CN113278094B - 一种环糊精衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种环糊精衍生物及其制备方法和应用，属于抗菌材料技术领域。本发明提供了一种环糊精衍生物，将细菌靶向分子苯硼酸接枝于环糊精，作为靶向分子，环糊精的疏水内腔可与各种抗菌分子或材料结合，形成具有靶向抗菌性能的功能分子或材料，以提高其抗菌效率；苯硼酸和正电荷的季铵盐具有双重靶向细菌的作用，可以进一步提高抗菌效率。

Description

一种环糊精衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗菌材料技术领域，尤其涉及一种环糊精衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，细菌感染作为世界上最严重的健康问题之一，由于其高发病率和高死亡率，引起了人们的广泛关注。传统的治疗细菌感染的策略是使用抗生素，但过度使用导致了多药耐药性细菌的出现。尽管许多新型抗生素在持续发展，但它们的发展速度远远低于耐药性细菌的不断涌现。更糟糕的是，细菌会粘附在生命体(如外科创面、鼻腔、泌尿道黏膜、肺组织或心内膜)和非生命体(如医疗设备：骨科内置物、内镜表面以及牙科陶瓷等)表面，进而繁殖、分化，并分泌一些多糖基质并将菌体群落包裹其中，最终形成生物膜。尤其是形成的生物膜不仅可以抵抗宿主的免疫抑制，而且可以抑制抗生素的渗透以增强细菌的耐药性，从而引起临床上持续性的慢性感染等各种问题，这也是导致细菌性疾病难以根治的主要原因。

硼酸(BA)是一个硼中心通过碳硼键连接3个羟基的化合物，因其与糖中顺式二醇共价结合具有较高的灵敏度，所以被广泛应用于生物化学传感器的开发和靶向抗肿瘤。由于苯硼酸可与革兰氏阴性菌细胞壁表面的脂多糖(富含顺式二醇分子)，或与革兰氏阳性菌细胞壁表面的脂磷壁酸(富含核糖醇或甘油残基)特异结合，硼酸基功能材料已被证明具有优良的识别和靶向细菌性能。虽然苯硼酸可靶向识别特异细菌，但苯硼酸并非能十分简易地修饰于所有种类的抗菌分子或材料中，且其靶向基团单一，难以真正用于靶向抗菌药物的设计中。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种环糊精衍生物及其制备方法和应用。本发明提供的环糊精衍生物可与大多数抗菌药物分子或材料结合，用以提高其抗菌效率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种环糊精衍生物，具有式I所示的结构：

其中：

当m＝1时，n＝5、6或7；

当n＝0时，m＝6、7或8；

a为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；

X为Cl、Br或I；

R₁或R₂独立地为C1-C18的烷基，所述C1-C18的烷基的直链上含有取代基，所述取代基的数量独立地为0～6，所述取代基独立地为-CH₃或-OH。

优选地，所述环糊精衍生物具有式II所示的结构：

优选地，所述环糊精衍生物具有式III所示的结构：

本发明还提供了上述所述的环糊精衍生物的制备方法，当m＝1时，n＝5、6或7时，所述制备方法包括以下步骤：

将环糊精和对甲苯磺酰氯在无机碱性环境中混合进行酯化反应，得到具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精；

将所述具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精、碘化钾和具有式V所示结构的N,N-二取代胺混合进行第一亲核取代反应，得到具有式VI所示结构的单取代二烷基胺环糊精衍生物；

其中，式V和式VI中R₁或R₂独立地为C1-C18的烷基，所述C1-C18的烷基的直链上含有取代基，所述取代基的数量独立地为0～6，所述取代基独立地为-CH₃或-OH；

将所述具有式VI所示结构的单取代二烷基胺环糊精衍生物、具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸和有机溶剂混合进行第二亲核取代反应，得到所述环糊精衍生物；

其中，式VII中a为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；

当n＝0时，m＝6、7或8时，所述制备方法包括以下步骤：

将三苯基膦、有机溶剂、卤素单质和环糊精混合，进行卤代反应，得到具有式VIII所示结构的卤代环糊精；

式VIII中R₃为卤素；

将所述具有式VIII所示结构的卤代环糊精取代的环糊精、具有式V所示结构的N,N-二取代胺和有机溶剂混合，进行第三亲核取代反应，得到具有式IX所示结构的胺基取代环糊精；

将所述具有式IX所示结构的胺基取代环糊精、具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸和有机溶剂混合，进行第四亲核取代反应，得到所述环糊精衍生物。

优选地，所述酯化反应的温度为0～5℃，时间为5～10h。

优选地，所述具有式V所示结构的N,N-二取代胺为二甲胺、二乙胺、二正丙胺、二异丙胺、二正丁胺、二异丁胺、二仲丁胺、二正己胺、二正辛胺、二异辛胺、二癸胺、二乙醇胺、二异丙醇胺、N-甲基乙胺、N-甲基丙胺、N-甲基丁胺、N-乙基丙胺或N-乙基正丁胺。

优选地，所述具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸为3-(溴甲基)苯硼酸、4-(溴甲基)苯硼酸、3-(氯甲基)苯硼酸或4-(氯甲基)苯硼酸。

优选地，所述卤代反应的温度为20～100℃，时间为1～50h。

优选地，所述第一亲核取代反应、第二亲核取代反应、第三亲核取代反应和第四亲核取代反应的温度独立地为20～100℃，时间独立地为7～48h。

本发明还提供了上述技术方案所述的环糊精衍生物或上述技术方案所述制备方法制得的环糊精衍生物在制备抗菌药物中的应用。

本发明提供了一种环糊精衍生物，将细菌靶向分子苯硼酸接枝于环糊精，作为靶向分子，环糊精的疏水内腔可与各种抗菌分子或材料结合，形成具有靶向抗菌性能的功能分子或材料，以提高其抗菌效率；苯硼酸和正电荷的季铵盐具有双重靶向细菌的作用，可以进一步提高抗菌效率。

本发明还提供了上述技术方案所述环糊精衍生物的制备方法，本发明提供的制备方法原料来源广泛，操作步骤简单，适于工业化应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的环糊精衍生物或上述技术方案所述制备方法制得的环糊精衍生物在制备抗菌药物中的应用，将本发明提供的环糊精衍生物为靶向分子进行NO抗菌和纳米银研究，可知，本发明提供的环糊精衍生物具有优异的细菌靶向性能，极大地提高了抗菌药物的抗菌性能。

附图说明

图1为为β-CD-OTs的质谱谱图；

图2为β-CD-OTs的核磁谱图；

图3为β-CD-(dma)₁的质谱谱图；

图4为β-CD-(dma)₁的核磁谱图；

图5为β-CD-QAS-B₁的质谱谱图；

图6为β-CD-QAS-B₁的核磁谱图；

图7为β-CD-(I)₇核磁谱图；

图8为β-CD-(dma)₇的核磁谱图；

图9为β-CD-(dma)₇的质谱谱图；

图10为β-CD-QAS-B₇的核磁谱图；

图11为超分子组装及靶向抗菌机理示意图；

图12为Ad-MH的质谱谱图；

图13为Ad-MH的核磁谱图

图14为Ad-MH-Br的核磁谱图；

图15为从右往左NO浓度随时间延长而增加，与Griess反应显色实物图；

图16为B₁-QAS@MH-NO和B₇-QAS@MH-NO的TEM谱图，其中(a)为B₁-QAS@MH-NO的TEM谱图，(b)为B₇-QAS@MH-NO的TEM谱图；

图17为细菌与不同材料作用后在固体琼脂平板上存活菌落生长情况，其中(a)为PBS，(b)为Ad-MH-NO，(c)为B₁-QAS@MH-NO，(d)为B₇-QAS@MH-NO；

图18为细菌与不同材料作用后在固体琼脂平板上存活菌落图，其中(a)为β-CD-QAS-B₁，(b)为β-CD-QAS-B₇；

图19为不同材料作用后细菌SEM图像，其中(a)为PBS，(b)为Ad-MH-NO，(c)为B₁-QAS@MH-NO，(d)为B₇-QAS@MH-NO；

图20为AgNP-β-CD、AgNP-β-CD₁、AgNP-β-CD₇三种抗菌材料对大肠杆菌的抗菌率与材料浓度的关系图；

图21为AgNP-β-CD、AgNP-β-CD₁、AgNP-β-CD₇三种抗菌材料对金黄色葡萄球菌的抗菌率与材料浓度的关系图。

具体实施方式

本发明提供了一种环糊精衍生物，具有式I所示的结构：

其中：

当m＝1时，n＝5、6或7；

当n＝0时，m＝6、7或8；

a为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；

X为Cl、Br或I；

R₁或R₂独立地为C1-C18的烷基，所述C1-C18的烷基的直链上含有取代基，所述取代基的数量独立地为0～6，所述取代基独立地为-CH₃或-OH。

在本发明中，所述环糊精衍生物优选具有式II所示的结构：

在本发明中，所述环糊精衍生物优选具有式III所示的结构：

本发明还提供了上述技术方案所述的环糊精衍生物的制备方法，当m＝1时，n＝5、6或7时，所述制备方法包括以下步骤：

将环糊精和对甲苯磺酰氯在无机碱性环境中混合进行酯化反应，得到具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精；

将所述具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精、碘化钾和具有式V所示结构的N,N-二取代胺混合进行第一亲核取代反应，得到具有式VI所示结构的单取代二烷基胺环糊精衍生物；

其中，式V和式VI中R₁或R₂独立地为C1-C18的烷基，所述C1-C18的烷基的直链上含有取代基，所述取代基的数量独立地为0～6，所述取代基独立地为-CH₃或-OH；

将所述具有式VI所示结构的单取代二烷基胺环糊精衍生物、具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸和有机溶剂混合进行第二亲核取代反应，得到所述环糊精衍生物；

其中，式VII中a为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；

当n＝0时，m＝6、7或8时，所述制备方法包括以下步骤：

将三苯基膦、有机溶剂、卤素单质和环糊精混合，进行卤代反应，得到具有式VIII所示结构的卤代环糊精；

式VIII中R₃为卤素；

将所述具有式VIII所示结构的卤代环糊精取代的环糊精、具有式V所示结构的N,N-二取代胺和有机溶剂混合，进行第三亲核取代反应，得到具有式IX所示结构的胺基取代环糊精；

将所述具有式IX所示结构的胺基取代环糊精、具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸和有机溶剂混合，进行第四亲核取代反应，得到所述环糊精衍生物。

以m＝1，n＝6为例，所述制备方法的原理优选如式1所示：

式1中曲线表示环糊精上取代的苯硼酸结构。

以n＝0，m＝7为例，所述制备方法的原理优选如式2所示：

式2中曲线表示环糊精上取代的苯硼酸结构。

在本发明中，若无特殊说明，使用的原料均为本领域市售商品。

本发明将环糊精和对甲苯磺酰氯在无机碱性环境中混合进行酯化反应，得到具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精。

在本发明中，所述环糊精优选为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。

在本发明中，所述无机碱性环境优选为NaOH水溶液，每120mLNaOH水溶液中优选含有NaOH 3.6g。

在本发明中，所述NaOH与环糊精的摩尔比优选为0.09：5.3。

在本发明中，所述环糊精与对甲苯磺酰氯的摩尔比优选为5.3：6.3。

在本发明中，所述酯化反应的温度优选为0～5℃，时间优选为5～10h。

本发明优选将环糊精加入到NaOH水溶液中溶解，再加入对甲苯磺酰氯。

在本发明中，所述酯化反应优选在冰浴搅拌条件下进行。

所述酯化反应完成后，本发明优选将所得酯化反应产物依次进行过滤、调节pH值和抽滤。

本发明对所述过滤的具体方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可，所述过滤的作用是除去不溶物。

在本发明中，所述调节pH值使用的调节剂优选为质量分数为30％的盐酸溶液，本发明对所述调节剂的用量没有特殊的限定，能够将pH值调节至7即可。

在本发明中，所述抽滤得到具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精粗产品，所述具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精粗产品优选于80℃热水中重结晶2次，得到所述具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精(CD-OTs)。

得到所述具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精后，本发明将所述具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精、碘化钾(KI)和具有式V所示结构的N,N-二取代胺混合进行第一亲核取代反应，得到具有式VI所示结构的单取代二烷基胺环糊精衍生物。

在本发明中，所述具有式V所示结构的N,N-二取代胺优选为二甲胺、二乙胺、二正丙胺、二异丙胺、二正丁胺、二异丁胺、二仲丁胺、二正己胺、二正辛胺、二异辛胺、二癸胺、二乙醇胺、二异丙醇胺、N-甲基乙胺、N-甲基丙胺、N-甲基丁胺、N-乙基丙胺或N-乙基正丁胺。

在本发明中，所述具有式V所示结构的N,N-二取代胺优选以具有式V所示结构的N,N-二取代胺水溶液的形式加入，所述具有式V所示结构的N,N-二取代胺水溶液的质量浓度为40％。

在本发明中，所述具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精、碘化钾和具有式V所示结构的N,N-二取代胺水溶液用量比优选为0.2mmol：0.016g：2mL。

本发明优选将所述具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精、碘化钾和具有式V所示结构的N,N-二取代胺共同溶解到单颈烧瓶中进行所述第一亲核取代反应。

在本发明中，所述第一亲核取代反应的温度优选为70℃，时间优选为7～48h，更优选为7h。

在本发明中，所述第一亲核取代反应优选在磁力搅拌回流的条件下进行。

在本发明中，所述第一亲核取代反应后优选自然冷却至室温，继续搅拌过夜。

所述第一亲核取代反应后，本发明优选将所得第一亲核取代反应混合物滴加到无水乙醇中得到沉淀，然后用无水乙醇洗涤所述沉淀，再进行真空干燥，得到所述具有式VI所示结构的单取代二烷基胺环糊精衍生物。

在本发明中，所述洗涤的次数优选为3次。

在本发明中，所述真空干燥的温度优选为40℃，本发明对所述真空干燥的时间没有特殊的限定，能够保证完全除去无水乙醇即可。

得到具有式VI所示结构的单取代二烷基胺环糊精衍生物，本发明将所述具有式VI所示结构的单取代二烷基胺环糊精衍生物、具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸和有机溶剂混合进行第二亲核取代反应，得到所述环糊精衍生物。

在本发明中，所述具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸优选为3-(溴甲基)苯硼酸、4-(溴甲基)苯硼酸、3-(氯甲基)苯硼酸或4-(氯甲基)苯硼酸。

在本发明中，所述具有式VI所示结构的单取代二烷基胺环糊精衍生物与具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸的当量比优选为1:1.5。

在本发明中，所述有机溶剂优选为DMSO。

在本发明中，所述具有式VI所示结构的单取代二烷基胺环糊精衍生物与DMSO的用量比优选为0.0125mmol：5mL。

在本发明中，所述第二亲核取代反应优选在氮气气氛中进行。

在本发明中，所述第二亲核取代反应的温度优选为20～100℃，更优选为室温，时间优选为7～48h，更优选为24h。

所述第二亲核取代反应完成后，本发明优选将所得第二亲核取代反应产物沉淀于过量丙酮中，然后用乙醚洗涤沉淀物3次，真空干燥得到所述环糊精衍生物。

在本发明中，当n＝0时，m＝6、7或8时，所述制备方法包括以下步骤：

将三苯基膦、有机溶剂、卤素单质和环糊精混合，进行卤代反应，得到具有式VIII所示结构的卤代环糊精；

式VIII中R₃为卤素；

将所述具有式VIII所示结构的卤代环糊精取代的环糊精、具有式V所示结构的N,N-二取代胺和有机溶剂混合，进行第三亲核取代反应，得到具有式IX所示结构的胺基取代环糊精；

将所述具有式IX所示结构的胺基取代环糊精、具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸和有机溶剂混合，进行第四亲核取代反应，得到所述环糊精衍生物。

本发明将三苯基膦、有机溶剂、卤素单质和环糊精混合，进行卤代反应，得到具有式VIII所示结构的卤代环糊精。

在本发明中，所述卤代反应的温度优选为20～100℃，更优选为70℃，时间优选为1～50h，更优选为18h。

在本发明中，所述有机溶剂优选为DMF。

在本发明中，所述三苯基膦、卤素单质和环糊精的用量比优选为153mmol：160mmol：11.5g。

在本发明中，所述三苯基膦与有机溶剂的用量比优选为153mmol：160mL。

本发明优选将三苯基膦溶于DMF中，然后在冰浴冷却下加入卤素单质，再将环糊精加入反应液中。

在本发明中，所述环糊精优选经真空干燥后再使用，所述真空干燥的温度优选为100℃，本发明对所述真空干燥的时间没有特殊的限定，能够保证完全除去水分即可。

所述卤代反应后，本发明优选将所得卤代反应产物减压旋蒸，在搅拌下加入甲醇钠溶液，再加入到甲醇溶液中沉淀出产物，离心过滤后用无水甲醇在索氏提取装置中回流提纯，最后真空干燥得到所述具有式VIII所示结构的卤代环糊精(β-CD-(I)m)。

本发明对所述减压旋蒸的压力和温度没有特殊的限定，能够完全除去DMF即可。

在本发明中，所述甲醇钠溶液的浓度优选为3M，所述甲醇钠溶液的作用是中和反应过程产生的酸。

本发明对真空干燥的具体参数没有特殊的限定，能够完全除去甲醇即可。

得到具有式VIII所示结构的卤代环糊精取代的环糊精后，本发明将所述具有式VIII所示结构的卤代环糊精取代的环糊精、具有式V所示结构的N,N-二取代胺和有机溶剂混合，进行第三亲核取代反应，得到具有式IX所示结构的胺基取代环糊精。

在本发明中，所述具有式V所示结构的N,N-二取代胺优选与上述方案一致，在此不再赘述。

在本发明中，所述具有式V所示结构的N,N-二取代胺优选以具有式V所示结构的N,N-二取代胺水溶液的形式加入，所述具有式V所示结构的N,N-二取代胺水溶液的质量浓度为40％。

在本发明中，所述有机溶剂优选为DMSO。

在本发明中，所述具有式VIII所示结构的卤代环糊精取代的环糊精与具有式V所示结构的N,N-二取代胺水溶液的用量比优选为0.6g：12mL。

在本发明中，所述具有式VIII所示结构的卤代环糊精取代的环糊精与有机溶剂的用量比优选为0.6g：8mL。

在本发明中，所述第三亲核取代反应的温度优选为20～100℃，更优选为70℃，时间优选为7～48h，更优选为48h。

所述第三亲核取代反应完成后，本发明优选将所得第三亲核取代反应产物旋蒸除去未反应完的具有式V所示结构的N,N-二取代胺，再用乙醇沉淀，并用乙醇洗涤沉淀2次，真空干燥得到所述具有式IX所示结构的胺基取代环糊精。

本发明对所述旋蒸的具体参数没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。

得到具有式IX所示结构的胺基取代环糊精后，本发明将所述具有式IX所示结构的胺基取代环糊精、具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸和有机溶剂混合，进行第四亲核取代反应，得到所述环糊精衍生物。

在本发明中，所述具有式IX所示结构的胺基取代环糊精和具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸的质量比优选为0.206g：2.5g。

在本发明中，所述有机溶剂优选为DMSO。

在本发明中，所述具有式IX所示结构的胺基取代环糊精和有机溶剂的用量比优选为0.206g：15mL。

在本发明中，所述第四亲核取代反应的温度优选为20～100℃，更优选为室温，时间优选为7～48h，更优选为24h。

在本发明中，所述第四亲核取代反应优选在氮气中进行。

所述第四亲核取代反应完成后，本发明优选将所得第四亲核取代反应产物用丙酮沉淀出粗产品，再用无水乙醚洗涤3次所述粗产品，再真空干燥，得到所述环糊精衍生物。

本发明还提供了上述技术方案所述的环糊精衍生物或上述技术方案所述制备方法制得的环糊精衍生物在制备抗菌药物中的应用。

在本发明中，所述应用时，所述环糊精衍生物优选作为靶向分子进行NO抗菌研究活纳米银抗菌研究。

为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的环糊精衍生物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

当m＝1，n＝6时，所述具有式II所示的结构的环糊精衍生物的制备方法：

(1)β-CD-OTs的合成

向250mL单颈的圆底烧瓶中加入120ml NaOH水溶液(3.6g，0.09mol)和β-环糊精(β-CD，6g，5.3mmol)，搅拌溶解后再冷却至5℃，然后加入对甲苯磺酰氯(1.2g，6.3mmol)，冰浴下搅拌反应5h，过滤除去不溶物，质量浓度为30％盐酸调节滤液pH＝7，有大量白色沉淀析出，混合液放冰箱冷藏过夜后抽滤得到白色固体粗产品，最后粗产品于80℃热水中重结晶2次得到纯净的环糊精6位上-单取代对甲苯磺酰基环糊精(β-CD-OTs)产品。MS：1311.11[M+Na]⁺。¹H NMR(400HMz,ppm,DMSO-d₆)：δ7.76(d,2H,-ArH-),7.44(d,2H,-ArH-),5.70(s,14H),4.86-4.77(m,7H),4.56-4.18(m,6H),3.72-3.20(m,44H,与水峰重叠),2.44(s,3H,-ArCH₃-)。

图1为β-CD-OTs的质谱谱图，图2为β-CD-OTs的核磁谱图。

(2)β-CD-(dma)₁的合成

β-CD-OTs(0.25g，0.2mmol)、0.016g碘化钾(KI)和2mL 40％(质量浓度)的二甲胺水溶液共同溶解到50mL的单颈烧瓶中，在70℃下磁力搅拌回流反应7h后冷却至室温继续搅拌过夜。反应结束后，该反应混合物滴加到10ml无水乙醇中产生沉淀，并用无水乙醇洗涤3次后于40℃真空干燥箱中烘干，最终得到产物为白色固体粉末。MS:1162.33,[M+H]⁺。¹H NMR(400HMz,ppm,DMSO-d₆):δ4.87-4.79(m,7H),3.70-3.21(m,44H,与水峰重叠),2.15(s,6H,-N(CH₃)₂-)。

图3为β-CD-(dma)₁的质谱谱图，图4为β-CD-(dma)₁的核磁谱图。

(3)β-CD-QAS-B1的合成

上述得到的β-CD-(dma)₁(0.0146g，0.0125mmol)和1.5eq的溴甲基苯硼酸共同溶解于5mL无水DMSO中，在氮气保护下室温反应24h后，沉淀于过量丙酮中，然后用乙醚洗涤沉淀物3次，真空干燥得到环糊精6位上带有1个苯硼酸功能基团的白色粉末固体。MS:1296.15[M]⁺。¹H NMR(400HMz,ppm,D₂O):δ7.88(d,2H,-ArH-),7.53(d,2H,-ArH-),5.06-4.90(m,7H),4.59(s,2H,-ArCH₂-),3.98-3.37(m,44H),3.12and 3.05(2×s,6H,-NCH₃-)。

图5为β-CD-QAS-B₁的质谱谱图，图6为β-CD-QAS-B₁的核磁谱图。

实施例2

当m＝7，n＝0时，所述具有式II所示的结构的环糊精衍生物的制备方法：

(1)β-CD-(I)₇的合成

将三苯基膦(PPh₃，40g，153mmol)溶于160mL干燥DMF溶剂中，然后在冰浴冷却下加入碘单质(40.5g，160mmol)，碘单质添加完毕后，再将提前在100℃下真空干燥过的β-CD(11.5g)加入反应液中，在氮气保护下升温至70℃搅拌反应18h后，停止加热。减压旋蒸除去大量的DMF溶剂(约100mL)，在搅拌下加入60mL的3M甲醇钠溶液，溶液由黑棕色变为亮黄色悬浊液，再加入到甲醇溶液中沉淀出产物，离心过滤后用无水甲醇在索氏提取装置中回流提纯，最后真空干燥得到环糊精6位上7取代的碘代环糊精(β-CD-(I)₇)白色固体粉末。¹HNMR(400HMz,ppm,DMSO-d₆):δ6.02-5.67(m,7H),4.97-4.87(m,7H),3.80-3.15(m,42H)。

图7为β-CD-(I)₇核磁谱图。

(2)β-CD-(dma)₇的合成

称取所制备的0.6gβ-CD-(I)₇加入到装有8mL DMSO的圆底烧瓶中搅拌溶解，再注入12mL的质量浓度为40％二甲胺水溶液，升温至70℃后回流搅拌反应48h，旋蒸除去未反应完的二甲胺水溶液后，用乙醇沉淀，并用乙醇洗涤沉淀2次，真空干燥得到环糊精6位上带有7个二甲胺取代的白色固体粉末(β-CD-(dma)₇)。MS:1324.44[M+H]⁺。¹H NMR(400HMz,ppm,DMSO-d₆):δ5.86-5.78(m,14H),4.86(s,7H),3.69-3.17(m,28H),2.77-2.67(m,7H),2.37(d,7H),2.14(s,42H,-N(CH₃)₂-)。

图8为β-CD-(dma)₇的核磁谱图，图9为β-CD-(dma)₇的质谱谱图。

(3)β-CD-QAS-B₇的合成

0.206g的β-CD-(dma)₇和2.5g溴甲基苯硼酸加入到50mL单颈圆底烧瓶，抽换氮气3次后注入15mL干燥DMSO溶剂，在氮气保护下室温搅拌反应24h。丙酮沉淀出粗产品，再用无水乙醚洗涤3次，真空干燥后得到环糊精6位上带有7个苯硼酸功能基团的白色粉末固体。¹HNMR(400HMz,ppm,D₂O):δ7.75-7.10(m,28H,-ArH-),4.57and 4.53(2×s,14H,-ArCH₂-),3.78-3.25(m,42H),3.25-2.70(m,42H,-N(CH₃)₂-)。

图10为β-CD-QAS-B₇的核磁谱图。

应用例1

以环糊精衍生物为靶向分子的NO抗菌研究

图11为超分子组装及靶向抗菌机理示意图。

NO供体Ad-MH-NO的合成路线式3所示：

式3中圆球是表示金刚烷。

(1)麦芽七糖(MH)的合成

称取50gβ-CD倒入500mL单口烧瓶中，加入200mL的0.01M盐酸水溶液，接通冷凝回流装置，搅拌加热至回流后，在回流状态下继续搅拌分解5h，然后用0.1MNaOH调节反应液pH为7，冷却至室温并放入冰箱冷藏过夜，有大量未被分解的环糊精固体析出，抽滤得到澄清滤液，向滤液中加入0.35mL二甲苯溶液后于60℃下搅拌4h，有白色二甲苯与环糊精复合物析出，冷却至室温继续冰箱冷藏过夜，适量硅藻土加入上述混合液中搅拌0.5h后静置2h，抽滤除去不溶物后，滤液浓缩至原来体积的1/10后再加入0.2mL二甲苯溶液，后续处理步骤与上述相同。最后将滤液浓缩至10mL后，将其逐滴加入到大量搅拌中的乙醇溶液中，离心过滤得到白色麦芽七糖(MH)沉淀，于40℃真空干燥。MS:1175[M+Na]⁺。¹H NMR(400HMz,ppm,D₂O):δ5.35-5.34(m,6H),5.17-5.16(m,1H),3.77-3.19(m,42H,与水峰重叠)。

(2)金刚烷端基修饰麦芽七糖(Ad-MH)的合成

向25mL圆底烧瓶中加入0.81g 1-金刚烷胺盐酸盐(Ad)，加入5mL甲醇超声溶解，再加入2mL三乙胺搅拌中和盐酸后，称取0.05g MH加入，于室温下磁力搅拌反应3天。用30mL二氯甲烷沉淀，并用二氯甲烷：甲醇(体积比1:3)洗涤2次后，立即加入到含有0.5mL乙酸酐和5mL甲醇的混合溶液中，于室温下继续搅拌反应2天，混合溶液由无色变为淡淡玫红色。减压旋蒸除去全部溶剂，加入甲苯：甲醇(体积比1:1)混合溶液共旋蒸除去未反应完的乙酸酐后，真空干燥得到粉红色金刚烷胺接枝麦芽七糖(Ad-MH)的固体粉末。IR:1730cm^-1(NC＝O),2860cm^-1(Ad)。MS:1328.23[M+H]⁺。¹H NMR(400HMz,ppm,D₂O):δ5.40-5.39(m,6H),5.23-5.22(m,1H),4.22-3.24(m,42H,与水峰重叠),2.37-1.78(m,-AdH-,-COCH₃-)。

图12为Ad-MH的质谱谱图，图13为Ad-MH的核磁谱图。

(3)Ad-MH-Br的合成

0.02g Ad-MH、0.03mL吡啶和2.5mL干燥DMF共同加入10mL的单口圆底烧瓶中搅拌溶解，另外0.04mL溴乙酰溴单独溶解到0.5mL干燥DMF中，在冰浴下滴加至Ad-MH混合溶液中，30分钟滴加完毕后，反应混合物在室温氮气保护下反应18h，溶液由浅黄变为深棕，再变为黑绿色。反应结束后，乙醚沉淀，乙醚洗涤2次后真空室温干燥。将干燥后的粗产品再用二次蒸馏水洗涤数次，最后冷冻干燥得到多个含溴支链修饰的麦芽七糖(Ad-MH-Br)白色固体粉末。IR:1740cm-1(BrCH₂C＝O),2860cm-1(Ad)。

图14为Ad-MH-Br的核磁谱图。

(4)Ad-MH-NO的合成

于100mL的单口圆底烧瓶中依次加入0.35g Ad-MH-Br、0.44g AgNO₃和25mL无水乙腈，氮气保护，搅拌溶解形成浅黄色溶液，在70℃下避光回流反应18h后，旋转离心除去AgBr沉淀，留下的澄清黄绿色溶液装入透析袋中(MWCO 2500Da)，在乙腈和水(体积比1:1)的混合溶液中透析24h后，再用蒸馏水透析24h，最后冷冻干燥得到NO供应前体的淡黄绿色粉末固体。

从Ad-MH-NO材料中释放出的NO可以快速转化为亚硝酸盐，然后与Griess试剂中磺胺在酸性下反应生成重氮化合物，再与奈基乙烯基二胺发生耦合反应显色为红色。如图15所示，含多个支链NO的供体材料分散到PBS溶液中，可以缓慢分解NO，随着时间延长，溶液中NO转换为亚硝酸盐浓度更大，则与Griess试剂反应显色程度增加(即从右往左NO浓度随时间延长而增加，与Griess反应显色越深)。NO供体材料溶液与Griess试剂有明显的显色反应，说明成功将NO供应前体的功能基团-ONO₂接枝到MH侧链中。

(5)纳米颗粒B₇-QAS@MH-NO或B₁-QAS@MH-NO的制备

将2mg(β-CD-QAS-B₇或β-CD-QAS-B₁)和其4倍当量的8mg Ad-MH-NO溶解到1mL DMSO中，将混合溶液超声5h后，室温下磁力搅拌12h，使其中环糊精和金刚烷充分接触有效形成络合物。然后用微量注射泵向DMSO混合溶液中以0.5mL/h的速度注射蒸馏水10mL，在搅拌状态下使含亲水/疏水链段的络合物自组装形成超分子胶束。注射结束后继续搅拌12h，将所得到的产物混合溶液装入透析袋中(MWCO 2500Da)，用蒸馏水透析24h，最后冷冻干燥得到最终络合自组装产物。整个络合及组装过程均在避光条件下进行。

为了得到带有靶向和NO供体一体化的抗菌材料，将含双靶向功能基团的主体分子β-CD-QAS-B₇和β-CD-QAS-B₁，分别与NO供体的客体分子Ad-MH-NO在DMSO溶液中通过主-客体作用耦合，随后含亲水和疏水链段的两亲性耦合超分子在水中组装成纳米胶束颗粒。如图16所示，其中(a)为B₁-QAS@MH-NO的TEM谱图，(b)为B₇-QAS@MH-NO的TEM谱图，在环糊精上1个和7个修饰的双靶向功能基团的主体分子均能与NO供体的客体分子耦合自组装成球形的纳米颗粒。通过透射电镜中均匀分散的纳米颗粒图片，可以得出已成功制备了超分子自组装胶束粒子B₁-QAS@MH-NO和B₇-QAS@MH-NO。

由于革兰氏阴性菌细胞膜结构的特殊性，选用大肠杆菌作为试验对象，探究所设计的含季胺正离子和硼酸基团的双靶向NO递送体系的抗菌活性。如图17所示，图17为细菌与不同材料作用后在固体琼脂平板上存活菌落生长情况，其中(a)为PBS，(b)为Ad-MH-NO，(c)为B₁-QAS@MH-NO，(d)为B₇-QAS@MH-NO，可知，大肠杆菌分别与不同材料相互作用一段时间后，在固态LB琼脂培养板上存活菌落的数量各不相同。相比于PBS溶液对照组，Ad-MH-NO虽然没有靶向细菌细胞膜的功能基团，但是持续释放NO也能诱导细菌快速凋亡，因而存活细菌菌落数远远少于PBS对照组中存活菌落数。当细菌与B₁-QAS@MH-NO或B₇-QAS@MH-NO双靶向纳米粒子相互作用后，可以看到平板上存活的细菌菌落数比没有靶向递送NO的体系少得多，而且B₇-QAS@MH-NO作用组的菌落数比B₁-QAS@MH-NO作用组的菌落数减少一半左右。然而只带有靶向基团的环糊精与细菌作用后，仍有大量细菌存活(图18)，图18为细菌与不同材料作用后在固体琼脂平板上存活菌落图，其中(a)为β-CD-QAS-B₁，(b)为β-CD-QAS-B₇，抗菌实验结果表明，在NO含量相同情况下，含有季胺正离子和苯硼酸的双靶向功能基团能够明显增强NO递送纳米平台的抗菌活性，并与靶向基团数量成正比。图19为不同材料作用后细菌SEM图像，其中(a)为PBS，(b)为Ad-MH-NO，(c)为B₁-QAS@MH-NO，(d)为B₇-QAS@MH-NO，箭头表示细菌细胞膜被损伤，从图19可知，与PBS缓冲溶液的对照组相比，未组装Ad-MH-NO的NO供体分子与细菌作用后，细菌细胞膜完整性几乎看不出异样，而与带有靶向功能基团的NO递送纳米颗粒作用后的细菌细胞膜完整性被严重破坏，说明利用靶向细菌细胞膜策略提高NO对细菌的损伤程度，用以提高NO的抗菌活性。

应用例2

以环糊精衍生物为靶向分子的纳米银抗菌研究

(1)以环糊精衍生物为靶向分子的纳米银的制备

将3mL葡萄糖水溶液(0.013mol L^-1)、3mL NaOH水溶液(0.01mol L^-1)和6mLβ-CD水溶液(0.015mol L^-1)等速混合并加热。当溶液温度达到60℃时，以1滴/秒的速度加入2mLAgNO₃水溶液(0.01mol L^-1)。然后将反应混合物在60℃的水浴中加热3小时，使得银纳米颗粒形成。再将产物放在离心机中以12000r/min的转速离心10分钟，并用蒸馏水洗涤两次，得AgNP-β-CD。其他条件不变，将β-CD水溶液(0.015mol L^-1)换成β-CD-QAS-B₁水溶液(0.0015mol L-1)和β-CD-QAS-B₇水溶液(0.00075mol L^-1)再做两组，得AgNP-β-CD₁和AgNP-β-CD₇。

(2)抗菌实验

向96孔板中加入终浓度为1、2、5、10、15、20μg/mL的大肠杆菌菌液与抗菌材料混合物，抗菌材料分别为AgNP-β-CD、AgNP-β-CD₁、AgNP-β-CD₇，共做三组。更换菌群，将大肠杆菌换成金黄色葡萄球菌，再做三组。然后将孔板放入摇床中在30℃，220rpm的转速下摇晃24h，用多功能酶标仪测其吸光度。向96孔板中加入10μL的PBS缓冲液和90μL的培养基作为空白组；再取10μL的PBS缓冲液和90μL的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌菌液作为对照组。

图20为AgNP-β-CD、AgNP-β-CD₁、AgNP-β-CD₇三种抗菌材料对大肠杆菌的抗菌率与材料浓度的关系图，由图20可知，伴随着材料浓度的升高，Ag-B₇(AgNP-β-CD₇)材料的抗菌率逐步降低，这是由于Ag-B₇材料在溶液中易发生聚沉的现象，这会导致抗菌效率的降低。但可看出Ag-B₇由于具有7个苯硼酸取代基，整体抗菌率高于其它两种材料，进一步说明苯硼酸靶向性的实际意义。而Ag-B₁(AgNP-β-CD₁)材料针对大肠杆菌的抗菌能力差别不大可能是由于Ag-B₁材料的识别细菌能力不足所导致。

图21为AgNP-β-CD、AgNP-β-CD₁、AgNP-β-CD₇三种抗菌材料对金黄色葡萄球菌的抗菌率与材料浓度的关系图，可知，伴随着材料浓度的升高，Ag-B₇材料的抗菌率逐步降低，原因和上述类似，是因为Ag-B₇材料的聚沉现象导致。而Ag-B₁材料的抗菌率随浓度稳步上升，符合基本规律，并且因其聚沉现象不明显，所以当浓度达到某一程度时最终会出现抗菌率大于Ag-B₇的现象出现。由图也可看出，无苯硼酸的Ag-CD材料随着加入浓度的升高，抗菌效果也有所体现，这是由于无靶向功能的纳米银颗粒本身也具有抗菌能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种环糊精衍生物，具有式I所示的结构：

其中：

当m＝1时，n＝5、6或7；

当n＝0时，m＝6、7或8；

a为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；

X为Cl、Br或I；

R₁或R₂独立地为C1-C18的烷基，所述C1-C18的烷基的直链上含有取代基，所述取代基的数量独立地为1～6，所述取代基独立地为-CH₃或-OH；或者所述C1-C18的烷基的直链上不含有取代基。

2.根据权利要求1所述的环糊精衍生物，其特征在于，所述环糊精衍生物具有式II所示的结构：

3.根据权利要求1所述的环糊精衍生物，其特征在于，所述环糊精衍生物具有式III所示的结构：

4.权利要求1～3任一项所述的环糊精衍生物的制备方法，其特征在于，

当m＝1时，n＝5、6或7时，所述制备方法包括以下步骤：

将环糊精和对甲苯磺酰氯在无机碱性环境中混合进行酯化反应，得到具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精；

将所述具有式IV所示结构的对甲苯磺酰基环糊精、碘化钾和具有式V所示结构的N,N-二取代胺混合进行第一亲核取代反应，得到具有式VI所示结构的单取代二烷基胺环糊精衍生物；

其中，式V和式VI中R₁或R₂独立地为C1-C18的烷基，所述C1-C18的烷基的直链上含有取代基，所述取代基的数量独立地为1～6，所述取代基独立地为-CH₃或-OH；或者所述C1-C18的烷基的直链上不含有取代基；

将所述具有式VI所示结构的单取代二烷基胺环糊精衍生物、具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸和有机溶剂混合进行第二亲核取代反应，得到所述环糊精衍生物；

其中，式VII中a为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9；

当n＝0时，m＝6、7或8时，所述制备方法包括以下步骤：

将三苯基膦、有机溶剂、卤素单质和环糊精混合，进行卤代反应，得到具有式VIII所示结构的卤代环糊精；

式VIII中R₃为卤素；

将所述具有式VIII所示结构的卤代环糊精取代的环糊精、具有式V所示结构的N,N-二取代胺和有机溶剂混合，进行第三亲核取代反应，得到具有式IX所示结构的胺基取代环糊精；

将所述具有式IX所示结构的胺基取代环糊精、具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸和有机溶剂混合，进行第四亲核取代反应，得到所述环糊精衍生物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述酯化反应的温度为0～5℃，时间为5～10h。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述具有式V所示结构的N,N-二取代胺为二甲胺、二乙胺、二正丙胺、二异丙胺、二正丁胺、二异丁胺、二仲丁胺、二正己胺、二正辛胺、二异辛胺、二癸胺、二乙醇胺、二异丙醇胺、N-甲基乙胺、N-甲基丙胺、N-甲基丁胺、N-乙基丙胺或N-乙基正丁胺。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述具有式VII所示结构的卤代烷基苯硼酸为3-(溴甲基)苯硼酸、4-(溴甲基)苯硼酸、3-(氯甲基)苯硼酸或4-(氯甲基)苯硼酸。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述卤代反应的温度为20～100℃，时间为1～50h。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一亲核取代反应、第二亲核取代反应、第三亲核取代反应和第四亲核取代反应的温度独立地为20～100℃，时间独立地为7～48h。

10.权利要求1～3任一项所述的环糊精衍生物或权利要求4～9任一项所述制备方法制得的环糊精衍生物在制备抗菌药物中的应用。

Images