CN108031442B - 一种纳米脂质磁球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种纳米脂质磁球及其制备方法，属于分子生物学技术领域。将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；向磁球悬浮液中依次加入GHDC、胆固醇、DOPC溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液，混合，将混合物进行超声处理，得到超声处理的混合物；将超声处理的混合物进行减压浓缩，得到纳米脂质磁球。将制备得到的纳米脂质磁球进行结合细胞的实验，结果显示本发明制备的磁球比常规磁球具有更高的细胞和DNA片段结合能力，表明对DNA片段具有较高的回收效率，可用于游离DNA的回收中。

Description

一种纳米脂质磁球及其制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种纳米脂质磁球及其制备方法。
背景技术
血清或血浆中的游离核酸包括DNA和RNA二大类，后者又分为信使RNA(mRNA)和小RNA(microRNA)等。现有资料揭示，恶性肿瘤患者血循环中的游离DNA不仅含量显著高于健康人和良性疾病患者，而且原发肿瘤的遗传突变在血清游离DNA中也可以检测到，如表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor，EGFR)酪氨酸编码区基因突变检测作为肺癌患者的药物敏感标志，已经在临床个体化靶向治疗(Targetedtherapy)研究中得到应用。
肺癌是预后最差的恶性肿瘤之一，因而寻找肺癌患者血清游离DNA中的相应肿瘤分子标志十分重要。通过利用qPCR检测健康人、良性及恶性肺癌患者的血清中分离得到的游离DNA的含量，从而得到肺癌患者的游离DNA含量。
血浆游离核酸在技术上操作上从Lo等报道的煮沸法提取血浆DNA，发展到商业化血浆核酸手动提取或者自动提取试剂盒，应用血浆中游离核酸进行分子诊断变得更加准确、敏感和迅速。但是由于血浆、血清以及其他体液中循环DNA含量通常较低，同时血浆、血清中和体液中存在不同数量和类型的DNA和RNA，这些不稳定性可能使得待分离的核酸被遗漏，影响检测的准确性，因此，提供一种高效分离游离DNA的方法是现有阶段亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纳米脂质磁球及其制备方法，所述纳米脂质磁球能够高效的快速肺癌血清游离DNA。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种纳米脂质磁球的制备方法，包括以下步骤：
1)将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为200mg：2.35ml。
2)向所述步骤1)中得到的磁球悬浮液中依次加入二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)、胆固醇、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液，混合，得到混合物；所述磁球悬浮液、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的体积与二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)、胆固醇的质量比为1ml：0.25ml：0.1ml：10mg：10mg；所述1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液的浓度为9～11mg/ml；壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的浓度为9～11mg/ml；
3)将所述步骤2)中混合物进行超声处理，得到超声处理的混合物；
4)将所述步骤3)中超声处理的混合物进行减压浓缩，得到纳米脂质磁球。
优选的，所述超声处理的条件：超声功率为27％，超声2s，间隔1s，总时间6min，温度25℃。
优选的，所述超声处理进行30s后，将超声溶液用水进行稀释，稀释的倍数为1:5～6。
优选的，所述减压浓缩为旋转蒸发，所述旋转蒸发的真空度为0.8Mpa以上；所述旋转蒸发的转速为250～300rpm；所述旋转蒸发的时间为30min。
本发明提供了上述方案制备得到的纳米脂质磁球，1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和复合包载Fe3O4磁性纳米颗粒合成的磁性脂质体；纳米脂质磁球的粒径为176.5～183.5nm。
本发明提供了一种纳米脂质磁球的制备方法：采用滴定水解法进行，具体是将稀碱溶液添加到摩尔比为2:1的三价铁盐((Fe3+)和二价铁盐(Fe2+))的混合溶液中，使铁盐溶液的pH值逐步升高，达到6～7，使之水解生成四氧化三铁纳米晶体。
具体实施方式
本发明提供了纳米脂质磁球的制备方法，包括以下步骤：
1)将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为200mg：2.35ml。
2)向所述步骤1)中得到的磁球悬浮液中依次加入二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)、胆固醇、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液，混合，得到混合物；所述磁球二氯甲烷混合物、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的体积与GHDC、胆固醇的质量比为1ml：0.25ml：0.1ml：10mg：10mg；所述1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液的浓度为9～11mg/ml；壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的浓度为9～11mg/ml；
3)将所述步骤2)中混合物进行超声处理，得到超声处理的混合物；
4)将所述步骤3)中超声处理的混合物进行减压浓缩，得到纳米脂质磁球悬浮液。
本发明将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为200mg：2.35ml。
在本发明中，所述Fe3O4磁性纳米颗粒的粒径优选为183.5nm，更优选为176.5nm。所述Fe3O4磁性纳米颗粒的制备方法：滴定水解法，即将稀碱溶液添加到摩尔比为2:1的三价铁盐((Fe3+)和二价铁盐(Fe2+)的混合溶液中，使铁盐溶液的pH值逐步升高，达到6～7，使之水解生成四氧化三铁纳米晶体。得到的磁球悬浮液后，本发明向所述磁球悬浮液中依次加入二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)、胆固醇、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液，混合，得到混合物；所述磁球二氯甲烷混合物、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的体积与GHDC、胆固醇的质量比为1ml：0.25ml：0.1ml：10mg：10mg；所述1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液的浓度为9～11mg/ml，优选为10mg/ml；壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的浓度为9～11mg/ml，优选为10mg/ml；
本发明对所述混合方式没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的混合方式即可。
在本发明中，所述1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液的浓度优选为10mg/ml；壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的浓度为10mg/ml。各成分材料的作用：二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)：是一类阳离子化试剂,也是一种带有活性基团的季铵盐型阳离子表面活性剂、胆固醇：是磁球骨架的链接者、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液：充当表面活性剂、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液(DOPC)：是一种磁性材料，可大大提高材料的生物相容性。
得到混合物后，将所述混合物进行超声处理，得到超声处理的混合物。
在本发明中，所述超声处理的条件优选如下：超声功率为27％，超声2s，间隔1s，总时间6min，温度25℃。本发明对所述超声处理的仪器没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的超声处理仪即可。本发明实施例中，所述超声处理仪来自上海新芝生物技术研究所，型号为JY92-Ⅱ。
在本发明中，所述超声处理进行30s后，将超声溶液优选用水进行稀释，得到稀释液。所述稀释的倍数优选为1:5～6。混合或超声的过程中，溶液会逐渐由无色变浑浊，形成均匀分布的黑色溶液。得到稀释液后，本发明将所述超声处理的混合物进行减压浓缩，得到纳米脂质磁球。
在本发明中，所述减压浓缩优选为旋转蒸发，所述旋转蒸发的真空度优选为0.8Mpa以上，更优选为0.7～0.8Mpa；所述旋转蒸发的转速优选为250～300rpm，更优选为280rpm；所述旋转蒸发的时间优选为30min。所述旋转蒸发的温度优选为24～25℃，更优选为25℃。得到的纳米脂质磁球悬浮液的相对密度为30～40mg/ml。
本发明提供了上述方案制备得到的纳米脂质磁球悬浮液，1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和复合包载Fe3O4磁性纳米颗粒合成的磁性脂质体；纳米脂质磁球的粒径为176.5～183.5nm。
下面结合实施例对本发明提供的一种纳米脂质磁球及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
用分析天平称取GHDC 10.0mg，称取胆固醇10.0mg；启动通风橱(以下操作均在通风橱中进行)；用定量移液器取磁球溶液1mL于1.5mL的离心管中，置于磁性分离架上，分离磁球，弃去溶剂，用移液管取1mL二氯甲烷到离心管中，摇匀，将溶液移至100mL的磨口梨形瓶中，再用移液管取1mL二氯甲烷到离心管中，清洗残存的磁球，将清洗液也移至梨形瓶中。重复清洗一次；将称量好的GHDC、胆固醇加入梨形瓶中，用移液管取250uL的DOPC溶液，100uL的壳聚糖十六烷基季胺盐溶液至梨形瓶中，混匀；将梨形瓶快速超声波细胞粉碎仪中，启动仪器，设置超声功率为27％，超声2S，间隔1S，总时间6min，温度25℃，启动仪器；30S后停止超声，用定量移液器取6mL超纯水至梨形瓶中，继续超声至时间结束；取出梨形瓶，将其移至旋转蒸发仪上，启动真空泵，待真空度达到0.8Mpa以上时，将旋转蒸发仪上的转速迅速调到最大，进行真空旋转蒸发；30min后拧开旋钮，放入空气，先关闭真空泵，再关闭旋转蒸发仪，取下梨形瓶；将反应后的溶液移至15mL的离心管中；贴上标签(注明样品名，制备人及制备时间)2～8℃保存备用。所述纳米脂质磁球平均粒径为180±3.5nm。
将制备得到的纳米脂质磁球进行结合细胞的实验，测定裸磁球表面点位、所述纳米脂质磁球的结合细胞后的粒径及结合细胞后复合物表面电位变化。结果见表1。
表1裸磁球与结合细胞后的磁球的粒径及电位
Figure GDA0002728092180000051
未结合细胞的纳米脂质磁球平均粒径为180±3.5nm，结合细胞后磁球-细胞复合物的平均粒径明显增大。纳米脂质磁球带正电位，平均电位为4.6±0.2mv，结合细胞后电位趋向于电中性，平均电位为0.4±0.1mv。这表明本发明制备的磁球具有较高的细胞结合能力。
对比例1
采用市售普通磁球与本发明制备的纳米脂质磁球对物理参数进行对比，结果见表2。
表2纳米脂质磁球与常规的磁球物理参数对比
物理参数 纳米脂质磁球 市售普通正电性磁球
粒径 180±3.5nm 270±15.0nm
电位 4.6±0.2mv 2.3±0.4mv
由表2可知，本发明制备的纳米脂质磁球粒径小于常规正电性磁球，而电位高于市售普通正电性磁球。这为磁球吸附细胞和DNA片段垫定物理基础。
对比例2
用本发明提供的纳米磁球和市售普通磁球对不同长度的DNA片段进行吸附试验，统计DNA片段的回收率。结果见表3。
表3纳米脂质磁球与常规的磁球对小片段DNA回收的对比效果
DNA片段大小(bp) 纳米脂质磁球回收率(％) 常规正电性磁球回收率(％)
100 98.5±3.2 90.0±1.5
200 94.0±1.5 80.0±4.5
300 90.0±2.5 80.0±2.0
500 88.5±0.5 78.0±4.3
1000 86.0±2.5 70.0±5.5
由表3可知，与常规正电性磁球相比，纳米脂质磁球对各个片段大小的DNA片段都具有较高的回收效率，而且回收效率显著高于常规正电性磁球。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种纳米脂质磁球的制备方法，包括以下步骤：
1)将Fe3O4磁性纳米颗粒与二氯甲烷混合，得到磁球悬浮液；所述Fe3O4磁性纳米颗粒的质量与二氯甲烷的体积比为200mg：2.35ml；
2)向所述步骤1)中得到的磁球悬浮液中依次加入二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、胆固醇、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液和壳聚糖十六烷基季胺盐溶液，得到混合料液；所述磁球悬浮液、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液、壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的体积与GHDC、胆固醇的质量比为1ml：0.25ml：0.1ml：10mg：10mg；所述1,2-二油酰基磷脂酰胆碱溶液的浓度为9～11mg/ml；壳聚糖十六烷基季胺盐溶液的浓度为9～11mg/ml；
3)将所述步骤2)中混合物进行超声处理，得到超声处理的混合物；所述超声处理的条件：超声功率为27％，超声2s，间隔1s，总时间6min，温度25℃；
4)将所述步骤3)中超声处理的混合物进行减压浓缩，得到纳米脂质磁球。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述超声处理进行30s后，将超声溶液用水进行稀释，稀释的倍数为1:5～6。
3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，所述减压浓缩为旋转蒸发，所述旋转蒸发的真空度为0.8Mpa以上；所述旋转蒸发的转速为250～300rpm；所述旋转蒸发的时间为30min。
4.权利要求1～3任意一项所述方法制备的纳米脂质磁球，其特征在于，1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和复合包载Fe3O4磁性纳米颗粒合成的磁性脂质体；纳米脂质磁球的粒径为176.5～183.5nm。
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