JP2022519326A - 診断および治療目的のためのエキソソーム関連マイクロバイオームの単離および検出 - Google Patents

診断および治療目的のためのエキソソーム関連マイクロバイオームの単離および検出 Download PDF

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Abstract

本発明は、単離されたエキソソームに存在するマイクロバイオームシグネチャーを分析することによって、患者における疾患を予測、診断、および予後判定する方法を提供する。一実施形態において、患者におけるマイクロバイオームを検出する方法を提供し、前記方法は、（ａ）患者から体液サンプルを得ること；（ｂ）前記体液サンプルのエキソソーム画分を単離すること；および（ｃ）前記エキソソーム画分中に存在する微生物巨大分子を検出することを含む。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年２月８日に出願された米国仮出願第６２／８０２，９９４号に対する優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、一般に医薬品の分野に関する。より具体的には、循環エキソソーム内のマイクロバイオームの検出に関する。さらに具体的には、疾患の分析および処置における、循環エキソソーム内のマイクロバイオームの検出に関する。
近年、ヒト結腸および他の組織に存在するマイクロバイオームが、個人の健康を決定する重要な因子であることが確認されている。実際に、腫瘍関連マイクロバイオームおよび結腸関連マイクロバイオームは、がん療法（免疫療法を含む）に対して影響を与えることが確認されている。マイクロバイオームが、個人の健康に影響を与え得るかどうか、および疾患に対する将来のリスクを決定し得るかどうかを決定するための方法が必要とされている。
血液中のエキソソームは、マイクロバイオーム関連マーカー、例えば核酸を運搬する。したがって、本発明は、ヒト血清サンプルから単離されたエキソソーム内に見出されるマイクロバイオームを分析および検出する方法を提供する。
一実施形態において、患者におけるマイクロバイオームを検出する方法を提供し、前記方法は、（ａ）患者から体液サンプルを得ること；（ｂ）前記体液サンプルのエキソソーム画分を単離すること；および（ｃ）前記エキソソーム画分中に存在する微生物巨大分子を検出することを含む。いくつかの態様において、前記体液サンプルは、血液、リンパ、唾液、喀痰、尿、脳脊髄液、骨髄吸引物、眼滲出液／涙、または血清である。
いくつかの態様において、マイクロバイオームは、マイクロバイオームシグネチャーである。いくつかの態様において、マイクロバイオームは、２つまたはそれを超える細菌種を含む。いくつかの態様において、微生物巨大分子は、微生物核酸分子、例えば、微生物ＤＮＡ分子、微生物１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、または微生物ＲＮＡ分子などである。いくつかの態様において、微生物巨大分子は、微生物タンパク質である。
いくつかの態様において、微生物シグネチャーは、疾患のリスクファクターを指し示す。いくつかの態様において、微生物シグネチャーは、疾患と関係することが知られている微生物シグネチャーと比較される。いくつかの態様において、微生物シグネチャーは、患者における疾患を指し示す。いくつかの態様において、疾患は、がん、遺伝子刷り込み障害（ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、神経障害、自己免疫疾患、または代謝障害である。
いくつかの態様において、疾患は、がんであり、方法は、エキソソーム画分からグリピカン１含有エキソソームを単離することをさらに含む。いくつかの態様において、がんは、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである。
いくつかの態様において、方法は、患者に治療剤を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、疾患は、がんであり、治療剤は、抗がん療法である。
いくつかの態様において、方法は、患者の診断を報告することをさらに含む。いくつかの態様において、報告することは、書面報告書または電子報告書を作成することを含む。いくつかの態様において、方法は、報告書を患者、医師、病院、または保険会社に提供することをさらに含む。
いくつかの態様において、患者は、健常患者である。いくつかの態様において、患者は、寛解状態にあり、方法は、再発を検出する方法である。いくつかの態様において、患者は、ヒトである。いくつかの態様において、方法は、前記方法を２回目に実施することをさらに含む。いくつかの態様において、２回目は、前記方法を最初に実施してから、少なくとも１日後、１週間後、または１か月後である。
本明細書で使用される場合、「本質的に含まない」は、特定のコンポーネントに関して、その特定のコンポーネントが、組成物中に意図的には一切配合されておらず、および／または、混入物としてのみ存在するか、もしくは痕跡量でのみ存在することを意味するために使用される。したがって、あらゆる意図しない組成物の混入物に由来する特定のコンポーネントの総量は、０．０５％より十分に少なく、好ましくは０．０１％より少ない。最も好ましいのは、前記特定のコンポーネントが、標準的な分析方法によって検出できない組成物である。
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１またはそれを超えることを意味し得る。特許請求の範囲で使用される場合、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用される場合、語句「ａ」または「ａｎ」は、１、または１を超えることを意味し得る。
特許請求の範囲における用語「または（ｏｒ）」の使用は、代替物のみを指すことが明示されているか、または代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ、ならびに「および／または」を指す定義をサポートする。本明細書で使用される場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも２番目、またはそれを超えるものを意味し得る。
本出願全体を通して、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、値が、その値を決定するために使用されるデバイス、方法の誤差に固有の変動、調査対象間に存在する変動、または示されている値の１０％以内の値を含むことを指すために使用される。
本発明のその他の目的、特徴、および利点が、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、この詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになることから、単に例証の目的で示されているものであることを理解されたい。
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明のある特定の態様をさらに説明するために含められている。本発明は、本明細書に示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つまたは複数を参照することによって、よりよく理解され得る。
図１Ａ～Ｂは、健常血清由来エキソソームにおける微生物ＤＮＡの同定である。血清由来エキソソームサンプルをＤＮＡ抽出前にＤＮＡｓｅで処理し、遊離して循環しているあらゆる核酸を除去した。ＤＮＡを、健常な血清（１ｍＬ）に由来するＤＮＡｓｅ処理エキソソームから単離した。単離されたＤＮＡを、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のためのユニバーサルプライマー（２７Ｆ－Ｂ：ＡＧＲＧＴＴＹＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号１）、１４９２Ｒ：ＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ（配列番号２）；１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子について約１５００ｂｐ）を用いてＰＣＲ増幅した。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）由来のＤＮＡを陽性対照として使用した。ヒト細胞株Ｐａｎｃ－１および線維芽細胞ＢＪ由来のＤＮＡ、ならびにブランク（テンプレートＤＮＡなし）を陰性対照として使用した。増幅されたＤＮＡを、ゲル電気泳動によって分析した。図１Ａは、１つのリピートからのデータを示し；図１Ｂは、別のリピートからのデータを示す。
健常個体の血液中のエキソソームは、細菌マイクロバイオームを含有している。これらのエキソソームは、体内の微生物によって、または細菌が感染した細胞によって生成され得る。そうであるため、患者のマイクロバイオームは、循環エキソソームを単離すること、およびそこに存在する微生物コンポーネント（例えば微生物核酸）を検出することによって評価することができる。これによって、患者のマイクロバイオームを、単純な血液エキソソーム試験を使用してサンプリングすることが可能になる。このような試験の結果によって、治療の選択肢、および糞便移植の成績が決定され得る。マイクロバイオームは、エキソソーム内において、免疫系の細胞から保護され、さらに免疫クリアランスを逃れるため、より安定である。患者のマイクロバイオームは、個体の全体的な健康状態を表すことができ、かつ多くの疾患のリスクに対する潜在的な見通しを提供することができる。そうであるため、患者のエキソマイクロバイオームをサンプリングすることによって、がんなどの種々の疾患について、または療法に対する応答について、患者をスクリーニングすることが可能である。
Ｉ．エキソソーム
用語「マイクロベシクル」および「エキソソーム」は、本明細書で使用される場合、直径（または、粒子が球状ではない場合は、最大の寸法）が、約１０ｎｍ～約５０００ｎｍ、より典型的には３０ｎｍ～１０００ｎｍ、最も典型的には約５０ｎｍ～７５０ｎｍである膜性の粒子を指し、ここで、エキソソームの膜の少なくとも一部は、細胞から直接得られる。最も一般的には、エキソソームは、ドナー細胞のサイズの、最大で５％までのサイズ（平均粒径）を有する。したがって、特に意図されるエキソソームとしては、細胞から排出されるエキソソームがあげられる。
エキソソームは、任意の適切なサンプルタイプ（例えば、体液など）において検出され得るか、またはそのようなサンプルタイプから単離され得る。本明細書で使用される場合、用語「単離される」は、その自然環境から分離されることを指し、少なくとも部分精製を含むことを意図し、実質的な精製を含んでもよい。本明細書で使用される場合、用語「サンプル」は、本発明によって提供される方法に適した任意のサンプルを指す。サンプルは、検出または単離に適したエキソソームを含む任意のサンプルであり得る。サンプルの起源としては、血液、骨髄、胸水、腹水、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、滑液、母乳、汗、涙、関節液、および気管支洗浄液があげられる。１つの態様において、サンプルは、血液サンプルであり、血液サンプルには、例えば、全血、またはその任意のフラクションもしくはコンポーネントが含まれる。本発明と共に使用するために適した血液サンプルは、血液細胞またはそのコンポーネントを含むことが知られている任意の源（ｓｏｕｒｃｅ）、例えば、静脈源、動脈源、末梢源、組織源、臍帯源などから抽出することができる。例えば、サンプルは、周知かつ日常的な臨床的方法（例えば、全血を抜き取り、処理するための手順）によって取得し、処理することができる。１つの態様において、例示的なサンプルは、がんを有する対象から抜き取られた末梢血であり得る。
エキソソームは、また、組織サンプルから、例えば、外科的サンプル、生検サンプル、組織、糞便、および培養細胞から単離することもできる。組織源からエキソソームを単離する場合、単一の細胞懸濁液を得るために組織をホモジナイズし、次いで細胞を溶解させ、エキソソームを遊離させることが必要であり得る。組織サンプルからエキソソームを単離する場合、エキソソームを破壊させないホモジナイズ手順および溶解手順を選択することが重要である。本明細書において意図されているエキソソームは、好ましくは、生理学的に許容され得る溶液（例えば、緩衝食塩水、成長培地、種々の水性媒体など）中で体液から単離される。
エキソソームは、採取した新鮮なサンプルから単離してもよく、または冷凍もしくは冷蔵保存されたサンプルから単離してもよい。いくつかの実施形態において、エキソソームは、細胞培養培地から単離してもよい。必須ではないが、体積排除ポリマーによる沈殿の前に、液体サンプルが清澄化され、サンプルから任意のデブリが除去されている場合、より高い純度のエキソソームが得られ得る。清澄化の方法としては、遠心分離、超遠心分離、濾過、または限外濾過があげられる。最も典型的には、エキソソームは、当該技術分野において知られている数多くの方法によって単離することができる。好ましい方法の１つは、体液または細胞培養上清からの分画遠心分離である。エキソソームの単離のための例示的な方法は、（Ｌｏｓｃｈｅら、２００４；ＭｅｓｒｉおよびＡｌｔｉｅｒｉ、１９９８；Ｍｏｒｅｌら、２００４）に記載されている。あるいは、エキソソームは、また、（Ｃｏｍｂｅｓら、１９９７）に記載されているように、フローサイトメトリーによって単離することもできる。
エキソソームを単離するための確立したプロトコルの１つとしては、超遠心分離があげられ、比較的低密度のエキソソームを浮遊させるために、ショ糖密度勾配またはショ糖クッションと組み合わされることが多い。連続的分画遠心分離によるエキソソームの単離は、サイズ分布が他のマイクロベシクルまたは巨大分子複合体と重なり合っている可能性があるために、複雑である。さらに、遠心分離によって提供されるサイズに基づくベシクルの分離手段は、不十分であり得る。しかしながら、ショ糖勾配超遠心分離と組み合わせた場合、連続的遠心分離によって、エキソソームの高富化を実現し得る。
超遠心分離ルートの代替手段を用いた、サイズに基づくエキソソームの単離は、別の選択肢である。超遠心分離よりも時間がかからず、特別な機器を使用する必要がない、限外濾過手順を用いたエキソソームの精製が成功したことが報告されている。同様に、流体を押しやるために陽圧を利用して、１つのマイクロフィルター上で細胞、血小板、および細胞デブリを除去し、２番目のマイクロフィルター上に３０ｎｍより大きいベシクルを捕捉する、市販のキット（ＥＸＯＭＩＲ（商標）、Ｂｉｏｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が利用可能である。しかしながら、このプロセスにおいては、エキソソームは回収されず、そのＲＮＡ内容物が、第２のマイクロフィルター上に捕捉された材料から直接抽出され、次いで、それがＰＣＲ分析に使用され得る。ＨＰＬＣベースのプロトコルによって、潜在的には、非常に純粋なエキソソームの取得が可能になり得るが、これらのプロセスは、専用の機器を必要とし、またスケールアップが困難である。重大な問題は、血液と細胞培養培地が、どちらも、エキソソームと同じサイズ範囲内のナノ粒子（ある程度非ベシクル性）を多数含有していることである。例えば、ある程度のｍｉＲＮＡは、エキソソームではなくて、細胞外タンパク質複合体内に含まれている場合があるが、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）による処理を行い、「エキソソーム外」タンパク質による任意の起こり得る混入を排除することができる。
別の実施形態において、がん細胞由来エキソソームは、サンプルをエキソソームについて富化するために一般に使用される技術、例えば、免疫特異性相互作用を利用する技術（例えば、免疫磁気捕捉）によって捕捉してもよい。免疫磁気捕捉（免疫磁気細胞分離としても知られる）は、典型的には、特定の細胞タイプ上に見出されるタンパク質に対する抗体を、小さな常磁性ビーズに結合させることを含む。この抗体でコーティングしたビーズをサンプル（例えば、血液）と混合すると、ビーズはその特定の細胞に付着し、細胞を取り囲む。次いで、サンプルを強磁場に置き、それによってビーズを片側にペレット化させる。血液を取り除いた後、捕捉された細胞はビーズによって保持される。この一般的な方法の多くの変形が当該技術分野において周知であり、エキソソームを単離するための使用に適している。１つの例において、エキソソームを磁気ビーズ（例えば、アルデヒド／サルフェートビーズ）に付着させ、次いでその混合物に抗体を加え、ビーズに付着させたエキソソームの表面上のエピトープを認識させてもよい。がん細胞由来エキソソーム上に見出されることが知られている例示的なタンパク質としては、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー６（ＡＢＣＡ６）、テトラスパニン－４（ＴＳＰＡＮ４）、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質４（ＳＬＩＴＲＫ４）、推定プロトカドヘリンベータ－１８（ＰＣＤＨＢ１８）、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３（ＣＤ３３）、およびグリピカン１（ＧＰＣ１）（米国特許第９，９２１，２２３号（参照によりその全体が本明細書に援用される））があげられる。がん細胞由来エキソソームは、例えば、これらのうちの１つまたはそれを超えるタンパク質に対する抗体またはアプタマーを使用して単離してもよい。
本明細書で使用される場合、分析は、エキソソームの直接的または間接的な可視化を可能にする任意の方法を含み、またｉｎ ｖｉｖｏであってもよく、ｅｘ ｖｉｖｏであってもよい。例えば、分析には、それらに限定されないが、固体基材に結合させたエキソソームの、ｅｘ ｖｉｖｏの顕微鏡またはサイトメトリーによる検出および可視化、フローサイトメトリー、蛍光イメージングなどが含まれ得る。例示的な態様において、がん細胞由来エキソソームは、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー６（ＡＢＣＡ６）、テトラスパニン－４（ＴＳＰＡＮ４）、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質４（ＳＬＩＴＲＫ４）、推定プロトカドヘリンベータ－１８（ＰＣＤＨＢ１８）、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３（ＣＤ３３）、グリピカン１（ＧＰＣ１）、ヒストンＨ２Ａタイプ２－Ａ（ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＡ）、ヒストンＨ２Ａタイプ１－Ａ（ＨＩＳＴ１Ｈ１ＡＡ）、ヒストンＨ３．３（Ｈ３Ｆ３Ａ）、ヒストンＨ３．１（ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ）、ジンクフィンガータンパク質３７ホモログ（ＺＦＰ３７）、ラミニンサブユニットベータ－１（ＬＡＭＢ１）、尿細管間質性腎炎抗原－様（ＴＩＮＡＧＬ１）、ペルオキシレドキシン－４（ＰＲＤＸ４）、コラーゲンアルファ－２（ＩＶ）鎖（ＣＯＬ４Ａ２）、推定タンパク質Ｃ３Ｐ１（Ｃ３Ｐ１）、ヘミセンチン－１（ＨＭＣＮ１）、推定ロフィリン２様タンパク質（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｒｈｏｐｈｉｌｉｎ－２－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＲＨＰＮ２Ｐ１）、アンキリンリピートドメイン含有タンパク質６２（ＡＮＫＲＤ６２）、三要素モチーフ含有タンパク質４２（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｍｏｔｉｆ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４２）（ＴＲＩＭ４２）、ジャンクションプラコグロビン（ＪＵＰ）、チューブリンベータ－２Ｂ鎖（ＴＵＢＢ２Ｂ）、エンドリボヌクレアーゼＤＩＣＥＲ（ＤＩＣＥＲ１）、Ｅ３ユビキチン・タンパク質リガーゼＴＲＩＭ７１（ＴＲＩＭ７１）、カタニン（Ｋａｔａｎｉｎ）ｐ６０ ＡＴＰアーゼ含有サブユニットＡ－様２（ＫＡＴＮＡＬ２）、タンパク質Ｓ１００－Ａ６（Ｓ１００Ａ６）、５’－ヌクレオチダーゼドメイン含有タンパク質３（ＮＴ５ＤＣ３）、バリンｔＲＮＡリガーゼ（ＶＡＲＳ）、カズリン（Ｋａｚｒｉｎ）（ＫＡＺＮ）、ＥＬＡＶ様タンパク質４（ＥＬＡＶＬ４）、ＲＩＮＧフィンガータンパク質１６６（ＲＮＦ１６６）、ＦＥＲＭおよびＰＤＺドメイン含有タンパク質１（ＦＲＭＰＤ１）、７８ｋＤａグルコース調節タンパク質（ＨＳＰＡ５）、輸送タンパク質粒子複合体サブユニット６Ａ（ＴＲＡＰＰＣ６Ａ）、スクアレンモノオキシゲナーゼ（ＳＱＬＥ）、腫瘍感受性遺伝子１０１タンパク質（ＴＳＧ１０１）、液胞タンパク質選別２８ホモログ（ＶＰＳ２８）、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮ）、イソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア（ＡＣＡＤ８）、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニット６Ｂ（ＰＳＭＣ４）、伸長因子１－ガンマ（ＥＥＦ１Ｇ）、チチン（Ｔｉｔｉｎ）（ＴＴＮ）、チロシン－プロテインホスファターゼ１３（ＰＴＰＮ１３）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、またはカルボキシペプチダーゼＥ（ＣＰＥ）のうちの１つまたはそれを超えるものに対する抗体を用いて検出され、次いで固体基材に結合させ、および／または顕微鏡またはサイトメトリーによる検出を用いて可視化される。
細胞において発現される全てのタンパク質が、その細胞によって分泌されるエキソソーム内に見出されるわけではないことに留意すべきである。例えば、カルネキシン、ＧＭ１３０、およびＬＡＭＰ－２は、全てＭＣＦ－７細胞内で発現されるタンパク質であるが、ＭＣＦ－７細胞が分泌するエキソソーム内には見出されない（Ｂａｉｅｔｔｉら、２０１２）。別の例として、１つの試験により、膵管腺癌患者１９０名中１９０名において、ＧＰＣ１＋エキソソームのレベルが健常対照よりも高いことが見出された（Ｍｅｌｏら、２０１５（参照によってその全体が本明細書に援用される））。注目すべきことに、ＧＰＣ１＋エキソソームを有する健常対照は、平均で、わずか２．３％であった。
Ａ．細胞培養物からエキソソームを採取するための例示的なプロトコル
第１日に、Ｔ２２５フラスコ中で、１０％ＦＢＳを含む培地に、細胞が翌日に約７０％コンフルエントになるように、十分な細胞（例えば、約５００万個の細胞）を播種する。第２日に、細胞上の培地を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで２５～３０ｍＬの基本培地（すなわち、ＰｅｎＳｔｒｅｐもＦＢＳも含まない）を細胞に加える。細胞を２４～４８時間インキュベートする。４８時間のインキュベーションが好ましいが、いくつかの細胞株は無血清培地に対してより感受性が高く、そのため、インキュベーション時間を２４時間に短縮すべきである。ＦＢＳは、ＮａｎｏＳｉｇｈｔの結果を大きく歪めるエキソソームを含んでいることに留意されたい。
第３／４日に、培地を採取し、室温で５分間、８００×ｇで遠心分離して、死細胞と大きなデブリをペレット化する。上清を新しいコニカルチューブに移し、培地をさらに１０分間、２０００×ｇで遠心分離して、他の大きなデブリと大きなベシクルを除去する。培地を０．２μｍのフィルターに通し、次いで超遠心分離管（例えば、２５×８９ｍｍのＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ）に、遠心管あたり３５ｍＬずつ分注する。遠心管あたりの培地量が３５ｍＬ未満である場合、遠心管の残りをＰＢＳで満たし、３５ｍＬにする。培地を、ＳＷ３２Ｔｉローター（ｋファクターが２６６．７、最大ＲＣＦが１３３，９０７）を使用して、４℃で２～４時間、２８，０００ｒｐｍで超遠心分離する。上清を、液体の残量がおよそ１インチになるまで注意深く吸引する。遠心管を傾け、残りの培地がアスピレーターピペットにゆっくり入るようにする。所望により、エキソソームペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、再度２８，０００ｒｐｍでの超遠心分離を１～２時間繰り返し、エキソソームの集団をさらに精製してもよい。
最後に、エキソソームペレットを２１０μＬのＰＢＳ中に再懸濁する。各サンプルにつき複数の超遠心分離管がある場合、同じ２１０μＬのＰＢＳを使用して、各エキソソームペレットを順次再懸濁する。各サンプルにつき、１０μＬを取り、９９０μＬのＨ２Ｏに加えてナノ粒子トラッキング解析に使用する。残りの２００μＬのエキソソーム含有懸濁液を下流のプロセスに使用するか、またはすぐに－８０℃で保管する。
Ｂ．血清サンプルからエキソソームを抽出するための例示的なプロトコル
まず、血清サンプル（または他の体液）を氷上で解凍する。次いで、２５０μＬの無細胞血清サンプルを１１ｍＬのＰＢＳ中に希釈し；ポアサイズ０．２μｍのフィルターを通して濾過する。希釈したサンプルを、４℃で終夜、１５０，０００×ｇで超遠心分離する。翌日、上清を注意深く除き、エキソソームペレットを１１ｍＬのＰＢＳ中で洗浄する。２回目の超遠心分離を、４℃で２時間、１５０，０００×ｇで実施する。最後に、上清を注意深く除き、エキソソームペレットを、分析のために、１００μＬのＰＢＳ中に再懸濁する。
ＩＩ．マイクロバイオーム
ヒトマイクロバイオータは、１５０～２００の優勢な細菌種と１０００のより一般的ではない細菌種を含む数兆の微生物からなり、ヒトゲノム中に存在する遺伝子の１００倍を超える遺伝子を含んでいる。マイクロバイオータは、主に細菌から構成されるが、古細菌、原虫、およびウイルスも含んでいる。マイクロバイオータは、食物の処理、複雑な難消化性多糖類の消化、およびビタミンの合成を含む、健康維持に不可欠な生命機能を果たし、また、病原体の抑制から毒性化合物の代謝、宿主代謝のモジュレーションにおよぶ多様な機能を有する生物活性代謝物を分泌する。
マイクロバイオータの乱れは、ヒトにおいて、小児における壊死性腸炎から、成人における肥満、糖尿病、メタボリックシンドローム、過敏性腸症候群、および炎症性腸疾患まで、種々の障害に関係づけられてきた。ヒトの健康におけるマイクロバイオームディスバイオシスの最近の研究によって、がんを含む多くの疾患状態におけるマイクロバイオームの特定の変化が示唆されている。「マイクロバイオーム」は、マイクロバイオータの集合的なゲノムを指す。さらに、研究によって、特定のマイクロバイオームと特定のがんとの関連性が示唆されている。よって、別個のマイクロバイオームが、疾患の発症または進展に寄与している可能性がある。逆に、腫瘍の微環境が、これらのウイルスおよび微生物が生き残る特別な微小環境を提供している可能性がある。いずれのケースでも、疾患タイプに特異的なマイクロバイオームシグネチャーは、早期の診断、予後判定、および処置戦略のためのバイオマーカーを提供し得る。
いくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える種類の微生物もしくはコンポーネントのレベルもしくは一群のレベル、またはそれらの産物のレベルもしくは一群のレベルを決定することは、１つまたはそれを超えるＤＮＡ配列のレベルまたは一群のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれを超えるＤＮＡ配列は、異なる微生物種を識別するために使用できる任意のＤＮＡ配列を含む。ある特定の実施形態において、１つまたはそれを超えるＤＮＡ配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。ある特定の実施形態において、１つまたはそれを超えるＤＮＡ配列は、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態において、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１，０００、５，０００、またはそれを超える配列が増幅される。
それぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は原核生物リボソームの、そして１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は真核生物リボソームの、小さなサブユニットコンポーネントをコードする。ｒＲＮＡ遺伝子は、これらの遺伝子の配列が、微生物種の間で異なるが、プライマーの結合のために高度に保存されている領域を有するため、微生物の種類を識別するために特に有用である。保存されたプライマー結合領域間のこの特異性によって、多くの異なる種類の微生物のｒＲＮＡ遺伝子を、単一のセットのプライマーによって増幅し、次に増幅された配列によって識別することが可能になる。
ＩＩＩ．疾患の診断、予後判定、および処置
本発明の方法を使用した、エキソマイクロバイオームの検出、単離、および特徴付けは、疾患のリスクファクターの評価、診断、および予後判定において有用であり、また疾患の再発をもたらし得る処置不成功の早期検出のための治療有効性のモニタリングにおいて有用である。さらに、本発明によるエキソマイクロバイオーム分析によって、療法のコースが完了している症状が現れる前の患者における早期再発の検出が可能になる。これが可能なのは、エキソソーム内に存在するマイクロバイオームの存在が、疾患の増悪、療法に対する応答不良、疾患の再発、および／または経時的な生存率の低下と関係および／または相関し得るためである。よって、エキソマイクロバイオームの計数および特徴付けによって、療法に対する応答に基づいて、初期のリスクおよびその後のリスクを予測する基準となる特性に関して患者を層別化する方法が提供される。
例えば、上記に開示された方法によって単離されたがん細胞由来エキソソームは、対象におけるがんの診断または予後判定のために分析されてもよい。そうであるから、本発明の方法は、例えば、がん細胞由来エキソソームと非がん性細胞に由来するエキソソームのエキソマイクロバイオームを比較することによって、がん患者およびがんのリスクがある患者を評価するために使用し得る。本明細書に記載された診断または予後判定方法のいずれかにおいて、がんの１つまたはそれを超える指標（例えば、がん特異的エキソマイクロバイオームシグネチャー）、または任意の他の障害の１つまたはそれを超える指標の存在もしくは不存在のいずれかを、診断または予後判定を下すために使用してもよい。
１つの態様において、本明細書に記載されているように、体液（例えば、血液、尿、唾液など）サンプルが患者から抜き取られ、疾患細胞由来エキソソームが検出および／または単離される。例えば、エキソソームは、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー６（ＡＢＣＡ６）、テトラスパニン－４（ＴＳＰＡＮ４）、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質４（ＳＬＩＴＲＫ４）、推定プロトカドヘリンベータ－１８（ＰＣＤＨＢ１８）、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３（ＣＤ３３）、および／またはグリピカン１（ＧＰＣ１）に結合する１つまたはそれを超える抗体またはアプタマーで標識されてもよく、前記抗体は、共有結合した蛍光標識を有していてもよい。次いで、分析を行って、サンプル中のがん細胞由来エキソソームの数および特徴付けを決定してもよく、この測定から、最初の血液サンプル中に存在するがん細胞由来エキソソームの数を決定してもよい。がん細胞由来エキソソームとして同定されたエキソソームは、がん細胞由来エキソソーム中に選択的または特異的に存在することが知られている第２の（またはそれを超える）マーカー、例えば、ヒストンＨ２Ａタイプ２－Ａ（ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＡ）、ヒストンＨ２Ａタイプ１－Ａ（ＨＩＳＴ１Ｈ１ＡＡ）、ヒストンＨ３．３（Ｈ３Ｆ３Ａ）、ヒストンＨ３．１（ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ）、ジンクフィンガータンパク質３７ホモログ（ＺＦＰ３７）、ラミニンサブユニットベータ－１（ＬＡＭＢ１）、尿細管間質性腎炎抗原－様（ＴＩＮＡＧＬ１）、ペルオキシレドキシン－４（ＰＲＤＸ４）、コラーゲンアルファ－２（ＩＶ）鎖（ＣＯＬ４Ａ２）、推定タンパク質Ｃ３Ｐ１（Ｃ３Ｐ１）、ヘミセンチン－１（ＨＭＣＮ１）、推定ロフィリン２様タンパク質（ＲＨＰＮ２Ｐ１）、アンキリンリピートドメイン含有タンパク質６２（ＡＮＫＲＤ６２）、三要素モチーフ含有タンパク質４２（ＴＲＩＭ４２）、ジャンクションプラコグロビン（ＪＵＰ）、チューブリンベータ－２Ｂ鎖（ＴＵＢＢ２Ｂ）、エンドリボヌクレアーゼＤＩＣＥＲ（ＤＩＣＥＲ１）、Ｅ３ユビキチン・タンパク質リガーゼ ＴＲＩＭ７１（ＴＲＩＭ７１）、カタニンｐ６０ ＡＴＰアーゼ含有サブユニットＡ－様２（ＫＡＴＮＡＬ２）、タンパク質Ｓ１００－Ａ６（Ｓ１００Ａ６）、５’－ヌクレオチダーゼドメイン含有タンパク質３（ＮＴ５ＤＣ３）、バリンｔＲＮＡリガーゼ（ＶＡＲＳ）、カズリン（ＫＡＺＮ）、ＥＬＡＶ様タンパク質４（ＥＬＡＶＬ４）、ＲＩＮＧフィンガータンパク質１６６（ＲＮＦ１６６）、ＦＥＲＭおよびＰＤＺドメイン含有タンパク質１（ＦＲＭＰＤ１）、７８ｋＤａグルコース調節タンパク質（ＨＳＰＡ５）、輸送タンパク質粒子複合体サブユニット６Ａ（ＴＲＡＰＰＣ６Ａ）、スクアレンモノオキシゲナーゼ（ＳＱＬＥ）、腫瘍感受性遺伝子１０１タンパク質（ＴＳＧ１０１）、液胞タンパク質選別２８ホモログ（ＶＰＳ２８）、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮ）、イソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア（ＡＣＡＤ８）、２６Ｓプロテアーゼ調節サブユニット６Ｂ（ＰＳＭＣ４）、伸長因子１－ガンマ（ＥＥＦ１Ｇ）、チチン（ＴＴＮ）、チロシン－プロテインホスファターゼ１３（ＰＴＰＮ１３）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、またはカルボキシペプチダーゼＥ（ＣＰＥ）などを検出することによって、がん細胞由来エキソソームであることを確認してもよい。がん細胞由来エキソソームの数は、エキソソームを視覚的に定量および特徴付けするためのサイトメトリーまたは顕微鏡技術によって決定してもよい。がん細胞由来エキソソームは、当該技術分野で知られている他の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって検出および定量してもよい。
種々の態様において、対象のエキソマイクロバイオームの分析は、対象の増悪および病変を評価するために、特定の時間経過にわたって、種々の時間間隔で行ってもよい。例えば、分析は、時間の関数としてエキソマイクロバイオームのレベルおよび特徴付けを追跡するために、１日、２日、３日、１週間、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、または１年などの一定の時間間隔で実施してもよい。がんが現存する患者のケースにおいては、これにより、その疾患の増悪の有用な指標がもたらされ、医療実施者が、エキソマイクロバイオームにおける増加、減少、または変化がないことに基づいて、適切な治療上の選択を行う助けとなる。
本明細書において提供される任意の方法において、エキソマイクロバイオームを特徴付けし、追加の臨床的評価を提供するための、追加の分析を行ってもよい。例えば、ＰＣＲ技術を利用してもよく、例えば特定のマーカーに特異的なプライマーで多重化し、エキソマイクロバイオームが由来する微生物の種類などの情報を得てもよい。さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡ分析、プロテオーム分析、またはメタボローム分析を、患者の特徴付けに関する追加の情報を評価するための手段として実施してもよい。
例えば、エキソマイクロバイオーム分析は、特定の治療レジメンに対する対象の応答性を決定するために十分なデータ、がんの処置における候補薬剤の有効性を決定するために十分なデータを提供し得る。したがって、本発明は、本明細書に記載されているように、対象のエキソマイクロバイオームを検出することによって、特定の治療レジメンに対する対象の応答性を決定する方法、またはがんの処置における候補薬剤の有効性を決定する方法を提供する。例えば、患者に薬物処置が施されたら、本発明の方法を使用して薬物処置の有効性を決定することが可能である。例えば、薬物処置の前に患者から採取されたサンプル、ならびに薬物処置と併せてまたは薬物処置の後に患者から採取された１つまたはそれを超えるサンプルを、本発明の方法を使用して処理してもよい。各処理サンプルの分析結果を比較することによって、その薬物処置の有効性、またはその薬剤に対する患者の応答性を決定することができる。このようにして、不合格の化合物を早期に同定することができ、または有望な化合物を早期に確認することができる。
本発明のある特定の態様を、エキソマイクロバイオームの存在に基づく疾患または障害の予防または処置に使用することができる。本発明のある特定の態様によって、治療剤または診断剤を発現するか、または含むエキソマイクロバイオームによる、患者の処置が提供される。「治療剤」は、本明細書で使用される場合、がんまたは他の状態の処置において有用な原子、分子、または化合物である。治療剤の例としては、それらに限定されないが、薬物、化学療法剤、治療用抗体もしくは抗体フラグメント、毒素、放射性同位体、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、および色素があげられる。「診断剤」は、本明細書で使用される場合、疾患の診断、検出、または可視化において有用な原子、分子、または化合物である。本明細書に記載された実施形態によれば、診断剤としては、それらに限定されないが、放射性物質（例えば、放射性同位体、放射性核種、放射標識または放射性トレーサー）、色素、造影剤、蛍光化合物または分子、生物発光化合物または分子、酵素、および増強剤（例えば、常磁性イオン）があげられる。
いくつかの態様において、治療用組換えタンパク質は、患者の細胞において失われてしまった活性を有するタンパク質、所望の酵素活性を有するタンパク質、所望の阻害活性を有するタンパク質などであってもよい。例えば、タンパク質は、転写因子、酵素、タンパク質性毒素、抗体、モノクローナル抗体などであってもよい。モノクローナル抗体は、細胞内抗原に対して特異的または選択的に結合することができる。モノクローナル抗体は、細胞内抗原の機能を阻害することができ、および／またはタンパク質間相互作用を妨害することができる。本発明の他の態様によって、患者サンプル中のがん細胞由来エキソソームにおいて見出されるある特定のエキソマイクロバイオームの存在に基づく、疾患の診断が提供される。
用語「対象」は、本発明で使用される場合、対象となる方法が行われる任意の個体または患者を指す。一般に、対象はヒトであるが、当業者に理解されているように、対象は動物であってもよい。よって、哺乳類、例えばげっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、農場動物（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む）、および霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む）を含む他の動物は、対象の定義に含まれる。
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患もしくは健康に関連する状態の治療的利益を得ることを目的として、対象に対して治療剤を投与もしくは適用すること、または対象に対して手順もしくはモダリティを実施することを指す。例えば、処置は、化学療法、免疫療法、もしくは放射線療法を施すこと、外科手術を実施すること、またはそれらの組み合わせを含み得る。
用語「治療的利益」または「治療的に有効」は、本明細書で使用される場合、この状態の医学的処置に関して、対象の福祉（ｗｅｌｌ－ｂｅｉｎｇ）を促進または増強するあらゆるものを指す。これには、それらに限定されないが、疾患の徴候もしくは症状の頻度もしくは重症度の低下が含まれる。例えば、がんの処置は、例えば、腫瘍の侵襲性の低下、がんの成長速度の低下、または転移の防止を含んでもよい。がんの処置は、また、がんを有する対象の生存期間を延長することを指してもよい。
用語「がん」は、本明細書で使用される場合、固形腫瘍、転移性がん、または非転移性がんを記述するために使用され得る。ある特定の実施形態において、がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、睾丸、舌、または子宮において発生し得る。
本発明は、また、非がん性疾患を診断するために、特にエキソマイクロバイオームの変化に関連することが知られている任意の疾患を診断するためにも使用し得ることも認識される。例えば、本発明は、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症）、代謝障害（高血糖症（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｓ）、高脂血症、心血管疾患、糖尿病）、神経疾患（例えば、自閉症スペクトラム障害、レット症候群（Ｒｅｔｔ ｓｙｍｄｒｏｍｅ）、パーキンソン病、統合失調症）、または精神障害を診断するために使用し得る。
処置に対する患者の有効な応答、または患者の「応答性」とは、疾患または障害のリスクがあるか、または疾患または障害に罹患している患者にもたらされる臨床的もしくは治療的利益を指す。そのような利益には、細胞応答または生物学的応答、完全奏効、部分奏効、安定病態（増悪も再発もない）、または後に再発がある応答が含まれる。例えば、有効な応答は、がんと診断された患者における、腫瘍サイズの減少または増悪がない生存であり得る。
本明細書に記載された方法によって、処置の成績を予測およびモニタリングすることができ、および／またはそのような処置から利益を受ける患者を同定または選択することができる。
新生物性状態の処置に関して、新生物性状態のステージに依存して、新生物性状態の処置は、以下の療法の１つまたは組み合わせを含む：新生物性組織を除去する外科手術、放射線療法、および化学療法。他の治療レジメンを抗がん剤の投与と組み合わせてもよい（例えば、治療用組成物と化学療法剤）。例えば、このような抗がん剤による処置を受ける患者は、また、放射線療法も受けてもよく、および／または外科手術も受けてもよい。
疾患の処置について、治療用組成物の適切な投与量は、上で定義した処置される疾患の種類、疾患の重症度および経過、患者の臨床歴および薬剤に対する応答、および主治医の裁量によって決まるう。薬剤は、一度に、または一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。
治療および予防の方法ならびに組成物は、所望の効果を実現するために効果的な、組み合わせた量で提供してもよい。組織、腫瘍、または細胞は、１つまたはそれを超える薬剤を含む１つまたはそれを超える組成物もしくは薬理学的製剤（単数または複数）と接触させてもよく、または組織、腫瘍、および／または細胞を、２つまたはそれを超える別々の組成物もしくは製剤と接触させることによって接触させてもよい。また、このような併用療法は、化学療法、放射線療法、外科療法、または免疫療法と組み合わせて使用できることが意図されている。
ＩＶ．キットおよび診断
本発明の種々の態様において、体液または組織培養培地からエキソソームを精製するために必要なコンポーネントを含むキットが意図される。さらに別の態様において、エキソソームを単離し、単離されたエキソソーム内のマイクロバイオームの存在を決定するために必要なコンポーネントを含むキットが想定される。
キットは、このようなコンポーネントのいずれかを含む１つまたはそれを超える密封バイアルを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、キットは、また、キットのコンポーネントと反応しない容器である適切な容器手段（例えばエッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、または管）を含んでいてもよい。容器は、プラスチックまたはガラスなどの滅菌可能な材料から作られていてもよい。キットは、本明細書に記載された方法の手順のステップの概要を示す指示書をさらに含んでいてもよく、本明細書に記載されたものと実質的に同じ手順に従うか、または当業者に知られている。指示の情報は、コンピューターによって実行された場合に、サンプルからエキソソームを精製し、および／またはその中のエキソマイクロバイオームを同定する実際の手順または仮想的な手順を表示させる機械可読指示を含む、コンピューター可読媒体中にあってもよい。
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明するために含められている。以下の実施例において開示されている技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって見出された技術を示し、したがって、本発明の実施のための好ましいモードを構成するものとみなされ得ることを、当業者は理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、開示されている特定の実施形態に対して多くの変更を加えることができ、それでもなお、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、同様または類似の結果が得られ得ることを理解すべきである。
健常血清由来エキソソーム中の微生物ＤＮＡの同定
５人の健常ヒト対象から得た血清サンプル（１ｍＬ）からエキソソームを単離した。単離されたＤＮＡがいずれも内腔局在であることを確実にするために、単離されたエキソソームをＤＮＡ抽出前にＤＮＡｓｅで処理し、遊離して循環しているあらゆる核酸を除去した。ＤＮＡ抽出に続いて、このＤＮＡを、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のためのユニバーサルプライマー（２７Ｆ－Ｂ：ＡＧＲＧＴＴＹＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号１）、１４９２Ｒ：ＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ（配列番号２）；１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子について約１５００ｂｐ）を用いてＰＣＲ増幅した。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）ＤＮＡを陽性対照として使用した。ヒト細胞株Ｐａｎｃ－１および線維芽細胞ＢＪから単離されたＤＮＡ、ならびにブランク（テンプレートＤＮＡなし）を陰性対照として使用した。増幅されたＤＮＡを、ゲル電気泳動を用いて可視化した。このプロトコルを２回繰り返し、得られたデータを図１Ａ～Ｂに示す。
本明細書に記載および特許請求されている方法の全ては、本開示を考慮して、過度な実験を行うことなく実施または実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様によって説明されてきたが、本発明の概念、趣旨、および範囲を逸脱することなく、その方法に対して、ならびに本明細書に記載されている方法のステップまたは一連のステップにおいて、変更を加えてもよいことが当業者には明らかである。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある特定の薬剤を、本明細書に記載されている薬剤の代用としてもよく、それでもなお同じまたは類似の結果が達成されることが明らかである。当業者に明らかなこのような類似の置換および改変は、全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨、範囲、および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されているものを補足する、例示的な手順上またはその他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に援用される。
米国特許第９，９２１，２２３号
Figure 2022519326000002

Claims (25)

  1. 患者におけるマイクロバイオームを検出する方法であって、
    （ａ）患者から体液サンプルを得ること；
    （ｂ）前記体液サンプルのエキソソーム画分を単離すること；および
    （ｃ）前記エキソソーム画分中に存在する微生物巨大分子を検出すること
    を含む、方法。
  2. 前記マイクロバイオームが、マイクロバイオームシグネチャーである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記マイクロバイオームが、２つまたはそれを超える細菌種を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記微生物巨大分子が、微生物核酸分子である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記微生物核酸分子が、微生物ＤＮＡ分子である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記微生物核酸分子が、微生物１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記微生物核酸分子が、微生物ＲＮＡ分子である、請求項４に記載の方法。
  8. 前記微生物巨大分子が、微生物タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記微生物シグネチャーが、疾患のリスクファクターを指し示す、請求項２に記載の方法。
  10. 前記微生物シグネチャーが、疾患と関係することが知られている微生物シグネチャーと比較される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記微生物シグネチャーが、前記患者における疾患を指し示す、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記患者が、健常患者である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記患者が、寛解状態にあり、前記方法が、再発を検出する方法である、請求項１に記載の方法。
  14. 前記体液サンプルが、血液、リンパ、唾液、喀痰、尿、脳脊髄液、骨髄吸引物、眼滲出液／涙、または血清である、請求項１に記載の方法。
  15. 前記疾患が、がん、遺伝子刷り込み障害、神経障害、自己免疫疾患、または代謝障害である、請求項１１に記載の方法。
  16. 前記疾患が、がんであり、前記方法が、前記エキソソーム画分からグリピカン１含有エキソソームを単離することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  17. 前記がんが、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、脳がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記患者に治療剤を投与することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  19. 前記疾患が、がんであり、前記治療剤が、抗がん療法である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記患者の前記診断を報告することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  21. 報告することが、書面報告書または電子報告書を作成することを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記報告書を、前記患者、医師、病院、または保険会社に提供することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記患者が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
  24. 前記方法を２回目に実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  25. 前記２回目が、前記方法を最初に実施してから、少なくとも１日後、１週間後、または１か月後である、請求項２４に記載の方法。
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