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一种乳腺癌患者血清游离dna定量检测试剂盒及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒及其应用方法。其中试剂盒由表面带正电的磁性纳米微球、裂解吸附液、洗涤液I和II、洗脱液以及磁分离架构成。在利用磁分离法去收集到患者血清的游离DNA后，可进行荧光定量PCR检测及数据统计分析。血清游离DNA定量检测试剂盒的建立可为临床的个体化诊疗提供有价值的数据平台。

Description

一种乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒及其应用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及利用磁性纳米微球进行疾病诊断方面的技术及应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种以细胞异常增生为基本特征的人类疾病。伴随着肿瘤的发生发展，其大分子物质（包括核酸、蛋白和多糖等）可以由癌细胞释放进入血液循环，此类游离（Circulating）大分子作为生物标志物（Biomarkers）在肿瘤诊断、预后评估及病情随访中均具有广泛的临床价值。
血清中的游离核酸包括DNA和RNA二大类，后者又分为信使RNA（mRNA）和小RNA（microRNA）等。自1948年Mandel和Metais首次报道至今，游离DNA研究已有70余年历史。现有资料揭示，恶性肿瘤患者血循环中的游离DNA不仅含量显著高于健康人和良性疾病患者，而且原发肿瘤的遗传突变在血清游离DNA中也可以检测到，如表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸编码区基因突变检测作为肺癌患者的药物敏感标志，已经在临床个体化靶向治疗（Targeted therapy）研究中得到应用。
乳腺癌是我国女性公民最常见的恶性肿瘤，因而寻找乳腺癌患者血清游离DNA中的相应肿瘤分子标志十分重要。通过检测健康人、良性及恶性乳腺疾病患者的血清游离DNA含量，可证实乳腺癌患者的游离DNA含量显著增高；因此可以利用表面带正电的磁性纳米微球及缓冲液体系技术将乳腺癌患者中的游离DNA吸附，并进行分离富集，最后对DNA进行分析检验。
发明内容
本发明目的是提供一种乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒及应用方法，主要为构建一种分离简便、成本低廉高效的快速乳腺癌血清游离DNA分离方法及检测系统。具体技术方案如下：
一种乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒，所述定量检测试剂盒由如下组分构成：
（1）表面带正电的磁性纳米微球；
（2）裂解吸附液：所述裂解吸附液是体积比为5:1的水溶液和异丙醇的混合溶液；其中，水溶液的pH为 6.5～6.8，含3.8M 盐酸胍、1M NaCl、1% Triton x-100、0.5% SDS、10mM Tris、1mM EDTA；
（3）洗涤液I：1M NaCl，0.5% SDS，60%乙醇；
（4）洗涤液II：70%乙醇；
（5）洗脱液：pH 7.0～7.25，10mM Tris1-HCl；
（6）磁分离架。
所述表面带正电的磁性纳米微球是二氧化硅包裹的Fe3O4纳米粒子，且在溶液中的表面电位为正，具有超顺磁性，所述表面带正电的磁性纳米微球的平均粒径为50～10000nm。
所述血清游离DNA的片段长度范围为100bp～800bp。
上述的乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒的应用方法，包括如下步骤：
（1）首先，在1.5ml离心管中加入100μl血液，再加入400μl裂解吸附液及10μl表面带正电的磁性纳米微球，混匀，20～60℃水浴放置10～15分钟；
（2）然后，将离心管放在磁分离架上静置，磁分离后去上清液；
（3）再加入500μl 洗涤液I，涡旋洗涤20～30秒后，置于磁分离架上，静置1～2分钟，磁分离后去上清液；重复洗涤3次，并吸干离心管盖上的残留液；
（4）继续加入500μl洗涤液II，涡旋洗涤20～30秒，静置1～2分钟，磁分离后去上清液；重复洗涤5次，去上清液后吸干离心管盖上的残留液；将离心管留在磁分离架上，打开盖子在室温下放置5～10分钟；
（5）继续加入30μl 洗脱液，用枪头将表面带正电的磁性纳米微球吹分散，20～60℃放置5分钟；磁分离后回收上清液，将回收的上清液在-20℃保存或直接测定分析；
（6）最后，取步骤（5）磁分离后回收的上清液进行荧光定量PCR检测；包括PCR扩增后检测方法的建立，利用荧光定量PCR方法对样本中含有的游离DNA含量的确定，及数据统计分析。
上述的乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒在乳腺癌患者诊断及治疗方面的应用。
本发明所述的乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒的应用，应用方法为，在利用试剂盒获得癌细胞基因组DNA并进行PCR扩增，产物可经纯化并作为检测模板建立标准曲线。 
本发明以血清游离DNA为检测对象，对健康女性志愿者、乳腺良性疾患及恶性乳腺癌患者进行了临床样本的检测，检测结果证实乳腺癌患者的游离DNA含量增高，差异具有统计学显著意义。
 本发明所述试剂盒以GAPDH基因拷贝数作为评估指标，发现85%的I～II期乳腺癌患者中含有103或以上基因拷贝，足以满足基因诊断要求。
本发明显示乳腺恶性肿瘤患者的血循环中游离DNA含量显著增高，这些肿瘤源性的遗传物质可为研究开发无创伤性的特异性分子诊断新技术提供新思路。
本发明所述试剂盒特别适用于自动化提取基因组DNA，也可用于手动进行全血基因组DNA的纯化；同时适用于从全血、血斑、组织、培养细胞等样品中提取基因组DNA，提取的基因组DNA可用于酶切、PCR等。
附图说明
图1是使用本发明的试剂盒进行荧光定量PCR检测DNA的标准曲线；
图2是实施例的健康女性志愿者、乳腺病良性疾病及乳腺癌患者血清游离DNA差异的统计分析比对图；其中，1：健康女性志愿者，2：乳腺病良性疾病，3：乳腺癌患者；
图3是实施例的Ⅰ-Ⅱ期乳腺癌患者血清游离DNA分布的统计分析比对图。
具体实施方式
实施例1  乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒的准备
准备如下组分，制作成乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒：
（1）表面带正电的磁性纳米微球；
（2）裂解吸附液：裂解吸附液是体积比为5:1的水溶液和异丙醇的混合溶液；
其中，水溶液的pH为 6.5～6.8，含3.8M 盐酸胍、1M NaCl、1% Triton x-100、0.5% SDS、10mM Tris、1mM EDTA；
（3）洗涤液I：1M NaCl，0.5% SDS，60%乙醇；
（4）洗涤液II：70%乙醇；
（5）洗脱液：pH 7.0～7.25，10mM Tris1-HCl；
（6）磁分离架。
实施例2  乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒的使用步骤
试剂盒的使用包括如下步骤：
（1）首先，在1.5ml离心管中加入100μl血液，再加入400μl裂解吸附液及10μl表面带正电的磁性纳米微球，混匀，20～60℃水浴放置10～15分钟；
（2）然后，将离心管放在磁分离架上静置，磁分离后去上清液；
（3）再加入500μl 洗涤液I，涡旋洗涤20～30秒后，置于磁分离架上，静置1～2分钟，磁分离后去上清液；重复洗涤3次，并吸干离心管盖上的残留液；
（4）继续加入500μl洗涤液II，涡旋洗涤20～30秒，静置1～2分钟，磁分离后去上清液；重复洗涤5次，去上清液后吸干离心管盖上的残留液；将离心管留在磁分离架上，打开盖子在室温下放置5～10分钟；
（5）继续加入30μl 洗脱液，用枪头将表面带正电的磁性纳米微球吹分散，20～60℃放置5分钟；磁分离后回收上清液，将回收的上清液在-20℃保存或直接测定分析；
（6）最后，取步骤（5）磁分离后回收的上清液进行荧光定量PCR检测；包括PCR扩增后检测方法的建立，利用荧光定量PCR方法对样本中含有的游离DNA含量的确定，及数据统计分析。
实施例3 乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒的应用实例
3.1研究对象：选取上海市长宁区妇幼保健院2008年1月1日～2009年12月31日收治的乳腺疾病患者300例，其中乳腺癌200例，良性疾病100例，年龄在26～74岁之间，中位年龄50岁。所有患者均经病理检测确诊，组织类型包括侵润性导管癌，侵润性小叶癌，髓样癌，侵润性癌，导管内癌。同时选择健康女性志愿者100例作为对照，其中年龄在24～64岁之间，中位年龄44岁。
3.2 样本采集及DNA提取 
（1）样本采集：收集400份血清，-80℃保存备用；
（2）DNA提取：在1.5ml离心管中加入100μl血液；加入400μl裂解吸附液及10μl带正电的磁性纳米微球，混匀，20～60℃水浴放置10～15分钟；将离心管放在磁分离架上静置，磁分离后去上清；加入500μl 洗涤液I，涡旋洗涤20～30秒后，置于磁分离架上，静置1～2分钟，磁分离后去上清；重复洗涤3次，并吸干离心管盖上的残留液；加入500μl洗涤液II ，涡旋20～30秒，静置1～2分钟，磁分离后去上清；重复洗涤5次，去上清后，吸干离心管盖上的残留液；将离心管留在磁分离架上，打开盖子室温度下放置5～10分钟；加入30μl 洗脱液，用枪头将带正电的磁性纳米微球吹分散，20～60℃放置5分钟；磁分离后回收上清，将上清-20℃保存或直接测定分析。
3.3 荧光定量PCR检测  
3.4 统计学分析  应用SPSS 11.5统计软件包，采用SPSS12.0统计方法。
实施例4  乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒检测结果分析
4.1建立检测方法
    对癌细胞基因组DNA进行PCR扩增，产物经纯化后作为检测模板建立标准曲线，结果如图1所示：在104～109拷贝数范围内，DNA含量与循环数呈线性关系，相关系数（r）为0.999。
4.2健康女性的游离DNA含量
   100例健康女性志愿者中79例未能检出游离DNA，21例检测到DNA，其中含量为 102或以下拷贝数量级的14例，103拷贝数量级者5例，另2例DNA含量分别达到1.59×105和1.2×106。因此，以游离DNA含量＞1 x 103拷贝作为阳性标准，则93% 的健康女性属于DNA检测阴性。统计分析如表1所示：游离DNA含量在不同年龄组受检者之间无统计学显著差异（P ＞0.05）。
4.3乳腺良性疾病患者的游离DNA含量
   100例乳腺良性疾病（乳腺小叶增生）患者中75例未能检出游离DNA，25例检测到DNA，其中含量超过阳性标准者仅5例，即95%的乳腺良性疾病患者属于DNA检测阴性。统计分析如表2所示：游离DNA含量在健康女性及乳腺良性疾病之间无统计学显著差异（P ＞0.05）。
4.4乳腺癌患者的游离DNA含量
 200例乳腺癌患者血样中游离DNA含量低于103拷贝数量级者31例，占15.5%，其中未检测到DNA者8例，占4%。84.5%（169例）乳腺癌患者的游离DNA含量超过阳性标准，统计分析如图2所示。
（1）DNA读数log转换后，与年龄进行相关分析，结果显示相关系数r=-0.087，p=0.222，即未发现两者存在线形相关；
（2）DNA分层（＜1000，1000～10000，≥10000）后与组织类型比较，卡方检验结果χ2=17.893，p=0.007，即游离DNA水平与组织类型有关。
将游离DNA含量分为A（未能检出，拷贝数为0）、B（低含量，拷贝数为100～102）、C（中等含量，拷贝数为103～106）、D（高含量，拷贝数为107～109）四组的健康女性和疾病患者人员进行统计分析，图2结果清晰显示健康女性及乳腺良性疾病患者主要属于A和B组，而乳腺癌患者则多数分布在C和D组，游离DNA检测阳性率在乳腺癌患者中显著增高 (P＜0.05)。游离DNA的重要诊断价值之一是从中找出特异性基因标志并用于肿瘤早期诊断，而这种新颖诊断手段的前提条件是早期患者血清中含有足够数量的DNA。为此，我们从本组乳腺癌病例中选择I～II 期患者共94例进行了分析，图3结果揭示属于C组和D组者分别占64.9%（61例）和19.1%（18例），说明85%（79/94例）的I～II 期乳腺癌患者血清中的DNA含量足以进行基因检测。
参考值范围：乳腺癌≥1.0×104；血清循环DNA含量＞1.0×103做进一步筛查以确诊患病/复发。
本发明公开和揭示的一种乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒及应用方法，可通过借鉴本文公开内容。尽管本发明的一种乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒及应用方法已通过较佳实施例进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法改动，更具体地说，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神的范围内。

Claims (5)

1.一种乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述定量检测试剂盒由如下组分构成：
（1）表面带正电的磁性纳米微球；
（2）裂解吸附液：所述裂解吸附液是体积比为5:1的水溶液和异丙醇的混合溶液；其中，水溶液的pH为 6.5～6.8，含3.8M 盐酸胍、1M NaCl、1% Triton x-100、0.5% SDS、10mM Tris、1mM EDTA；
（3）洗涤液I：1M NaCl，0.5% SDS，60%乙醇；
（4）洗涤液II：70%乙醇；
（5）洗脱液：pH 7.0～7.25，10mM Tris1-HCl；
（6）磁分离架。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述表面带正电的磁性纳米微球是二氧化硅包裹的Fe3O4纳米粒子，且在溶液中的表面电位为正，具有超顺磁性，所述表面带正电的磁性纳米微球的平均粒径为50～10000nm。
3.根据权利要求1所述的乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述血清游离DNA的片段长度范围为100bp～800bp。
4.权利要求1或2或3任一所述的乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）首先，在1.5ml离心管中加入100μl血液，再加入400μl裂解吸附液及10μl表面带正电的磁性纳米微球，混匀，20～60℃水浴放置10～15分钟；
（2）然后，将离心管放在磁分离架上静置，磁分离后去上清液；
（3）再加入500μl 洗涤液I，涡旋洗涤20～30秒后，置于磁分离架上，静置1～2分钟，磁分离后去上清液；重复洗涤3次，并吸干离心管盖上的残留液；
（4）继续加入500μl洗涤液II，涡旋洗涤20～30秒，静置1～2分钟，磁分离后去上清液；重复洗涤5次，去上清液后吸干离心管盖上的残留液；将离心管留在磁分离架上，打开盖子在室温下放置5～10分钟；
（5）继续加入30μl 洗脱液，用枪头将表面带正电的磁性纳米微球吹分散，20～60℃放置5分钟；磁分离后回收上清液，将回收的上清液在-20℃保存或直接测定分析；
（6）最后，取步骤（5）磁分离后回收的上清液进行荧光定量PCR检测；包括PCR扩增后检测方法的建立，利用荧光定量PCR方法对样本中含有的游离DNA含量的确定，及数据统计分析。
5.权利要求1至3任一所述的乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒在乳腺癌患者诊断及治疗方面的应用。
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