CN114947107B - 一种改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及乳液制备技术领域，尤其涉及一种改性豌豆蛋白‑壳聚糖纳米颗粒的制备和在高内相Pickering乳液中的应用。改性豌豆蛋白与壳聚糖复合获得改性豌豆蛋白‑壳聚糖纳米颗粒；其中，改性豌豆蛋白与壳聚糖的质量比为1:3‑1:7，所述改性豌豆蛋白为利用pH偏移‑加热将豌豆蛋白进行改性。本发明中的豌豆蛋白‑壳聚糖纳米颗粒具有良好的乳化性，所制备的乳液安全性高且稳定性好、刺激性和毒害小、对环境友好。在4℃下贮藏120天以上依然稳定，可替代脂肪用于肉制品加工中，在食品领域具有良好的应用前景。

Description

一种改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒的制备及其应用
技术领域
本发明涉及乳液制备技术领域，尤其涉及一种改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒的制备和在高内相Pickering乳液中的应用。
背景技术
传统的乳状液是大多由表面活性剂作为乳化剂而稳定形成的乳状液。但是广泛使用这类表面活性剂会给生态环境造成威胁。Pickering乳液是一种采用固体颗粒稳定的新型乳液，固体颗粒紧密吸附在油水两相界面，形成包裹层将油滴包裹，以阻止油滴间的聚合，从而阻止液滴之间的碰撞及聚集，可减少表面活性剂的使用量，使得乳液得以稳定。
Pickering乳液具有乳化成本低、良好的稳定性和较易控制粒径大小等优点。而以食品级的固体颗粒作为稳定剂所制备的Pickering乳液具有良好的生物相容性、降解性、稳定性和环境友好的优点。目前，Pickering乳液在食品、化妆品、医药及乳液催化剂等领域具有很强的应用前景。
制备Pickering乳液的固体颗粒种类繁多，包括无机颗粒和天然有机颗粒。这些颗粒要求不溶于两相，并应具有中性润湿性。二氧化钛、Fe2O3、二氧化硅和氧化石墨烯等无机粒子基本满足这些要求。但这极大限制了Pickering乳液在医药、农业、食品和化妆品等领域的应用。因此，寻求环境友好型、天然来源、可再生、可生物降解和可食用的固体颗粒用于稳定Pickering乳液已成为研究热点。在有限数量的研究中，生物来源的胶体颗粒已用于稳定Pickering乳液，如多糖类，包括淀粉纳米晶、经化学修饰的淀粉纳米颗粒、纤维素纳米晶、甲壳素纳米晶等；蛋白类，包括大豆分离蛋白、乳铁蛋白、乳清蛋白、玉米醇溶蛋白等；另外，还有具有生物活性的小分子物质如黄酮和植物甾醇。
可食用的天然蛋白质、多糖是自然界可再生的资源，其生物相容性和可降解性远优于无机材料，但由于润湿性、水溶性等问题不能直接用于稳定Pickering乳液，近年来科研工作者们通过修饰、改性、复合等多种手段，以天然蛋白质、多糖为材料制备出了低毒、环保和高稳定性的食品级固体颗粒，并实现了Pickering乳液的稳定。目前利用天然蛋白质和多糖制备纳米颗粒的方法主要包括化学改性和物理改性。化学改性可将天然蛋白质和多糖复合，利用亲、疏水性互补的方式实现界面行为调节并获得两相润湿性好的固体颗粒；在蛋白溶液中加入钙离子交联成纳米粒子，不同来源的淀粉颗粒可以通过不同的烯琥珀酸酐进行化学修饰，通过辛烯基琥珀酸酐(OSA)化学改性增强淀粉颗粒的疏水性最为常见；醇溶蛋白颗粒大多使用反溶剂法制备，先溶解原材料于合适溶剂中，随后将有机相分散在水相中，最终再将溶剂移除。物理改性常采用超声、高压、加热等。但单独采用上述方法所获得的颗粒存在粒径大、原料用量大，并且可能会带来环境污染等问题。因此，采用对环境污染少的化学改性方法并联合适当的物理改性方法是制备粒度大小适宜、乳化性能优良的固体颗粒的良好选择。
与大豆蛋白相比，国内外对豌豆蛋白稳定乳液的研究相对较少。豌豆是仅次于大豆的第二大食用豆科植物，含20％～30％的蛋白质，研究较多的是其凝胶性质。豌豆蛋白主要由球蛋白组成，具有均衡的氨基酸组分，成本低廉，易获得，与其他豆类蛋白相比具有更低的致敏性。近年来有研究表明，豌豆蛋白在中性条件下具有良好的乳化活性，可作为食品工业中的新型乳化剂。但是，在商业条件下提取的豌豆蛋白的溶解性和表面疏水性较差，以此制备的乳液稳定性也较差，从而限制了豌豆蛋白在Pickering乳液中的应用。可见，提高豌豆蛋白乳液的稳定性至关重要。由于壳聚糖具有大量的亲水基团和正电荷，因此利用壳聚糖通过亲疏水性互补以及表面电荷结合的方式，并利用pH偏移、加热和超声联合改性技术提高固体颗粒的乳化性能，为提高豌豆蛋白利用率以及制备超稳定的Pickering乳液提供理论依据及技术支持。此外，由于Pickering乳液具有类固体性质，且界面固体颗粒具有延缓内部油脂氧化的功能，因此，可用Pickering乳液包埋多不饱和脂肪酸含量高的油脂应用于低脂食品中，不仅可改善产品的感官品质，还能改善脂肪酸比例、降低脂肪含量。
发明内容
本发明的目的在于制备一种改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒的制备及其在高内相Pickering乳液中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒，改性豌豆蛋白与壳聚糖复合获得改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒；其中，改性豌豆蛋白与壳聚糖的质量比为1:3-1:7，所述改性豌豆蛋白为利用pH偏移-加热将豌豆蛋白进行改性。
所述改性豌豆蛋白为将豌豆蛋白溶液经碱调节pH值至碱性，磁力搅拌维持1h后再用酸将体系pH值调节至中性，继续磁力搅拌维持1h，随后经水浴热处理，处理后立即冰浴，即实现改性。
所述豌豆蛋白溶液为豌豆蛋白溶于蒸馏水中，磁力搅拌后放入4℃冰箱过夜水化18h，制成浓度范围在0.1％～0.5％的豌豆蛋白溶液。
所述壳聚糖的分子量为3000～10000DA，脱乙酰度大于90％。
一种所述改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒的制备方法，改性豌豆蛋白与壳聚糖溶液超声混合分散，即可得到改性豌豆蛋白-壳聚糖复合纳米颗粒。
将豌豆蛋白溶液经过pH偏移、水浴热处理后立即冰浴，冷却后加入壳聚糖溶液进行磁力搅拌，随后利用超声探针对混合分散液，即可得到改性豌豆蛋白-壳聚糖复合纳米颗粒。
所述将豌豆蛋白溶液经NaOH调节体系的pH值至12-13，磁力搅拌维持1h后再用HCl调节豌豆蛋白溶液pH值至7-8，继续磁力搅拌维持1h，而后将豌豆蛋白溶液在60℃～100℃水浴锅中加热处理30min获得改性豌豆蛋白，而后向改性豌豆蛋白中加入壳聚糖溶液，超声处理获得改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒；其中，改性豌豆蛋白与壳聚糖的质量比为1:3-1:7。
所述豌豆蛋白溶液为将豌豆蛋白溶于蒸馏水中，磁力搅拌后放入4℃冰箱过夜水化18h，制成浓度范围在0.1％～0.5％的豌豆蛋白溶液(优选0.2％)；所述壳聚糖溶液为将壳聚糖溶于0.1％的醋酸溶液中磁力搅拌2h，制成浓度为20mg/mL的壳聚糖溶液。
所述改性豌豆蛋白中加入壳聚糖溶液为在搅拌条件下加入壳聚糖溶液混合后超声处理，其中，超声设置参数为20kHz，超声功率225W～525W，以工作4s，间歇2s模式，超声3min～15min。
一种颗粒的应用，所述颗粒在制备高内相Pickering乳液中的应用。
一种高内相Pickering乳液，含所述改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒。
乳液为油相和所述改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒，其中，油相占乳液体积的60％～80％。
高内相Pickering乳液的应用，所述乳液在作为脂质替代品中的应用。进一步的说在低脂香肠、低脂肉丸、低脂牛排、低脂肉饼中的应用。
所述的低脂香肠，所述高内相Pickering乳液替代25％～100％的猪脂肪制作低脂香肠。具体为：
将高内相Pickering乳液替代猪脂肪加入斩拌好的肉馅中，按照常规加入量加入水、食盐、复合磷酸盐，调配好的香肠肉馅用灌肠机灌入泡发好的肠衣中，80℃煮制30min后，将香肠冷却，得到成品，于4℃下贮藏。
本发明所具有的优点：
1.本发明采用pH偏移-加热-超声联合技术改性获得豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒，颗粒增强豌豆蛋白的疏水性，属于物理-化学改性相结合，无污染，制备过程绿色、环保；具体为：采用pH偏移-加热-超声联合技术改性获得豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒，先通过pH偏移-加热联合改性豌豆蛋白，然后加入壳聚糖，通过超声制备豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒，再通过均质乳化技术，构建了稳定的豌豆蛋白-壳聚糖高内相Pickering乳液。
2.本发明使豌豆蛋白和壳聚糖自组装成复合颗粒，一是利用亲水性的壳聚糖有效改善了豌豆蛋白的湿润性，使其达到中性湿润性，二是在壳聚糖含量很低的情况下，通过联合改性使壳聚糖与豌豆蛋白两者之间形成氢键作用力。
3.本发明稳定的蛋白微凝胶颗粒具有很好的两亲性，表现出良好的乳化性，可代替表面活性剂制备高内相Pickering乳液。
4.本发明使用的原材料营养价值高，无毒副作用，本身具有可食性，为作为稳定剂制备绿色安全的高内相乳液奠定了基础，制备工艺条件温和，制备的复合颗粒作为稳定剂具有绿色安全、无污染的特点，通过乳化均质剪切技术制备得到高内相乳液，该乳液能在4℃条件下储藏时间超过4个月以上。
5.本发明提供了一种高内相Pickering乳液的制备方法，该方法操作简便，且用时短，所用仪器简单，适合工业化生产。
6.本发明利用复合颗粒制备获得的高内相Pickering乳液，所得乳液可为包埋的活性物质提供高稳定的环境，用于运载或保护活性物质。也可提高其生物利用度，最大限度地减少对产品感官特性的影响。
7.本发明制备的高内相Pickering乳液可作为脂质替代品中的应用于食品中，具体是可用于肉制品中，替代脂肪，在不影响产品品质的前提下，显著降低产品中的脂肪含量，在低脂乳化肉糜加工中具有良好应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的不同加热温度对豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒粒径、电位的影响图。
图2为本发明实施例1提供的不同加热温度对豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒表面疏水性的影响图。
图3为本发明实施例1提供的不同加热温度对豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒储藏稳定性的影响图。
图4为本发明实施例2提供的不同超声功率对豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒粒径、电位的影响图。
图5为本发明实施例2提供的不同超声功率对豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒表面疏水性的影响图。
图6为本发明实施例2提供的不同超声功率对豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒储藏稳定性的影响图。
图7为本发明实施例3提供的不同超声时间对豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒粒径、电位的影响图。
图8为本发明实施例3提供的不同超声时间对豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒表面疏水性的影响图。
图9为本发明实施例3提供的不同超声时间对豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒储藏稳定性的影响图。
图10为本发明实施例3提供的最佳优化条件颗粒的热稳定性影响图。
图11为本发明实施例3提供的最佳优化条件颗粒的离子强度稳定性影响图。
图12为本发明实施例4提供的不同油相比例对Pickering乳液粒径的影响图。
图13为本发明实施例4提供的不同油相比例对Pickering乳液流变特性的影响图；其中，A为静态流变图；B为储能模量图；C为损耗模量图。
图14为本发明实施例4提供的不同油相比例对Pickering乳液储藏稳定性的影响图。
图15为本发明实施例4提供的最佳油相比例Pickering乳液热稳定性的影响图。
图16为本发明实施例4提供的最佳油相比例Pickering乳液离子强度稳定性的影响图。
图17为本发明实施例5提供的不同高内相Pickering乳液替代量对低脂香肠蒸煮损失的影响图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明采用pH偏移-加热-超声协同改性获得豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒，所得复合颗粒使具有较好亲水性的豌豆蛋白增强了疏水性，从而充分发挥改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒的乳化作用。利用本发明经过pH偏移-加热-超声协同改性来制备固体颗粒，可提高其热稳定性和离子强度稳定性。利用改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒制备的高内相Pickering乳液，其制备方法简单，所得乳液乳化稳定性良好，所制备的乳液可在4℃条件下贮藏120天以上，具有良好的热稳定性和离子强度稳定性。可替代动物脂肪用于低脂食品的生产，还可包埋油溶性的活性物质，为其提供高稳定的环境，从而起到保护、运载的作用，应用于食品、化妆品、医药领域。
实施例1
改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒的制备
(1)将市购豌豆蛋白溶于蒸馏水中，磁力搅拌后放入4℃冰箱过夜水化18h，制成浓度0.2％的豌豆蛋白溶液；将壳聚糖溶于0.1％的醋酸溶液中磁力搅拌2h，制成浓度为20mg/mL的壳聚糖溶液。
上述壳聚糖的分子量为8000DA，脱乙酰度大于90％。
(2)将上述豌豆蛋白溶液进行pH偏移，具体是使用1M NaOH将上述获得豌豆蛋白溶液的pH值调节到12，磁力搅拌维持1h后再用1M HCl将豌豆蛋白溶液的pH值调回7，继续磁力搅拌维持1h实现pH偏移。在不同水浴温度下加热30min后立即冰浴，冷却后加入占豌豆蛋白溶液体积2％的壳聚糖溶液进行磁力搅拌，随后利用超声探针处理,设置参数为20kHz，超声功率为375W，时间9min，工作4s，间歇2s模式，对混合分散液进行超声改性，即可得到不同加热条件下的豌豆蛋白-壳聚糖复合纳米颗粒。所述不同加热温度对复合颗粒性质的影响
豌豆蛋白溶液经过pH偏移后在60、70、80、90、100℃温度下水浴加热处理30min，通过粒径、电位、表面疏水性、储藏稳定性确定最适加热温度，同时以未加热豌豆蛋白作为对照。
由图1可知，与未加热豌豆蛋白相比，加热后的复合颗粒的粒径明显减小，在加热温度90℃的条件下，复合颗粒的Zeta电位绝对值最大，稳定性最强。
由图2可知，不同热处理得到的豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒的表面疏水性都要高于未加热的，在加热温度90℃的条件下，复合颗粒的表面疏水性最强。
由图3可知，第一天样品外观并无明显差别，均未出现沉淀。第五天时，样品外观并无明显差别，未经加热处理产生沉淀，60℃少量沉淀。第十五天时均产生沉淀，沉淀情况：0＞60℃＞70℃＝80℃＝100℃＞90℃。相比较90℃时沉淀较少，未经加热处理产生沉淀相对较多。
由上述数据可见，最适加热温度为90℃。
实施例2
改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒的制备
(1)将市购豌豆蛋白(江苏鑫瑞生物科技有限公司)溶于蒸馏水中，磁力搅拌后放入4℃冰箱过夜水化18h，制成浓度0.2％的豌豆蛋白溶液；将壳聚糖溶于0.1％的醋酸溶液中磁力搅拌2h，制成浓度为20mg/mL的壳聚糖溶液。
上述壳聚糖的分子量为8000DA，脱乙酰度大于90％。
(2)将上述豌豆蛋白溶液经过pH偏移，具体是使用1M NaOH将上述获得豌豆蛋白溶液的pH值调节到12，磁力搅拌维持1h后再用1M HCl将豌豆蛋白溶液的pH值调回7，继续磁力搅拌维持1h实现pH偏移，而后在90℃水浴温度下加热处理30min后立即冰浴，冷却后加入占豌豆蛋白溶液体积2％的壳聚糖溶液进行磁力搅拌，随后在不同超声频率探针处理9min，对混合分散液进行超声改性，即可得到不同超声功率下的豌豆蛋白-壳聚糖复合纳米颗粒。
所述不同超声功率对复合颗粒性质的影响
设置参数为20kHz，超声功率分别设置为225、300、375、450、535W，超声时间9min，工作4s，间歇2s模式。通过粒径、电位、表面疏水性、储藏稳定性确定最适超声功率。
由图4可知，随着超声功率的增加，复合颗粒的粒径呈现先减小后增大的趋势，375W时Zeta电位绝对值达到最大，稳定性最强。
由图5可知，颗粒的表面疏水性随着超声功率的增加呈现先增加后减小的趋势。当超声功率达到375W时，复合颗粒的表面疏水性最强。
由图6可知，第一天未经过超声处理的样品相较于经过超声处理的较为澄清。第五天未经过超声处理的样品更为澄清，底部出现少量沉淀。第十五天时，沉淀产生情况：0＞525W＝300W＞225W＝450W＞375W。未经超声处理的样品产生沉淀最多，其次为525W和300W，375W沉淀最少，225W和450W产生沉淀大致相同。
由上述数据可见，最适超声功率为375W。
实施例3
改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒的制备
(1)将市购豌豆蛋白(江苏鑫瑞生物科技有限公司)溶于蒸馏水中，磁力搅拌后放入4℃冰箱过夜水化18h，制成浓度0.2％的豌豆蛋白溶液；将壳聚糖溶于0.1％的醋酸溶液中磁力搅拌2h，制成浓度为20mg/mL的壳聚糖溶液。
上述壳聚糖的分子量为8000DA，脱乙酰度大于90％。
(2)将上述豌豆蛋白溶液经过pH偏移，具体是使用1M NaOH将上述获得豌豆蛋白溶液的pH值调节到12，磁力搅拌维持1h后再用1M HCl将豌豆蛋白溶液的pH值调回7，继续磁力搅拌维持1h实现pH偏移，而后在90℃水浴温度下加热处理30min后立即冰浴，冷却后加入占豌豆蛋白溶液体积2％的壳聚糖溶液进行磁力搅拌，随后在375W超声频率探针处理不同时间，对混合分散液进行超声改性，即可得到不同超声功率下的豌豆蛋白-壳聚糖复合纳米颗粒。
所述不同超声时间对复合颗粒性质的影响
设置参数为20kHz，超声功率设置为375W，超声时间分别设置为3、6、9、12、15min，工作4s，间歇2s模式。通过粒径、电位、表面疏水性、储藏稳定性确定最适超声时间。
由图7可知，在最适的加热温度和超声功率下，颗粒的平均粒径随着超声时间的延长呈现一直减小的趋势。Zeta电位绝对值呈现先增大后减小的趋势，9min时绝对值最大，颗粒稳定性较强。
由图8可知，在最适的加热温度和超声功率下，随着超声时间的延长，豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒表面疏水性呈现先增加后降低的趋势。超声处理9min时，颗粒的表面疏水性达到最高。
由图9可知，第一天未经过超声处理的样品相较于经过超声处理的较为澄清。第五天时，未经超声处理的样品更澄清，沉淀增多，超声3min的样品出现少量沉淀。第十五天时，沉淀产生情况：0＞3min＝6min＞12min＝15min＞9min。未经超声处理样品的沉淀最多，其次为3min和6min，9min沉淀最少，12min和15min沉淀相差不多。
由上述数据可见，最适超声时间为9min。
实施例4
按照上述实施例3的制备方法，以表面疏水性作为评定指标，根据肖志刚(2018)的方法，将复合颗粒分散液进行10～50倍的稀释，取20μL溶解于磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.0)的ANS溶液(8mM)加入到4mL改性复合颗粒稀释液中，利用涡旋混匀，在避光处静置15min。利用荧光分光光度计，测其表面疏水性，激发波长为390nm、470nm。进行三因素三水平响应面试验设计，研究各因素对改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒性质的影响试验设计及结果见表1-2。
表1响应面分析因素及水平表
表2响应面分析结果表
通过Design-Expert8.0.6分析软件对表2中的试验数据进行二次线性回归拟合和方差分析，建立相应的回归模型，获得到了加热温度(A)、超声功率(B)、超声时间(C)对表面疏水性(R1)为响应值的二次多项回归方程：
R1＝-15770.95250+268.17025X1+1249600X2+463.09750X3+0.042200X1X2-2.35750X1X3+0.16000X2X3-1.40493X1 2-0.22430X2 2-16.23806X3 2
响应面优化得到的最优条件：加热温度93.52℃，超声功率400.22W，超声时间9.44min。但考虑到减少机器能耗，节约生产成本，最终选择联合改性条件为：加热温度94℃，超声功率397.5W，超声时间9min。
由图10可知，通过最佳条件制备出的改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒经过60～100℃的加热，并没有沉淀产生，放置30天依旧稳定。
由图11可知，通过最佳条件制备出的改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒在0～0.6M离子强度下外观颜色没有变化，也没有析出沉淀，12h后依旧稳定，说明经过联合改性复合颗粒在高盐浓度下具有较强的稳定性。
实施例4
步骤一：改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒的制备
将豌豆蛋白溶于蒸馏水中，磁力搅拌后放入4℃冰箱过夜水化18h，制成浓度0.2％的豌豆蛋白溶液；将壳聚糖溶于0.1％的醋酸溶液中磁力搅拌2h，制成浓度为20mg/mL的壳聚糖溶液。
将上述豌豆蛋白溶液经过pH偏移，具体是使用1M NaOH将上述获得豌豆蛋白溶液的pH值调节到12，磁力搅拌维持1h后再用1M HCl将豌豆蛋白溶液的pH值调回7，继续磁力搅拌维持1h实现pH偏移，而后在94℃水浴温度下加热处理30min后立即冰浴，冷却后加入占豌豆蛋白溶液体积2％的壳聚糖溶液进行磁力搅拌，随后利用超声探针处理，设置参数为20kHz，超声功率397.5W，超声时间9min，工作4s，间歇2s模式。对混合分散液进行超声改性，即可得到改性豌豆蛋白-壳聚糖复合纳米颗粒。
步骤二：高内相Pickering乳液的制备
将玉米油作为油相分散至上述获得复合颗粒分散液中，其中，油相占乳液的不同体积百分比为60％、65％、70％、75％、80％。
不同油相分散至上述获得复合颗粒分散液中后用高速分散剪切机均质2min，转速为12800rpm，得到高内相Pickering乳液。
对上述获得不同配比的乳液进行检测(参见图12～14)：
1)测试乳液粒径：Pickering乳液粒径的测定参考Galińska等的方法，用1％SDS溶液将乳液稀释100倍，使用激光粒度仪测量其粒径分布，光分散角度定为90°，温度设定为25℃，平衡时间120s。
2)测试乳液流变：使用流变仪测定Pickering乳液的流变特性，选用直径40mm的平板夹具(间隙高度1mm)。取适量乳液均匀涂布于流变仪的底板上，并用一薄层硅油封闭样品。记录剪切速率从0.1增加到100s-1的过程中乳液的黏度变化。动态频率扫描：在1％的恒定应变下，频率0.1～10Hz，记录储能模量(G′)、损耗模量(G″)，表征Pickering乳液的动态粘弹性。所有的实验在25±0.1℃的测试温度下进行。
3)测试乳液储藏稳定性：将所制备的Pickering乳液分别取10mL置于小玻璃瓶中，并于4℃下储藏。分别在1、3、5、7、15、30、120天拍照观察。
4)测试乳液热稳定性：取新制乳液于样品瓶中，100℃水浴30min，冷却至室温后，观察乳液外观。
5)测试乳液离子强度稳定性：制备含有0～0.6M的离子浓度的Pickering乳液，分别取10mL置于小玻璃瓶中，并于4℃下储藏。在第1、60、120天拍照观察乳液外观。
由图12可知，乳液粒径随着油相比例的增加而减小，当油相比例达到75％时，粒径达到最小值。
由图13A可知，随着油相比例的增加，表观粘度逐渐增大，当油相比例75％时，达到最大。随着剪切速率的增加而乳液表观黏度逐渐变小，呈现非牛顿流体行为。并且添加不同的油相体积分数稳定的乳液表观黏度不同，油相体积75％时，表观粘度最大，这是由于油脂与蛋白质之间作用，油相占比越高，液滴之间碰撞几率增大，蛋白质分子之间连接越紧密，导致乳滴聚集。乳液表观黏度越大，表明流动性越差。但当油相体积达到80％时，乳液具有剪切稀化现象。
由图13B～C可知，随着油相比例的增大，Pickering乳液在频率0-10Hz下，储能模量G′均大于损耗模量G″，都呈现出逐渐上升的趋势，说明此条件下制备的Pickering乳液是具有弹性为主的凝胶性质。相较于高油相(70％、75％)，油相体积分数为60％、65％的Pickering乳液，G″随频率的变化不明显且G″值小。而在体积分数为70％和75％的油相下，G″明显增大，当油相体积分数为75％的高内相Pickering乳液，因为液滴间相互作用会更强，通过紧密堆积液滴形成弹性网络，导致高内相乳液有更高的弹性强度。
图14为本发明基于改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒稳定的高内相Pickering乳液放置120天的外观图。即使在储存120天后，75％油相比例也没有观察到漏油的迹象，依旧稳定。
由图15可知，乳液经过100℃加热30min后，油相比例60％、65％、70％、80％均产生分层，油相比例为75％的乳液稳定性最强。
由上述数据可见，最佳油相比例为75％。此时改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒可形成高内相Pickering乳液。
由图16可知，油相比例75％的高内相Pickering乳液在0～0.6M离子强度下，在120天内具有良好的稳定性，表现出极好的盐离子耐受性。
实施例5
步骤一：改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒的制备
将豌豆蛋白溶于蒸馏水中，磁力搅拌后放入4℃冰箱过夜水化18h，制成浓度0.2％的豌豆蛋白溶液；将壳聚糖溶于0.1％的醋酸溶液中磁力搅拌2h，制成浓度为20mg/mL的壳聚糖溶液。
将上述豌豆蛋白溶液经过pH偏移，具体是使用1M NaOH将上述获得豌豆蛋白溶液的pH值调节到12，磁力搅拌维持1h后再用1M HCl将豌豆蛋白溶液的pH值调回7，继续磁力搅拌维持1h实现pH偏移，而后在94℃水浴温度下加热处理30min后立即冰浴，冷却后加入占豌豆蛋白溶液体积2％的壳聚糖溶液进行磁力搅拌，随后利用超声探针处理，设置参数为20kHz，超声功率397.5W，超声时间9min，工作4s，间歇2s模式。对混合分散液进行超声改性，即可得到改性豌豆蛋白-壳聚糖复合纳米颗粒。
步骤二：高内相Pickering乳液的制备
将75％玉米油作为油相分散至上述获得复合颗粒分散液中，用高速分散剪切机均质2min，转速为12800rpm，得到稳定的高内相Pickering乳液。
步骤三:低脂香肠的制备
工艺流程：原料肉的预处理(去除可见筋膜，分割)→瘦肉加食盐、复合磷酸盐：高速搅拌3min后静置→加入猪背膘和/或高内相Pickering乳液高速搅拌1min→加入冰水高速搅拌3min→灌肠(每个质量100.0g±5.0g)→煮制(80℃，30min)→冷却→包装→成品，于4℃冷库中贮藏。
不同实验组中利用高内相乳液替代猪脂肪制作低脂香肠配方如表3所示。
表3利用高内相乳液替代猪脂肪制作低脂香肠配方
通过质构、色差、感官评价、蒸煮损失的评价获得最佳高内相乳液替代量：
1)质构：将4℃贮藏的香肠放置在室温下平衡1h，剥去肠衣，将样品切成20mm×18mm(高×直径)的圆柱体，每组样品选取6段使用美国CT3 10K质构分析仪测定其质构，探头型号为TA11。测量参数为：测试前速率为5mm/s，测试速率为1mm/s，测试后速率为1mm/s，压缩比为50％，触发力为5g循环2次。每组样品做3次重复，结果取平均值。测定指标包括硬度、弹性、内聚性、咀嚼性和回复性。
由表4可知，脂肪的减少会显著影响产品的质量和质地。如表4所示，与对照组相比，随着替代物比例的增加，低脂香肠的硬度和咀嚼性明显增加(P＜0.05)。这是由于在加热过程中，豌豆蛋白分子结构舒展暴露活性基团，同时随着乳液添加量的增大，引入更多的蛋白质参与肉糜凝胶网络结构的形成，肉糜与蛋白的紧密结合增加了产品的硬度。高内相Pickering乳液替代组的低脂香肠咀嚼性和回复性也显著增加(P＜0.05)，弹性和内聚性增加具有显著性差异(P＜0.05)。弹性和回复性分别为表征样品在第1次压缩后再恢复的程度和回弹能力的指标。高内相Pickering乳液形成稳固的类固体结构存在于肉基质中，因此使香肠具有稳定的凝胶特性。因此，高内相Pickering乳液替代猪背膘加入低脂香肠中可以提高香肠的质构特性，改善产品的质地。
表4乳液替代比例对香肠质构的影响
2)色差：将4℃贮藏的香肠放置在室温下平衡1h，切成高20mm的圆柱体，然后将色差仪用标准白板校对后，测定样品色度，每个样品选取6段，分别记录香肠的L*值(亮度)、a*值(红度)和b*值(黄度)。每段样品重复测定3次，结果取平均值。
由表5可知，与对照组相比，随着乳液替代脂肪比例的增加，香肠的L*值显著增加(P＜0.05)，a*值和b*值显著降低(P＜0.05)。相比斩拌的固态肥膘，高内相Pickering乳液中油液滴较小，具有较大的表面积，通过提高光的反射率增加了香肠的亮度L*值。而且实验组肉糜凝胶网络的内部水分较对照组损失减少，也可增强光的反射，这与蒸煮损失的结果相一致。L*值的增加主要是由于动物脂肪和植物油之间颜色差异引起的。a*值的降低主要是由于高内相Pickering乳液替代量的增加，使得肉糜中的肌球蛋白与其结合，体现肉糜红色的红色素随之减少，因此，相较于对照组a*值显著降低(P＜0.05)。b*值随着取代脂肪的高内相Pickering乳液水平的增加而降低，通常脂肪氧化后颜色较正常时明显变黄，因此当前研究下香肠b*值的降低可能归因于高内相Pickering乳液较强的抗脂肪氧化能力。
表5乳液替代比例对香肠色差的影响
3)感官评价：由10位食品专业的组成感官评定小组，从组织结构、色泽、滋味、口感及可接受性5个方面进行评分，分值均在1-20分之间，感官评定的标准如表4-2所示。所有待评定样品随机取样，评定员独自进行评定。
由表6可知，高内相Pickering乳液替代猪脂肪比例对低脂香肠的感官品质影响逐渐显著。随着乳液替代猪脂肪比例的增加，表观状态、色泽、滋味和口感均呈现增大的趋势，具有较好的可接受性。当使用100％乳液替代猪脂肪时，香肠的表观状态、色泽、滋味和口感明显好于100％猪脂肪的香肠(P＜0.05)，可接受度最高。总的来说，脂肪替代物的添加没有给香肠感官带来不适，甚至提高了香肠的感官品质。
表6乳液替代比例对香肠感官评价的影响
4)蒸煮损失：取斩拌后的肉糜(质量记为W1)置于50mL离心管中，于80℃水浴30min后取出，室温冷却1h后用滤纸吸干表面多余的水分，再次进行称重(W2)，计算蒸煮损失率。
由图17可知，随着高内相Pickering乳液替代比例的增加，蒸煮损失率减少。原因在于高内相Pickering乳液良好的热稳定性使其在高温蒸煮过程中不至于破乳以致造成汁液流失。结果表明，在高内相Pickering乳液的作用下，香肠内形成了稳定的肉食体系，工艺质量有所改善。当高内相Pickering乳液用于替代肉糊中的脂肪时，乳化过程中脂肪球在蛋白质基质中的更好分布也有助于产生更高的乳化稳定性，故而蒸煮损失率降低。当高内相Pickering乳液替代比例达到75％以上时，香肠的保水性得到显著改善(P＜0.05)，加热过程中蛋白质间的交互作用增强，从而形成更加稳定、富有弹性的网络结构，增强其对水的束缚能力，提高肉糜的保水性。此外，蛋白质的亲水性也使其具有良好的保水性能。
综上所述，经过pH偏移-加热-超声联合改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒粒径小、电位绝对值大并且表现出良好的表面疏水性，极大改善了豌豆蛋白的乳化特性，为其后续应用提供了有效指导。制备的高内相乳液具有乳化剂用量少，原料便宜易得，制备方法简单，环境友好等特点，并且具有极好的储藏稳定性及流变特性。本发明制备的联合改性豌豆蛋白-壳聚糖复合颗粒能够有效制备出具有超高稳定性的Pickering乳液以及提高豌豆蛋白及壳聚糖的生物利用率；进而将其作为脂肪替代物用于低脂食品的生产，实现其降低脂肪含量、提高营养价值、减少心脑血管疾病等发病率及改善产品品质和稳定性的目的。近年来，越来越多的消费者追求更营养、更健康的肉制品。在肉制品生产过程中，用植物油或鱼油取代动物脂肪，将水包油型稳定的高内相Pickering乳液替代动物脂肪作为营养成分添加具有巨大的加工优势。

Claims (6)

1.一种改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于：
将豌豆蛋白溶液经过pH偏移、水浴热处理后立即冰浴，冷却后加入壳聚糖溶液进行磁力搅拌，随后利用超声探针对混合分散液处理，即可得到改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒；
具体操作为：
将豌豆蛋白溶液经NaOH调节体系的pH值至12-13，磁力搅拌维持1 h后再用HCl调节豌豆蛋白溶液pH值至7-8，继续磁力搅拌维持1 h，而后将豌豆蛋白溶液在60 ℃～100 ℃水浴锅中加热处理30 min获得改性豌豆蛋白，而后向改性豌豆蛋白中加入壳聚糖溶液，超声处理获得改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒；其中，改性豌豆蛋白与壳聚糖的质量比为1:3-1:7；
所述改性豌豆蛋白中加入壳聚糖溶液为在搅拌条件下加入壳聚糖溶液混合后超声处理，其中，超声设置参数为20 kHz，超声功率225 W～525 W，以工作4 s，间歇2 s模式，超声3min～15 min。
2.一种改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒，其特征在于：按照权利要求1所述制备方法制备得到的改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒。
3.按权利要求2所述颗粒的应用，其特征在于：所述颗粒在制备高内相皮克林乳液中的应用。
4.一种高内相皮克林乳液，其特征在于：含权利要求2所述改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒。
5.按权利要求4所述的高内相皮克林乳液，其特征在于：乳液为油相和权利要求2所述改性豌豆蛋白-壳聚糖纳米颗粒，其中，油相占乳液体积的60%～80%。
6.按权利要求5所述的高内相皮克林乳液的应用，其特征在于：所述乳液在作为脂质替代品中的应用。
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