CN111658784B - 一种多糖季铵盐在递送核酸和蛋白质上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多糖季铵盐在递送核酸和蛋白质上的应用，所述的多糖季铵盐可以用于递送核酸和蛋白质，其制备步骤为：1)配制伯胺多糖的水溶液；所述的伯胺多糖平均分子量为4000～30000；2)加入短烷基碳原子数为X的环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐进行反应进行反应，反应温度为25～90℃，反应时间为6～72小时，所述的X＝1～5，3)沉淀、洗涤、干燥，得到仲胺型‑多糖季铵盐；步骤2)所述的环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐与步骤1)所述的伯胺多糖投料质量比为0.1～3:1。本发明的多糖季铵盐递送载体用于核酸和蛋白质的递送，递送效率和生物相容性将远优于现有载体。

Description

一种多糖季铵盐在递送核酸和蛋白质上的应用
技术领域
本发明属于递送载体领域，涉及一种多糖季铵盐在递送核酸和蛋白质上的应用。
背景技术
核酸、蛋白质类生物大分子的胞内递送对疾病治疗和生物医学研究具有重要作用，目前阳离子聚合物递送载体有聚乙烯亚胺(PEI)和PAMAM等(International Journalof Pharmaceutics,2014,465(1-2):112-119.)，但是一般毒性大，递送效率有限。本课题团队曾利用聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)与乙醇胺(EA)的开环反应，制备了链节中同时含有仲胺基团和羟基的新型阳离子聚合物PGEA，相比于PEI、PAMAM等具有更高的递送效率和低毒性(Biomacromolecules,2010,11(6):1437-1442；ZL201210127021.0)。有多糖基递送载体的一些文献报导(Biomaterials,2012,33(6):1873-1883；ACS Applied Materials&Interfaces,2016,8(47):32146；Advanced Functional Materials,2019,29(11):1807104.1-1807104.12等)，大多是阳离子聚合物接枝多糖载体，能够结合阳离子聚合物的负电性络合能力(络合核酸，结合蛋白质)和多糖的生物相容性，有可能制备出递送效率较高和毒性较低的载体。但是由于侧链接枝的仍是较大平均分子量的阳离子聚合物，此类阳离子聚合物接枝多糖载体的毒性仍然不容忽视，限制了进一步提高递送效率、降低毒性及临床应用的可能。因此，开发新型结构的功能基团并引入多糖结构以构建新型高效率、低毒载体很有必要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种多糖季铵盐在递送核酸和蛋白质上的应用，本发明具体提供了如下的技术方案：
1、一种多糖季铵盐在递送核酸和蛋白质上的应用，所述的多糖季铵盐递送可以用于递送核酸和蛋白质，其制备步骤为：
1)配制伯胺多糖的水溶液；所述的伯胺多糖平均分子量为4000～30000；
2)加入短烷基碳原子数为X的环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐进行反应进行反应，反应温度为25～90℃，反应时间为6～72小时，所述的X＝1～5，
3)沉淀、洗涤、干燥，得到仲胺型-多糖季铵盐；
步骤2)所述的环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐与步骤1)所述的伯胺多糖投料质量比为0.1～3:1。
进一步，步骤1)所述的伯胺多糖为自身带伯胺的甲壳素、壳聚糖或壳聚糖酸盐，所述的壳聚糖酸盐为壳聚糖盐酸盐、壳聚糖醋酸盐、壳聚糖乳酸盐或壳聚糖柠檬酸盐，所述的水溶液为纯水溶液或纯水与盐酸、醋酸、乳酸、柠檬酸中一种酸的混合溶液。
进一步，步骤1)所述的伯胺多糖为自身不带伯胺的多糖经伯胺小分子偶联反应后得到的伯胺多糖；所述的自身不带伯胺的多糖为葡聚糖、环糊精、普鲁兰、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基淀粉、直链淀粉或支链淀粉。
进一步，步骤1)所述的伯胺多糖制备方法为：将自身不带伯胺的多糖溶于溶剂，加入可激活多糖上的羟基的催化剂和伯胺基试剂，在25～70℃下反应5～72小时，去离子水透析，冷冻干燥后得到伯胺多糖，所述催化剂与多糖上的单糖单元的质量比为0.05～3:1，所述伯胺基试剂与催化剂的质量比为0.2～30:1。
进一步，步骤1)所述的伯胺多糖平均分子量为7000～25000。
进一步，所述的溶剂为水、二甲基亚砜、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺的一种或多种混合溶剂；所述催化剂根据溶剂选择，水对应催化剂氢氧化钠，二甲基亚砜对应催化剂N,N-羰基二咪唑，二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺对应催化剂为对硝基氯甲酸苯酯；所述的伯胺基试剂为2-氯乙胺盐酸盐、3-氯丙胺盐酸盐、4-氯丁胺盐酸盐、乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、二亚乙基三胺，2,2'-二氨基-N-甲基二乙胺中的一种或多种。
进一步，步骤2)所述的环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐和步骤1)所述的伯胺多糖的投料质量比为0.2～1.5:1。
进一步，步骤2)所述的环氧基短烷基链季铵盐为2,3-环氧丙基三甲基氯化铵或由环氧氯丙烷和N,N-二甲基X胺的反应得到的产物，所述的氯羟丙基短烷基季铵盐为3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵或由环氧氯丙烷和N,N-二甲基X胺在盐酸存在下的反应产物，所述的X为乙、丙、丁或戊。
进一步，步骤3)之后将仲胺型-多糖季铵盐与核酸递送增强分子进行接枝反应，所述的核酸递送增强分子为精氨酸、组氨酸、咪唑、苯硼酸、叶酸、胆酸、胆固醇酸的一种或多种。
进一步，将所述材料与所述核酸和蛋白质按照质量比0.5～100组成复合体，进行递送；所述的核酸为包括质粒DNA、微环DNA、基因组DNA、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)在内的脱氧核糖核酸或核糖核酸；所述的蛋白质为包括牛血清白蛋白、溶菌酶、绿色荧光蛋白、p53抑瘤蛋白、碱性磷酸酶、胞嘧啶脱氨酶、核酸酶、胸苷激酶、紫外光响应蛋白、红外光响应蛋白、核糖核蛋白等水溶液中呈负电性蛋白质。
本发明的有益效果在于：采用含伯胺的多糖，因为含有伯胺的多糖可与环氧基生成具有仲胺基团的季铵盐结构，季铵盐基团可有效络合负电性的核酸和蛋白质，增强与蛋白质的相互结合促进蛋白质的递送，仲胺基团的缓冲能力将克服常规单一季铵盐改性载体的不足(缺乏缓冲能力，内涵体逃逸能力差，导致递送的蛋白质或核酸被溶酶体吞噬，递送效率低)，提高载体的递送效率；采用环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐(C原子数为1～5)对伯胺多糖进行改性，而不是长烷基链(C原子数＞6)对伯胺多糖接枝改性，因为短烷基链季铵盐有利于细胞内聚合物载体与核酸/蛋白质的解离，有效提高载体的递送效率；同时结合了短烷基链季铵盐良好的生物相容性与环氧基开环反应生成的羟基对正电荷的有效屏蔽作用，使得载体的毒性极低，将赋予载体很高的递送效率。本发明同时利用多糖上伯胺与环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐生成仲胺、羟基及短链季铵基团，制备的多糖季铵盐递送载体用于核酸和蛋白质的递送，递送效率和生物相容性将远优于现有载体，且载体毒性非常低。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
1)将1.0g环氧氯丙烷滴加到1.0g N,N-二甲基乙胺中，40℃下搅拌24小时，结束后乙醚沉淀洗涤2次，减压干燥，得到环氧季铵盐A，分子式为
Figure BDA0002539480470000031
1)2.5g羟丙基纤维素先溶解于80mL二氯甲烷中，再加入0.8g对硝基氯甲酸苯酯和20mL吡啶；0℃下搅拌4小时。然后用无水乙醚沉淀3次，纯化得到产物HPC-4-NC。
2)2.0g HPC-4-NC加入80mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入5.5g乙二胺。室温(25℃)氮气气氛下搅拌24小时。
3)反应结束在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为17000～20000的氨基羟丙基纤维素。
4)将2.0g氨基羟丙基纤维素溶于200mL去离子水中；0.45g环氧季铵盐A溶于20mL去离子水中后加入，30℃反应24小时。
5)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.225:1的仲胺型-羟丙基纤维素季铵盐PS-N+-1。
实施例2
1)将2.0g环氧氯丙烷滴加到5.0g N,N-二甲基丙胺，45℃下搅拌18小时，结束后石油醚沉淀洗涤2次，减压干燥，得到环氧季铵盐B，分子式为
Figure BDA0002539480470000041
2)将2.0g葡聚糖和1.0g N,N'-羰基二咪唑分别溶解在无水二甲基亚砜中；将N,N'-羰基二咪唑溶液在室温(25℃)下加入葡聚糖溶液中，室温反应24小时。
3)将6.0g二亚乙基三胺溶液快速加入到上述N,N'-羰基二咪唑活化的葡聚糖溶液中；室温在氮气气氛下搅拌24小时。
4)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为15000～18000的氨基葡聚糖。
5)将2.0g氨基葡聚糖溶于200mL去离子水中，之后0.7g环氧季铵盐B加入到氨基葡聚糖溶液中，25℃反应48小时。
6)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.35:1的仲胺型-葡聚糖季铵盐PS-N+-2。
实施例3
1)将1.0g环氧氯丙烷滴加到4.0g N,N-二甲基丁胺中，60℃下搅拌4小时，结束后环己烷沉淀洗涤2次，减压干燥，得到环氧季铵盐C，分子式为
Figure BDA0002539480470000042
2)2.0g支链淀粉加入无水二甲基亚砜溶液中，先加热至100℃溶解，再降温至室温(25℃)；0.1g N,N'-羰基二咪唑溶解在无水二甲基亚砜中；室温下，将N,N'-羰基二咪唑溶液加入支链淀粉溶液中，反应24小时。
3)将0.5g丁二胺的无水二甲基亚砜溶液快速加入到上述N,N'-羰基二咪唑活化的支链淀粉溶液中。25℃下在氮气气氛下搅拌48小时。
4)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为17000～23000的氨基支链淀粉。
5)将2.0g氨基支链淀粉加入200mL去离子水中，在35℃下加热溶解。之后1.5g环氧季铵盐C溶于20mL去离子水中并加入到氨基支链淀粉溶液中，35℃反应36小时。
6)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，真空干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.75:1的仲胺型-支链淀粉季铵盐PS-N+-3。
实施例4
1)将2.0g环氧氯丙烷滴加到6.0g N,N-二甲基戊胺，50℃下搅拌20小时，结束后石油醚沉淀洗涤2次，减压干燥，得到环氧季铵盐D，分子式为
Figure BDA0002539480470000051
2)将2.4g N,N’-羰基二咪唑和2.0g环糊精分别溶解在无水二甲基亚砜中；将N,N’-羰基二咪唑溶液在室温(25℃)下加入环糊精溶液中，室温反应24小时。
3)将2.2g丙二胺的无水二甲基亚砜溶液快速加入到上述N,N’-羰基二咪唑活化的环糊精溶液中。30℃下在氮气气氛下搅拌36小时。
4)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为13000～18000的氨基环糊精。
5)将2.0g氨基环糊精加入200mL去离子水中，30℃下加热溶解。之后1.8g环氧季铵盐D溶于20mL去离子水中并加入到氨基环糊精溶液中，50℃反应40小时。
6)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，经真空干燥，即可得到接环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.9:1的仲胺型-环糊精季铵盐PS-N+-4。
实施例5
1)将2.0g盐酸滴加到2.0g N,N-二甲基丙胺中，55℃再搅拌加入1.0g环氧氯丙烷，70℃下搅拌7小时，结束后减压干燥，得到3-氯-2-羟丙基季铵盐E，分子式为
Figure BDA0002539480470000052
2)将3.5g 3-氯丙胺盐酸盐溶于150mL去离子水中，加入10.0g普鲁兰。65℃搅拌下将3.1g的氢氧化钠滴加到反应混合物中，反应18小时。
3)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为10000～12000的氨基普鲁兰。
4)将2.0g氨基普鲁兰溶于200mL的氢氧化钠溶液(质量溶度40.0％)中，之后0.8g3-氯-2-羟丙基季铵盐E水溶液加入到氨基普鲁兰溶液中，70℃反应24小时。
5)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，真空干燥，即可得到氯羟丙基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.4:1的仲胺型-普鲁兰季铵盐PS-N+-5。
实施例6
1)2.0g普鲁兰先溶解于80mL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入1.9g对硝基氯甲酸苯酯和20mL吡啶，0℃下搅拌12小时。
2)向上述溶液中加入4.0g戊二胺。50℃下氮气气氛下搅拌5小时。
3)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为9000～13000的氨基普鲁兰。
4)将2.0g氨基普鲁兰加入200mL去离子水中，在70℃下加热溶解，0.6g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵溶于20mL去离子水中并加入到氨基普鲁兰溶液中，25℃反应70小时。
5)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.3:1的仲胺型-普鲁兰季铵盐PS-N+-6。
实施例7
1)如实施例3步骤1，制备环氧季铵盐C，分子式为
Figure BDA0002539480470000061
2)将2.0g壳聚糖盐酸盐(脱乙酰度为90％，平均分子量为18000)加入200mL去离子水中，在55℃下加热溶解。之后2.5g环氧季铵盐C溶于20mL去离子水中并加入到壳聚糖盐酸盐溶液中，55℃反应30小时。
3)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，真空干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为1.25:1的仲胺型-壳聚糖季铵盐PS-N+-7。
实施例8
1)如实施例2步骤1，制备环氧季铵盐B，分子式为
Figure BDA0002539480470000062
2)将2.0g葡聚糖和1.0g N,N'-羰基二咪唑分别溶解在无水二甲基亚砜中；将N,N'-羰基二咪唑溶液在室温(25℃)下加入葡聚糖溶液中，室温反应24小时。
3)将6.0g二亚乙基三胺溶液快速加入到上述N,N'-羰基二咪唑活化的葡聚糖溶液中；室温在氮气气氛下搅拌24小时。
4)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为20000～25000的氨基葡聚糖。
5)将2.0g氨基葡聚糖溶于200mL去离子水中，之后0.3g环氧季铵盐B加入到氨基葡聚糖溶液中，30℃反应24小时。
6)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.15:1的仲胺型-葡聚糖季铵盐PS-N+-8。
实施例9
1)如实施例1步骤1，制备环氧季铵盐A，分子式为
Figure BDA0002539480470000071
2)2.5g羟丙基纤维素先溶解于80mL二氯甲烷中，再加入0.8g对硝基氯甲酸苯酯和20mL吡啶；0℃下搅拌4小时。然后用无水乙醚沉淀3次，纯化得到产物HPC-4-NC。
3)2.0g HPC-4-NC加入80mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入5.5g乙二胺。室温(25℃)氮气气氛下搅拌24小时。
4)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为17000～20000的氨基羟丙基纤维素。
5)将2.0g氨基羟丙基纤维素溶于200mL去离子水中；5.0g环氧季铵盐A溶于20mL去离子水中后加入，30℃反应24小时。
6)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为2.5:1的仲胺型-羟丙基纤维素季铵盐PS-N+-9。
实施例10
1)将2.0g壳聚糖(脱乙酰度85％，平均分子量为18000)加入200mL醋酸溶液(质量分数0.3％)中，在60℃下加热溶解。之后4.5g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵溶于20mL去离子水中并加入到壳聚糖溶液中，60℃反应36小时。
2)反应结束用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为2.25:1的仲胺型-壳聚糖季铵盐PS-N+-10。
实施例11
1)如实施例2步骤1，制备环氧季铵盐B，分子式为
Figure BDA0002539480470000072
2.0g葡聚糖和1.0g N,N'-羰基二咪唑分别溶解在无水二甲基亚砜中；将N,N'-羰基二咪唑溶液在室温(25℃)下加入葡聚糖溶液中，室温反应24小时。
2)将6.0g二亚乙基三胺溶液快速加入到上述N,N'-羰基二咪唑活化的葡聚糖溶液中；室温在氮气气氛下搅拌24小时。
3)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为26000～30000的氨基葡聚糖。
4)将2.0g氨基葡聚糖溶于200mL去离子水中，之后0.7g环氧季铵盐B加入到氨基葡聚糖溶液中，25℃反应36小时。
5)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.35:1的仲胺型-葡聚糖季铵盐PS-N+-11。
实施例12
1)如实施例5步骤1，制备3-氯-2-羟丙基季铵盐E，分子式为
Figure BDA0002539480470000081
2)将3.5g 3-氯丙胺盐酸盐溶于150mL去离子水中，加入10.0g普鲁兰。65℃搅拌下将3.1g的氢氧化钠滴加到反应混合物中，反应18小时。
3)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为4000～6000的氨基普鲁兰。
4)将2.0g氨基普鲁兰溶于200mL的氢氧化钠溶液(质量分数40.0％)中，之后0.8g3-氯-2-羟丙基季铵盐E水溶液加入到氨基普鲁兰溶液中，70℃反应24小时。
5)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，真空干燥，即可得到氯羟丙基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.4:1的仲胺型-普鲁兰季铵盐PS-N+-12。
实施例13
1)如实施例3步骤1，制备环氧季铵盐C，分子式为
Figure BDA0002539480470000082
2)将2.0g壳聚糖醋酸盐(脱乙酰度90％，平均分子量为5500)加入200mL去离子水中，在70℃下加热溶解。之后1.0g环氧季铵盐C溶于20mL去离子水中并加入到壳聚糖醋酸盐溶液中，70℃反应8小时。
3)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.5:1的仲胺型-壳聚糖季铵盐PS-N+-13。
实施例14
1)将2.0g壳聚糖(脱乙酰度85％，平均分子量为28000)加入200mL醋酸溶液(质量分数0.3％)中，在60℃下加热溶解。之后4.5g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵溶于20mL去离子水中并加入到壳聚糖溶液中，60℃反应36小时。
2)反应结束用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为2.25:1的仲胺型-壳聚糖季铵盐PS-N+-14。
实施例15
如实施例3，制备仲胺型-支链淀粉季铵盐(PS-N+-3)，继续进行如下反应：将2.0gPS-N+-11、1.0g精氨酸溶于N,N,N',N'-四甲基乙二胺/盐酸缓冲液(pH＝5.0)中，加入2.3g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、1.4g N-羟基琥珀酰亚胺，室温(25℃)搅拌24小时，在去离子水中透析2天，然后冷冻干燥，得到精氨酸-仲胺型-支链淀粉季铵盐PS-N+-15。
实施例16
如实施例5，制备仲胺型-普鲁兰季铵盐(PS-N+-5)，继续进行如下反应：将2.0gPS-N+-10，0.78g咪唑-1-乙酸溶于N,N,N',N'-四甲基乙二胺/盐酸缓冲液(pH＝5.0)中，加入2.3g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、1.4g N-羟基琥珀酰亚胺，60℃搅拌36小时，在去离子水中透析3天，然后进行冷冻干燥，得到咪唑-仲胺型-普鲁兰季铵盐PS-N+-16。
对比例1
1)将2.0g环氧氯丙烷滴加到5.0g N,N-二甲基辛胺，40℃下搅拌24小时，结束后正己烷沉淀洗涤2次，真空干燥，得到长烷基链环氧季铵盐F，分子式为
Figure BDA0002539480470000091
2)将3.5g 3-氯丙胺盐酸盐溶于150mL去离子水中，加入10.0g普鲁兰。65℃搅拌下将3.1g的氢氧化钠滴加到反应混合物中，反应18小时。
3)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为4000～6000的氨基普鲁兰。
4)将2.0g氨基普鲁兰溶于200mL去离子水中，之后0.8g环氧季铵盐F水溶液加入到氨基普鲁兰溶液中，70℃反应24小时。
5)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到环氧基长烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.4:1的仲胺型-普鲁兰季铵盐Pu-N+-1。
对比例2
1)2.0g普鲁兰先溶解于80mL N,N-二甲基甲酰胺中，再加入1.9g对硝基氯甲酸苯酯和20mL吡啶，0℃下搅拌12小时。
2)向上述溶液中加入4.0g戊二胺。50℃下氮气气氛下搅拌5小时。
3)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为9000～13000的氨基普鲁兰。
4)将2.0g氨基普鲁兰和7.2g碘化钠于60℃搅拌下分散于200mL N-甲基吡咯烷酮中，然后加入10mL的氢氧化钠溶液(质量分数为15％)，最后加入0.6g碘甲烷，70℃反应24小时；
5)反应结束用正己烷沉淀洗涤3次，后将其溶于40mL去离子水中，加入250mL1mol/L的盐酸乙醇溶液，搅拌1小时后离心，离心后，减压干燥，即可得到卤代烷与伯胺多糖投料质量比为0.3:1的无仲胺型-普鲁兰季铵盐Pu-N+-2。
对比例3
1)将2.0g羟丙基纤维素加入200mL去离子水中，0.45g环氧季铵盐A溶于20mL去离子水中并加入到羟丙基纤维素溶液中，30℃反应24小时。
2)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与无伯胺多糖投料质量比为0.225:1的无仲胺型-羟丙基纤维素季铵盐HPC-N+-3。
对比例4
1)如实施例4步骤1，制备环氧季铵盐D，分子式为
Figure BDA0002539480470000101
2)将2.4g N,N’-羰基二咪唑和2.0g环糊精分别溶解在无水二甲基亚砜中；将N,N’-羰基二咪唑溶液在室温(25℃)下加入环糊精溶液中，室温反应24小时。
3)将2.2g丙二胺的无水二甲基亚砜溶液快速加入到上述N,N’-羰基二咪唑活化的环糊精溶液中。30℃下在氮气气氛下搅拌36小时。
4)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为13000～18000的氨基环糊精。
5)将2.0g氨基环糊精加入200mL去离子水中，30℃下加热溶解。之后9.0g环氧季铵盐D溶于20mL去离子水中并加入到氨基环糊精溶液中，50℃反应40小时。
6)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，经真空干燥，即可得到接环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为4.5:1的仲胺型-环糊精季铵盐CD-N+-4。
对比例5
1)如实施例3步骤1，制备环氧季铵盐C，分子式为
Figure BDA0002539480470000102
2)将2.0g壳聚糖盐酸盐(脱乙酰度90％，平均分子量为18000)加入200mL去离子水中，在55℃下加热溶解。之后0.1g环氧季铵盐C溶于20mL去离子水中并加入到壳聚糖盐酸盐溶液中，55℃反应30小时。
3)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，真空干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.05:1的仲胺型-壳聚糖季铵盐CS-N+-5。
对比例6
1)将2.0g壳聚糖(脱乙酰度85％，平均分子量为40000万)加入200mL醋酸溶液(质量分数0.3％)中，在60℃下加热溶解。之后4.5g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵溶于20mL去离子水中并加入到壳聚糖溶液中，60℃反应36小时。
2)反应结束用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为2.25:1的仲胺型-壳聚糖季铵盐CS-N+-6。
对比例7
1)如实施例2步骤1，制备环氧季铵盐B，分子式为
Figure BDA0002539480470000111
将1.0g N,N'-羰基二咪唑和2.0g葡聚糖分别溶解在无水二甲基亚砜中；将N,N'-羰基二咪唑溶液在室温(25℃)下加入葡聚糖溶液中，室温反应24小时。
2)将6.0g二亚乙基三胺溶液快速加入到上述N,N'-羰基二咪唑活化的葡聚糖溶液中；室温在氮气气氛下搅拌24小时。
3)反应结束后在去离子水中透析，冷冻干燥后，得到平均分子量为1500～2500的氨基葡聚糖。
4)将2.0g氨基葡聚糖溶于200mL的氢氧化钠溶液(质量分数40.0％)中，之后2.2g环氧季铵盐B加入到氨基葡聚糖溶液中，30℃反应24小时。
5)反应结束后用乙醇沉淀洗涤3次，减压干燥，即可得到氯羟丙基短烷基链季铵盐与伯胺多糖投料质量比为1.1:1的仲胺型-葡聚糖季铵盐Dex-N+-7。
测试例1核酸递送效率对比
检测方法：利用海肾荧光素酶质粒(pRL-CMV，环状脱氧核糖核酸)作为报告基因来评价实施例和对比例得到的递送载体在HEK 293细胞系中的核酸递送效率。具体步骤如下：按照w/w比将递送载体材料溶液分别与pRL-CMV溶液混合，振荡后室温静置30分钟，备用。在含有0.5mL 10％胎牛血清培养液的24孔板中接种5×104个细胞。在37℃，5％CO2条件下孵育24小时后细胞增殖至60％-70％的区域，移除培养液，加入0.5mL含不同w/w比的材料/pRL-CMV复合物的(每孔含1.0μg pRL-CMV)新鲜培养液。孵育4小时后移除培养液，加入0.5mL新鲜培养液。继续培养20小时后吸出培养液，用PBS小心洗两遍，吸净残余PBS，加入70μL裂解液，室温振荡2小时后刮板，用冷光仪测试荧光值。pRL-CMV的递送效率以pRL-CMV表达的平均荧光强度与蛋白质含量的比值表示，单位为RLU/mg protein。实验测试了w/w比从1至30的不同w/w比的转染效率，最高转染效率如表1中所示。
表1核酸递送效率测试
Figure BDA0002539480470000112
Figure BDA0002539480470000121
由表1中可以看出：
1)伯胺多糖接枝环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐得到的PS-N+-1～PS-N+-14递送载体(实施例1～14)的转染效率可与PEI和PGEA(2万)相比(相当或优于)；其转染效率随着伯胺多糖的平均分子量、环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐与伯胺多糖投料质量比的不同而变化，在伯胺平均分子量为7000～19000、环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.2～1.5:1得到的PS-N+-1～PS-N+-6递送载体(实施例1～6)，有最高转染效率；
2)在此基础上接枝功能分子之后得到的PS-N+-15～PS-N+-16递送载体(实施例15、16)的转染效率均优于PEI和PGEA(2万)；
3)伯胺多糖接环氧基长烷基链季铵盐得到的Pu-N+-1递送载体(对比例1)在HEK293细胞中转染效率均较低，远低于伯胺多糖接环氧基短烷基链季铵盐得到的PS-N+-5递送载体(实施例5)的转染效率；
4)伯胺多糖接枝卤代烷季铵化得到的Pu-N+-2递送载体(对比例2)在HEK 293细胞中的转染效率均较低，远低于伯胺多糖接环氧基短烷基链季铵盐得到的PS-N+-6递送载体(实施例6)的转染效率；
5)不含伯胺的多糖接枝环氧基短烷基链季铵盐得到的HPC-N+-3递送载体(对比例3)在HEK 293转染效率很低，远低于含伯胺的多糖接枝季铵盐得到的PS-N+-1(实施例1)的转染效率。
6)环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖在较高投料质量比(4.5:1)或较低投料质量比(0.05:1)分别得到的CD-N+-5、CS-N+-6递送载体(对比例4、5)在HEK 293细胞中转染效率很低，远低于环氧基短烷基链季铵盐与伯胺多糖在投料质量比为0.9:1和1.25:1时得到的PS-N+-4、PS-N+-7(实施例4、7)的转染效率。
7)平均分子量超过30000或不足4000的伯胺多糖分别接枝环氧基短烷基链季铵盐得到的CS-N+-6、Dex-N+-7递送载体(对比例6、7)在HEK 293细胞中转染效率很低，低于平均分子量为4000～30000的伯胺多糖接枝环氧基短烷基链季铵盐得到的PS-N+-10、PS-N+-8(实施例10、8)的转染效率。
分析如下：伯胺多糖接枝环氧基长烷基链季铵盐得到的递送载体(对比例1)相较于伯胺多糖接枝环氧基长烷基链季铵盐得到的递送载体(实施例5)，由于长烷基链季铵盐不利于胞内递送核酸的解离，因此其转染效率不高。
伯胺多糖直接与卤代烷季铵化得到的递送载体(对比例2)相较于伯胺多糖接枝环氧基长烷基链季铵盐得到的递送载体(实施例11)，由于生成仲胺基团数量很少，pH缓冲能力和对应的内涵体逃逸能力较弱，不含伯胺的多糖直接接枝环氧基短烷基链季铵盐得到的递送载体(对比例3)相较于伯胺多糖接枝环氧基短烷基链季铵盐得到的递送载体(实施例1)，由于多糖没有伯胺基团，无法与环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐生成仲胺基团，不具备pH缓冲能力和对应的内涵体逃逸能力，导致递送的核酸在胞内被溶酶体吞噬，不能有效释放，因此其转染效率均很低。
环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐与伯胺多糖投料质量比过高或过低得到的递送载体(对比例4、对比例5)以及伯胺多糖的分子量过大或过小得到的递送载体(对比例6、对比例7)都会降低载体的转染效率，相比之下，当伯胺多糖的平均分子量为4000～30000，环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐与伯胺多糖投料质量比为0.1～3:1(实施例1～14)，特别地伯胺多糖的平均分子量为7000～25000，投料质量比为0.2～1.5:1时得到的递送载体(实施例1～6)转染效率最高。
由此说明，由一定平均分子量的多糖得到的伯胺多糖在按照优先投料质量比下，伯胺多糖的伯胺基团与环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐生成的具有合适的pH缓冲能力，内涵体逃逸能力，促进核酸从内含体中释放的仲胺基团和利于释放后的核酸在胞内解离的短烷基链以及季铵基团临近处的可屏蔽表面有害正电荷的羟基对提高转染效率的提高至关重要。
测试例2蛋白质胞内递送效率对比
检测方法：利用具有自荧光性的增强绿色荧光蛋白质(EGFP)作为本研究的模型蛋白质来评价实施例和对比例得到的递送载体在Hela细胞系中的蛋白质胞内递送效率。具体步骤如下：按照w/w比将递送载体材料溶液分别与EGFP溶液混合，振荡后室温静置30分钟，备用。在含有0.5mL 10％胎牛血清培养液的24孔板中接种5×104个细胞。在37℃，5％CO2条件下孵育24小时后细胞增殖至60％-70％的区域，移除培养液，加入0.5mL含材料/EGFP复合物的(每孔含1.0μg EGFP)新鲜培养液。孵育4小时后移除含有蛋白质复合物的培养液，用PBS小心洗两遍，吸净残余PBS，收集细胞，使用流式细胞术检测EGFP阳性细胞百分比。EGFP的递送效率通过EGFP阳性细胞百分比来表示。实验测试了w/w比从1至30的不同w/w比的蛋白质递送效率，最佳递送效率如表2中所示。
表2蛋白质递送效率测试
材料 Hela
PS-N<sup>+</sup>-8 88.92％
PS-N<sup>+</sup>-9 87.94％
PS-N<sup>+</sup>-15 89.54％
Pu-N<sup>+</sup>-2 28.45％
HPC-N<sup>+</sup>-3 27.97％
由表2可以看出：
伯胺多糖接枝环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐得到的递送载体PS-N+-8、PS-N+-8(实施例8、9)及在其基础上接枝功能小分子得到的递送载体PS-N+-15(实施例15)可以在HEK 293和Hela细胞中达到较高的蛋白递送效率；由伯胺多糖接枝卤代烷季铵化得到的递送载体Pu-N+-2(对比例2)和不含伯胺的多糖接枝环氧基短烷基链季铵盐得到的递送载体HPC-N+-3(对比例3)在Hela细胞中的蛋白递送效率较低。
分析如下：由伯胺多糖接枝环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐得到的递送载体(实施例8、9、15)通过季铵盐的正电性可以与蛋白质上的负电性位点相结合，同时接枝的功能分子可以进一步增加与蛋白质的相互作用，提高蛋白质的细胞摄取，通过伯胺与环氧基团开环得到的仲胺提高其pH缓冲能力，促进蛋白质的内含体释放得到较高的蛋白质胞内递送效率。由伯胺多糖直接与卤代烷季铵化得到的递送载体(对比例2)由于生成仲胺基团数量很少，pH缓冲能力和对应的内涵体逃逸能力较弱，由不含伯胺的多糖直接接季铵盐得到的递送载体(对比例3)无法与环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐生成仲胺基团，不具备pH缓冲能力和对应的内涵体逃逸能力，使得其蛋白质胞内递送效率低于伯胺多糖接枝环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐得到的递送载体。
由此说明，伯胺多糖上的伯胺基团与环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐生成的仲胺基团对蛋白质胞内递送至关重要。
测试例3细胞毒性对比
检测方法：通过MTT(噻唑蓝)法评价了各实验例、对比例得到的递送载体在Hela细胞系中的毒性。具体步骤如下：在含有100μL10％胎牛血淸培养液的96孔板中接种2×104个细胞，37℃，5％CO2条件下孵育24小时；细胞增殖至覆盖培养板60％-70％的区域后，用移液器移除培养液，加入含不同w/w比的递送载体/pDNA复合物的100μL新鲜培养液(每孔含0.33μg pDNA)；培养4小时后，更换为100μL新鲜培养液继续培养20小时，之后吸出培养液，用100μL PBS小心洗两遍，加入含MTT的无血清培养液(MTT浓度为0.5mg/mL)，在培养箱中染色4小时后移除培养液，用100μL PBS小心洗两遍。活细胞中的线粒体会将MTT还原成不溶于水的蓝紫色晶体甲臢。加入100μL DMSO溶解甲臢。用酶标仪测定490nm波长处的光吸收值，根据测得的吸光值来判断活细胞相对数量，表征细胞活性。待测孔的吸光度减去空白对照(细胞全死)孔的吸光度，作为测试孔的吸光度A测；正常对照(培养液未加聚合物)孔减去空白对照(细胞全死)孔的吸光度，作为对照孔的吸光度A对照；两者的比值A测/A对照为测试孔相对存活率的数值，百分数表示，测试孔和对照孔均以六个平行孔的平均值计算。实验测试了w/w比从1至30的不同w/w比的细胞毒性，最高转染效率对应w/w比的细胞毒性如表3中所示：
表3细胞毒性测试
Figure BDA0002539480470000151
Figure BDA0002539480470000161
由表3可以看出：
多糖接枝环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐得到的递送载体PS-N+-1、PS-N+-4、PS-N+-7、PS-N+-8、PS-N+-10、PS-N+-13、PS-N+-14、PS-N+-15、HPC-N+-3、的细胞毒性均低于PEI和PGEA，而多糖接枝环氧基长烷基链季铵盐得到的递送载体(Pu-N+-1)和多糖接枝卤代烷季铵盐得到的递送载体(Pu-N+-2)具有较高的细胞毒性。
分析如下：多糖接枝环氧基长烷基链季铵盐得到的递送载体中长烷基链季铵盐的疏水作用较强，对细胞膜的伤害较大，多糖接枝卤代烷季铵盐得到的递送载体季铵基团临近处没有亲水性基团羟基，无法屏蔽表面有害正电荷，毒性较大，均具有较高的细胞毒性。
由此可见，与环氧基团开环反应生成的亲水性羟基，同时结合具有生物相容性较好的短烷基链季铵盐对降低递送载体的细胞毒性，提高其生物相容性具有重要意义。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种多糖季铵盐在制备递送核酸和蛋白质药物的载体材料上的应用，其特征在于，所述的多糖季铵盐可以用于递送核酸和蛋白质，其制备步骤为：
1)配制伯胺多糖的水溶液；所述的伯胺多糖平均分子量为4000～30000；
2)加入短烷基碳原子数为X的环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐进行反应进行反应，反应温度为25～90℃，反应时间为6～72小时，所述的X＝1～5；
3)沉淀、洗涤、干燥，得到仲胺型-多糖季铵盐；
步骤2)所述的环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐与步骤1)所述的伯胺多糖投料质量比为0.1～3:1；
步骤1)所述的伯胺多糖为自身带伯胺的甲壳素、壳聚糖或壳聚糖酸盐，所述的壳聚糖酸盐为壳聚糖盐酸盐、壳聚糖醋酸盐、壳聚糖乳酸盐或壳聚糖柠檬酸盐，所述的水溶液为纯水溶液或纯水与盐酸、醋酸、乳酸、柠檬酸中一种酸的混合溶液；
步骤1)所述的伯胺多糖为自身不带伯胺的多糖经伯胺小分子偶联反应后得到的伯胺多糖；所述的自身不带伯胺的多糖为葡聚糖、环糊精、普鲁兰、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基淀粉、直链淀粉或支链淀粉。
2.根据权利要求1所述的一种多糖季铵盐在制备递送核酸和蛋白质药物的载体材料上的应用，其特征在于，步骤1)所述的伯胺多糖制备方法为：将自身不带伯胺的多糖溶于溶剂，加入可激活多糖上的羟基的催化剂和伯胺基试剂，在25～70℃下反应5～72小时，去离子水透析，冷冻干燥后得到伯胺多糖，所述催化剂与多糖上的单糖单元的质量比为0.05～3:1，所述伯胺基试剂与催化剂的质量比为0.2～30:1。
3.根据权利要求1所述的一种多糖季铵盐在制备递送核酸和蛋白质药物的载体材料上的应用，其特征在于，步骤1)所述的伯胺多糖平均分子量为7000～25000。
4.根据权利要求2所述的一种多糖季铵盐在制备递送核酸和蛋白质药物的载体材料上的应用，其特征在于，所述的溶剂为水、二甲基亚砜、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺的一种或多种混合溶剂；所述催化剂根据溶剂选择，水对应催化剂氢氧化钠，二甲基亚砜对应催化剂N,N-羰基二咪唑，二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺对应催化剂为对硝基氯甲酸苯酯；所述的伯胺基试剂为2-氯乙胺盐酸盐、3-氯丙胺盐酸盐、4-氯丁胺盐酸盐、乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、二亚乙基三胺，2,2'-二氨基-N-甲基二乙胺中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种多糖季铵盐在制备递送核酸和蛋白质药物的载体材料上的应用，其特征在于，步骤2)所述的环氧基短烷基链季铵盐或氯羟丙基短烷基季铵盐和步骤1)所述的伯胺多糖的投料质量比为0.2～1.5:1。
6.根据权利要求1所述的一种多糖季铵盐在制备递送核酸和蛋白质药物的载体材料上的应用，其特征在于，步骤2)所述的环氧基短烷基链季铵盐为2,3-环氧丙基三甲基氯化铵或由环氧氯丙烷和N,N-二甲基X胺的反应得到的产物，所述的氯羟丙基短烷基季铵盐为3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵或由环氧氯丙烷和N,N-二甲基X胺在盐酸存在下的反应产物，所述的X为乙、丙、丁或戊。
7.根据权利要求1所述的一种多糖季铵盐在制备递送核酸和蛋白质药物的载体材料上的应用，其特征在于，步骤3)之后将仲胺型-多糖季铵盐与核酸递送增强分子进行接枝反应，所述的核酸递送增强分子为精氨酸、组氨酸、咪唑、苯硼酸、叶酸、胆酸、胆固醇酸的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的一种多糖季铵盐在制备递送核酸和蛋白质药物的载体材料上的应用，其特征在于，将所述材料与所述核酸和蛋白质按照质量比0.5～100组成复合体，进行递送；所述的核酸为包括质粒DNA、微环DNA、基因组DNA、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)在内的脱氧核糖核酸或核糖核酸；所述的蛋白质为包括牛血清白蛋白、溶菌酶、绿色荧光蛋白、p53抑瘤蛋白、碱性磷酸酶、胞嘧啶脱氨酶、核酸酶、胸苷激酶、紫外光响应蛋白、红外光响应蛋白、核糖核蛋白水溶液中呈负电性蛋白质。
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