CN102234658A - 靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体、制备方法及应用。由高分子季铵盐和脂质成分按质量比为0.05～20∶1制成季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体；可通过组装或修饰的方法进行改性，制备叶酸或EGFR抗体修饰的阳离子高分子脂质基因载体。基因转染实验的结果表明在293T和NIH-3T3细胞中的基因转染效率与阳性对照阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000相当；EGFR抗体修饰的阳离子高分子脂质体在肝癌Huh-7和乳腺癌MCF-7细胞中的转染效率高于Lipofectamine^TM2000。所述的阳离子高分子脂质基因载体系统具有较好的生物相容性，细胞毒性低，可作为优良的非病毒基因给药载体。

Description

靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及改性高分子聚合物构建的药物和基因载体、制备方法及应用，进一步的说是一种靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体、制备方法及应用，属于功能化脂质体的制备及应用技术。

背景技术

基因治疗主要是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段以纠正或补偿基因的缺陷或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的，而基因投递系统则是指将目的基因、基因片断或短链干扰RNA导入靶细胞以达到治疗目的的方式。基因投递系统是恶性肿瘤基因治疗最为关键的瓶颈问题，也是制约恶性肿瘤基因治疗从实验研究到临床应用的核心技术问题。基因投递系统主要依赖于载体系统，而理想的基因载体应具备：(1)靶向特异性，并且可被免疫系统识别；(2)高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化；(3)无毒性，对病人及环境安全无害；(4)有利于基因高效转移和长期表达。而本发明的主要目的是构建一种制备简单、成本低廉、安全性好、转染效率高的非病毒基因载体系统。

目前，在基因载体的设计上，大致可分为两大类：病毒类和非病毒类。病毒载体效率较高，但存在导向性差、携带能力低、免疫原性和潜在致瘤性等缺点。非病毒性载体主要是针对病毒载体的缺点而研制的，并具有低毒性、低免疫原性、低致瘤性、易制备等优点，其主要包括：真核细胞表达质粒载体、阳离子聚合物、阳离子脂质体、聚合物嵌段共聚物和胶束等。

常用的可用于基因转染的阳离子聚合物包括聚赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)、多聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(polyehylenimine，PEI)、天然高分子生物材料壳聚糖、树枝状大分子、及由这些阳性聚合物载体所构建的聚合物胶束系统和聚合物微球(聚乳酸类)；如聚乙二醇(PEG)修饰的PLL(PEG-PLL)、硬脂酰化聚赖氨酸、转铁蛋白修饰的PLL、PEG-PEI、PEG-壳聚糖、PEI-壳聚糖、壳聚糖季铵盐等。这些材料作为转基因的载体有其优越性，然而也或多或少的存在转染效率低、稳定性差、部分材料毒性大、制备工艺复杂等问题；再者微球材料工艺中使用的有机金属催化剂、有机溶剂和稳定剂的残存都可能在转染中引起不容忽视的副作用，微球包裹外源基因也可能在制备消毒过程中受损。

阳离子脂质体因具有优良的特性(无免疫原性、制备简单、使用方便、转染效率高等)而在科研及临床实验中广泛应用，其通常由一个阳离子两亲化合物和一个中性脂质组成。常用的阳离子脂质材料有N-[1-(2，3-二油基氧)丙基]-N，N，N，-氯化三甲铵(DOTMA)、1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)、3β[N-(N’，N’-二甲氨基乙基)氨甲酰基-胆固醇(DC-Chol)等。但阳离子脂质体也存在毒性大、成本高、针对性差(对特定肿瘤可能转染效率低下)等缺点；而将阳离子脂质体技术与阳离子聚合物技术相结合所开发的阳离子高分子脂质体则可能具有更优良的特性，其具有脂质体和高分子胶束的优点，可将二者的优势互补，并充分克服阳离子脂质体所存在的缺点。

发明内容

本发明目的是提供一种靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体，是构建一种制备简单、成本低廉、安全性好、转染效率高的非病毒基因载体系统。

本发明的目的还是提供一种上述靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体制备方法。

本发明另一目的是提供一种上述靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体的应用。

本发明采用具有双亲性特性的高聚物物质高分子季铵盐来代替普通阳离子脂质体中的阳性成分，再与普通阳离子脂质体的脂质成分组合来制备阳离子高分子脂质基因载体，该阳离子高分子脂质基因载体具有与普通脂质体相类似的双层膜结构，可包载药物、结合基因，并介导DNA/siRNA的转染，可转染的细胞种类多，转染效率高，可在含血清的培养液中使用，制备和操作简单。

本发明所述的靶向性高分子季铵盐类阳离子脂质基因载体，其关键特征在于使用高分子季铵盐来代替普通阳离子脂质体中所含有的阳性成分，因此可以称之为阳离子高分子脂质体。阳离子高分子脂质体是将阳离子脂质体技术与阳离子聚合物技术相结合所开发的一种与阳离子脂质体结构相同的纳米基因载体系统，其具有更优良的特性，并有脂质体和高分子胶束的优点，可将二者的优势互补。本发明的阳离子高分子脂质体不仅具备小分子脂质体的优点，且制备方法简单，稳定性好，药物渗漏少，同时含有氨基和羧基等官能团，易进行多功能化组装。

本发明中的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体由高分子季铵盐和脂质成分组成，其中，高分子季铵盐与脂质成分的质量比为0.05～20∶1，优先选择的高分子季铵盐与脂质成分的质量比为1～8∶1。高分子季铵盐作为主膜材构成高分子脂质基因载体的主体，所述的基因载体为具有类似脂质体双层膜结构的纳米粒，粒径在1～100000nm，优选10～500nm。

本发明中所述的靶向性高分子季铵盐类阳离子脂质基因载体中，所述的高分子季铵盐是可溶于极性有机溶剂(氯仿、二氯甲烷、乙醇等)和水，高分子季铵盐在极性有机溶剂或水溶液中的溶解度均大于0.1mg/mL，高分子季铵盐的重均分子量在1000～1000000之间，优选为2000～200000，高分子季铵盐的分子结构中可以含有氨基、羧基、羟基等官能团，具体为壳聚糖基-季铵盐、聚乙烯亚胺(PEI)基-季铵盐、海藻酸钠基-季铵盐、多聚赖氨酸基-季铵盐和聚酯胺(Poly EsterAmine，PEA)基-季铵盐，其中优选为聚乙烯亚胺基三(十二烷基)氯化铵、聚乙烯亚胺基三(十六烷基)氯化铵、聚乙烯亚胺基三(十八烷基)氯化铵、海藻酸钠基三(十二烷基)氯化铵、多聚赖氨酸基三(十八烷基)氯化铵、羧甲基壳聚糖基三(十二烷基)氯化铵、羧甲基壳聚糖基三(十六烷基)氯化铵、羧甲基壳聚糖基三(十八烷基)氯化铵、羧甲基壳聚糖基甲基二(十八烷基)氯化铵、赖氨酸壳聚糖基三(十二烷基)氯化铵、赖氨酸壳聚糖基三(十六烷基)氯化铵、赖氨酸壳聚糖基三(十八烷基)氯化铵、赖氨酸壳聚糖基甲基二(十八烷基)氯化铵、壳聚糖基三甲基氯化铵、壳聚糖羟丙基三甲基氯化铵及其上述季铵盐的相应溴化物。

本发明中所述的靶向性高分子季铵盐类阳离子脂质基因载体的制备方法为脂质体的通用制备方法：包括薄膜分散法、逆向蒸发法、复乳法、离心法、pH梯度法、注入法和混溶法等，其中可优选为薄膜分散法和逆向蒸发法；

其中薄膜分散法的基本步骤为：将壳聚糖长链烷基季铵盐(质量浓度1％～100％)和脂质成分(质量浓度0.1％～60％)共溶于有机溶剂氯仿中，混匀作为有机相；除去有机溶剂使成薄膜，然后加入水相振荡使脂质膜水化，水相为水相为0.9％的生理盐水或pH＝6～9的缓冲溶液。

其中逆向蒸发法的基本步骤为：将壳聚糖长链烷基季铵盐(质量浓度1％～100％)和脂质成分(质量浓度0.1％～60％)共溶于有机溶剂氯仿中，混匀作为有机相；将水相与有机相(水相和有机相的比例为1/6∶6/1)混合，超声乳化后，旋转蒸发除去有机溶剂。

本发明中所述的脂质成分为构成普通脂质体和阳离子脂质体的基本成分，具体为胆固醇、二油酰脂酰乙醇胺(DOPE)、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种，如2-3种的脂质成分，优选为胆固醇、DOPE和DC-Chol。

本发明所述的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体的可以用于制备基因药物。

所述的基因药物可为有机药物、水溶性药物、水不溶性药物、基因DNA/siRNA、探针和诊断试剂，如治疗基因、RB基因和p53基因、紫杉醇、消炎痛、抗叶酸类(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤类(如巯嘌呤)、抗嘧啶类(如氟尿嘧啶、替加氟)、核苷酸还原酶抑制药(如羟基脲)、脱氧核糖核苷酸多聚酶抑制药(如环胞苷)、直接影响和破坏DNA结构及其功能的药物(如氮芥、环磷酰胺、氮甲、顺铂、丝裂霉素、喜树碱)、抑制蛋白质合成的药(如阿霉素、柔红霉素、光辉霉素)、影响微管蛋白质组装和纺锤丝形成的药物(长春碱、依托泊苷)。

本发明所述的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体可通过对高分子季铵盐阳离子脂质基因载体进行修饰或组装而增加纳米粒的使用功能，所用的修饰制剂包括抗体配体(肿瘤相关抗原标志物)、蛋白和酶(酶类标志物)、转铁蛋白、激素、肽类、聚乙二醇(PEG)、基因和小分子制剂等；优选为甲胎蛋白、癌胚抗原、组织多肽抗原、淀粉酶、乳酸脱氢酶、核糖核酸酶、5-核苷酸酶、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、生长激素、转化生长因子、雌激素、孕激素、儿茶酚胺类及其衍生物、ras基因家族及其表达产物、myc基因家族及其表达产物、表皮生长因子受体、叶酸、三苯氧胺、磁性颗粒。使用以上物质对基因载体进行改性时所使用的方法包括直接对基因载体纳米粒的表面修饰或先制备含活性成分的前体物质再进行组装等方法。

其中叶酸修饰的高分子季铵盐阳离子脂质纳米粒对叶酸受体高表达的肿瘤细胞具有靶向性，如肿瘤细胞IGROV1、KB3-1、Ishikawa和MCF-7等；叶酸修饰的高分子季铵盐阳离子脂质纳米粒的制备方法优选为：

a：制备前体物质叶酸修饰的高分子季铵盐；

b：将高分子季铵盐(质量浓度1％～100％)和脂质成分(质量浓度0.1％～60％)溶于氯仿中，将叶酸修饰的高分子季铵盐(质量浓度0.1％～39％)溶于水相，然后使用薄膜分散法或逆向蒸发法制备叶酸修饰的高分子季铵盐阳离子脂质纳米粒。

其中PEG修饰的高分子季铵盐阳离子脂质纳米粒具有体内长循环功能和被动靶向功能，其制备方法优选为：

a：制备前体物质PEG修饰的高分子季铵盐；

b：将高分子季铵盐(质量浓度1％～100％)和脂质成分(质量浓度0.1％～60％)溶于氯仿中，将PEG修饰的高分子季铵盐(质量浓度0.1％～39％)溶于水相，然后使用薄膜分散法或逆向蒸发法制备PEG修饰的高分子季铵盐阳离子脂质纳米粒。

其中EGFR抗体修饰的高分子季铵盐阳离子脂质纳米粒对EGFR受体高表达的肿瘤细胞具有靶向性，如肿瘤细胞SMMC-7721和MCF-7等；EGFR抗体修饰的高分子季铵盐阳离子脂质纳米粒的制备方法优选为：

可先制备在水相当中浓度为0.1～5mg/mL的高分子季铵盐阳离子脂质基因载体纳米粒，然后使用偶联剂将EGFR抗体偶联到高分子季铵盐阳离子脂质基因载体的表面既得EGFR抗体修饰的高分子季铵盐阳离子脂质基因载体，其中高分子季铵盐、脂质成分和EGFR抗体的质量组成依次为1％～100％，0.1％～60％，0.1％～39％。

本发明所述的靶向性高分子季铵盐类阳离子脂质基因载体的用途，包括对药物和基因的递送、缓控释、逆转肿瘤细胞的耐药特性及对疾病的诊断和治疗；高分子季铵盐阳离子脂质基因载体作为基因转染的非病毒载体时，与商用阳离子脂质体Lipofectamine 2000相比，具有更低的细胞毒性和更高的基因转染效率。

本发明所述的靶向性高分子季铵盐类阳离子脂质基因载体纳米粒，采用与阳离子脂质体具有更大相似性的阳离子高分子脂质基因载体来构建功能化的、安全性好、效率高的纳米基因载体系统，并充分利用阳离子高分子脂质体所具有的优点以克服阳离子脂质体的缺点。阳离子脂质体与阳离子高分子脂质体的组成及性质，N-[1-(2，3-二油基氧)丙基]-N，N，N，-氯化三甲铵(DOTMA)、1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)等对照如下表1。

表1

本发明所述的靶向性高分子季铵盐类阳离子脂质纳米基因载体系统具有以下特点：

(1)将功能强大的阳离子高分子脂质体用做基因载体。

(2)阳离子高分子脂质体具有灵活多样、基因转染效率高、毒性低、制备方法简便等优点。

(3)将阳离子高分子脂质体进行靶向性设计可得到专一性好的基因载体系统。

为提高载体系统针对特定肿瘤的基因递送效率，即专一性，则可充分利用阳离子高分子脂质体相对阳离子脂质体所具有的功能化修饰容易的优点。利用肿瘤细胞表面的特异性受体配体结合原理，可选择对乳腺癌具有较好靶向功能的叶酸或EGFR抗体对阳离子高分子脂质体进行修饰来增强其针对乳腺癌的基因转染效果，同时也采用多靶点联用的方法来提高载体的专一性。

附图说明

图1为阳离子高分子脂质体的微观结构图(透射电子显微镜照片)及功能化组装示意图；

a.单层阳离子高分子脂质体(聚乙烯亚胺基三(十八烷基)氯化铵/胆固醇)；

b.大单层阳离子高分子脂质体(聚乙烯亚胺基三(十八烷基)氯化铵/胆固醇)。

图2为使用逆向蒸发法所制备的PEG修饰的阳离子高分子脂质体多聚赖氨酸基三(十八烷基)氯化铵/胆固醇(a)和叶酸修饰的阳离子高分子脂质体多聚赖氨酸基三(十八烷基)氯化铵/胆固醇(b)的透射电子显微镜照片；

由图可见阳离子高分子脂质体的粒径较小，且分布均匀。

图3是用流式细胞仪测定的阳离子高分子脂质体羧甲基壳聚糖基三(十八烷基)氯化铵/DOPE(OQC/DOPE)和阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000在293T细胞中的转染效率图。

其中Lipofectamine^TM2000为阳离子脂质体阳性对照，阳离子高分子脂质体中羧甲基壳聚糖基三(十八烷基)氯化铵和DOPE的质量比为2∶1，其中A：

Lipofectamine 2000组；B：OQC胶束组；C：OQC/DOPE组，逆向蒸发法制备；

D：OQC/DOPE组，薄膜法制备。

图4是用荧光显微镜观察阳离子高分子脂质体赖氨酸壳聚糖基甲基二(十八烷基)氯化铵(LDQA)/DOPE的基因转染照片。

LDQA/DOPE包载绿色荧光蛋白质粒后对293T细胞进行基因导入(左：暗场；右：明场)，A：Lipofectamine 2000组；B：LDQA胶束组；C：LDQA/DOPE组，逆向蒸发法制备；D：LDQA/DOPE组，薄膜法制备。

具体实施方式

下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实施例1：

本实施例探讨采用逆向蒸发法时聚乙烯亚胺基三(十八烷基)氯化铵(PQA)和胆固醇的不同配比对阳离子高分子脂质体粒径产生的影响。

将不同配比的PQA(重均分子量为2万)和胆固醇共溶于二氯甲烷中，混匀得溶液I；准备去离子水溶液II，其中溶液I和溶液II的比例为1∶2；将两种溶液混合后，充分超声乳化，在旋转蒸发仪上减压蒸馏除尽二氯甲烷得高分子脂质体溶液。由表2可见，调整PQA和胆固醇的质量配比可以得到不同粒径大小的高分子脂质体，所得的阳离子高分子脂质体在水溶液中的粒径大小分布也都比较均匀。其中图1为PQA/胆固醇阳离子高分子脂质体的TEM照片。

表2

实施例2：

本实施例主要提供使用其他脂质成分制备阳离子高分子脂质体的实例。

称取羧甲基壳聚糖基三(十八烷基)氯化铵(季铵盐取代度为90.0％，重均分子量为1000)15.0mg，DOPE 12.0mg共溶于3.0ml二氯甲烷中，振荡均匀得溶液I，放入茄形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸馏，并不时的通入氮气，直至二氯甲烷挥发完全，然后室温真空干燥24h后再用溶有3.0mg水溶性磁粒子的5.0mlPBS(pH＝7.4)缓冲溶液II超声水化10min(薄膜法)；或将溶液I溶液II共混乳化，超声10min，待形成稳定的乳液后放入茄形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸馏至二氯甲烷挥发完全；得磁性高分子脂质体羧甲基壳聚糖基三(十八烷基)氯化铵/DOPE(逆向法)。该类脂质体的Zeta电位可达+40.0mv，表面可吸附基因，可作为一种高效的基因转染试剂。

类似的可用其他脂质成分代替DOPE制备高分子脂质体。图3是用流式细胞仪测定的阳离子高分子脂质体羧甲基壳聚糖基三(十八烷基)氯化铵/DOPE(OQC/DOPE)和阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000在293T细胞中的转染效率图。

实施例3：

本实施例为制备PEG修饰的阳离子高分子脂质体的方法。以PEG修饰的阳

本实施例为制备叶酸修饰的阳离子高分子脂质体的方法。以叶酸修饰的阳离子高分子脂质体FA-PQA(叶酸修饰的多聚赖氨酸基三(十八烷基)氯化铵)/PQA/胆固醇为例，进行举例：首先制备FA-PQA，然后再进行组装，具体的实验过程如下：

(1)FA-PQA的制备：

将2.5g叶酸FA溶于50mL DMSO溶液中，向其加入1.5ml三乙胺，将1.3gNHS用一定量的DMSO溶解后加入到上述反应体系中避光反应12hour以上。将产物过滤，得到黄色固体NHS-FA活性物。取1.0克的NHS-FA活性物溶于25mL二甲基亚砜DMSO中，加入一定量的PQA。用Na₂HPO₄与NaOH缓冲溶液调节反应体系的pH＝10，反应1hour。将最后产物透析24hour，冻干即得FA-PQA。通过红外光谱和¹H-NMR检测FA的成功连接。所制备的FA-PQA中叶酸在高分子季铵盐上的取代度为10％。

(2)叶酸修饰的阳离子高分子脂质体的制备：

称取0.8mg FA-PQA，溶于4.5mL蒸馏水中，待用；称取5mg PQA，4mg胆固醇，溶于2.5mL二氯甲烷中；用旋蒸仪进行旋蒸，温度为35-40℃，减压蒸尽二氯甲烷后取下，加入3mL蒸馏水进行超声，得到薄膜法制备的FA-PQA/PQA/胆固醇阳离子高分子脂质体溶液。

实施例5：

本实施例为制备转铁蛋白修饰的阳离子高分子脂质体的方法。以转铁蛋白抗体修饰的阳离子高分子脂质体PQA/DOPE为例，具体的实验过程如下：

配置质量浓度为1.0mg/mL的阳离子高分子脂质体纳米粒PQA/DOPE溶液50mL(pH＝7.4的PBS缓冲液)备用；20mg转铁蛋白溶于2ml pH＝7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液中备用，将二者混合。1.065mg N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)溶于80μl无水乙醇，在搅拌下将SPDP滴加入上述溶液中，25℃反应40分钟。离心超滤4次除去未反应的SPDP和其它小分子物质，得转铁蛋白修饰的阳离子高分子脂质体PQA/DOPE。

实施例6：

本实施例为制备EGFR抗体修饰的阳离子高分子脂质体的方法。

配置溶有EGFR抗体(质量浓度为1.0mg/mL)的PBS溶液(pH＝7.4，浓度0.1mol/L)备用；配置质量浓度为1.0mg/mL的阳离子高分子脂质体纳米粒赖氨酸壳聚糖基甲基二(十八烷基)氯化铵(LDQA)/DOPE溶液备用；将EGFR抗体溶液和LDQA/DOPE阳离子高分子脂质体溶液按体积比为1∶1进行混合，加入EDC(1.0mg/mL)和NHS(0.5mg/mL)，混合均匀，反应10-48小时，之后透析，除去未反应的EDC和NHS，冻干后备用。1mg阳离子高分子脂质体上可连接有0.08mg EGFR抗体。

使用以上方法可制备其它抗体修饰的阳离子高分子脂质体。

实施例7：

本实施例为使用薄膜分散法，利用高分子脂质体包载水溶性物质的探讨。

称取羧甲基壳聚糖基三(十六烷基)溴化铵(重均分子量为2000)15mg，胆固醇12mg，溶于3ml二氯甲烷中，振荡均匀得溶液I，然后放入茄形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸馏，并不时的通入氮气，直至二氯甲烷挥发完全，然后室温真空干燥24h；称取3.0mg长春新碱溶于5ml PBS(pH＝7.4)缓冲溶液中，摇匀使长春新碱充分溶解得水溶液II；然后将上述5.0ml长春新碱溶液II加入茄形瓶中，在超声的条件让脂质薄膜充分水化，超声10min后，过凝胶分离柱分离游离的药物得载长春新碱的高分子脂质体。使用此方法制备的长春新碱高分子脂质体包封率可达90.0％以上，且在Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液中具有良好的缓控释功能。

用类似方法也可分别制得包载其它水溶性物质的高分子脂质体，只须将需要的水溶性物质溶于相应的水溶液II既可。

实施例8：

本实施例为使用高分子脂质体包载油溶性物质的探讨。

称取海藻酸钠基三(十八烷基)溴化铵(重均分子量为100万)15mg，胆固醇12mg和3.0mg脂溶性维生素E共溶于3mL二氯甲烷中，振荡均匀，放入茄形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸馏，并不时的通入氮气，直至二氯甲烷挥发干净，然后室温真空干燥24h后再用5.0mL PBS(pH＝7.4)缓冲溶液超声水化；或将二氯甲烷溶液与5.0mL PBS(pH＝7.4)缓冲溶液共混乳化，超声10min，待形成稳定的乳液后放入茄形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸馏至二氯甲烷挥发完全；过凝胶分离柱分离游离的药物得载维生素E的高分子脂质体。所得维生素E高分子脂质体包封率可在80％以上，粒径可控，并具有缓释效果。

用类似方法也可分别制得包载其它油溶性物质的高分子脂质体。

实施例9：

本实施例为制备载基因阳离子高分子脂质体的探讨。

配置质量浓度为1mg/mL的阳离子高分子脂质体纳米粒赖氨酸壳聚糖基甲基二(十八烷基)氯化铵(LDQA)/DOPE溶液备用，其中LDQA中季铵盐取代度为70.0％，重均分子量为1万；配置质量浓度为1.0g/L的绿色荧光蛋白(pEGFP)质粒的溶液备用；在室温下，将二者按质量比为3∶1进行混合，孵育20～30min后得到荷载基因的阳离子高分子脂质体溶液。

然后可进行基因转染实验，具体过程如下：

(1)转染前24h，将生长状态良好的肺癌A549细胞常规消化后种板，无抗生素全培养基培养过夜，在转染时细胞融合度应达到80％；(2)播种细胞24h之后，移除培养孔中的全培养基，洗后，每孔加入无血清的培养基使细胞处于饥饿状态；(3)将与DNA孵育后的LDQA/DOPE纳米粒及阳性对照加入细胞培养版中，前后晃动培养板使其充分混匀；(4)将细胞培养版置于37℃细胞培养箱中培养24-48h；在此过程中可根据不同的纳米粒样品采取不同的处理方法，如阳离子磁性高分子脂质体则可在培养板下使用磁场；(5)24h之后取出培养版置于荧光显微镜下进行观察拍照，并将转染后的细胞常规消化并清洗后，用流式细胞仪进行定量分析或用化学发光仪进行定量。

图4是用荧光显微镜观察阳离子高分子脂质体(LDQA/DOPE)的基因转染照片.LDQA/DOPE包载绿色荧光蛋白质粒后对293T细胞进行基因导入(左：暗场；右：明场)，A：Lipofectamine 2000组；B：LDQA胶束组；C：LDQA/DOPE组，逆向蒸发法制备；D：LDQA/DOPE组，薄膜法制备。

实施例10：

靶向性阳离子高分子脂质体的基因转染实验。

按常规方法，进行基因转染实验，结果表明，所制备的阳离子高分子脂质体OQC/DOPE系统在293T(市购)和NIH-3T3(市购)细胞中的转染效率与阳性对照阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000相当，但对L929细胞具有更低的细胞毒性；叶酸修饰的阳离子高分子脂质体OQC/DOPE在乳腺癌MCF-7细胞中的转染效率明显高于阳性对照阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000；EGFR抗体修饰的阳离子高分子脂质体OQC/DOPE在肝癌Huh-7和SMMC-7721细胞中的转染效率高于阳性对照阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000。

实施例11：

本实施例提供使用除薄膜分散法和逆向蒸发法外的其他方法制备阳离子高分子脂质体的实例。

pH梯度法：取100mg羧甲基壳聚糖基三(十二烷基)氯化铵(季铵盐取代度为60.0％，重均分子量为50万)以及60mg胆固醇溶解于15ml乙醇中，减压蒸发制备脂质膜后，假如硫酸铵溶液水化，制备空白高分子脂质体。将探头超声过的空白高分子脂质体依次通过0.8μm、0.65μm、0.45μm和0.22μm的微孔滤膜，进行整粒。整粒后的高分子脂质体装入透析袋中，用150mmol/L NaCl溶液透析24h。透析后的空白脂质体中加入30mg盐酸环丙沙星，然后置于水浴保温，即得盐酸环丙沙星高分子脂质体。

类似的可用制备传统脂质体的复乳法、离心法、注入法和混溶法来获得季铵盐阳离子高分子脂质体。

本发明公开和揭示的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体、制备方法及应用，可通过借鉴本文公开内容。尽管本发明的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体、制备方法及应用已通过较佳实施例进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法改动，更具体地说，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (10)

1.一种靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体，其特征在于所述的高分子季铵盐类阳离子脂质基因载体由高分子季铵盐和脂质成分组成，其中，高分子季铵盐与脂质成分的质量比为0.05～20∶1；粒径在1～100000nm；

所述的高分子季铵盐是在极性有机溶剂或水中的溶解度大于0.1mg/mL，重均分子量在1000～1000000之间，分子结构中含有季铵盐基团的高分子物质，其中的季铵盐优选为氯化物和溴化物；

所述的脂质成分为胆固醇、二油酰脂酰乙醇胺、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或2-3种，优选为胆固醇、二油酰脂酰乙醇胺或3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇。

2.如权利要求1所述的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体，其特征在于所述的高分子季铵盐为聚乙烯亚胺基-季铵盐、海藻酸钠基-季铵盐、壳聚糖基-季铵盐、多聚赖氨酸基-季铵盐和聚酯胺基-季铵盐。

3.如权利要求2所述的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体，其特征在于所述的高分子季铵盐为聚乙烯亚胺基三(十二烷基)氯化铵、聚乙烯亚胺基三(十六烷基)氯化铵、聚乙烯亚胺基三(十八烷基)氯化铵、海藻酸钠基三(十二烷基)氯化铵、多聚赖氨酸基三(十八烷基)氯化铵、羧甲基壳聚糖基三(十二烷基)氯化铵、羧甲基壳聚糖基三(十六烷基)氯化铵、羧甲基壳聚糖基三(十八烷基)氯化铵、羧甲基壳聚糖基甲基二(十八烷基)氯化铵、赖氨酸壳聚糖基三(十二烷基)氯化铵、赖氨酸壳聚糖基三(十六烷基)氯化铵、赖氨酸壳聚糖基三(十八烷基)氯化铵、赖氨酸壳聚糖基甲基二(十八烷基)氯化铵、壳聚糖基三甲基氯化铵、壳聚糖羟丙基三甲基氯化铵及其上述季铵盐相应的溴化物。

4.一种如权利要求书1所述的靶向性高分子季铵盐类阳离子脂质基因载体的制备方法，其特征在于所提供下述的薄膜分散法或逆向蒸发法获得：

薄膜分散法的基本步骤为：

将质量浓度1％～100％的高分子季铵盐和质量浓度0.1％～60％的脂质成分共溶于极性有机溶剂中，混匀作为有机相，除去有机溶剂使成薄膜，然后加入水相使脂质膜水化，水相为0.9％的生理盐水或pH＝5～9的缓冲溶液；

逆向蒸发法的基本步骤为：

将质量浓度1％～100％的高分子季铵盐和质量浓度0.1％～60％脂质成分共溶于极性有机溶剂中，混匀作为有机相；水相为0.9％的生理盐水或pH＝6～9的缓冲溶液；将水相与有机相混合，水相和有机相的体积比为1∶6～6∶1，超声乳化后，旋转蒸发除去有机溶剂；

所述的高分子季铵盐和脂质成分同权利要求1～3所述。

5.一种如权利要求4所述的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体的用途，其特征是用于制备基因药物。

6.如权利要求5所述的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体的用途，其特征是所述的基因药物为治疗基因、RB基因和p53基因、紫杉醇、消炎痛、甲氨蝶呤、巯嘌呤、氟尿嘧啶、羟基脲、环胞苷、氮芥、环磷酰胺、氮甲、顺铂、丝裂霉素、喜树碱、阿霉素、柔红霉素、光辉霉素、长春碱、依托泊苷中的一种或几种。

7.如权利要求6所述的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体的用途，其特征是所述的制备是对靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体进行表面修饰或先制备含活性成分的前体物质再进行组装；所用的修饰剂为聚乙二醇、EGFR抗体、叶酸、三苯氧胺、转铁蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、组织多肽抗原、淀粉酶、乳酸脱氢酶、核糖核酸酶、5-核苷酸酶、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、生长激素、转化生长因子、雌激素、孕激素、儿茶酚胺类及其衍生物、ras基因家族及其表达产物、myc基因家族及其表达产物、表皮生长因子受体、磁性颗粒。

8.如权利要求6所述的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体的用途，其特征是所述的修饰剂为叶酸时，需要先制备前体物质叶酸修饰的高分子季铵盐；然后，将质量浓度为0.1％～39％的叶酸修饰的高分子季铵盐、质量浓度为1％～100％的高分子季铵盐和质量浓度为0.1％～60％的脂质成分使用薄膜分散法或逆向蒸发法制备叶酸修饰的高分子季铵盐阳离子脂质基因载体；

所述的高分子季铵盐和脂质成分如权利要求1所述。

9.如权利要求6所述的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体的用途，其特征是所述的修饰剂为聚乙二醇时，需要先制备前体物质聚乙二醇修饰的高分子季铵盐；然后，将质量浓度为0.1％～39％的聚乙二醇修饰的高分子季铵盐、质量浓度1％～100％的高分子季铵盐和质量浓度为0.1％～60％脂质成分使用薄膜分散法或逆向蒸发法制备聚乙二醇修饰的高分子季铵盐阳离子脂质基因载体；

所述的高分子季铵盐和脂质成分如权利要求1所述。

10.如权利要求6所述的靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体的用途，其特征是所述的修饰剂为EGFR抗体时，可先制备在水相当中浓度为0.1～5mg/mL的高分子季铵盐阳离子脂质基因载体，然后使用偶联剂将EGFR抗体偶联到高分子季铵盐阳离子脂质基因载体的表面既得EGFR抗体修饰的高分子季铵盐阳离子脂质基因载体，其中高分子季铵盐、脂质成分和EGFR抗体的质量组成依次为1％～100％，0.1％～60％，0.1％～39％；所述的高分子季铵盐和脂质成分如权利要求1所述。

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