CN111903981A - 一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法与应用 - Google Patents

一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法与应用，属于功能食品加工技术领域。本发明通过在第一次超声处理得到的亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液中加入油脂剪切均质得到粗乳液，随后经第二次超声处理制备得到水包油纳米乳液。该制备方法不仅可以通过第一次超声处理使复合溶液的粘度降低，增加后续剪切均质的可操作性，还能促进植物蛋白结构中疏水性氨基酸的暴露，增大复合溶液的内源荧光强度和表面疏水性，从而增强亚麻籽胶和植物蛋白之间的疏水相互作用，以改善亚麻籽胶/植物蛋白复合物的乳化特性；再通过第二次超声处理粗乳以促进纳米级液滴的形成。本发明公开的制备方法操作简便、成本低，适于推广与应用。

Description

一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米 乳液的方法与应用
技术领域
本发明属于功能食品加工技术领域，具体涉及一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法与其在药物制剂及食品加工中的应用。
背景技术
含多不饱和脂肪酸(PUFAs)的乳液在治疗临床营养不良和预防某些慢性疾病等方面具有潜在的应用价值。ω-3多不饱和脂肪酸主要包括α-亚麻酸、EPA和DHA，是重要的脂质营养素，广泛存在于植物、鱼类及藻类生物中，能有效促进人体生长发育，具有抗炎、抗癌、预防心脑血管疾病、防治糖尿病和降血脂等重要的生理功能。研究发现水包油乳液是一种合适的摄取PUFAs的途径，可以扩展PUFAs在亲水体系中的应用(例如酸奶、牛奶或饮料等)，并增加其生物利用率。水包油纳米乳液属于非热力学稳定体系，需要两亲性的乳化剂来稳定形成具有抗沉降和抗乳析动力学稳定的乳液。根据乳化剂的来源，可分为合成型乳化剂与天然型乳化剂，但随着人们健康意识的不断提高，消费者越来越偏好选择有益于健康的天然成分，使得许多具有两亲性的植物蛋白质，以及具有持水、增稠、乳化、凝胶等特性的多糖成为制备水包油纳米乳液常用的添加剂。
亚麻籽胶作为一种膳食纤维，主要从脱脂饼粕、亚麻籽壳或直接从亚麻籽中提取，具有丰富来原料来源，可降低糖尿病、冠心病、结直肠癌和肥胖症的发病率。亚麻籽胶用于稳定乳液是因为其具有良好的持水能力和增稠特性，可以调节连续相的流变性及网状结构，延迟相分离和重力引起的乳状液分层，同时由于亚麻籽胶结构中结合了一定量的蛋白质(水提法最优条件下的蛋白含量小于80g/kg)而具有乳化作用，但与食品工业上常用的乳化剂相比，亚麻籽胶的乳化能力十分有限，所制备的乳液易发生乳析沉降，且制备的乳液粒径较大，预想通过亚麻籽胶制备更稳定的水包油纳米乳液需要与其他具有两亲性的乳化剂协同作用。植物蛋白作为消费者友好型蛋白，在自然界中具有丰富的资源和很好的乳化活性，有研究表明，选择多糖/蛋白复合物相较单独使用多糖或者蛋白质作为稳定剂和乳化剂可以显著提高乳液的稳定性。亚麻籽胶由酸性多糖(25％)和中性多糖(75％)组成，是一种亲水的阴离子杂多糖，可与植物蛋白之间可以通过四种非共价相互作用形成复合物来稳定乳液，这四种非共价作用包括静电相互作用、空间排斥、疏水作用和氢键。亚麻籽胶和蛋白质相互作用的性质和强度是影响乳液整体稳定性和结构特性的关键因素，有研究表明通过pH、离子强度可以调节静电相互作用强弱，通过控制温度、选择多糖和蛋白质的类型和浓度可以调节空间位阻、疏水或氢键作用力。考虑到中性条件在生产应用中的适用性，以及大多数植物蛋白的等电点小于7，在高于等电点条件下的植物蛋白均具有较好的溶解性，同时亚麻籽胶也具有较大的凝胶强度，但亚麻籽胶与植物蛋白之间的静电相互作用较弱，为了提高亚麻籽胶/植物蛋白之间的相互作用，得到具有特定结构和功能性质的复合物，从而改善多糖的乳化性能，提高蛋白质的溶解度、稳定性和乳化能力，需要借助其他的技术手段来强化亚麻籽胶与植物蛋白之间的相互作用。
超声作为一种操作更简单、对超声对象要求较低的一种处理乳液的手段，在食品工业中的应用引起了特别关注。当超声波在介质中传播时，超声的空化效应会引起热效应、机械效应及水分子裂解产生的自由基效应，从而导致亚麻籽胶的分子量、单糖组成、分支度以及空间结构发生变化，使得部分亚麻籽胶降解，分子量减小，进而导致其溶解度增大，粘度降低，并增加亚麻籽胶在体系中的分散。同时有研究表明超声使蛋白质暴露更多的内部疏水基团以改变蛋白质的二级结构，从而增加了食品蛋白质的溶解度和乳化性能。在超声传播过程中，大量空化气泡形成、生长、振荡、破裂，在极短的时间内产生较高的局部压力，可能使发生降解并粘度降低的亚麻籽胶与疏水性增加的蛋白之间形成更强的疏水作用力和氢键相互作用。虽然高压均质和传统一步超声是目前制备乳液最常用的方法，但高压均质对溶液的粘稠度有很高的要求，较大粘度的乳液较难通过高压均质机，甚至会直接堵塞仪器。现有的一步超声法制备乳液前需高速剪切制备粗乳，但由于亚麻籽胶的凝胶和增稠特性，会使得剪切均质过程不均匀，蛋白吸附至油水界面能力受阻，高能量输入有助于复合物发生结构重组和功能改性。因此，对亚麻籽胶/植物蛋白复合水溶液进行第一步高能超声，可能会使得部分亚麻籽胶降解，分子量减小，破坏了亚麻籽胶与水分子之间的氢键作用力，从而降低水溶液的粘度，改善剪切均质制备粗乳时的可操作性。同时第一步超声可能增加植物蛋白的表面疏水性，增强亚麻籽胶/植物蛋白之间的相互作用，从而提高亚麻籽胶/植物蛋白的乳化性能。再按照传统的超声法第二步超声粗乳，通过超声促进体系中亚麻籽胶/植物蛋白复合乳化剂向油/水界面处的扩散、吸附和构象重排，增强乳化剂与油滴之间的相互作用，并通过超声空化引起的爆轰使微米级油滴破裂形成纳米级液滴，从而减少液滴的重力分离、絮凝和聚结的发生，形成具有较好动力学稳定性的水包油纳米乳液。
因此，如上所述，超声波是广泛用于增强食物多糖、蛋白质功能特性的有效方法，尽管已经广泛研究了超声功率或超声时间对食物蛋白质的影响，但超声对亚麻籽胶/植物蛋白复合物产生的影响尚未见研究报道。将超声与高压均质和传统一步超声法结合并对其改进，从而开发一种利用两步超声制备具有良好功能活性的亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法就成为了本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白水包油纳米乳液的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法，所述水包油纳米乳液是将富含多不饱和脂肪酸的油脂加入到经超声处理后的亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液中，随后剪切均质、再一次超声处理得到水包油纳米乳液体系；所述方法具体包括如下步骤：
(1)将植物蛋白粉溶解于磷酸盐缓冲液中，搅拌、离心得到植物蛋白溶液；
(2)在步骤(1)得到的植物蛋白溶液中加入亚麻籽胶，搅拌、混合均匀并经第一次超声处理得到亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液；
(3)向步骤(2)超声处理后的亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液中加入油脂得到油水混合物；
(4)对步骤(3)得到的油水混合物剪切均质得到粗乳液，随后进行第二次超声处理，最终得到亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液。
进一步的，步骤(1)中，磷酸盐缓冲液的pH为7.0～9.0，浓度为0～10mmol/mL，且所述磷酸缓冲液是用磷酸二氢钾和磷酸氢二钾溶液配制；搅拌时间为5～24h，搅拌速率为700～1000r/min，以保证植物蛋白粉充分分散于磷酸缓冲液中，从而高效提取蛋白。
进一步的，步骤(2)中，所述植物蛋白与亚麻籽胶的浓度比为(1～4)：1，及植物蛋白粉与亚麻籽胶的总浓度为所述亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液的1～4％(w/w)。
更进一步的，步骤(2)中的搅拌速率为500～700r/min，搅拌时间为2～5h。
进一步的，第一次超声处理条件为：超声功率为300～600W，超声时间为6～20min，超声时间间隔为1～5S，即超声模式为开1～5S关1～5S。
进一步的，步骤(3)中，油脂的加入量为所述水包油纳米乳液质量的5～20％。
进一步的，步骤(4)中，剪切均质的工艺参数为：剪切速率为10000～15000r/min，剪切时间为3～6min。
具体的，所述剪切均质是指利用高速剪切机在13000r/min下对油水混合溶液剪切3min即可得到粗乳液。
更进一步的，第二次超声处理条件为：超声功率为100～400W，超声时间0～20min，且超声时间间隔为1～5S，即超声开1～5S关1～5S。
其中，上述制备水包油纳米乳液时用的植物蛋白包括大豆蛋白、豌豆蛋白、火麻仁蛋白、葵花籽蛋白、糙米蛋白、牡丹籽蛋白、紫苏籽蛋白和亚麻籽蛋白等；所述油脂为富含多不饱和脂肪酸的油脂，且所述油脂至少为亚麻籽油、DHA藻油、鱼油、紫苏油和美藤果油等中的一种。
此外，发明人后续对上述利用两步超声制备水包油纳米乳液的工艺参数进行优选得知，在下述最佳工艺条件下制备的纳米乳液粒径为0.299μm，电位为-55mV，且可在4℃稳定1个月以上。
植物蛋白与亚麻籽胶的添加浓度比为4：1，及植物蛋白与亚麻籽胶的总添加浓度为亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液(水相)的1％(w/w)，对粗乳液进行第二次超声处理条件为：超声功率400W，超声时间20min，超声时间间隔为1S，即超声开1S关1S。
并且，通过上述超声工艺制备的亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液的内源荧光强度和表面疏水性相较单一蛋白溶液和未超声的亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液有所增加，粘度有所降低，并增加了亚麻籽胶/植物蛋白的乳化效果，提高了乳液的稳定性。
需要说明的是，两步超声法相较一步超声法具有更好乳化效果的原因不是因为次数多、超声时间长导致的，是因为相比传统一步超声，增加了对亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液的第一步超声，这一步超声使得部分亚麻籽胶降解，分子量减小，破坏了亚麻籽胶与水分子之间的氢键作用力，进而导致亚麻籽胶溶解度增大，粘度降低，增加亚麻籽胶在体系中的分散，有利于后续剪切均质制备乳液时的顺利操作，而不会由于粘度太大阻碍油滴充分分散在水相体系，同时这一步超声促进了植物蛋白结构中疏水性氨基酸的暴露，增大了亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液的表面疏水性值和荧光强度，从而增强了亚麻籽胶和植物蛋白之间的疏水相互作用，使亚麻籽胶/植物蛋白复合物的乳化性能增强，更有利于制备稳定的水包油乳液。
进一步的，若将本申请公开的两步超声转变为三步超声，即先对植物蛋白溶液进行第一步超声，将亚麻籽胶加入至植物蛋白溶液并磁力搅拌后进行第二步超声，制备粗乳后进行第三步超声，与两步超声法相比只是增加了对植物蛋白的超声时间，且三步超声会将制备工艺复杂化、增加制乳的操作时间、提高能耗和成本。而对于本发明使用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的原理如下所述：
通过第一次超声处理使得部分亚麻籽胶降解，分子量减小，破坏亚麻籽胶与水分子之间的氢键作用力，使溶液的粘度降低，增加亚麻籽胶在体系中的分散，增加后续剪切均质的可操作性，还能促进植物蛋白结构中疏水性氨基酸的暴露，增大亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液的内源荧光强度和表面疏水性，从而增强亚麻籽胶和植物蛋白之间的疏水相互作用，以改善亚麻籽胶/植物蛋白复合物的乳化特性。再通过第二次超声处理粗乳，通过超声促进体系中亚麻籽胶/植物蛋白复合乳化剂向油/水界面处的扩散、吸附和构象重排，增强乳化剂与油滴之间的相互作用，并通过超声空化引起的爆轰使微米级油滴破裂形成纳米级液滴，从而减少液滴的重力分离、絮凝和聚结的发生，形成具有较好动力学稳定性的水包油纳米乳液。
更进一步的，本发明的创新点不仅仅是将传统的一步超声处理扩展为两步超声处理，还通过对亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液超声，降低复合溶液的粘度，增强亚麻籽胶与植物蛋白间相互作用、乳化效果，随后与其他的低能或者高能乳化技术配套使用，以期获得尺寸更小、稳定性更高的乳液，使应用领域更广泛、产品更加高值化。
此外，本发明申请还请求保护上述方法制备的亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液在药物制剂及食品加工中的应用。
与现有技术相比，本发明公开提供的一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法与应用，具有如下优异效果：
本发明通过在第一次超声处理得到的亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液中加入油脂剪切均质得到粗乳液，随后经第二次超声处理制备得到水包油纳米乳液。该制备方法不仅可以通过第一次超声处理使得部分亚麻籽胶降解，分子量减小，破坏亚麻籽胶与水分子之间的氢键作用力，使溶液的粘度降低，增加亚麻籽胶在体系中的分散，增加后续剪切均质的可操作性，还能促进植物蛋白结构中疏水性氨基酸的暴露，增大亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液的内源荧光强度和表面疏水性，从而增强亚麻籽胶和植物蛋白之间的疏水相互作用，以改善亚麻籽胶/植物蛋白复合物的乳化特性。再通过第二次超声处理粗乳，利用超声空化引起的超声爆轰导致微米级油滴破裂，以促进纳米级液滴的形成，有利于制备更稳定的乳液。本发明公开的制备方法操作简便、成本低，适于推广与应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图
图1为本发明亚麻籽胶/豌豆蛋白复合水包油纳米乳液的工艺优化图。
图2为本发明亚麻籽胶/豌豆蛋白复合水包油纳米乳液的微观结构及储存外观变化图。
图3为本发明亚麻籽胶/豌豆蛋白复合溶液表面疏水性分析图。
图4为本发明亚麻籽胶/豌豆蛋白复合溶液粘度分析曲线。
图5为本发明亚麻籽胶/豌豆蛋白复合水包油纳米乳液、亚麻籽胶/其他植物蛋白复合水包油乳液的两步超声处理下乳液的粒径、电位对比图。
具体实施方式
下面将结合说明书附图对本发明公开保护的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
实施例1
一种利用两步超声制备亚麻籽胶/豌豆蛋白复合水包油纳米乳液的方法，具体包括如下步骤：
(1)豌豆蛋白的溶解：
称取一定量的豌豆蛋白粉于5mM的磷酸盐缓冲液(PBS溶液，pH 7.0)中，700rpm磁力搅拌5h后，在20℃下以10,000rpm离心30min，取上清液，稀释一定倍数后用紫外可见分光光度计在280nm下测吸光度，使吸光度在0.1-0.9之间，以保证测试结果的准确性。随后根据稀释倍数和吸光度计算蛋白浓度，如公式一所示：
蛋白浓度(％)＝吸光度×0.75×稀释倍数÷10 (公式一)
(2)亚麻籽胶/豌豆蛋白复合溶液的制备：
称取一定量的亚麻籽胶于步骤(1)的豌豆蛋白溶液中，磁力搅拌2h使其充分混合；然后用超声细胞破碎仪超声处理混合的溶液，其中超声处理工艺条件为：超声功率300W，超声开1S关1S，超声时间6min。
(3)亚麻籽胶/豌豆蛋白复合水包油纳米乳液的制备：
向亚麻籽胶/豌豆蛋白复合溶液中加入亚麻籽油，控制亚麻籽油的加入量相对于乳液的质量比为10％，并将混合溶液在13,000rpm下剪切均质3min得到粗乳液；随后用超声细胞破碎仪在下述不同工艺条件下超声处理粗乳液得到系列亚麻籽胶/豌豆蛋白复合水包油纳米乳液。
其中，水包油纳米乳液中亚麻籽胶与豌豆蛋白的总添加量占亚麻籽胶/豌豆蛋白复合溶液的1～4％(w/w)，豌豆蛋白与亚麻籽胶浓度比为4:1～1:1，超声时间为0～20min，超声功率为100～400W，超声开关模式为开1-5S关1-5S。
针对上述公开的亚麻籽胶/豌豆蛋白复合水包油纳米乳液的工艺条件进行优化，具体如下：
通过粒度分布仪(Mastersizer 2000，英国Malvern公司)和电位测定仪(Nanoseries ZS，英国Malvern公司)分别测量乳液的粒径和ζ电势，按照乳液粒径、电位或贮存外观变化对乳液的制备工艺进行优化，且计算过程中使用的亚麻籽油和水相的折射率分别为1.490和1.330。结果如图1所示。
(1)pH的选择
由图1中的A可知，在豌豆蛋白：亚麻籽胶为1:1，豌豆蛋白与亚麻籽胶总添加量为1％，亚麻籽胶/豌豆蛋白混合溶液在1S开1S关的模式下，以300W超声6min(总超声时间3min)，粗乳液在5S开5S关模式下，以300W超声5min(总超声时间2.5min)制备不同水相pH的水包油纳米乳液。
在不同pH值下，乳液的粒径有所不同，当pH为2-5时，乳液的D4,3均大于3μm，而pH由4增加至10的过程中，乳液的粒径D4,3随着pH的增加呈现先降低后趋于平衡的趋势，从pH7.0开始时乳液的D4,3趋于平衡。在pH为6时，乳液的电位值最低，pH为10时，乳液的电位值最高，其他乳液的电位值无显著性差异(p<0.05)。综合不同pH下乳液的粒径和电位结果分析，选择pH 7.0为较合适的pH条件。
(2)豌豆蛋白与亚麻籽胶总添加量的选择
由图1中的B可知，在豌豆蛋白：亚麻籽胶为1:1，亚麻籽胶/豌豆蛋白混合溶液在1S开1S关的模式下，以300W超声6min(总超声时间3min)，粗乳液在5S开5S关的模式下，以300W超声5min(总超声时间2.5min)制备不同豌豆蛋白与亚麻籽胶总添加量的水包油纳米乳液。
在豌豆蛋白与亚麻籽胶总添加量为1％时，乳液的D4,3和D3,2相对较小，分别为3.173±0.996μm和0.545±0.014μm。随着总添加量的增大，乳液的粒径呈现增加趋势，这是由于乳化剂添加量越大，亚麻籽胶相对乳液整体的添加量也愈大，亚麻籽胶具有很好的增稠作用，浓度越大，会降低乳液的流动性，因此在剪切乳化过程中，难以使乳化剂充分发挥乳化作用。Wang等人也发现亚麻籽胶添加量过高，会使得大豆分离蛋白乳液的粒径呈现增加趋势。且乳液在4℃下储存1天后的乳析现象也表明，亚麻籽胶含量低(豌豆蛋白与亚麻籽胶总添加量为1％)时，乳液未见乳析现象，但总添加量为2％和3％时，乳液可见乳析现象。综合考虑粒径和乳液稳定性因素，选取豌豆蛋白与亚麻籽胶总添加量为1％。
(3)豌豆蛋白与亚麻籽胶比例的选择
由图1中的C可知，在豌豆蛋白与亚麻籽胶总添加量为2％，亚麻籽胶/豌豆蛋白混合溶液在1S开1S关的模式下，以300W超声6min(总超声时间3min)，粗乳液在5S开5S关的模式下，以300W超声5min(总超声时间2.5min)制备不同豌豆蛋白/亚麻籽胶比例的水包油纳米乳液。
豌豆蛋白与亚麻籽胶的比例越大，也就是说亚麻籽胶所占比例越小，乳液的粒径(D4,3和D3,2)相对越小，在豌豆蛋白：亚麻籽胶的比例为4:1时，乳液的粒径(D4,3和D3,2)最小，分别为3.560±0.070μm和1.179±0.005μm。且乳液在4℃下储存1天后的乳析现象也表明，豌豆蛋白与亚麻籽胶比例为3:1和2:1时，乳液可见严重的乳析现象，但豌豆蛋白与亚麻籽胶比例为4：1时，乳液未见乳析现象。豌豆蛋白：亚麻籽胶在这四个比例下，电位值无显著性差异。综合考虑粒径和乳液稳定性因素，选取豌豆蛋白与亚麻籽胶比例为4:1。
(4)粗乳超声时间的选择
由图1中的D可知，在豌豆蛋白与亚麻籽胶总添加量为1％，豌豆蛋白：亚麻籽胶为4:1，亚麻籽胶/豌豆蛋白混合溶液在1S开1S关的模式下，以300W超声6min(总超声时间3min)，粗乳液在5S开5S关的模式下，以300W超声0-22min(总超声时间0-11min)制备水包油纳米乳液。
随着总超声时间的增加，乳液的粒径(D4,3和D3,2)随之降低，当存在足够的乳化剂以覆盖液滴时，增大超声粗乳液的接触时间可以将乳液液滴的尺寸减小到最小尺寸。在其他工艺条件未达到最优条件时，当总超声时间超过10min，乳液的粒径D3,2降低至1μm以下(为0.693±0.006μm)。结合能耗因素，以及长时间超声波处理会导致温度升高使蛋白质发生热变性，因此选择20min(总超声时间10min)为较优的总超声时间以制备水包油纳米乳液。
(5)粗乳超声功率的选择
由图1中的E可知，在豌豆蛋白与亚麻籽胶总添加量为1％，豌豆蛋白：亚麻籽胶为4:1，亚麻籽胶/豌豆蛋白混合溶液在1S开1S关的模式下，以300W超声6min(总超声时间3min)，粗乳液在5S开5S关的模式下，以100-400W超声5min(总超声时间2.5min)制备不同超声功率处理的水包油纳米乳液。
随着超声功率的增加，乳液的粒径(D4,3和D3,2)随之降低，在4℃下储存1天后，可见超声功率越大，乳化层高度越高，因此选择400W为合适的超声功率，在该功率下，乳液的D4,3和D3,2分别为1.358±0.008μm和0.511±0.011μm。
(6)粗乳超声开关间隔模式的选择
由图1中的F可知，在豌豆蛋白与亚麻籽胶总添加量为1％，豌豆蛋白：亚麻籽胶为4:1，亚麻籽胶/豌豆蛋白混合溶液在1S开1S关的模式下，以300W超声6min(总超声时间3min)，制备的粗乳液以400W超声5min(总超声时间2.5min)制备不同超声开关间隔模式的水包油纳米乳液。
因超声开关间隔模式对乳液的粒径和稳定性有一定的影响，由开1S关1S至开5S关5S的过程中，粒径呈现先增大(开1S关1S至开3S关3S)，后降低(开3S关3S至开5S关5S)的趋势，在开1S关1S模式下，乳液的D3,2最小(0.425±0.010μm)，在开5S关5S模式下，乳液的D4,3最小(1.780±0.003μm)，但结合乳液在4℃下储存1天后的外观图可知，开2S关2S至开5S关5S这四种模式下的乳液均出现了乳析，但在开1S关1S超声模式下，乳液最为稳定，未出现乳析现象，综上所述选择开1S关1S的超声开关间隔模式。
为了进一步验证本发明申请预想保护的技术方案相较现有技术存在的非显而易见性，发明人还进行了如下表征及测定实验，具体如下：
实验一：合适工艺条件下水包油纳米乳液的微观结构及储存外观变化
使用荧光倒置显微镜在60倍物镜和10倍目镜下观察上述合适工艺条件下制备的乳液微观结构。先将水包油纳米乳液样品用PBS稀释50倍，然后取5μL置于显微镜载玻片上，盖上盖玻片以观察乳液的微观结构。将上述得到的合适工艺条件下的乳液置于4℃冰箱中储存，隔一段时间拍照观察乳液的外观稳定性变化，具体结果如附图2所示。
如图2中A可知，本发明得到的亚麻籽胶/豌豆蛋白复合水包油乳液中乳滴分布均匀，无聚集现象，说明本发明得到的亚麻籽胶/豌豆蛋白复合水包油乳液具有良好的稳定性，且分布粒径较小。乳液在4℃冰箱储存1个月期间，未见外观不稳定性变化，在储存42天后，乳液出现乳析(图2B中红框所示)，表明该制备工艺条件下可获得至少30天稳定且均匀的亚麻籽胶/豌豆蛋白复合水包油纳米乳液，有助于其在药物制剂、食品和饮料等行业中的潜在应用。
实验二：亚麻籽胶/豌豆蛋白复合溶液性质的评价
(1)亚麻籽胶/豌豆蛋白复合溶液表面疏水性分析
采用酶标仪测定不同蛋白溶液的内源荧光光谱和表面疏水性指数值(H0)，具体操作如下：
使用5mM PBS溶液(pH 7.0)将蛋白溶液稀释至蛋白浓度为5mg/mL，并在290nm的激发波长和300～500nm的发射波长下进行测量溶液的内源荧光光谱，每个样品扫描三遍。
采用ANS荧光探针法测定不同蛋白溶液的表面疏水性指数，具体操作如下：
向装有4mL PBS溶液(5mM,pH 7.0)的塑料离心管中分别添加10、20、30、40和50μL1％的蛋白溶液，在测试前添加20μL 8mmol/L ANS储液，振荡均匀，在8～15min内采用酶标仪检测样品的荧光强度。其中激发和发射波长分别370nm和470nm，并以相对荧光强度对蛋白质浓度作图，其初始阶段的斜率作为蛋白溶液的表面疏水性指数(H0)，具体测定结果参见附图3。
由图3中的A可知，溶出的蛋白的最大吸收波长(λmax)均大于330nm，表明色氨酸残基位于蛋白质分子的外部(极性环境)。亚麻籽胶/豌豆蛋白混合溶液(PPFG)在λmax的荧光强度大于豌豆蛋白溶液(PP)，表明亚麻籽胶与豌豆蛋白产生相互作用，有助于增强豌豆蛋白中内部疏水基团的暴露。且超声处理后的豌豆蛋白溶液(PPU)以及亚麻籽胶/豌豆蛋白复合溶液(PPFGU)发生轻微蓝移(向亲水性环境)，由349nm蓝移至347nm，且荧光强度增加(PPFGU>PPU>PPFG>PP)。由于亚麻籽胶的作用以及超声处理后，亚麻籽胶/豌豆蛋白复合溶液的荧光强度最高，由此表明亚麻籽胶和超声有利于溶出蛋白中的内部疏水基团的暴露，增强亚麻籽胶和植物蛋白之间的疏水相互作用，以改善亚麻籽胶/植物蛋白复合物的乳化特性。
蛋白质的表面疏水性，可间接反映其结构，且与蛋白质吸附到界面的能力相关。由图3中的B可知，豌豆蛋白溶液(PP)的疏水性相对高于磁力搅拌得到的亚麻籽胶/豌豆蛋白混合溶液(PPFG)，超声处理后两组水溶液的表面疏水性均增加，这可能是由于超声使蛋白质聚集体内部的疏水性蛋白质残留物显露出来的，因此疏水性增加。
(2)亚麻籽胶/豌豆蛋白复合溶液粘度分析
采用旋转流变仪测定亚麻籽胶/豌豆蛋白复合溶液的粘度随剪切速率的变化，具体操作如下：
将0.6mL样品于25℃平衡2min后，以2S-1剪切2min，然后开始测量粘度随剪切速率(2-200S-1)的变化，具体结果如附图4所示。
由图4可知，豌豆蛋白和亚麻籽胶磁力搅拌混合后的溶液(PPFG)粘度最高，超声作用后亚麻籽胶/豌豆蛋白复合溶液(PPFGU)的粘度降低，表明超声破坏了亚麻籽胶与水分子之间的氢键作用力，从而降低水溶液的粘度，有助于后续的高速剪切制备粗乳，充分发挥亚麻籽胶/豌豆蛋白复合物的乳化效果。
实验三：两步超声法的优势
通过粒度分布仪(Mastersizer 2000，英国Malvern公司)和电位测定仪(Nanoseries ZS，英国Malvern公司)分别测量乳液的粒径和ζ电势。通过乳液的粒径、电位值或贮存外观变化来探究两步超声的优势。计算中使用的亚麻籽油和水相的折射率分别为1.490和1.330。结果如附图5所示。
(1)对亚麻籽胶/豌豆蛋白混合溶液第一步超声的优势
由图5中的A可知，在豌豆蛋白与亚麻籽胶总添加量为1％，豌豆蛋白：亚麻籽胶为4:1，亚麻籽胶/豌豆蛋白混合溶液在1S开1S关的模式下，以300W超声6min(总超声时间3min)，粗乳液在1S开1S关的模式下，以400W超声20min(总超声时间10min)制备水包油纳米乳液。
对豌豆蛋白-亚麻籽胶混合溶液进行超声处理后用于制备乳液，相比未进行超声处理的豌豆蛋白-亚麻籽胶混合溶液，电位值无显著差异(p<0.05)，但其乳液粒径(D4,3和D3,2)显著降低，由3.350±1.249μm和0.728±0.018μm降低为0.646±0.002μm和0.299±0.001μm。结果表明对亚麻籽胶/豌豆蛋白混合溶液进行超声有利于增强亚麻籽胶/豌豆蛋白复合物的乳化特性，从而降低乳液液滴的尺寸。
(2)对剪切均质后粗乳第二步超声的优势
由图5中的B可知，在豌豆蛋白与亚麻籽胶总添加量为1％，豌豆蛋白：亚麻籽胶为4:1，亚麻籽胶/豌豆蛋白混合溶液在1S开1S关的模式下，以300W超声6min(总超声时间3min)，粗乳液在1S开1S关的模式下，以400W超声20min(总超声时间10min)制备水包油纳米乳液。
对剪切均质后的粗乳液进行超声后，超声乳液的粒径(D4,3和D3,2)相较粗乳液显著降低，D4,3和D3,2分别由13.557±0.279μm和8.108±0.018μm降低为0.646±0.002μm和0.299±0.001μm。超声乳液的电位值相对粗乳液显著升高，由-40.0mV增加至-55.0mV，电位值越大越有利于通过静电排斥防止液滴聚集从而稳定乳液。且在4℃下储存1天后，超声乳液未出现乳析现象，而粗乳明显分层，表明超声有利于降低乳滴的尺寸，增强乳液的稳定性。这归因于超声空化引起的超声爆轰使微米级油滴破裂，并形成纳米级液滴，同时超声处理导致未经处理的聚集体内部的疏水性蛋白质残留物显露出来的，使得蛋白疏水性增加，多糖得到解聚，因此液滴界面处的界面堆积得到了改善，从而增加了亚麻籽胶/豌豆蛋白的乳化效果，提高了乳液的稳定性。
(3)两步超声法在其他蛋白/亚麻籽胶乳液中的作用效果
由图5中的C可知，将豌豆蛋白(PP)、大豆分离蛋白(SPI)、火麻仁蛋白(HMR)、葵花籽蛋白(KHZ)以及糙米蛋白(CM)、牡丹籽蛋白(MDZ)、紫苏籽蛋白(ZSZ)、亚麻籽蛋白(YMZ)分别和亚麻籽胶磁力搅拌混合2h后，进行第一步超声(600W，开1S关1S，超声6min)，再加入10％亚麻籽油后13,000rpm剪切均质3min制备粗乳液，最后对粗乳液第二步超声(600W，开1S关1S，超声6min)制备两步超声乳液。相比未对亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液超声而直接制备的一步超声乳液，两步超声乳液的的粒径显著性降低，进一步验证了两步超声在亚麻籽胶与其他植物蛋白复合溶液制备水包油乳液的优势和适用性。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法，所述水包油纳米乳液是将富含多不饱和脂肪酸的油脂加入到经超声处理后的亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液中，随后剪切均质、再一次超声处理得到水包油纳米乳液体系；所述方法具体包括如下步骤：
(1)将植物蛋白粉溶解于磷酸盐缓冲液中，搅拌、离心得到植物蛋白溶液；
(2)在步骤(1)得到的植物蛋白溶液中加入亚麻籽胶，搅拌、混合均匀并经第一次超声处理得到亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液；
(3)向步骤(2)超声处理后的亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液中加入油脂得到油水混合物；
(4)对步骤(3)得到的油水混合物剪切均质得到粗乳液，随后进行第二次超声处理，最终得到亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液。
2.根据权利要求1所述的一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法，其特征在于，步骤(1)中，磷酸盐缓冲液的pH为7.0～9.0，浓度为0～10mmol/L，且搅拌时间为5～24h，搅拌速率为700～1000r/min。
3.根据权利要求1所述的一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述植物蛋白与亚麻籽胶的浓度比为(1～4)：1，及植物蛋白与亚麻籽胶的总浓度为所述亚麻籽胶/植物蛋白复合溶液的1～4％(w/w)，搅拌速率为500～700r/min，搅拌时间为2～5h。
4.根据权利要求3所述的一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法，其特征在于，第一次超声处理条件为：超声功率为300～600W，超声时间为6～20min，且超声时间间隔为1～5S。
5.根据权利要求1所述的一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法，其特征在于，步骤(3)中，油脂的加入量为所述水包油纳米乳液质量的5～20％。
6.根据权利要求1所述的一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法，其特征在于，步骤(4)中，剪切均质的工艺参数为：剪切速率为10000～15000r/min，剪切时间为3～6min。
7.根据权利要求6所述的一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法，其特征在于，第二次超声处理条件为：超声功率为100～400W，超声时间0～20min，且超声时间间隔为1～5S。
8.根据权利要求1～7任一所述的一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法，其特征在于，植物蛋白包括大豆蛋白、豌豆蛋白、火麻仁蛋白、葵花籽蛋白、糙米蛋白、牡丹籽蛋白、紫苏籽蛋白或亚麻籽蛋白；所述油脂为富含多不饱和脂肪酸的油脂，且所述油脂至少为亚麻籽油、DHA藻油、鱼油、紫苏油、美藤果油中的一种。
9.根据权利要求1～7任一所述的一种利用两步超声制备亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液的方法，其特征在于，所述方法能够与微射流、高压均质技术配套使用转化。
10.一种如权利要求1～9任一方法制备的亚麻籽胶/植物蛋白复合水包油纳米乳液在药物制剂及食品加工中的应用。
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