物降解性、生物相容性、生物粘附性和无毒性的独特特性，CS基纳米颗粒(NPs)广泛用于稳定皮克林乳液，其可进一步用作药物递送系统。另外，食物蛋白质由于具有高营养价值及良好功能性质，其稳定的胶体体系越来越多的用于活性物质的包埋稳定及输送。以往的蛋白稳定的胶体输送体系大都基于动物来源蛋白，如乳清蛋白、明胶及酪蛋白酸钠等。与动物蛋白相比，植物蛋白特别是大豆蛋白具有低过敏性和低价格等优势，因而在构建胶体输送体系方面具有很广的应用前景。目前存在一些处理大豆分离蛋白进而形成纳米颗粒的方法，例如对其加热，从而热聚集成纳米粒子；或在大豆分离蛋白溶液中加入钙离子交联成纳米粒子，但是现已证明复合物形成的粒子优于单个原料制成的纳米粒子，所以，需要研发一种新的蛋白-多糖复合粒子来满足市场需要。
发明内容
本发明解决的技术问题是，目前存在一些处理大豆分离蛋白进而形成纳米颗粒的方法，例如对其加热，从而热聚集成纳米粒子；或在大豆分离蛋白溶液中加入钙离子交联成纳米粒子，但是现已证明复合物形成的粒子优于单个原料制成的纳米粒子，所以，需要研发一种新的蛋白-多糖复合粒子来满足市场需要。
为解决上述问题，本发明利用壳聚糖(CS)和大豆分离蛋白(SPI)具有相反电荷，从而可以发生静电相互作用，通过离子交联形成纳米复合物的特性，合成了一种大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶，质量好、安全无毒，能有效解决植物精油及DHA/EPA等在水中溶解度低和稳定性及生物利用度有限等问题，可广泛应用于功能性食品等领域。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现，一种大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶，所述纳米凝胶是由壳聚糖溶液和大豆分离蛋白溶液混合搅拌制备得到，粒径均一且稳定性好，粒径范围在150～400nm。通过以下方法制备得到：
(1)制备壳聚糖(CS)和大豆分离蛋白(SPI)溶液：
将壳聚糖溶于0.1％的醋酸溶液中搅拌10h，制成浓度为0.5～1mg/ml的壳聚糖溶液，随后调节壳聚糖溶液的pH为5.1～5.5；将大豆分离蛋白溶于超纯水中，加入0.02％的叠氮化钠，以抑制微生物的生长；搅拌2h后放入4℃冰箱过夜水化，将蛋白分子通过直接吸附及松散结合，被水分子层层包围起来，后将大豆分离蛋白溶液以8000r离心25min，以除去不溶物质，调节其pH至6.6～7.6，制成浓度范围在1.8％～2.8％的大豆分离蛋白溶液。调节其pH是因为CS、SPI在此pH范围下电荷的相互作用较大，有利于更好的形成纳米颗粒，从而得到大量的纳米颗粒用于稳定皮克林乳液。如图6所示，CS溶液的PH对粒径的影响也非常大，当CS溶液的PH降至5.0时，CS与SPI的交联程度变强，从而导致它的粒径突增到7388nm，另外CS溶液的PH不能超过6，因为CS在酸性条件下才能溶解。如图7所示，当SPI溶液PH降低到6.5时，SPI与CS交联过度，SPI-CS纳米粒子升高至微米级并且沉淀，而PH增大至7.2以上时，SPI与CS的交联程度降低，有未交联的蛋白和多糖存在。其原因是SPI带负点，CS带正电，且SPI与CS带电的多少与它们的PH有密切的联系，因此只有在一个合适的PH范围内，二者的交联程度才适中，进而形成纳米粒子，否则不能形成纳米粒子。而本发明均采用1M NaOH与1MHCL调试PH。
(2)制备大豆分离蛋白壳聚糖(SPI/CS)纳米凝胶：
在700r/min的磁力搅拌下不断将壳聚糖溶液以1ml/min的速度滴加到大豆分离蛋白溶液中，搅拌1h即可得到SPI/CS纳米凝胶。充分搅拌可使大豆分离蛋白与壳聚糖充分混合，使粒径均一，混合不均会容易造成粒子的大小不一。此外，与反溶剂法制作纳米粒子不同，体系中不存在乙醇，粒子形成后本身就以水悬浮液的形式存在，因此不需要旋蒸除去乙醇等步骤，另外，大豆分离蛋白与壳聚糖的结合力强，只需搅拌均匀就可结合成纳米粒子，不需要高速剪切等任何形式的外源能量供给，只需滴加搅拌均匀即可形成纳米粒子，步骤非常简单，想要获得纳米粒子，可以直接冻干，可制备大量的粒子以用于皮克林乳液的制备。
进一步的，步骤(1)中壳聚糖的分子量为3000～10000DA，脱乙酰度大于90％。如图2所示，当壳聚糖的分子量变大时，SPI-CS粒子的粒径也随之变大，因此分子量大的壳聚糖不易与大豆分离蛋白形成纳米凝胶，当壳聚糖分子量为3000～6000Da时，大豆分离蛋白才与壳聚糖形成纳米颗粒，粒径小且均一。所以，原料选择及各影响因素的参数是形成纳米粒子的关键。另外，采用高脱乙酰度的壳聚糖，是因为壳聚糖脱乙酰基程度增高，由于胺基质子化而使得壳聚糖在稀酸溶液中带电基团增多，聚电解质电荷密度增加，从而更有利于大豆分离蛋白与壳聚糖的静电结合作用。
进一步的，步骤(1)中大豆分离蛋白为凝胶型、非凝胶型中的一种或两种的混合物。
进一步的，步骤(1)中离心后的大豆分离蛋白溶液过0.22μm水系膜后调节pH，得到大豆分离蛋白溶液。由于大豆分离蛋白溶于水后有许多不溶成分，即使通过离心也不能完全去除，残留的不溶物质会导致与壳聚糖形成的纳米粒子不够均一，粒径也会变大，因此，将离心得到的大豆分离蛋白溶液过0.22μm水系膜以进一步除去不溶物质，以避免大豆分离蛋白溶液中的不溶性大颗粒对实验结果造成影响，得到的纳米凝胶也可以更好的分散在水中。
进一步的，步骤(2)中大豆分离蛋白溶液与壳聚糖溶液的体积比为2:1～5:12。如图3所示，SPI-CS粒子粒径随着壳聚糖浓度的增加而增加，当CS浓度增加到1mg/ml以上时，粒子变为微米级的粒子并且放置1h就产生沉淀。其原因是随着CS浓度的增加，它与SPI的交联程度增大，粒径变大。如图4所示，SPI-CS粒子粒径随着大豆分离蛋白溶液浓度的增加而降低，当浓度缩小至1.4％时，SPI-CS粒子的粒径则升到2165nm。其原因是当壳聚糖的量确定时，过大的SPI浓度会导致有过多的SPI未与CS交联，而过少的SPI会与CS交联过度，形成微米级的粒子并且会放置产生沉淀。如图5所示，当两溶液的浓度确定后，二者要有一定的体积比才能有最合适的交联程度，或大或小都会导致交联程度的增高或者降低，从而使粒子不均一。
一种用上述大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶制备皮克林乳液的方法，包括以下步骤：
将步骤(1)中离心完后的大豆分离蛋白悬浮液冷冻干燥为粉末，重新分散到超纯水中；以步骤(2)的纳米凝胶溶液为水相，以玉米油为油相，用高速剪切乳化机在15000rpm转速下搅拌分散2min后获得稳定的皮克林乳液。如图10所示，为放置20天的皮克林乳液的显微结构，纳米粒子仍然在稳定的包围油相。
进一步的，所述纳米凝胶水相溶液的浓度为1.5wt％～4.5wt％。如图9所示，随着纳米颗粒的浓度增加，液滴的尺寸会变小，因为此时体系中有更多的纳米粒子去包围有限的油相，但仅有少量纳米颗粒就可以稳定大量的油相且在很长时间内不明显分层，因此增加更多的纳米颗粒在体系中是多余的。
进一步的，油相的体积分数为0.5～0.7。如图8所示，本专利得到的纳米粒子的目的是要保护更多易被破坏的油相，因此，测试了本专利的纳米粒子能包覆油相的比例在0.5～0.7，符合我们的目的。
本发明大豆分离蛋白、壳聚糖为原材料，通过蛋白多糖复合凝聚得到SPI/CS悬浮液；将此悬浮液冷冻干燥，得到再生SPI/CS粉末；将SPI/CS粉末分散于超纯水中，形成SPI/CS悬浮液，随后向上述悬浮液中加玉米油，通过高速分散，得到稳定的白色皮克林乳液。该皮克林乳液将有效解决植物精油、DHA/EPA等在水中溶解度低和稳定性及生物利用度有限等问题。本发明的有益效果在于：
(1)乳化性强，仅用1.5wt％的纳米颗粒就可稳定70％的油相，因此可包覆更多的活性物质；
(2)原材料易得且使用量少，仅用非常少量的大豆分离蛋白和壳聚糖就能合成大量的纳米凝胶，且粒径均一，进而制成皮克林乳液，从而降低成本。
(3)操作简单，成品在短时间内就能制成，得到的皮克林乳液30天不明显分层。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是SPI-CS纳米颗粒的透射电镜图(标尺为50nm)。
图2是壳聚糖分子量对纳米凝胶粒子粒径的影响。
图3是CS浓度对纳米凝胶粒子粒径的影响。
图4是SPI浓度对纳米凝胶粒子粒径的影响。
图5是SPI：CS体积比对纳米凝胶粒子粒径的影响。
图6是CS溶液pH对纳米凝胶粒子粒径的影响。
图7是SPI溶液pH对纳米凝胶粒子粒径的影响。
图8是油相比例对皮克林乳液粒子粒径的影响。
图9是颗粒浓度对皮克林乳液粒子粒径的影响。
图10是皮克林乳液光学显微镜图(40倍)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种制备大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶，再制备皮克林乳液的方法：
(1)制备CS和SPI溶液：
将壳聚糖溶于0.1％的醋酸溶液中搅拌10h，制成浓度为0.6mg/ml的壳聚糖溶液，随后调节壳聚糖溶液的PH为5.1；将大豆分离蛋白溶于超纯水中配成1.6％浓度的SPI溶液，加入0.02％的叠氮化钠，搅拌2h后放入4℃冰箱过夜水化，后将大豆分离蛋白溶液以8000r离心25min，调节其PH至6.6，再进一步过膜以除去不溶物质。
(2)制备SPI/CS纳米凝胶：
在700r/min的磁力搅拌下不断将壳聚糖溶液以1ml/min的速度，按照SPI:CS(v/v)＝2:1滴加到大豆分离蛋白溶液中，搅拌1h。
(3)制备皮克林乳液：
将(1)将离心完后的悬浮液冷冻干燥为粉末，重新分散到超纯水中，得到1.5wt％的纳米颗粒悬浮液，以所述纳米凝胶悬浮液为水相，以玉米油为油相，油相比例为0.55，用高速剪切乳化机在15000rpm转速下搅拌分散2min后获得稳定的皮克林乳液。
实施例2：
一种制备大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶，再制备皮克林乳液的方法：
(1)制备CS和SPI溶液：
将壳聚糖溶于0.1％的醋酸溶液中搅拌10h，制成浓度为0.7mg/ml的壳聚糖溶液，随后调节壳聚糖溶液的PH为5.2；将将大豆分离蛋白溶于超纯水中配成1.8％浓度的SPI溶液，加入0.02％的叠氮化钠，搅拌2h后放入4℃冰箱过夜水化，后将大豆分离蛋白溶液以8000r离心25min，调节其PH至6.8，再进一步过膜以除去不溶物质。
(2)制备SPI/CS纳米凝胶：
在700r/min的磁力搅拌下不断将壳聚糖溶液以1ml/min的速度，按照SPI:CS(v/v)＝1:1滴加到大豆分离蛋白溶液中，搅拌1h。
(3)制备皮克林乳液：
将(1)将离心完后的悬浮液冷冻干燥为粉末，重新分散到超纯水中，得到2.5wt％的纳米颗粒悬浮液，以所述纳米凝胶悬浮液为水相，以玉米油为油相，油相比例为0.6，用高速剪切乳化机在15000rpm转速下搅拌分散2min后获得稳定的皮克林乳液。
实施例3：
一种制备大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶，再制备皮克林乳液的方法：
(1)制备CS和SPI溶液：
将壳聚糖溶于0.1％的醋酸溶液中搅拌10h，制成浓度为0.8mg/ml的壳聚糖溶液，随后调节壳聚糖溶液的PH为5.3；将大豆分离蛋白溶于超纯水中配成2.0％浓度的SPI溶液，加入0.02％的叠氮化钠，搅拌2h后放入4℃冰箱过夜水化，后将大豆分离蛋白溶液以8000r离心25min，调节其PH至7.0，再进一步过膜以除去不溶物质。
(2)制备SPI/CS纳米凝胶：
在700r/min的磁力搅拌下不断将壳聚糖溶液以1ml/min的速度，按照SPI:CS(v/v)＝5:8滴加到大豆分离蛋白溶液中，搅拌1h。
(3)制备皮克林乳液：
将(1)将离心完后的悬浮液冷冻干燥为粉末，重新分散到超纯水中，得到3.5wt％的纳米颗粒悬浮液，以所述纳米凝胶悬浮液为水相，以玉米油为油相，油相比例为0.65，用高速剪切乳化机在15000rpm转速下搅拌分散2min后获得稳定的皮克林乳液。
实施例4：
一种制备大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶，再制备皮克林乳液的方法：
(1)制备CS和SPI溶液：
将壳聚糖溶于0.1％的醋酸溶液中搅拌10h，制成浓度为0.9mg/ml的壳聚糖溶液，随后调节壳聚糖溶液的PH为5.4；将大豆分离蛋白溶于超纯水中配成2.2％浓度的SPI溶液，加入0.02％的叠氮化钠，搅拌2h后放入4℃冰箱过夜水化，后将大豆分离蛋白溶液以8000r离心25min，调节其PH至7.2，再进一步过膜以除去不溶物质。
(2)制备SPI/CS纳米凝胶：
在700r/min的磁力搅拌下不断将壳聚糖溶液以1ml/min的速度，按照SPI:CS(v/v)＝1:2滴加到大豆分离蛋白溶液中，搅拌1h。
(3)制备皮克林乳液：
将(1)将离心完后的悬浮液冷冻干燥为粉末，重新分散到超纯水中，得到4.5wt％的纳米颗粒悬浮液，以所述纳米凝胶悬浮液为水相，以玉米油为油相，油相比例为0.7，用高速剪切乳化机在15000rpm转速下搅拌分散2min后获得稳定的皮克林乳液。
Claims (9)
1.一种大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶，其特征在于：所述纳米凝胶是由壳聚糖溶液和大豆分离蛋白溶液混合搅拌制备得到，粒径均一且稳定性好，粒径范围在150～400nm。
2.一种权利要求1中的大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶制备方法，其特征在于：
(1)制备壳聚糖和大豆分离蛋白溶液：
将壳聚糖溶于0.1％的醋酸溶液中搅拌10h，制成浓度为0.5～1mg/ml的壳聚糖溶液，随后调节壳聚糖溶液的pH为5.1～5.5；将大豆分离蛋白溶于超纯水中，加入0.02％的叠氮化钠；搅拌2h后放入4℃冰箱过夜水化，后将大豆分离蛋白溶液以8000r离心25min，调节其pH至6.6～7.6，制成浓度范围在1.8％～2.8％的大豆分离蛋白溶液；
(2)制备大豆分离蛋白壳聚糖(SPI/CS)纳米凝胶：
在700r/min的磁力搅拌下不断将壳聚糖溶液以1ml/min的速度滴加到大豆分离蛋白溶液中，搅拌1h即可得到SPI/CS纳米凝胶。
3.如权利要求2所述的大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中壳聚糖的分子量为3000～10000DA，脱乙酰度大于90％。
4.如权利要求2所述的大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中大豆分离蛋白为凝胶型、非凝胶型中的一种或两种的混合物。
5.如权利要求2所述的大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中离心后的大豆分离蛋白溶液过0.22μm水系膜后调节pH，得到大豆分离蛋白溶液。
6.如权利要求2所述的大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中大豆分离蛋白溶液与壳聚糖溶液的体积比为2:1～5:12。
7.一种用权利要求1的大豆分离蛋白壳聚糖纳米凝胶制备皮克林乳液的方法，其特征在于：将步骤(1)中离心完后的大豆分离蛋白悬浮液冷冻干燥为粉末，重新分散到超纯水中；以步骤(2)的纳米凝胶溶液为水相，以玉米油为油相，用高速剪切乳化机在15000rpm转速下搅拌分散2min后获得稳定的皮克林乳液。
8.如权利要求7所述的皮克林乳液的制备方法，其特征在于：所述纳米凝胶水相溶液的浓度为1.5wt％～4.5wt％。
9.如权利要求7所述的皮克林乳液的制备方法，其特征在于：油相的体积分数为0.5～0.7。
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