CN113331301A - 一种酶改性豌豆蛋白的制备及在低脂红肠中的应用 - Google Patents
一种酶改性豌豆蛋白的制备及在低脂红肠中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明适用于食品加工技术领域，提供一种酶改性豌豆蛋白的制备及在低脂红肠中的应用，通过采用木瓜蛋白酶对豌豆蛋白进行改性获得酶改性豌豆蛋白；所述酶改性的条件为：酶添加量0.15％，底物浓度6％，酶解时间40min；所述豌豆蛋白通过酶改性后乳化性、乳化稳定性、持水性、粘度、巯基含量和表面疏水性分别提升了22.9％、3.6％、77.8％、14.3％、160.36％和11.87％；本发明采用酶解法改性豌豆蛋白，制备获得低脂红肠，可为其加工提供理论和技术支持；酶法改性反应条件温和、副反应少、不破坏氨基酸、水解程度易控制，易保留营养成分，采用蛋白酶对豌豆蛋白进行限制性水解，可显著提高蛋白质溶解性能，使蛋白质分子柔性增大，易于在界面吸附，增强乳化性。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，尤其涉及一种酶改性豌豆蛋白的制备及在低脂红肠中的应用。
背景技术
肉制品在人们的膳食结构中占有极为重要的地位，是人体所需优质蛋白质的主要供体，也是维生素、矿物质的重要来源。脂肪是肉制品中重要的组成部分，赋予肉制品香醇的口感、独特的香气、良好的质地和多汁性，但肉制品中的动物脂肪含有较高的饱和脂肪酸和胆固醇，长期食用会导致肥胖以及心血管疾病的发生。美国1995年的膳食指南指出，在人们的膳食中，脂肪提供的热量不宜超过总热量的30％。因此，如何减少肉制品的脂肪含量成为目前的热点研究。
在过去的研究中，为达到降脂所采用的最简单的方法是直接减少肉制品中的动物脂肪含量，但该方法会导致蒸煮损失显著增加，产品质地过硬，且颜色呈现暗红色，不易被消费者接受。因此，为了降低由脂肪减少而产生的肉制品品质特性的负面影响，大量研究者使用脂肪模拟物来部分替代肉制品中的动物脂肪。
脂肪模拟物是指能够模拟动物脂肪的物理特性和感官特性，但是提供较低卡路里的物质。脂肪模拟物不与食品中其他组分发生不良反应，同时还可以表现出脂肪独特的感官特点，既满足了人们日常生活中对于风味的追求，又减少了食用过多脂肪带来的隐患。
红肠作为一种西式肉制品，具有特殊的烟熏风味，而且口感良好，被广大消费者所喜爱。红肠能为人体提供蛋白质、必需氨基酸、铁、锌等微量元素以及维生素B等营养物质。然而，红肠的脂肪含量较高，约占产品总质量的20％～30％。
豌豆，作为富含植物蛋白质的杂粮，具有降低胆固醇、预防骨质疏松的保健效果。用其作为蛋白质基质脂肪替代物的原料，不仅廉价易得，而且安全营养。豌豆蛋白是一种较好的必需氨基酸源，组成比例平衡，接近FAO/WHO推荐模式。以豌豆蛋白为基质制备的脂肪模拟物本质还是蛋白质，所以不仅可以参与人体正常代谢过程，还能为人体提供多种必需的氨基酸，兼具营养性和安全性，因而豌豆蛋白脂肪模拟物的开发具有广阔的应用前景。
基于以上几点，我们以豌豆蛋白为基质，通过酶改性提高乳化性和保水性，制备脂肪模拟物应用于红肠中制备动物脂肪含量降低50％的低脂肉制品。
发明内容
本发明提供一种酶改性豌豆蛋白的制备及在低脂红肠中的应用，旨在解决现有技术中豌豆蛋白为基质的脂肪模拟物乳化性和保水性低的问题。
本发明是这样实现的，一种酶改性豌豆蛋白的制备方法，是通过采用木瓜蛋白酶对豌豆蛋白进行酶解改性获得酶改性豌豆蛋白，进而通过酶改性提升豌豆蛋白的乳化性、乳化稳定性、持水性、粘度、巯基含量和表面疏水性；
所述豌豆蛋白酶改性的具体步骤为：
配制一定底物浓度的豌豆蛋白溶液，并在豌豆蛋白溶液中添加蛋白酶；
再利用HCl或NaOH调节豌豆蛋白溶液pH值后进行酶解；
酶解反应结束后在沸水中钝化酶；
最后对溶液进行离心沉淀，冻干。
优选的，所述酶解条件为：蛋白酶添加量为豌豆蛋白质量的0.1％～0.15％，底物豌豆蛋白溶液浓度为4％～6％，酶解时间为30min～40min，pH为6.5，酶解温度为45℃。
优选的，所述酶解条件为：蛋白酶添加量为豌豆蛋白质量的0.15％，底物豌豆蛋白溶液浓度为6％，酶解时间为40min，pH为6.5，酶解温度为45℃。
优选的，所述钝化时间为5min～10min，离心时间不少于15min。
优选的，所述冻干是在30min内冷冻至-40℃，在-40℃、绝对压力15Pa、干燥48h的条件下获得真空冷冻干燥粉末。
本发明进行了低脂肉制品的开发，脂肪模拟物是一种具有脂肪的物理和感官性质，能被人体消化和吸收，但热量较低的物质。本发明以豌豆蛋白为基质制备脂肪模拟物，优化豌豆蛋白酶改性的最佳条件，并对改性后的豌豆蛋白进行功能分析，将其作为脂肪模拟物替代50％动物脂肪添加到红肠中考察对红肠微生物性质、理化性质和感官品质的影响。
本发明对豌豆蛋白酶改性条件进行工艺优化，选用五种蛋白酶(木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶)在各自最佳酶解条件下对豌豆蛋白进行酶解，以乳化性、乳化稳定性、持水性和粘度作为指标筛选酶种类，然后用最适蛋白酶对豌豆蛋白进行酶改性，通过单因素试验和正交试验确定最佳的酶改性条件。试验确定最适蛋白酶为木瓜蛋白酶，其最佳酶改性条件为：酶添加量0.15％，底物浓度6％，酶解时间40min。
本发明为进一步研究酶改性豌豆蛋白的功能和性质，试验通过傅里叶红外光谱(FTIR)、差示扫描量热分析(DSC)、内源荧光光谱等方法对其结构进行表征，并对豌豆蛋白改性前后的表面疏水性、巯基含量等功能性质进行对比分析。结果表明：豌豆蛋白通过酶改性后乳化性、乳化稳定性、持水性、粘度、巯基含量和表面疏水性分别提升了22.9％、3.6％、77.8％、14.3％、160.36％和11.87％，均显著高于未改性蛋白(P<0.05)。内源性荧光光谱分析发现改性蛋白的最大吸收波长发生红移，内部疏水基团增强。红外光谱证实了酶改性使蛋白形成了更多的分子间氢键，导致C-N、C＝O伸缩振动频率及吸收峰强度发生明显变化。DSC结果显示改性蛋白变性温度高于未改性蛋白，说明改性化处理提高了豌豆蛋白的热稳定性。
本发明还公开一种酶改性豌豆蛋白的应用，根据上述任意一项所述制备方法获得的改性豌豆蛋白用于肉质品加工过程中，所述肉质品为红肠。
优选的，所述红肠的制备方法包括如下步骤：选择和修整猪肉，将瘦肉绞碎低温腌制，再加入肥肉、脂肪模拟物、配料、20％冰水、0.3％黄原胶和0.3％卡拉胶，随后充分搅拌均匀、灌肠，在75℃烘烤60min～90min，再蒸煮，所述蒸煮为在75℃～80℃煮制60min～90min，使中心温度不低于72℃，随后烟熏，最后在75℃条件下，继续烘烤30min，冷却至室温，制成成品。
优选的，所述腌制过程包括添加食盐28g/kg，复合磷酸盐4g/kg，抗坏血酸钠0.55g/kg和亚硝酸钠0.15g/kg，在4℃条件下腌制12h～24h。
优选的，以肉重为基准，所述脂肪模拟物包括4％酶改性豌豆蛋白，脂肪添加量为15％，所述配料包括胡椒粉0.126％，红曲红0.4％，味精0.6％，白糖2.5％，五香粉0.6％，大蒜0.3％。
优选的，所述烟熏过程包括把红肠均匀地挂到熏炉内，不挤不靠，各层之间相距10cm，炉温75～80℃，烟熏材料为白糖：烟熏液＝10:1，烟熏时间30min。
本发明实施了豌豆蛋白脂肪模拟物在红肠中的应用。为研究改性豌豆蛋白对低脂红肠品质的影响，以添加酶改性豌豆蛋白的红肠作为试验组(替代50％脂肪)，同时设立不添加改性豌豆蛋白的对照组，分析红肠的基本组成成分、菌落总数和大肠杆菌、色泽、质构、亚硝基肌红蛋白含量、TBARS值、水分活度、保水保油性和感官品质，对低脂红肠的品质作出评价。结果表明：添加改性豌豆蛋白，提高了低脂红肠的蛋白质含量、红度值、保油性，降低了低脂红肠的脂肪含量、菌落总数和水分活度。
本发明技术原理：本发明提供一种酶改性豌豆蛋白的制备及在低脂红肠中的应用，进行了低脂肉制品的开发，本发明以豌豆蛋白为基质制备脂肪模拟物，优化豌豆蛋白酶改性的最佳条件，并对改性后的豌豆蛋白进行功能分析，将其作为脂肪模拟物替代50％动物脂肪添加到红肠中考察对红肠微生物性质、理化性质和感官品质的影响。
本发明在对豌豆蛋白酶改性条件进行工艺优化时，选用五种蛋白酶在各自最佳酶解条件下对豌豆蛋白进行酶解，以乳化性、乳化稳定性、持水性和粘度作为指标筛选酶种类，然后用最适蛋白酶对豌豆蛋白进行酶改性，通过单因素试验和正交试验确定最佳的酶改性条件。试验确定最适蛋白酶为木瓜蛋白酶，其最佳酶改性条件为：酶添加量0.15％，底物浓度6％，酶解时间40min。本发明采用酶解法改性豌豆蛋白，工艺简单，对酶改性工艺进行优化，获得的豌豆蛋白可用于肉制品加工过程中，降低肉制品脂肪，制备获得低脂红肠，可为其加工提供理论和技术支持。
为研究酶改性豌豆蛋白的功能和性质，本发明对其结构进行表征，并对豌豆蛋白改性前后的表面疏水性、巯基含量等功能性质进行对比分析。结果表明：豌豆蛋白通过酶改性后乳化性、乳化稳定性、持水性、粘度、巯基含量和表面疏水性分别提升了22.9％、3.6％、77.8％、14.3％、160.36％和11.87％，均显著高于未改性蛋白(P<0.05)。内源性荧光光谱分析发现改性蛋白的最大吸收波长发生红移，内部疏水基团增强。红外光谱证实了酶改性使蛋白形成了更多的分子间氢键，导致C-N、C＝O伸缩振动频率及吸收峰强度发生明显变化。DSC结果显示改性蛋白变性温度高于未改性蛋白，说明改性化处理提高了豌豆蛋白的热稳定性。
本发明在实施豌豆蛋白脂肪模拟物在红肠中的应用时，为研究改性豌豆蛋白对低脂红肠品质的影响，以添加酶改性豌豆蛋白的红肠作为试验组(替代50％脂肪)，同时设立不添加改性豌豆蛋白的对照组，分析红肠的基本组成成分、菌落总数和大肠杆菌、色泽、质构、亚硝基肌红蛋白含量、TBARS值、水分活度、保水保油性和感官品质，对低脂红肠的品质作出评价。结果表明：添加改性豌豆蛋白，提高了低脂红肠的蛋白质含量、红度值、保油性，降低了低脂红肠的脂肪含量、菌落总数和水分活度。
本发明技术效果：本发明提供一种酶改性豌豆蛋白的制备及在低脂红肠中的应用，通过采用木瓜蛋白酶对豌豆蛋白进行酶改性获得酶改性豌豆蛋白；所述酶改性的条件为：酶添加量0.15％，底物浓度6％，酶解时间40min；所述豌豆蛋白通过酶改性后乳化性、乳化稳定性、持水性、粘度、巯基含量和表面疏水性分别提升了22.9％、3.6％、77.8％、14.3％、160.36％和11.87％；本发明采用酶解法改性豌豆蛋白，可为其加工提供理论和技术支持，适合大规模生产。酶法改性反应条件温和、副反应少、不破坏氨基酸、水解程度易控制，特别是在营养成分的保留上，具有不可比拟的优点。采用蛋白酶对豌豆蛋白进行限制性水解，可显著提高蛋白质溶解性能，使蛋白质分子柔性增大，易于在界面吸附，增强乳化性。
附图说明
图1为本发明实施例中不同蛋白酶对豌豆蛋白改性效果的影响；
图2为本发明实施例中双酶添加方式对豌豆蛋白改性效果的影响；
图3为本发明实施例中单-双酶对豌豆蛋白改性效果的影响；
图4为本发明实施例中酶添加量对豌豆蛋白酶改性效果的影响；
图5为本发明实施例中底物浓度对豌豆蛋白酶改性效果的影响；
图6为本发明实施例中酶解时间对豌豆蛋白酶改性效果的影响；
图7为本发明实施例中因子载荷图；
图8为本发明实施例中改性前后豌豆蛋白的功能性质对比；注：大写字母不同表示不同蛋白相同指标之间的差异显著(P＜0.05)；
图9为本发明实施例中改性前后豌豆蛋白表面疏水性的变化；
图10为本发明实施例中改性前后豌豆蛋白巯基含量的变化；
图11为本发明实施例中改性前后豌豆蛋白的红外光谱分析；
图12为本发明实施例中改性前后豌豆蛋白的差示扫描量热分析；
图13本发明实施例中改性前后豌豆蛋白的内源荧光光谱分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1至图13，在本发明的一个实施方式中，提供一种酶改性豌豆蛋白的制备方法，是通过采用木瓜蛋白酶对豌豆蛋白进行酶解改性获得酶改性豌豆蛋白，进而通过酶改性提升豌豆蛋白的乳化性、乳化稳定性、持水性、粘度、巯基含量和表面疏水性；
所述豌豆蛋白酶改性的具体步骤为：
配制一定底物浓度的豌豆蛋白溶液，并在豌豆蛋白溶液中添加蛋白酶；
再利用HCl或NaOH调节豌豆蛋白溶液pH值后进行酶解；
酶解反应结束后在沸水中钝化酶；
最后对溶液进行离心沉淀，冻干。
根据本发明的一个优选实施例，所述酶解条件为：蛋白酶添加量为豌豆蛋白质量的0.1％～0.15％，底物豌豆蛋白溶液浓度为4％～6％，酶解时间为30min～40min，pH为6.5，酶解温度为45℃。
根据本发明的一个优选实施例，所述酶解条件为：蛋白酶添加量为豌豆蛋白质量的0.15％，底物豌豆蛋白溶液浓度为6％，酶解时间为40min，pH为6.5，酶解温度为45℃。
根据本发明的一个优选实施例，所述钝化时间为5min～10min，离心时间不少于15min。
根据本发明的一个优选实施例，冻干是在30min内冷冻至-40℃，在-40℃、绝对压力15Pa、干燥48h的条件下获得真空冷冻干燥粉末。
本发明的一个实施方式中，还提供一种酶改性豌豆蛋白的应用，根据上述任意一项所述制备方法获得的改性豌豆蛋白用于肉质品加工过程中，所述肉质品为红肠。
根据本发明的一个优选实施例，红肠的制备方法包括如下步骤：选择和修整猪肉，将瘦肉绞碎低温腌制，再加入肥肉、脂肪模拟物、配料、20％冰水、0.3％黄原胶和0.3％卡拉胶，随后充分搅拌均匀、灌肠，在75℃烘烤60min～90min，再蒸煮，所述蒸煮为在75℃～80℃煮制60min～90min，使中心温度不低于72℃，随后烟熏，最后在75℃条件下，继续烘烤30min，冷却至室温，制成成品。
根据本发明的一个优选实施例，腌制过程包括添加食盐28g/kg，复合磷酸盐4g/kg，抗坏血酸钠0.55g/kg和亚硝酸钠0.15g/kg，在4℃条件下腌制12h～24h。
根据本发明的一个优选实施例，以肉重为基准，脂肪模拟物包括4％酶改性豌豆蛋白，脂肪添加量为15％，配料包括胡椒粉0.126％，红曲红0.4％，味精0.6％，白糖2.5％，五香粉0.6％，大蒜0.3％。
根据本发明的一个优选实施例，烟熏过程包括把红肠均匀地挂到熏炉内，不挤不靠，各层之间相距10cm，炉温75～80℃，烟熏材料为白糖：烟熏液＝10:1，烟熏时间30min。
以下对本发明的优选实施例进行详细说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
以下各实施例是本申请发明人按照本发明的制备方法和使用方法进行具体实验。
以下实施例中，所涉及的主要原料、主要试剂，主要仪器和设备如下所示。
主要原料
豌豆蛋白，烟台恒源生物科技有限公司；金龙鱼大豆油，南宁市新惠源食品有限公司；猪背最长肌和猪肥膘，购于山西省太谷县家家利购物中心；肠衣，江苏南通双宇肠衣直销商。
主要试剂
木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶均购自安徽通用生物有限公司；复合磷酸盐、D-异抗坏血酸钠为食品级，购自河南万帮实业有限公司；液体烟熏液为食品级，购自河南蜜丹儿商贸有限公司；盐酸，氢氧化钠、亚硝酸钠、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、无水乙醇、石油醚、2-硫代巴比妥酸、氯仿、丙酮等均为分析纯，购自天津化学试剂一厂。
主要仪器与设备
LD5-2B低速离心机，北京雷勃尔医疗器械有限公司；FM-200型高剪切均质乳化仪，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；PB-10pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；NDJ-1型旋转式粘度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；恒温水浴锅，上海梅特勒托利多仪器有限公司；5801R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；HY-2调速多用振荡器，常州国华电器有限公司；BSA-124S-CW电子天平，上海精密科学仪器公司；YE4D350189移液枪，上海求精生化试剂仪器有限公司；JHY-12绞肉机，江苏省丹徒区辛丰金汇缘食品机械厂；ZB-5斩拌机，山西青浦食品包装机械经营厂；HD-5水分活度仪，无锡市华科仪器仪表有限公司；DHG-9243BS电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司。WFJT200可见分光光度计，尤尼科仪器有限公司；5801R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；冷冻干燥机，美国SP-Scientific公司；IRAffinity-1傅里叶红外光谱，惠州市华高仪器设备有限公司；DSC 3500德国耐驰差示扫描量热仪，深圳市蓝星宇电子科技有限公司；F98荧光分光光度计，济南爱来宝仪器设备有限公司，50型烟熏炉，四川成都明辉机械有限公司。
本发明实施例中，实验均重复3次，结果用平均值±标准差表示。数据统计分析采用Statistix 8.1软件包进行差异显著性分析，采用SPSS 22软件进行主成分分析，并应用Origin Pro9.0绘图软件作图。
实施例1酶改性豌豆蛋白的制备方法
配制一定底物浓度的豌豆蛋白溶液，添加一定量的蛋白酶，用1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调节至最适pH，在其最适温度下进行酶解，反应结束后在95～100℃的沸水中钝化酶5～10min，以转速为3000r/min离心15min，收集下层沉淀，冻干(30min内冷冻至-40℃，在-40℃、绝对压力15Pa、干燥48h的条件下获得真空冷冻干燥粉末)备用。
实施例2红肠的制备方法
红肠的制备采用如下工艺，工艺流程：猪肉选择和修整→瘦肉绞碎低温腌制(添加食盐28g/kg，复合磷酸盐4g/kg，抗坏血酸钠0.55g/kg和0.15g/kg亚硝酸钠，在4℃条件下腌制12h～24h)→加入肥肉、脂肪模拟物、配料(胡椒粉0.126％,红曲红0.4％，味精0.6％，白糖2.5％，五香粉0.6％,大蒜0.3％)、20％冰水、0.3％黄原胶和0.3％卡拉胶→充分搅拌均匀→灌肠→烘烤(75℃烘烤60min～90min)→蒸煮(75℃～80℃煮制60min～90min，使中心温度不低于72℃)→烟熏(烟熏炉温度75～80℃，烟熏材料为白糖：烟熏液＝10:1，烟熏时间30min。)→烘烤(75℃条件下，继续烘烤30min)→冷却至室温→成品。
实施例3豌豆蛋白酶改性条件的工艺优化
(1)最适改性蛋白酶的筛选
称取10g豌豆蛋白，配制成质量浓度为5％豌豆蛋白溶液，充分搅拌后，分别添加木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶，加酶量均为0.15％(相对于豌豆蛋白的质量)，在各自最佳酶解温度和pH值下，酶解30min后，在95～100℃沸水中钝化酶5～10min，以转速为3000r/min离心15分钟，收集下层沉淀，冻干，测定乳化性、乳化稳定性、持水性和粘度，选出合适的蛋白酶。酶解条件见表1。
表1 蛋白酶的最佳酶解条件
乳化特性和保水性是评价酶改性效果的重要指标，所以选用乳化性和持水性最高的两种酶A，B。设定双酶添加方式为：先加A后加B、A与B同时加入(添加时的pH和温度为先加入蛋白酶的最适pH和温度)。计算乳化性、乳化稳定性、持水性和粘度，比较不同双酶组合酶效果，再将酶改性效果较好的双酶组合与最适单酶的改性结果进行比较。
在对酶改性豌豆蛋白的工艺优化时，不同蛋白酶改性效果比较如图1所示。不同蛋白酶具有不同的酶切位点和反应条件，决定了水解肽键的数量和位置，使酶解产物有着不同的生理活性，因此酶的选择尤为重要。由图1(A)可知，在加酶量相同的条件下，五种蛋白酶对乳化性的影响依次为：木瓜蛋白酶＞复合蛋白酶＞胰蛋白酶＞碱性蛋白酶＞风味蛋白酶，使用木瓜蛋白酶对豌豆蛋白进行酶改性，乳化性最高，达到59.48％。在加酶量相同的条件下，五种蛋白酶对乳化稳定性的影响如图1(B)所示：胰蛋白酶＞碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞复合蛋白酶＞风味蛋白酶。如图1(C)所示：在加酶量相同的条件下，利用木瓜蛋白酶进行酶解，豌豆蛋白的持水性最大，为5.01g/g。由图1(D)可知，在加酶量相同的条件下，五种蛋白酶对粘度的影响大小为：碱性蛋白酶＞复合蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞风味蛋白酶。
基于对酶改性的要求，在改性效果的考核上，以乳化性作为首要考核指标，其次是持水性，然后才是乳化稳定性和粘性。因此，选用乳化性和持水性较好的木瓜蛋白酶和复合蛋白酶以先后添加、同时添加的方式进行双酶解。图2为双酶添加方式对豌豆蛋白改性效果的影响。由图2可知，双酶先后添加方式(先添加木瓜蛋白酶，再添加复合蛋白酶)乳化性、乳化稳定性、粘度均高于同时添加方式，仅持水性低于同时添加方式且差异不显著(P>0.05)。因此确定双酶酶解时采用先添加木瓜蛋白酶，再添加复合蛋白酶的方式进行。
再将木瓜蛋白酶单酶酶解与双酶先后酶解的酶解效果进行比较，图3为单-双酶酶解对豌豆蛋白改性效果的影响。由图3可知，由于双酶解改善效果不明显，特别是乳化性，木瓜酶单酶酶解乳化性(59.48％)显著高于双酶酶解(52.10％)(P<0.05)，因此，在后续试验中选用木瓜蛋白酶对豌豆蛋白进行酶改性。
实施例4豌豆蛋白酶改性的单因素试验
利用最适的蛋白酶，对豌豆蛋白进行酶改性，将豌豆蛋白按以下条件进行单因素试验，即：控制底物浓度和酶解时间相同的情况下，酶添加量为0.05％，0.10％，0.15％，0.20％，0.25％；控制酶解时间和酶添加量相同的情况下，底物浓度为3％，4％，5％，6％，7％；控制酶添加量和底物浓度相同的情况下，酶解时间为10min，20min，30min，40min，50min。以酶解物的乳化性、乳化稳定性、持水性和粘度作为评定指标。
(1)酶添加量对酶改性效果的影响
豌豆蛋白底物浓度和酶解时间相同的情况下，酶添加量为0.05％，0.10％，0.15％，0.20％，0.25％，酶改性效果如图4所示。
由图4所知，当酶添加量为0.15％时，乳化性、乳化稳定性和持水性都取得峰值，之后显著下降(P<0.05)，可能是由于酶解使包埋于内部的疏水性残基暴露，提高了其在界面的吸附，较易形成内聚性膜，但随着水解程度的提高，过度水解破坏蛋白质二级结构，导致蛋白酶解物乳化性和乳化稳定性的急剧下降。同时，蛋白质结构进一步打开后导致疏水性基团暴露使持水性显著性降低。粘度则无显著性变化(P>0.05)。
(2)底物浓度对酶改性效果的影响
在酶解时间和酶添加量相同的情况下，分别测定底物浓度为3％，4％，5％，6％，7％时酶改性的效果，结果如图5所示。
由图5可知，当底物浓度为3％～4％时，乳化性和乳化稳定性变化不显著(P>0.05)，这可能是因为底物浓度较低时，酶与底物碰撞的几率较少，反应速度较慢，导致水解度低，反应不充分。当底物浓度为4％～6％时，乳化性、乳化稳定性、持水性和粘度都呈现显著上升趋势(P<0.05)。随着底物浓度的增加，当底物浓度超过6％时，乳化性和持水性下降，乳化稳定性和粘度趋于平缓，这是因为随着底物浓度的增大，更多的底物与酶结合，促进酶解反应的进行；当酶与底物充分结合后，继续增大底物浓度，酶解反应速率将不再增加。
(3)酶解时间对酶改性效果的影响
控制酶添加量和底物浓度相同的情况下，分别测定酶解时间(10min、20min、30min、40min、50min)对酶改性效果的影响，结果如图6所示。
由图6可知，随着酶解时间的增加，乳化性、乳化稳定性和持水性均呈现先上升后下降的趋势，而粘度变化为先下降后上升的趋势。当酶解时间为30min时，乳化性和持水性都取得峰值；当酶解时间为10min～30min时，乳化稳定性无显著性变化(P>0.05)，而时间大于30min后呈显著下降趋势(P<0.05)；当酶解时间为40min时，粘度值最小，显著低于其它酶解时间(P<0.05)。这可能是由于蛋白质天然三级结构较致密，蛋白酶作用于豌豆蛋白后，随着水解的进行，小分子肽类增多，分子量逐渐减小，反应进行中原来的蛋白质网状结构被破坏，膨胀性减小，导致溶液粘度下降。
实施例5豌豆蛋白酶改性的正交试验
在单因素试验结果的基础上进行正交试验。以酶添加量(A)、底物浓度(B)、酶解时间(C)3个因子为自变量，以乳化性、乳化稳定性、持水性和粘度为指标。正交试验因素水平如表2所示。
表2 正交试验设计因素及水平
(1)极差分析法评价正交试验结果
本次实验通过多个指标进行正交试验的极差分析，见表3，4个指标的极差分析结果如表4所示。
表3 正交试验的结果
表4 正交试验极差分析结果
由表4可知，酶改性豌豆蛋白乳化性的主次影响顺序为C＞A＞B，对于乳化性来说，最优组合为A2B2C2；酶改性豌豆蛋白乳化稳定性的主次影响顺序为A＞B＞C，对于乳化稳定性来说，最优组合为A1B1C1；酶改性豌豆蛋白持水性的主次影响顺序为A＞B＞C，对于持水性来说，最优改性组合为A3B2C3；酶改性豌豆蛋白粘度的主次影响顺序为B＞C＞A，对于粘度来说，最优改性条件组合为A1B3C2。使用单一指标计算最佳方案较为片面，因此使用主成分分析法进行综合分析更为合适。
(2)主成分分析法评价正交试验结果
采用SPSS 22.0软件对表3酶改性豌豆蛋白的各指标进行主成分分析，如表5所示。由表5可知，主成分1、主成分2两者特征值均大于1，其中主成分1的特征值为2.142、主成分2的特征值为1.242，两个主成分数据信息有效。由成分载荷矩阵(表6)与载荷图(图7)可知，决定主成分1的主要指标为乳化性和持水性，决定主成分2的主要指标为乳化稳定性和粘度。基于原始数据的特征值、方差贡献率与累计方差贡献率，提取特征值大于1的主成分，计算酶改性豌豆蛋白的综合评分。
表5各元件的特征根、方差贡献率及累计贡献率
表6成分载荷矩阵
为消除各指标不同量纲所产生的影响，对各指标的原始数据进行标准化处理。根据原始变量标准化值与因子得分系数计算各主成分评分；以各主成分的相对贡献率为权重，各主成分与相应权重之间进行线性加权求和，计算综合评分。综合评分按式(1)～(3)计算：
F1＝0.412X1-0.285X2+0.411X3-0.215X4 (1)
F2＝0.187X1-0.541X2-0.222X3+0.654X4 (2)
F综＝0.54F1+0.31F2 (3)
式中：F1为主成分1评分；F2为主成分2评分；F综为综合评分；X1为乳化性；X2为乳化稳定性；X3为持水性；X4为粘度。
表7 不同试验组主成分分析评价结果
计算综合评分得分情况，结果如表7所示。因此，通过主成分分析可以确定最佳的试验方案为第5组A2B2C3，即酶添加量为0.15％，底物浓度为6％，酶解时间为40min。
实施例6不同改性豌豆蛋白的结构表征和功能特性分析
对豌豆蛋白改性前后的乳化性、乳化稳定性、持水性和粘度等功能指标进行测定，测定巯基含量、表面疏水性等结构指标，并通过傅里叶红外光谱(FTIR)、差示扫描量热分析(DSC)、内源荧光光谱等方法对改性蛋白的结构进行表征。
(1)改性前后豌豆蛋白的功能特性检测
乳化性的测定，参照熊柳公开的方法，在此基础上稍加修改。称取1.5g豌豆蛋白样品溶于25mL蒸馏水中，调节pH为7.0，加入25mL的色拉油，在高速剪切均质机中均质(10000～12000r/min)2min，再以转速为1500r/min离心5min之后，测定其乳化性。
乳化稳定性的测定，参考熊柳公开的方法，并稍加修改。称取1.5g豌豆蛋白样品溶于25mL蒸馏水中，调节pH为7.0，加入25mL的色拉油，在高速剪切均质机中均质(10000～12000r/min)2min，置于50℃水浴锅中水浴30min后，测出此时的乳化层高度，则乳化稳定性为：
持水性的测定，参考杨扬公开的方法。称取蛋白样品标记质量为m1，置于10mL离心管中，样品与离心管的总重量为m2。加入蒸馏水，使水刚好没过样品，震荡5min使其混匀，以转速为5000r/min离心15min之后，将离心管上层水分用滤纸吸出，准确称量样品和离心管的总质量，记为m3。
粘度的测定，参照郭奇玥公开的方法，并稍加修改。使用NDJ-1型旋转式粘度计进行粘度测定。用蒸馏水配制5％样品溶液，调pH为7，在25℃条件下，加入0.15％NaCl，用NDJ-1型粘度计测其表观粘度。
对改性前后豌豆蛋白的功能特性分析，图8为改性前后豌豆蛋白的功能性质对比。由图8可知，豌豆蛋白通过酶改性后乳化性、乳化稳定性、持水性分别提升了22.9％、3.6％和77.8％，显著高于未改性蛋白(P<0.05)。同时，粘度也变化显著(P<0.05)，与未改性蛋白相比，酶改性蛋白的粘度提高了14.3％。乳化性的提高可能是由于酶改性可以使包埋于蛋白质分子内部的疏水性残基暴露，提高了其在界面的吸附能力，更易形成内聚性膜的缘故。
(2)改性前后豌豆蛋白表面疏水性的测定
参照李懿璇公开的方法，并对其进行改进。用磷酸盐缓冲液配制豌豆蛋白溶液浓度为5mg/mL。室温振荡装有样液1mL和质量浓度为1mg/mL溴酚蓝溶液200μL的离心管10min，使其混合均匀后离心10min(8000r/min)。取1mL上清液与9mL磷酸盐缓冲液混合稀释10倍，于595nm波长下测定吸光值A，用磷酸盐缓冲液代替空白，表面疏水性按公式计算：
对改性前后豌豆蛋白表面疏水性对比分析。图9为改性前后豌豆蛋白表面疏水性的变化。表面疏水性是反映蛋白与外界极性水环境相连的分子表面疏水性基团数量的一项重要指标，是维持蛋白质三级结构的主要作用力。溴酚蓝可以与蛋白质的疏水性基团结合，因此可以根据蛋白质与溴酚蓝的结合量来评价表面疏水性的高低。如图所示，豌豆蛋白酶改性后表面疏水性为44.21μg，比未改性蛋白显著提高(P<0.05)了11.87％。常慧敏等研究发现，蛋白质上大量的疏水性基团有利于胶束的形成，使其更好地吸附和保留在油-水界面上，因此表面疏水性对蛋白质的乳化性起着重要作用。
(3)改性前后豌豆蛋白巯基含量的测定
巯基含量的测定采用DTNB法，最后按照公式进行计算：
式中：
c为考马斯亮蓝法测定所得的蛋白实际浓度；1.36×104为摩尔吸光系数；106为单位转换系数。
对改性前后豌豆蛋白巯基含量对比分析，在蛋白质的空间结构中，巯基是维持蛋白分子空间结构稳定的重要化学键，它的断裂、结合、重组都导致蛋白质的高级结构发生变化，进而改变蛋白质的功能特性。改性前后豌豆蛋白巯基含量的变化如图10所示。由图可知，酶改性蛋白巯基含量(33.43nmol·mg-1)显著高于未改性蛋白(P<0.05)。可能是通过酶解作用减弱了蛋白质高级结构的结合力，部分蛋白质裂解为多肽和氨基酸，致使巯基含量增加。
(4)改性前后豌豆蛋白的傅里叶红外光谱(FTIR)测定
参照林慧敏公开的方法，稍作修改。准确称量1mg豌豆蛋白样品与150mg充分干燥的溴化钾(将溴化钾放在烘箱中105℃烘干超过8小时)，用玛瑙研钵将其充分研磨至细末贴壁，颗粒直径2μm左右。使用压片机将混合粉末压制成透明薄片，用红外光谱仪做全波段扫描(4000-400cm-1)，扫描次数为16次，分辨率为4cm-1，以空气为采集背景，样品红外光谱图经过傅立叶变换得到。
图11为改性前后豌豆蛋白的红外光谱分析。红外光谱是一种目前最为常见的分析多肽和蛋白质二级结构的方法，它能灵敏地反应出肽链结构的变化。整个红外光谱可分为两个区域，波数4000～1300cm-1的区域为官能团区，在这个区域，可以分辨出不同官能团的特征吸收峰。波数为1300～600cm-1的区域为指纹区，该区域的吸收峰数量多、密度大、结构复杂，可以反应整个分子的特征，可作为判断分子结构的依据。一般蛋白质的红外光谱图有几组特征吸收谱带：酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ，酰胺Ⅰ实际上是酰胺化合物的羰基(C＝O)的伸缩振动吸收，其特征峰位于1600～1700cm-1；酰胺Ⅱ属于氨基(-NH2)伸缩振动，其特征峰位于1530～1550cm-1；酰胺Ⅲ其特征峰位于1200～1300cm-1，从图中可以看到蛋白质的这几条特征吸收谱带。从图中可以看出，未改性豌豆蛋白酶在1649.09cm-1处表现为羰基振动伸缩，酶改性蛋白向高波数方向移动至1654.88cm-1处表现为羰基振动伸缩；未改性豌豆蛋白酶在1544.94cm-1、酶改性蛋白在1543.04cm-1表现为氨基振动伸缩；酰胺Ⅲ的特征峰也由1240.19cm-1(未改性豌豆蛋白酶)向高波数方向移动到1242.12cm-1(酶改性蛋白)，酶改性改变了峰的强度、面积和位置，但是分子上的化学基团没有发生本质的变化，反映出蛋白在酶解过程中改变了各种构象所占比例，二级结构发生了变化。
(5)改性前后豌豆蛋白的差示扫描量热(DSC)测定
参照胡方洋公开的方法，采用DSC进行热力学性质测定。称取2～3mg豌豆蛋白样品放入坩埚中，进行压片，使样品与坩埚保持良好的传热接触，将装有样品的坩埚片小心地放入加热炉内，以空坩埚做空白，升温范围40～200℃，升温速度10℃/min，载气为空气。
改性前后豌豆蛋白的差示扫描量热分析如图12所示。差示扫描量热法是一种在程序控温和特定气氛下，测量流入流出样品和参照物的热通量或者输给样品和参照物的加热功率与温度或时间关系的技术。由图可以看出，2种豌豆蛋白的DSC曲线均呈现先下降后上升的趋势，且曲线峰温(Td)对应的温度为：未改性豌豆蛋白：68.7℃；酶改性豌豆蛋白：78.5℃，这与卢菊慧公开的相似。有研究发现，蛋白质Td的高低与其氨基酸的构成和蛋白质结构有关。本试验中豌豆蛋白通过改性，其蛋白质结构发生了变化，峰温的增加，说明豌豆蛋白改性后拥有了更好的热稳定性。
(6)改性前后豌豆蛋白的内源荧光光谱测定
参照梁晗妮公开的方法，稍作修改。将豌豆蛋白分散于10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中，蛋白浓度为0.1mg/mL，采用荧光光度计测定豌豆蛋白的内源荧光光谱。激发波长为290nm，发射波长为300-500nm，激发和发射狭缝宽度为5nm。
使用荧光分光光度计对改性前后的豌豆蛋白进行扫描测定。改性前后豌豆蛋白的内源荧光光谱如图13所示。由图可知，改性前后2种豌豆蛋白的最大吸收波长均大于330nm，表明色氨酸残基位于蛋白质分子的外部(极性环境)；豌豆蛋白通过酶改性后，荧光光谱的最大吸收波长发生了轻微的红移(向疏水环境)。由荧光峰的强度可知，豌豆蛋白改性后，内部疏水基团增强。这可能是由于酶的作用，蛋白质内部结构以及所处环境发生改变，使蛋白质中氨基酸所处位置发生变化，一部分色氨酸从亲水性区域游离到疏水性区域，导致荧光强度增加；另一部分色氨酸逐渐被暴露在分子外部，其所处的微环境极性增强，也导致了荧光强度增加。
实施例7豌豆蛋白脂肪模拟物在红肠中的应用
红肠的制作分为3组：第1组为高脂香肠对照组：(不添加豌豆蛋白，脂肪添加量30％)；第2组为低脂香肠对照组：(不添加豌豆蛋白，脂肪添加量为15％)；第3组为改性豌豆蛋白组(添加4％酶改性豌豆蛋白，脂肪添加量为15％)。制作完成分析红肠的基本组成成分、色泽、质构、pH值、亚硝基肌红蛋白含量、TBARS值、菌落总数和大肠杆菌、水分活度、保水保油性和感官品质，对低脂红肠的品质作出评价，之后真空包装4℃贮藏30d之后对微生物数量(菌落总数和大肠菌群)进行检测。
(1)红肠基本成分的测定
按照《GB/T 5009.3-2016食品中水分的测定》、《GB/T 5009.5-2016食品中蛋白质的测定》、《GB/T 5009.4-2016食品中灰分的测定》、《GB/T 5009.6-2016食品中脂肪的测定》测定红肠样品的水分、蛋白质、灰分及脂肪含量。
表8 红肠的基本成分(g/100g)
注：同列不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)
表8所示为红肠的基本营养成分组成。由表8可知，添加4％酶改性蛋白的红肠水分含量为38.00g/100g，显著高于两组不添加改性蛋白的对照组(P<0.05)，灰分含量(3.62g/100g)高于两组对照组但无显著性差异(P>0.05)。蛋白质含量为23.94g/100g，脂肪含量为15.13g/100g，都与两组对照组有显著差异(P<0.05)。这说明酶改性蛋白的添加在增加低脂红肠蛋白含量的同时降低了脂肪含量。
(2)红肠色泽的测定
将色差仪开机校准后，取红肠样品剁碎置于配套玻璃皿内，铺满底部并压实，观察表面无气泡。按键测定，记录L*(亮度)、a*(红度)、b*(黄度)值。
表9 改性豌豆蛋白对红肠色泽的影响
注：同列不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)
表9为改性豌豆蛋白对红肠色泽的影响，L*值表示亮度，a*表示红度，b*值为黄度。色泽为肉制品食用品质是否优良的重要评判标准之一。与高脂红肠对照组相比，降低脂肪含量(低脂红肠对照组)会导致L*值升高，a*和b*值降低，但是变化并不显著(P＞0.05)。与低脂红肠对照组相比，添加酶改性蛋白的红肠L*值显著降低(P＞0.05)，a*和b*值显著升高(P＜0.05)，这说明添加改性豌豆蛋白后，改变了低脂红肠(第2组)的色泽，使红度值和黄度值都得到提高，颜色进一步红艳。
(3)质构的测定
将红肠切成1.5cm左右厚度的切片，选用P/36R柱形探头，用质构仪进行TPA测定。
改性豌豆蛋白对红肠质构的影响：
质构特性是评价红肠食用品质的重要指标，用质构仪可以测定产品的硬度、内聚性、弹性、胶粘性和咀嚼性等质构特征。改性豌豆蛋白对红肠质构特性的影响如表10所示。由表10可知，与高脂红肠比较，低脂红肠对照组的硬度最高，达到66.28N，而弹性也增加至4.34mm，咀嚼性(214.79mJ)和胶粘性(49.55)显著增加，产品内聚性无显著性差异(P＞0.05)，说明降低脂肪含量使红肠变硬，不易于咀嚼。添加改性豌豆蛋白后改变了低脂红肠的质构特性，硬度、内聚性、弹性、胶粘性、咀嚼性和高脂红肠比较无显著性差异(P＞0.05)，说明添加酶改性蛋白的低脂红肠质构特性与普通红肠相当。
表10 改性豌豆蛋白对红肠质构的影响
注：同列不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)
(4)菌落总数(TVC)和大肠菌群的测定
参照GB/T 4789.2-2016《食品卫生微生物学检验：菌落总数测定》规定的方法进行平板计数。
参照GB/T 4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验：大肠菌群计数》规定的方法进行。
改性豌豆蛋白对红肠中菌落总数和大肠杆菌的影响进行分析，微生物是引起肉制品腐败变质的主要因素。表11为不同处理组红肠真空包装后在常温下贮藏30天时的微生物变化情况。由表11可知，与高脂红肠对照组相比，脂肪添加量为15％的低脂红肠对照组菌落总数上升，添加酶改性蛋白的红肠(第3组)菌落总数介于二者之间，为4.48lg(CFU/g)，但3组之间差异不显著(P>0.05)，说明低脂化处理及酶改性蛋白添加对红肠菌落总数的影响较小，且3组红肠的菌落总数均未超过国家标准(5.00lg CFU/g)，在可接受范围之内。同时，3组红肠均未检测出大肠杆菌，符合国家标准要求。
表11 改性豌豆蛋白对红肠微生物品质的影响
(5)改性豌豆蛋白对红肠理化指标的影响
硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)测定，取红肠样品于搅拌机中打碎，分别取5g放入锥形瓶中(平行三份)，加入25mL 7.5％三氯乙酸(含0.1％EDTA)，保鲜膜封口，恒温水浴振荡30min后，5000r/min 2℃离心10min，过滤后分别取5mL滤液(5mL蒸馏水作空白)，加入5mL0.02 mol/L的TBA溶液，摇匀后100℃水浴40min，迅速冷却，5000r/min 2℃离心5min，取上清液加入5mL氯仿，混匀，静置分层后取上清液置于532nm和600nm波长下测定，记录吸光值。按照以下公式计算：
pH值测定按照GB 5009.237-2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》进行。
亚硝基肌红蛋白含量的测定，参照朱培培公开的方法进行测定。
水分活度的测定，打开并校准水分活度仪，用干燥洁净的刀将红肠取三处不同位置剁碎，放入水分活度仪配套的塑料容器中，放至体积大于容器的一半，并将肉糜压实、表面抹平。将加好样品的器皿放入传感器并盖好。每个样品测定3组平行，结果取均值。
蒸煮损失的测定：取待测样品，称重记作m1，将其置于离心管中水浴锅控温85℃加热，煮至中心温度达70℃后继续加热35min。蒸煮完毕冷却，用滤纸吸干表面的汁液和油脂，再次准确称重记作m2。每个样品测定三组平行，最终结果取均值，计算公式如下：
离心损失的测定，参照施帅公开的方法进行测定。
保油性的测定，参照周伟伟公开的方法，并略做修改。将红肠样品切成2mm厚切片，称重后放入铝盒中，倒入等量乙醚浸泡，设定温度为80℃，待乙醚挥发完全后称量铝盒重量，失重即为肉样的粗脂肪量，每个样品重复测定3次，计算平均值。则：
式中：M0为铝盒的质量，g；M1为样品浸提前的质量，g；M2为样品浸提乙醚挥发后铝盒与脂肪的质量，g。
改性豌豆蛋白对红肠理化指标的影响：
表12 改性豌豆蛋白对红肠理化指标的影响
表12为改性豌豆蛋白对红肠理化指标的影响。脂肪氧化是引起红肠品质下降最主要的原因，TBARS值可以直接反应脂肪氧化的程度，TBARS值越大，脂肪氧化程度越高。从表中可以看出，高脂红肠对照组TBARS值为0.42mg/kg，低脂红肠对照组TBARS值显著降低为0.32mg/kg(P>0.05)，可见降低脂肪含量会导致TBARS值的降低。添加酶改性豌豆蛋白红肠的TBARS值为0.31mg/kg，与低脂红肠无显著差异(P>0.05)。
由表12可知3组红肠pH值的变化。当脂肪含量由30％(第1组)降低至15％(第2组)时，红肠的pH值差异不显著(P>0.05)。与不添加改性豌豆蛋白的红肠(第1组、第2组)相比，添加酶改性蛋白的红肠pH值上升(pH＝6.93)，但无显著性差异(P＞0.05)。
亚硝基肌红蛋白(nitrosomyoglobin，NO-Mb)是肌红蛋白与亚硝基结合后的产物，多存在于腌制肉及发酵肉制品中，是肉制品中主要的呈色物质。腌制过程中，亚硝酸盐经过复杂反应产生NO，与肌红蛋白结合形成NO-Mb，使肉色呈粉红色。从表中可以看出，3组试验组红肠中NO-Mb含量存在显著差异(P<0.05)。添加酶改性豌豆蛋白红肠的NO-Mb含量与低脂红肠对照组无显著性差异(P>0.05)，都显著高于第1组高脂香肠的NO-Mb，这是因为第2组和第3组中含有更多瘦肉的缘故，此结果与上述a*值测定结果相一致。
肉制品的保水性即持水性、系水性，是指在受外力作用时，如加压、加热、切碎、冷冻、解冻、腌制等加工或贮藏条件下，肉制品保持其原有水分与添加水分的能力。保水性的高低直接决定着肉制品的质地、风味、组织状态和出品率。由表可以看出改性豌豆蛋白对红肠蒸煮损失、离心损失及水分活度aw的影响。蒸煮损失和离心损失越大，保水性越差。由表可知，低脂红肠对照组的蒸煮损失和离心损失最大，分别达到11.62％和31.62％，显著高于高脂红肠对照组(P<0.05)。改性蛋白的添加提高了低脂红肠的保水性，蒸煮损失和离心损失分别降低为10.88％和26.81％，显著低于低脂红肠对照组(P<0.05)。水分活度aw是反映食品保藏性能的常用指标，aw越低表明其游离的水分子越少，其贮藏性更好。aw的测定结果与保水性的测定结果相一致，并且改性豌豆蛋白香肠与高脂红肠对照组aw无显著性差异(P>0.05)。
改性豌豆蛋白对红肠保油性的影响如表所示。由表可知，低脂红肠对照组保油性最低(67.38％)，显著低于第1组和第3组(P<0.05)，而改性蛋白的添加提高了低脂红肠的保油性(P<0.05)，这可能是由于豌豆蛋白通过酶改性后属于典型的氨基酸型表面活性剂，能够降低油、水的界面张力，使脂肪和水形成稳定体系。
(6)改性豌豆蛋白对红肠感官特性的影响
在食品工艺室内完成测试。请经过感官培训的技术工人共计20名组成评定小组，选择双向盲评法进行检验。样品按顺序编号，随机抽取，每次评定由评定人员独立进行。共从嫩度、多汁性、油滑性、表观结构、总体可接受性5个方面进行评价。每项的满分为9分，嫩度要求：硬度适中，易于咬切；多汁性要求：入口有咀嚼感，不粘口，后味正常；油滑性要求：口腔中形成脂肪状的油滴感，肉香味较好；表观结构要求：切面光滑、致密，有光泽，1.5mm后的薄片对折后无裂痕，并且可以再次对折；总体可接受性：受消费者喜爱。
不同处理组红肠的感官评价结果如下。
表13 改性豌豆蛋白对红肠感官特性的影响
由表13可知，低脂香肠对照组和高脂香肠对照组相比，产品的嫩度逐渐降低，多汁性变差，表观结构变得粗糙，切面不光滑，油滑性差，肉香味不明显，故总体接受性显著降低。添加改性豌豆蛋白后，红肠的嫩度有所恢复，咀嚼时多汁性感增强，且肉香味增强，切面光滑、致密，薄片对折后无裂痕，咀嚼时肉香味明显，总体接受性显著高于低脂香肠对照组的分值。
综上所述，本发明实施例表明：
(1)选用木瓜蛋白酶对豌豆蛋白进行酶改性，以乳化性、乳化稳定性、持水性和粘度为指标，通过单因素试验和正交试验得到最佳酶改性条件为：酶添加量0.15％，底物浓度6％，酶解时间40min。
(2)对改性豌豆蛋白结构进行表征，并对功能性质进行测定，结果表明：改性豌豆蛋白的乳化性、乳化稳定性、持水性、粘度、巯基含量和表面疏水性均得到提高。红外光谱确证了酶改性导致-NH2、C＝O伸缩振动频率及吸收峰强度发生变化。内源性荧光光谱发现改性蛋白的最大吸收波长发生红移，内部疏水基团增强。DSC测定发现改性蛋白变性温度高于未改性蛋白，说明改性蛋白热稳定性增强。
(3)分析改性豌豆蛋白对低脂红肠品质的影响，结果发现，添加改性豌豆蛋白提高了低脂红肠的蛋白质含量、红度值、保油性，降低了低脂红肠的脂肪含量、菌落总数和水分活度。
本发明技术原理：本发明提供一种酶改性豌豆蛋白的制备及在低脂红肠中的应用，进行了低脂肉制品的开发，本发明以豌豆蛋白为基质制备脂肪模拟物，优化豌豆蛋白酶改性的最佳条件，并对改性后的豌豆蛋白进行功能分析，将其作为脂肪模拟物替代50％动物脂肪添加到红肠中考察对红肠微生物性质、理化性质和感官品质的影响。
本发明在对豌豆蛋白酶改性条件进行工艺优化时，选用五种蛋白酶在各自最佳酶解条件下对豌豆蛋白进行酶解，以乳化性、乳化稳定性、持水性和粘度作为指标筛选酶种类，然后用最适蛋白酶对豌豆蛋白进行酶改性，通过单因素试验和正交试验确定最佳的酶改性条件。试验确定最适蛋白酶为木瓜蛋白酶，其最佳酶改性条件为：酶添加量0.15％，底物浓度6％，酶解时间40min。本发明采用酶解法改性豌豆蛋白，工艺简单，对酶改性工艺进行优化，获得的豌豆蛋白可用于肉制品加工过程中，降低肉制品脂肪，制备获得低脂红肠，可为其加工提供理论和技术支持。
为研究酶改性豌豆蛋白的功能和性质，本发明对其结构进行表征，并对豌豆蛋白改性前后的表面疏水性、巯基含量等功能性质进行对比分析。结果表明：豌豆蛋白通过酶改性后乳化性、乳化稳定性、持水性、粘度、巯基含量和表面疏水性分别提升了22.9％、3.6％、77.8％、14.3％、160.36％和11.87％，均显著高于未改性蛋白(P<0.05)。内源性荧光光谱分析发现改性蛋白的最大吸收波长发生红移，内部疏水基团增强。红外光谱证实了酶改性使蛋白形成了更多的分子间氢键，导致C-N、C＝O伸缩振动频率及吸收峰强度发生明显变化。DSC结果显示改性蛋白变性温度高于未改性蛋白，说明改性化处理提高了豌豆蛋白的热稳定性。
本发明在实施豌豆蛋白脂肪模拟物在红肠中的应用时，为研究改性豌豆蛋白对低脂红肠品质的影响，以添加酶改性豌豆蛋白的红肠作为试验组(替代50％脂肪)，同时设立不添加改性豌豆蛋白的对照组，分析红肠的基本组成成分、菌落总数和大肠杆菌、色泽、质构、亚硝基肌红蛋白含量、TBARS值、水分活度、保水保油性和感官品质，对低脂红肠的品质作出评价。结果表明：添加改性豌豆蛋白，提高了低脂红肠的蛋白质含量、红度值、保油性，降低了低脂红肠的脂肪含量、菌落总数和水分活度。
本发明技术效果：本发明提供一种酶改性豌豆蛋白的制备及在低脂红肠中的应用，通过采用木瓜蛋白酶对豌豆蛋白进行酶改性获得酶改性豌豆蛋白；所述酶改性的条件为：酶添加量0.15％，底物浓度6％，酶解时间40min；所述豌豆蛋白通过酶改性后乳化性、乳化稳定性、持水性、粘度、巯基含量和表面疏水性分别提升了22.9％、3.6％、77.8％、14.3％、160.36％和11.87％；本发明采用酶解法改性豌豆蛋白，工艺简单，对酶改性工艺进行优化，获得的豌豆蛋白品味、色泽优异，将其用于肉制品加工过程中，丰富肉制品风味，改善肉制品的品质，制备获得低脂红肠，可为其加工提供理论和技术支持，适合大规模生产。酶法改性反应条件温和、副反应少、不破坏氨基酸、水解程度易控制，特别是在营养成分的保留上，具有不可比拟的优点。采用蛋白酶对豌豆蛋白进行限制性水解，可显著提高蛋白质溶解性能，使蛋白质分子柔性增大，易于在界面吸附，增强乳化性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种酶改性豌豆蛋白的制备方法，其特征在于：是通过采用木瓜蛋白酶对豌豆蛋白进行酶解改性获得酶改性豌豆蛋白，进而通过酶改性提升豌豆蛋白的乳化性、乳化稳定性、持水性、粘度、巯基含量和表面疏水性；
所述豌豆蛋白酶改性的具体步骤为：
配制一定底物浓度的豌豆蛋白溶液，并在豌豆蛋白溶液中添加蛋白酶；
再利用HCl或NaOH调节豌豆蛋白溶液pH值后进行酶解；
酶解反应结束后在沸水中钝化酶；
最后对溶液进行离心沉淀，冻干。
2.根据权利要求1所述的一种酶改性豌豆蛋白的制备方法，其特征在于：所述酶解条件为：蛋白酶添加量为豌豆蛋白质量的0.1％～0.15％，底物豌豆蛋白溶液浓度为4％～6％，酶解时间为30min～40min，pH为6.5，酶解温度为45℃。
3.根据权利要求1所述的一种酶改性豌豆蛋白的制备方法，其特征在于：所述酶解条件为：蛋白酶添加量为豌豆蛋白质量的0.15％，底物豌豆蛋白溶液浓度为6％，酶解时间为40min，pH为6.5，酶解温度为45℃。
4.根据权利要求1所述的一种酶改性豌豆蛋白的制备方法，其特征在于：所述钝化时间为5min～10min，离心时间不少于15min。
5.根据权利要求1所述的一种酶改性豌豆蛋白的制备方法，其特征在于：所述冻干是在30min内冷冻至-40℃，在-40℃、绝对压力15Pa、干燥48h的条件下获得真空冷冻干燥粉末。
6.一种酶改性豌豆蛋白的应用，其特征在于：根据权利要求1至5任意一项所述制备方法获得的改性豌豆蛋白用于肉质品加工过程中，所述肉质品为红肠。
7.根据权利要求6所述的一种酶改性豌豆蛋白的应用，其特征在于：所述红肠的制备方法包括如下步骤：选择和修整猪肉，将瘦肉绞碎低温腌制，再加入肥肉、脂肪模拟物、配料、20％冰水、0.3％黄原胶和0.3％卡拉胶，随后充分搅拌均匀、灌肠，在75℃烘烤60min～90min，再蒸煮，所述蒸煮为在75℃～80℃煮制60min～90min，使中心温度不低于72℃，随后烟熏，最后在75℃条件下，继续烘烤30min，冷却至室温，制成成品。
8.根据权利要求7所述的一种酶改性豌豆蛋白的应用，其特征在于：所述腌制过程包括添加食盐28g/kg，复合磷酸盐4g/kg，抗坏血酸钠0.55g/kg和亚硝酸钠0.15g/kg，在4℃条件下腌制12h～24h。
9.根据权利要求7所述的一种酶改性豌豆蛋白的应用，其特征在于：以肉重为基准，所述脂肪模拟物包括4％酶改性豌豆蛋白，脂肪添加量为15％，所述配料包括胡椒粉0.126％，红曲红0.4％，味精0.6％，白糖2.5％，五香粉0.6％，大蒜0.3％。
10.根据权利要求7所述的一种酶改性豌豆蛋白的应用，其特征在于：所述烟熏过程包括烟熏材料为白糖：烟熏液＝10:1，烟熏炉炉温75～80℃，烟熏时间30min。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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