CN110938689B

CN110938689B - 一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒

Info

Publication number: CN110938689B
Application number: CN201811114805.3A
Authority: CN
Inventors: 梁晓飞; 宋萍
Original assignee: Huzhou Jukang Medical Technology Co ltd; Ju Kang Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huzhou Jukang Medical Technology Co ltd; Ju Kang Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2024-04-19
Anticipated expiration: 2038-09-25
Also published as: CN110938689A

Abstract

本发明提供了一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于检测已经脱离卵巢进入外周血中的循环肿瘤细胞，包括转铁蛋白免疫磁球、染色剂、引物组、分离膜、高保真Taq酶、2×Blood Direct PCR Master Mix、ddH₂O、RNase‑Free ddH₂O以及磷酸盐缓冲液。本发明提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒首先通过转铁蛋白免疫磁球分离循环肿瘤细胞，再用染色剂对循环肿瘤细胞染色并检测阳性细胞数量，最后通过引物组扩增基因进行基因检测，所以，本发明提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒能够从细胞层面上以及基因层面上准确检测受检者的循环肿瘤细胞。

Description

一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术与生物医学领域，具体涉及一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒。

背景技术

研究统计数据表明，卵巢癌的发病率仅次于宫颈癌和乳腺癌，但其死亡率却是妇科肿瘤中最高的。其原因主要是卵巢癌缺乏有效的早期诊断方法，而且早期临床体征不明显，70％的患者确诊时已经到了肿瘤晚期。另一方面，治疗效果仍然不太理想，5年生存期没有有效提高。

循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)是指脱离肿瘤并进入血液循环的癌细胞，这种远端转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因，近年来其在恶性肿瘤转移过程中的作用日益受到关注。CTC的检测可有效地应用于肿瘤的体外早期诊断，具有重要临床意义和广阔应用前景。

Veridex公司的Circulating Tumor Cell检测试剂盒应用于临床转移性乳腺癌患者的诊断与治疗评价。该技术通过偶联细胞上皮粘附蛋白(epiithlial celladhesion molecule-EpCAM)抗体的磁珠捕获细胞，并利用角蛋白和CD45荧光抗体对细胞进行鉴定。然而由于卵巢癌特殊的转移倾向(局部蔓延和淋巴结转移)使得该敏感性偏低的检测技术捕获的细胞数量极少，CTC的临床诊疗价值大打折扣。

基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因,目前应用于遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的是开发出特异性强、灵敏度高、能准确捕获已经脱离卵巢的CTC，并可以对捕获的CTC准确计数以及后续基因检测的试剂盒。

本发明提供了一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于检测已经脱离卵巢进入外周血中的循环肿瘤细胞，具有这样的特征，包括：转铁蛋白免疫磁球，用于捕获循环肿瘤细胞，其制备过程如下：第一步骤，按羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐：胆固醇＝1：0.5～1：5的质量比，将羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐与胆固醇混合并加入到三口烧瓶中；第二步骤，按去乙醇后的磁珠溶液：CH₂Cl₂＝1：1～1：5的体积比，将去乙醇后的磁珠溶液溶解于CH₂Cl₂，获得第一溶液；第三步骤，按第一溶液：第一步骤的混合物＝1：1～1：5的体积质量比，将第一溶液倒入第一步骤中的三口烧瓶里，获得第二溶液；第四步骤，将第二溶液在冰浴下乳化2min～20min，并在乳化时把溶于双蒸水的环氧丙基十六叔胺转铁蛋白按体积质量比，磁珠溶液：环氧丙基十六叔胺转铁蛋白＝1：1～1：5，加入正在乳化的第二溶液中，乳化完成后得到第三溶液；第五步骤，去除第三溶液中残留的CH₂Cl₂，得到第四溶液；第六步骤，将第四溶液进行磁分离，获得转铁蛋白免疫磁球；第七步骤，清洗转铁蛋白免疫磁球。

本发明提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还具有这样的特征：其中，环氧丙基十六叔胺转铁蛋白的制备过程如下：步骤Ⅰ，按转铁蛋白：环氧丙基十六叔胺＝1：1～1：5的质量比，将转铁蛋白和环氧丙基十六叔胺共溶于pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中；步骤II，将步骤Ⅰ中的溶液搅拌反应过夜；步骤III，将过夜后的溶液用分子量为5000～20000道尔顿的透析袋透析6h～24h，透析过程中每间隔两个小时换一次pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；步骤IV，完成透析后冻干，即获得环氧丙基十六叔胺转铁蛋白。

本发明提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还包括：染色剂，用在循环肿瘤细胞计数过程中对转铁蛋白免疫磁球捕获的循环肿瘤细胞进行染色，染色剂包括，DAPI、CK19-FITC以及CD45-PE。

本发明提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还包括：引物组，引物组包括EGFR19引物序列以及EGFR21引物序列，其中，EGFR19引物序列如下:

EGFR19 forward 5’-GCCTAGACGCAGCATCATTA-3’；

EGFR19 inverse 5’-ATGCCTCCATTTCTTCATCC-3’，

EGFR21引物序列如下：

EGFR21 forward 5’-GTAAGTTCAAGCCCAGGTCT-3’；

EGFR21 inverse 5’-GCAAGTACTGTTCCCAAAGC-3’。

本发明提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还包括：分离膜，4于分离并收集受检者外周血中的包含循环肿瘤细胞的细胞群以便转铁蛋白免疫磁球捕获循环肿瘤细胞，分离膜的孔径为5μm。

本发明提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还包括：高保真Taq酶以及2×Blood Direct PCR MasterMix。

本发明提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还包括：ddH₂O、RNase-Free ddH₂O以及pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。

发明的作用与效果

根据本发明所涉及的一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，因为首先通过转铁蛋白免疫磁球强特异性、高灵敏度地捕获并分离受检者外周血中的CTC；再采用包含DAPI、CK19-FITC以及CD45-PE的染色剂对分离的CTC进行染色并进一步检测CTC阳性细胞数量；最后通过高特异性的EGFR19引物、EGFR21引物扩增出受检者的CTC中基因EGFR19及基因EGFR21的序列。所以，本发明提供的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒能够从细胞层面上以及基因层面上准确检测受检者的CTC。

附图说明

图1是CTC数量与患者的分期之间的关系统计图；

图2是CTC与患者临床分期病理参数的相关性分析图表；

图3为某受检者EGFR 19外显子和EGFR 21外显子PCR后的琼脂糖凝胶电泳图；

图4是图3中EGFR19外显子测序的结果图；

图5是图3中EGFR21外显子测序的结果图；以及

图6是图3中阳性对照中EGFR19外显子基因缺失突变序列图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒作具体阐述。

<实施例一>

本实施例供了一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于捕获已经脱离卵巢进入外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，以下称CTC)，并对捕获的CTC进行计数检测，包括转铁蛋白免疫磁球、染色剂、分离膜、ddH₂O、RNase-Free ddH₂O以及pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。

本实施例的转铁蛋白免疫磁球，其制备过程如下：

第一步骤，称取5mg羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐和5mg胆固醇加入到50ml三口烧瓶中；

第二步骤，量取1.0ml去乙醇后的磁珠溶液溶解于3.0ml CH₂Cl₂中，获得第一溶液；

第三步骤，将第一溶液倒入第一步骤中的三口烧瓶里中，获得第二溶液；

第四步骤，将第二溶液在冰浴条件下使用探头超声仪进行乳化超声6min，并在乳化时把2mg环氧丙基十六叔胺转铁蛋白溶解于6ml双蒸水并加到第二溶液中，乳化完成后得到第三溶液；

第五步骤，用旋转蒸发仪除去第三溶液中残留的CH₂Cl₂，得到第四溶液；

第六步骤，将第四溶液进行磁分离，获得转铁蛋白免疫磁球；

第七步骤，用双蒸水对获得的转铁蛋白免疫磁球清洗3次。

其中，上述的环氧丙基十六叔胺转铁蛋白的制备过程如下：

步骤Ⅰ，称取57.1μg的转铁蛋白、100μg的环氧丙基十六叔胺共溶于3.0ml pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中；

步骤II，将步骤Ⅰ中的溶液4℃磁力搅拌反应过夜；

步骤III，将过夜后的溶液用分子量为8000-14000道尔顿的透析袋透析12h，透析过程中每2h换一次pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；

步骤IV，完成透析后冻干，即获得环氧丙基十六叔胺转铁蛋白。

本实施例的染色剂用在CTC计数过程中对转铁蛋白免疫磁球捕获的CTC进行染色，该染色剂包括DAPI、CK19-FITC以及CD45-PE。

本实施例的分离膜，用于分离并收集受检者外周血中包含CTC的细胞群，以便转铁蛋白免疫磁球捕获CTC，分离膜的孔径为5μm。

以下结合受检患者样品说明利用本实施例提供的检测试剂盒进行CTC计数检测的过程。

CTC计数检测：

(1)样本采集：收集2014年-2015年在我院接受诊治的的卵巢癌患者46例作为研究对象，所有患者均经过临床和手术病理确诊。排除以下患者：药物过敏者、同时还有其他原发肿瘤、不配合参加实验的患者以及未进行放化疗治疗的患者，同时选30例卵巢良性囊肿患者作为对照。所有参与本研究的患者都签署知情同意书，且经过医院伦理委员会批准。卵巢癌患者和对照组患者采血前一晚按时休息，第二天上午肘正中静脉采血7.5ml，采集的血液放进医用的、含有抗凝剂EDTA·K2的、含有分离膜的、采购自广州阳普医疗科技股份有限公司的抗凝采血管中，并将样本于4℃保存。

(2)样本寄送：在存储、处理和运输过程中避免冷冻，48h内进行检测。

(3)样本处理：具体步骤如下：

步骤(3)-1，将样本在离心机中以2500rpm转速下进行过膜处理，离心10min；

步骤(3)-2，取中上层液置于15ml EP管中后，加入与其等体积pH＝7.4的PBS充分混匀，获得待检测样品，冷藏备用。

(4)CTC计数检测，步骤如下：

步骤(4)-1，取上述待检测样品一半于EP管中；

步骤(4)-2，取30ul转铁蛋白免疫磁球并加入到步骤(4)-1中的EP管中，室温孵育30min，孵育过程中每5min混匀一次；

步骤(4)-3，将完成步骤(4)-2的EP管插入磁分离架上吸附15min，弃上清液，取出EP管；

步骤(4)-4，使用PBS对EP管中捕获的CTC进行磁分离洗涤数次；

步骤(4)-5，加DAPI 30ul、CK19-FITC 30ul、CD45-PE 10ul混匀避光染色15min；

步骤(4)-6，染色结束后加入1ml ddH₂O磁分离架进行磁分离15min，弃上清液；

步骤(4)-7，向EP管中加入30uldd H₂O重悬，混匀后的溶液均匀涂于防脱载玻片中心，待液滴干后在荧光显微镜下拍照计数。

(5)结合临床资料统计CTC检测数据：

图1是CTC数量与患者的分期之间的关系统计图；图2是CTC与患者临床分期病理参数的相关性分析图表。

如图1、图2所示，卵巢癌组病人年龄42-75岁，平均54.42±10.09岁，对照组年龄42-73岁，平均53.19±11.43岁，两组患者的年龄无统计学差异。46例卵巢癌患者中，CTC阳性患者34例，阳性率为73.91％；对照组无CTC阳性患者。卵巢癌患者外周血CTC阳性率与不同临床分期密切相关(χ²＝4.041，P＝0.021)，与患者年龄，病理组织学分型，病理分级无显著差异(P>0.05)。

截止到随访结束，共有1例患者(CTC表达阴性)失访，总随访率为97.83％。34例CTC表达阳性的患者，无进展生存18例，生存率为52.94％。11例CTC阴性表达患者，无进展生存9例，生存率为81.81％，两组比较，差异具有统计学意义(χ²＝5.011，P＝0.026)。

<实施例二>

本实施例供了一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于捕获已经脱离卵巢进入外周血中的CTC，并对已经捕获的CTC进行基因检测，包括转铁蛋白免疫磁球、分离膜、ddH₂O、RNase-Free ddH₂O、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液、分离膜、高保真Taq酶、2×BloodDirect PCR MasterMix、EGFR 19引物序列以及EGFR 21引物序列。

本实施例中的转铁蛋白免疫磁球及其制备方法与实施例一中的转铁蛋白免疫磁球相同，在此不再赘述。同时，本实施例中的分离膜与实施例一中的分离膜也相同。

以下结合采集受检患者样品说明利用本实施例提供的检测试剂盒进行基因检测的过程，该基因检测的过程包括EGFR 19检测以及EGFR 21检测。

首先对采集的受检者的外周血样品进行处理，获得待检测样品，具体操作步骤同实施例一中的步骤(3)。

其次通过转铁蛋白免疫磁球捕获待检测样品中的CTC，具体操作步骤同实施例一中CTC计数检测中的步骤(4)-1至步骤(4)-4。

最后检测基因EGFR 19以及基因EGFR 21，包括如下步骤：

步骤A，通过Genomic DNA Purification Kit，Cat.No.:B0007，EZBioscience，提取已被转铁蛋白免疫磁球捕获的CTC的DNA,具体如下：

子步骤A-1，向已经完成了步骤(4)-1至步骤(4)-4的溶液中加入500ul LysisBuffer裂解CTC；

子步骤A-2，把子步骤A-1得到的溶液放置在型号为XW-80A，采购自上海驰唐电子有限公司的涡旋混合器上震荡10s，充分裂解CTC；

子步骤A-3，之后用移液枪将子步骤A-2得到的溶液加入到DNA提取试剂盒中提供的离心柱中；

子步骤A-4，把离心柱放置在离心机上，在离心力为8000rpm，温度为24℃的条件下，离心1分钟；

子步骤A-5，取出离心柱并加入500ul Lysis Buffer，在离心力为12000rpm，温度为24℃条件下，离心1分钟；

子步骤A-6，取出离心柱并加入500ul按无水乙醇：Wash Buffer＝4:1的体积比稀释后的WashBuffer；

子步骤A-7，在离心力为12000rpm，温度为24℃条件下，离心1分钟；

子步骤A-8，取出后将离心柱转移至无DNA酶的1.5ml EP管中；

子步骤A-9，打开盖子2分钟，待提取的DNA干后向柱中心加入10ul ElutionBuffer(Elution Buffer需提前分装解冻，用完后放-20℃保存)，室温放置1分钟；

子步骤A-10，在离心力为12000rpm，温度为24℃条件下离心1分钟，弃去离心柱，所得DNA留在离心管中，冷藏保存。

步骤B，分别构建EGFR 19的PCR反应体系和EGFR 21的PCR反应体系，并分别将构建的反应体系混匀并分装8联排EP管中。

其中，EGFR 19的PCR反应体系如下：

DNA 1.5ul×8

高保真Taq酶2ul×8

EGFR19F(10uM)1.25ul×8(购自上海生工合成)

EGFR19R(10uM)1.25ul×8(购自上海生工合成)

2×Blood Direct PCR MasterMix 5ul×8(购自东盛生物)

RNase-Free ddH₂O 20ul×8

EGFR 19的引物序列如下：

EGFR19 forward 5’-GCCTAGACGCAGCATCATTA-3’；。

EGFR19 inverse 5’-ATGCCTCCATTTCTTCATCC-3’。

EGFR 21的PCR反应体系如下：

DNA 1.5ul×8

高保真Taq酶2ul×8

EGFR21F(10uM)1.25ul×8(购自上海生工合成)

EGFR21R(10uM)1.25ul×8(购自上海生工合成)

2×Blood Direct PCR MasterMix 25ul×8(购自东盛生物)

RNase-Free ddH₂O 20ul×8

EGFR 21的引物序列如下：

EGFR21 forward 5’-GTAAGTTCAAGCCCAGGTCT-3’；

EGFR21 inverse 5’-GCAAGTACTGTTCCCAAAGC-3’。

步骤C，分别对EGFR 19、EGFR 21进行PCR反应。

其中，EGFR 19的反应程序和EGFR 21的反应程序相同，如下：

步骤D，分别将EGFR 19的PCR产物、EGFR 21的PCR产物纯化回收并送去测序，具体如下：

通过琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，配置2％的凝胶，设置电泳程序(120V，40mA，25nim)，在全功能发光及荧光生物图像分析系统(复日科技FR-2000)观察电泳条带。

图3为某受检者EGFR 19外显子和EGFR 21外显子PCR后的琼脂糖凝胶电泳图。

如图3所示，从左至右依次为DNAmarker、EGFR 19外显子、EGFR 21外显子、阳性对照以及阴性对照，其中阳性对照为1例肺癌患者EGFR 19外显子基因突变，其EGFR 19外显子缺失突变，从图中可知，某受检者EGFR 19外显子及EGFR 21外显子未见有突变。

图4是图3中EGFR 19外显子测序的结果图；图5是图3中EGFR21外显子测序的结果图；以及图6是图3中阳性对照中EGFR19外显子基因缺失突变序列图。

如图4、图5、图6所示，某受检者EGFR19外显子没有发生阳性对照相同的基因缺失突变，EGFR21外显子也未见有突变，阳性对照中肺癌患者EGFR19外显子在第2239-第2253之间的碱基缺失。

实施例的作用与效果

根据本实施例所涉及的一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，因为转铁蛋白免疫磁球是通过本实施例中的制备方法制得的，所以，本实施例的转铁蛋白免疫磁球具有高活性、高纯度且能够强特异性、高灵敏度、最大程度上捕获受检者外周血中的CTC，尽可能减少CTC漏捕。

因为环氧丙基十六叔胺转铁蛋白是通过本实施例中的制备方法制得的，所以，本实施例的环氧丙基十六叔胺转铁蛋白具有高纯度、高活性，是制备优质高效的转铁蛋白免疫磁球最佳选择。

因为在本实施例中对CTC进行染色采用的染色剂是DAPI、CK19-FITC以及CD45-PE，所以，本实施例中的CTC染色效果好且长时间不褪色、有利于后续CTC细胞计数检测观察，且计数结果准确。

因为采用本实施例中的EGFR 19引物序列以及EGFR 21引物序列，上述引物特异性强，所以，本实施例中在进行基因检测时能够特异地识别EGFR 19以及EGFR 21，基因检测的结果准确可靠。

因为采用本实施例的分离膜分离外周血中的细胞，所以能最大程度上避免了分离细胞过程中破坏CTC，进一步保证后续CTC计数检测的准确性，且采用分离膜的孔径为5μm，所以能最大程度上分离出外周血中的所有细胞群。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims

1.一种卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于检测已经脱离卵巢进入外周血中的循环肿瘤细胞，其特征在于，包括：

转铁蛋白免疫磁球，用于捕获所述循环肿瘤细胞；

染色剂，用在所述循环肿瘤细胞计数过程中对所述转铁蛋白免疫磁球捕获的所述循环肿瘤细胞进行染色，所述染色剂包括DAPI、CK19-FITC以及CD45-PE；

引物组，所述引物组由EGFR19引物序列以及EGFR21引物序列组成，其中，所述EGFR 19引物序列如下：

EGFR19 forward 5’-GCCTAGACGCAGCATCATTA-3’，

EGFR19 inverse 5’-ATGCCTCCATTTCTTCATCC-3’，

所述EGFR 21引物序列如下：

EGFR21 forward 5’-GTAAGTTCAAGCCCAGGTCT-3’，

EGFR21 inverse 5’-GCAAGTACTGTTCCCAAAGC-3’；以及

分离膜，用于分离并收集受检者外周血中的包含所述循环肿瘤细胞的细胞群以便所述转铁蛋白免疫磁球捕获所述循环肿瘤细胞，所述分离膜的孔径为5μm，

其中，所述转铁蛋白免疫磁球的制备过程如下：

第一步骤，按羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐：胆固醇=1：0.5~1：5的质量比，将羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐与胆固醇混合并加入到三口烧瓶中；

第二步骤，按去乙醇后的磁珠溶液：CH₂Cl₂=1：1~1：5的体积比，将去乙醇后的磁珠溶液溶解于CH₂Cl₂，获得第一溶液；

第三步骤，按所述第一溶液：第一步骤的混合物=1：1~1：5的体积质量比，将所述第一溶液倒入第一步骤中的三口烧瓶里，获得第二溶液；

第四步骤，将所述第二溶液在冰浴下乳化2min~20 min，并在乳化时把溶于双蒸水的环氧丙基十六叔胺转铁蛋白按体积质量比，磁珠溶液：环氧丙基十六叔胺转铁蛋白=1：1~1：5，加入正在乳化的所述第二溶液中，乳化完成后得到第三溶液；

第五步骤，去除所述第三溶液中残留的CH₂Cl₂，得到第四溶液；

第六步骤，将所述第四溶液进行磁分离，获得所述转铁蛋白免疫磁球；

第七步骤，清洗所述转铁蛋白免疫磁球,

其中，所述环氧丙基十六叔胺转铁蛋白的制备过程如下：

步骤Ⅰ，按转铁蛋白：环氧丙基十六叔胺=1：1~1：5的质量比，将转铁蛋白和环氧丙基十六叔胺共溶于pH=7.4的磷酸盐缓冲液中；

步骤II，将步骤Ⅰ中的溶液搅拌反应过夜；

步骤 III，将过夜后的溶液用分子量为5000~20000道尔顿的透析袋透析6h~24 h，透析过程中每间隔两个小时换一次pH=7.4的磷酸盐缓冲液；

步骤 IV，完成透析后冻干，即获得所述环氧丙基十六叔胺转铁蛋白。

2.根据权利要求1所述的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还包括：

高保真Taq酶以及2×Blood Direct PCR Master Mix。

3.根据权利要求1所述的卵巢癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，还包括：

ddH₂O、RNase-Free ddH₂O以及pH=7.4的磷酸盐缓冲液。