CN117025773A - 一种用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物及其应用，涉及生物医药领域，所述标志物为Hsa_circ_0041150，本发明的标记物的试剂盒可用于小细胞肺癌铂类耐药诊断。本发明使用无创体液中新的肿瘤标志分子Hsa_circ_0041150对小细胞肺癌铂类化疗耐药患者进行诊断和预后监测，有利于临床诊疗。

Description

一种用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物及其应用
技术领域
本发明涉生物医药领域，具体而言，涉及一种用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物及其应用。
背景技术
肺癌是中国男性和女性癌症死亡的主要原因，占全球肺癌死亡人数的40％，给社会带来了巨大的负担。在所有类型的肺癌中，小细胞肺癌(small-cell lung cancer,SCLC)占15％，其复发率非常高，易早期转移，预后差，是非常危险的。根据发展阶段的不同，SCLC一般分为两种临床分期，即局限期(LD)和广泛期(ED)，由于SCLC具有肿瘤生长迅速、易早期转移扩散的特点，超过三分之二的患者被诊断为ED。因此，与绝大多数实体肿瘤不同，小细胞肺癌首选的治疗方法不是手术而是化疗，普遍接受的一线治疗方法是含铂联合化疗方案。
虽然绝大多数患者最初对化疗高度敏感，化疗后肿瘤消退明显，但临床问题在于耐药迅速出现，导致肿瘤复发或远处转移。由于SCLC患者很少接受手术，很难反复获得组织样本，且目前临床样本中SCLC肿瘤标志物主要涉及早期诊断，很少涉及化疗耐药的诊断，因此临床迫切需要从容易获得的样本中寻找新的SCLC化疗耐药生物标志物。
细胞外囊泡(EVs)是细胞分泌的纳米囊泡，平均直径约200纳米。它们包含多种成分，包括核酸、蛋白质、脂质、氨基酸和代谢物，在人体内作为细胞到细胞的运输系统，促进细胞成分的有效交换。检测生物体液中的EVs有可能提供有价值的诊断信息，反映细胞或组织的变化状态。目前对EVs的研究表明，这些纳米囊泡及其成分有望成为诊断、预后和治疗肺癌的新型生物标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物及其应用，解决背景提出所提出的至少一个技术问题。
第一方面，本发明提供一种用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物，所述标志物为Hsa_circ_0041150。
第二方面，本发明提供一种上述用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物在小细胞肺癌铂类耐药诊断中应用。
第三方面，本发明提供一种上述用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物在小细胞肺癌铂类耐药治疗中应用。
第四方面，本发明提供一种用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的试剂盒，所述试剂盒包含Hsa_circ_0041150的上、下游引物；上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8所示。
优先的，所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂、RNA提取所需试剂和荧光定量PCR反应所需试剂。
优先的，所述诊断标志物的检测样本为患者的临床生物样本。
优先的，所述临床生物样本包括血清。
第五方面，包括降低Hsa_circ_0041150表达的抑制剂，所述Hsa_circ_0041150的序列如：SEQ ID NO.1所示。
技术效果：
由于小细胞肺癌患者难以反复获取组织样本，本发明使用无创体液(血清+血清细胞外囊泡)中的新的肿瘤标志分子(Hsa_circ_0041150)对小细胞肺癌铂类化疗耐药患者进行诊断和预后监测，有利于临床诊疗。发现新的生物标志物，使用无创体液样本进行耐药诊断，无创体液中新的生物标志物诊断效率优于传统肿瘤标志物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1 H446和SHP77细胞之间circRNAs表达显著差异(|log2FC|>4,p值<0.05)；
图2 表达上调的环状RNAs的特征；
图3 表达上调环状RNAs的引物；
图4 上调的环状RNAs具有稳定的特征；
图5 circRNAs在SHP77细胞中的表达水平明显高于H446细胞；
图6 SCLC化疗耐药患者血清中circRNAs表达水平上调；
图7 SCLC化疗耐药患者血清细胞外囊泡中circRNAs表达水平上调；
图8 Hsa_circ_0041150对监测SCLC患者化疗耐药有较好的诊断效果；
图9 Hsa_circ_0041150联合NSE可提高SCLC化疗耐药患者的诊断敏感性和特异性；
图10 circRNAs和常规肿瘤标志物在SCLC化疗耐药患者中的ROC曲线；
图11 circRNAs和常规肿瘤标志物在SCLC化疗耐药患者中的诊断效率；
图12 Hsa_circ_0041150对监测SCLC患者从初诊到耐药的进展具有良好的价值；
图13 Hsa_circ_0041150表达水平与SCLC化疗耐药患者临床病理特征的临床关系；
图14 Hsa_circ_0041150促进SCLC细胞的增殖、侵袭、迁移和顺铂耐药。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
第一方面，本发明实施例提供一种用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物，所述标志物为Hsa_circ_0041150，序列如SEQ ID NO：1所示。
第二方面，本发明实施例提供一种上述用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物在小细胞肺癌铂类耐药诊断中应用。
第三方面，本发明实施例提供一种上述用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物在小细胞肺癌铂类耐药治疗中应用。
第四方面，本发明实施例提供一种用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的试剂盒，所述试剂盒包含Hsa_circ_0041150的上、下游引物。上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8所示。
进一步的，所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂、RNA提取所需试剂和荧光定量PCR反应所需试剂。反转录反应所需试剂包括II逆转录酶等，RNA提取所需试剂根据提取方法不同所需试剂不同。
本发明实施例，所述诊断标志物的检测样本为患者的临床生物样本，进一步的采用无创操作性体液(血清和血清细胞外囊泡)进行检测。
本发明实施例提供了上述标志物Hsa_circ_0041150的获得方法，具体为：
筛选小细胞肺癌化疗相对敏感细胞株(H446)和相对耐药细胞株(SHP77)，通过高通量测序方法筛选出两种细胞系中具有差异性表达的circRNAs，对差异有统计学意义的分子合成引物扩增，对产物送Sanger测序，验证环化位点。对验证成功环化的分子通过放线菌素D实验和RNA R酶实验进行半衰期和稳定性检测，对于筛选出的稳定的circRNAs分子，用QRT-PCR验证H446和SHP77细胞中circRNAs分子表达水平差异。为了筛选出适用于临床的分子，选择表达差异与测序结果一致，耐药后明显上调，且具有环状结构较稳定的circRNAs分子进行后续实验，最终选定6种circRNAs分子。分别为Hsa_circ_0041150、Hsa_circ_0017286、Hsa_circ_0040813、Hsa_circ_0001187、Hsa_circ_0003134、Hsa_circ_0000419。序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6所示。
选取54例临床使用铂类一线化疗方案的小细胞肺癌患者，同时收取耐药前和耐药后血清样本配对，同时检测耐药前后血清和血清细胞外囊泡中的circRNAs表达水平，最终筛选出差异最显著的分子：Hsa_circ_0041150。
具体的：
第一部分：筛选小细胞肺癌相对敏感和相对耐药细胞株中差异表达的circRNAs分子
1)检测细胞药物敏感实验
制备单细胞悬液,根据不同细胞(H446、SBC-3、H82、DMS273、H69、SHP77)生长速度，调节细胞数为(3-5)×103/mL，加入96孔板，每孔100μl。37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养24h，每孔分别加入不同浓度梯度的顺铂(DDP)、依托泊苷(VP16)，另设PBS对照组和空白对照组，每组均设3个复孔，37℃、5％ CO2培养箱中孵育24小时。24小时后，倒置显微镜下观察，将100μl 10％ CCK-8加入96孔板中，在37℃、5％ CO2条件下孵育2小时。然后在酶免疫OD 450nm处检测吸光度，绘制细胞生长曲线，计算IC50，根据相对IC50结果计算化疗耐药指数。通过使用小细胞肺癌化疗耐药常见的药物对常见人小细胞肺癌细胞系筛选，最终选定小细胞肺癌相对敏感细胞株(H446)和相对耐药细胞株(SHP77)进行测序。
2)通过高通量测序方法筛选出两种细胞系中差异性表达较大的circRNAs，NGS数据(GSE193854)见国家生物技术信息中心网站。
荧光定量PCR结果评定标准：以18S作为参照基因，检测各模板的Ct值，采取外参基因的△Ct法计算circRNAs的相对表达量。△Ct＝管家基因平均Ct值-待测组目的基因平均Ct值，通过软件分析，选择表达显著差异的circRNAs分子(|log2FC|>4,p值<0.05)。
第二部分：验证circRNAs分子的环状结构和稳定性
1)合成引物后进行qRT-PCR，对扩展产物进行Sanger测序检测环化位点。经RNAseR酶处理后，采用qRT-PCR检测circRNAs及其亲本基因对应的mRNA的表达量变化，circRNAs比其对应的mRNA更耐受RNAse R的消化作用，说明环状结构稳定。经放线菌素D处理，mRNA的半衰期显著变短，而circRNAs的半衰期更长，提示circRNAs比线性RNAs更稳定。通过RNA R酶实验和放线菌素D实验，验证circRNAs的稳定性。
2)在小细胞肺癌相对敏感细胞株(H446)和相对耐药细胞株(SHP77)中进行验证，选择在细胞中变化趋势与测序结果一致，且在耐药后显著上调的分子，因此选定6种circRNAs分子，分别为Hsa_circ_0041150、Hsa_circ_0017286、Hsa_circ_0040813、Hsa_circ_0001187、Hsa_circ_0003134、Hsa_circ_0000419。
第三部分：验证circRNAs分子在同一患者耐药前后的血清和血清细胞外囊泡中的变化趋势
1)收取配对的54例小细胞肺癌一线化疗方案耐药患者(耐药前+耐药后)血清标本2份，1份检测血清肿瘤标志物后，提取血清RNA，再逆转录进行RT-PCR；另一份使用超速离心法分离血清细胞外囊泡，提取细胞外囊泡RNA，逆转录进行RT-PCR。
2)超速离心法分泌细胞外囊泡，使用透射电镜、纳米流式及Western blot方法验证细胞外囊泡结构、大小和蛋白表达。
3)对耐药前后血清和血清细胞外囊泡中的circRNAs分子表达水平进行差异分析。
4)与传统的肺癌肿瘤标志物进行ROC分析比较，评估耐药后诊断效能。
因此选定Hsa_circ_0041150为研究的目的分子。
第四部分：评估Hsa_circ_0041150在小细胞肺癌耐药中作为新型生物标志物的价值
1)收取60例健康人、60例初诊初治小细胞肺癌患者，54例配对的耐药患者(耐药前+耐药后)血清标本，同时54例中有21例患者收集到了初次确诊未进行任何治疗时血清样本。
2)提取血清和血清细胞外囊泡RNA，逆转录经qRT-PCR检测Hsa_circ_0041150的表达水平，比较小细胞肺癌患者初次确诊时与健康人水平差异，以及小细胞肺癌患者Hsa_circ_0041150水平在治疗过程中的变化趋势。
3)通过生存曲线分析血清和血清细胞外囊泡中Hsa_circ_0041150不同表达水平与出现耐药时间之间的相关性。
4)对小细胞肺癌患者进行随访，并记录患者的复发、转移及预后情况，并分析耐药后Hsa_circ_0041150表达高低与患者临床病理参数之间的相关性，评估Hsa_circ_0041150在预测小细胞肺癌耐药方面的临床应用价值。
上述检测分析的过程为：
1、收集SCLC患者血清样本
本发明实施例的临床血清样本采集自接受铂类一线化疗方案治疗的SCLC患者。共招募174名参与者，分为三组:化疗耐药组、初诊组和健康对照组。对所有化疗耐药患者采集两次血清样本:一份样本在临床上确定为稳定疾病(SD)时采集，定义为化疗敏感；另一份样本在临床上确定为进展疾病(PD)时采集，定义为化疗耐药，疾病状态以当次住院治疗最终诊断为准。化疗耐药患者(n＝54)均采用相同的铂类一线化疗方案，每两个周期采用临床表现和影像学检查对所有患者进行评估。根据实体瘤应答评价标准1.1(RECIST 1.1)评价其治疗效果，将其疾病状态分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、病情稳定(SD)和病情进展(PD)。54例患者化疗周期均超过6个月，化疗后进展时间均大于90天。在这些疾病状态(CR、PR、SD和PD)中收集患者的血清样本，对SD(化学敏感)和PD(化学耐药)状态进行匹配检测和比较。同时我们收集了其中部分患者最初诊断时的另一份血清样本。我们还收集了患者的临床和病理资料，包括年龄、性别、临床分期、产生耐药时间、是否有淋巴转移、远处转移、吸烟史等。健康对照的纳入标准为肿瘤标志物正常、肝肾功能正常，无恶性肿瘤病史。初始诊断组的入选标准为初始诊断为SCLC，未进行任何临床治疗。
2、血清的分离
所有化疗耐药患者在SD和PD时采集外周静脉血，在3000×g离心10分钟分离血清。
3、血清细胞外囊泡的分离
采用超速离心法从患者外周血采集后的血清中分离EVs。血清与细胞通过分离凝胶管在3000×g下离心10分钟，然后在4℃、16 000×g下离心45分钟，去除细胞碎片和大脱落囊泡。将上清液在4℃、100 000×g超速离心1小时(Beckman Coulter,Optima MAX-XP,USA,Rotor:Beckman Coulter TLA55)，小心丢弃上清液。将微球重悬于1mL PBS中，再次在4℃和100 000×g下超速离心1小时。最后，丢弃上清，将细胞外囊泡重悬于20μl PBS中备用。通过透射电子显微镜(UltraScan 1000CCD,FEI,USA)观察细胞外囊泡形态，采用纳米流式细胞术分析血清EVs直径和浓度(富流生物科技，厦门)，使用Western blot检测细胞外囊泡特异性蛋白CD63和TSG101，以及阴性对照Calnexin。
4、RNA提取和实时定量PCR
使用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)从细胞、血清和血清EVs中提取总RNA。反转录PCR采用总RNA为1μg的II逆转录酶(Vazyme，南京，中国)合成cDNA。随后，用2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix(GenStar，北京，中国)在LightCycler480仪器(罗氏，德国)上对1ng cDNA进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)。
扩增条件设置为:95℃ 2分钟，95℃变性15s,60℃退火40s,72℃延伸30s,40个循环。内控采用18S核糖体RNA(18S rRNA)，采用比较周期阈值法2(-ΔΔCt)计算相对表达量进行数据分析
5、传统肿瘤标志物的检测
所有化疗耐药患者在SD和PD时采集外周静脉血，在3000×g离心10分钟分离血清。采用Alinty I型电化学发光免疫分析仪(Abbott，美国)检测肿瘤标志物，包括神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胃泌素释放肽前体(ProGRP)、糖类抗原125(CA125)和细胞角蛋白21-1(CA211)。所有的操作都严格按照试剂和仪器的指示进行。结果的判断标准为:当校准曲线正常，质控结果正常时，高于正常参考值范围上限[NSE:(0-16.3)ng/mL,ProGRP:(28.3-74.4)pg/mL,CA125:(0-35)U/mL,CA211:(0-3.3)ng/mL]定义为阳性结果。
6、构建过表达和敲低细胞系
Hsa_circ_0041150过表达慢病毒和相应的阴性对照来自广州吉赛，感染H446细胞。用5μg/ml,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA的嘌呤霉素(purromycin)转染稳定的细胞，建立H446过表达细胞系。Hsa_circ_0041150siRNA和shRNA购自中国广州RiboBio公司，Hsa_circ_0041150敲低慢病毒及其阴性对照购自中国上海的GeneChem公司。Hsa_circ_0041150敲低慢病毒分别感染H446和SHP77细胞。稳定转染后，用purromycin(5μg/ml,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)筛选细胞，建立H446敲低细胞系和SHP77敲低细胞系。所有程序严格按照试剂和仪器的说明进行。
7、细胞增殖实验
H446细胞(每孔2000个细胞)和SHP77细胞(每孔3000个细胞)分别接种于96孔板。第二天细胞状态良好时，每孔加入100μl 10％ CCK-8试剂(Beyotime)。然后在37℃,5％CO2培养箱中培养2小时。使用酶标仪在450nm处测量吸光度，在同一时间点连续5天重复该过程，用5天结果绘制不同组的增殖曲线。
8、细胞划痕实验
对于Hsa_circ_0041150过表达和敲低的H446细胞(5×105至1×106细胞/孔)，在对数生长期使用24孔板培养，在孔底部标记一条水平线，将板置于37℃,5％ CO2的培养箱中孵育。第二天，用200μl无菌移液器吸嘴制造一个垂直划痕，形成一个伤口，PBS清洗后采集伤口图像定义为0h。随后更换稍低浓度培养基(5％FBS-DMEM)，在37℃,5％ CO2培养箱中孵育。30h后取出24孔板，在显微镜下观察并拍照，分析不同组细胞的迁移能力。
9、细胞侵袭实验
在24孔板中加入800μl含有10％ FBS的培养基和Transwell腔室(康宁，美国)。Hsa_circ_0041150过表达和敲低的H446细胞(每孔5×104至1×105个细胞)在对数生长期制备单细胞悬液，加入200ul到Transwell室中，悬浮在培养基中。然后加了细胞的Transwell腔室置于含10％ FBS培养基的24孔板中，将细胞置于37℃的5％ CO2培养箱中，48小时后，去除上腔。用4％多聚甲醛(Beyotime)固定腔底15分钟，用0.1％结晶紫溶液(Beyotime)在室温下染色20分钟。随后，在显微镜下观察和拍摄Transwell腔，定量分析不同组细胞的侵袭能力。
10、顺铂耐药实验
将H446细胞(每孔3000-5000个细胞)接种于96孔板。顺铂(Solarbio)溶解于DMF(N'，N-二甲基甲酰胺)中，加入培养基中，最终浓度分别为0、50、100、150、200和250μg/ml，注意设置空白对照。第二天细胞生长状态良好时，分别在96孔板中加入100μl含不同浓度顺铂(0、50、100、150、200、250μg/ml)的培养基，37℃、5％ CO2培养箱中培养。24小时后，将100μl 10％ CCK-8试剂(Beyotime)加入96孔板中，在37℃、5％CO2条件下孵育2小时。然后使用酶标仪在450nm处测量吸光度以评估不同组细胞活力和对顺铂的耐受程度。
结果分析：
1、6个circRNAs分子在SCLC耐药细胞中稳定且显著上调
我们根据SCLC一线化疗药物顺铂(DDP)、依托泊苷(VP-16)的相对IC50(杀死50％细胞所需的药物剂量)和耐药指数，从H69、H82、H446、SHP77、SBC-3、DMS273等6个SCLC细胞系中鉴定出相对耐药细胞系SHP77和相对敏感细胞系H446。H446和SHP77细胞系的转录组高通量测序结果显示有1181个差异表达的circRNAs(NGS数据GSE193854见国家生物技术信息中心网站)。其中，按照(|log2FC|>4,p值<0.05)的标准，有8个circRNAs表达上调，5个circRNAs表达下调，见图1。为了寻找适合临床应用的SCLC耐药生物标志物，我们将重点放在上调的circRNAs上，circRNAs基本信息见图2，circRNAs引物序列见图3。随后，通过qRT-PCR验证上调的circRNAs，circBase中6个circRNAs(Hsa_circ_0041150、Hsa_circ_0017286、Hsa_circ_0040813、Hsa_circ_0001187、Hsa_circ_0003134、Hsa_circ_0000419)的序列与Sanger测序结果一致，见图4。此外，这六个circRNAs在放线菌素D处理后表现出比线性转录本mRNA更高的稳定性，见图4，并且对RNase R消化具有抗性，支持其环状结构，见图4。此外，这6个circRNAs分子经验证后，在SHP77细胞中的表达水平显著高于H446细胞，与测序结果一致，见图5。
2、这6个circRNAs分子的表达水平在SCLC化疗患者耐药后的血清中上调为了评估这6个circRNAs分子在SCLC患者化疗耐药中的临床意义，我们在疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)两个时间点收集了同一名接受一线化疗的患者的血清样本作为配对样本。我们的分析显示，4个circRNAs分子(Hsa_circ_0041150,Hsa_circ_0017286,Hsa_circ_0040813和Hsa_circ_0003134)在发生化学耐药后表现出增加。此外，当比较同一患者(n＝54)化疗耐药(PD)和病情稳定(SD)时间点之间的所有6个circRNAs分子的血清水平时，我们观察到它们在化疗耐药时的表达显著升高，见图6。
3、这6个circRNAs分子的表达水平在SCLC化疗患者耐药后的血清细胞外囊泡(EVs)中上调
我们采用超速离心方法从血清样本中分离出EVs，目的是研究这6个circRNAs分子是否特异性地包含在EVs中。通过透射电镜(TEM)、纳米流式细胞术(NanoFCM)和免疫印迹(western blotting)对血清EVs进行表征，评估其形态、浓度和标记物。TEM分析显示存在典型的可见膜双分子层，尺寸小于200nm。NanoFCM结果显示，纳米颗粒浓度为(2.03-2.53)×1010颗粒/ml，粒径范围为50～200nm。Western blotting进一步证实了经典EV蛋白标记CD63和TSG101的存在，表明从临床血清样品中成功提取了EVs。在此之后，我们检测了发生耐药性后血清EVs中6个circRNAs分子的表达。结果显示，化疗耐药后血清EVs中所有6个circRNAs均增加。此外，与同一患者(n＝54)病情稳定时相比，这些circRNAs在化疗耐药患者血清EVs中的表达水平显著更高。值得注意的是，我们的研究结果强调了血清EVs在预测化疗耐药方面的优越性能，与单独的血清相比，Hsa_circ_0041150在化疗耐药后的血清和血清EVs中与其他circRNAs相比，表现出最显著的差异，见图7。
4、Hsa_circ_0041150对SCLC患者化疗耐药有较好的诊断效果
Hsa_circ_0041150是一个外显子circRNA，位于chr17:131558-177370，大小为474bp。为了进一步探讨Hsa_circ_0041150在化疗耐药中的诊断价值，我们评估了血清和血清EVs中6个circRNAs的表达水平和ROC曲线下面积(AUC)。通过比较血清circRNAs、血清EVscircRNAs和传统临床肿瘤标志物NSE、proGRP、CA125、CA211对小细胞肺癌耐药的诊断效率，见图10，图11，我们发现血清EVs中Hsa_circ_0041150(AUC:0.7531)和血清中的Hsa_circ_0041150(AUC:0.7145)比其他circRNAs对化疗耐药的诊断价值更大，见图8，9。值得注意的是，NSE(AUC:0.7414)在预测SCLC患者化疗耐药方面优于其他临床肿瘤标志物，见图10，11。在这三个标记物中，EVs Hsa_circ_0041150对化疗耐药的SCLC患者表现出更强的预测作用。此外，这三种标志物联合使用比任何单一指标表现更好(AUC:0.8148)，灵敏度(70.37％)和特异性(81.48％)均有所提高，见图8，图9。
5、Hsa_circ_0041150对监测SCLC患者从初诊到耐药的进展具有良好的价值
我们对21例在我院接受一线化疗的SCLC患者进行了重点分析。我们比较了三个不同时间点血清和血清EVs中Hsa_circ_0041150的水平:初始诊断、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)。有趣的是，我们观察到，当患者被诊断为SCLC未进行任何治疗时，Hsa_circ_0041150在血清和血清EVs中都处于高水平，然而在一线化疗方案有效给药后，血清和血清EVs中Hsa_circ_0041150的表达水平迅速下降，差异有统计学意义(p<0.0001)。随后在化疗耐药的临床进展过程中，血清和血清EVs中Hsa_circ_0041150水平再次显著升高(p<0.0001)。为了进一步研究Hsa_circ_0041150在监测SCLC疾病进展中的潜在作用，我们还研究了60名来自本院的健康个体作为对照组。此外，我们在另外60名新诊断未治疗的SCLC患者中检测了Hsa_circ_0041150的表达水平。新诊断的SCLC患者血清和血清EVs中的Hsa_circ_0041150水平明显高于健康对照组。这些发现提示Hsa_circ_0041150水平可以作为监测SCLC疾病进展和化疗耐药进程的指标，见图12。
6、Hsa_circ_0041150表达水平与SCLC化疗耐药患者临床病理特征的临床关系
根据耐药后血清和血清EVs Hsa_circ_0041150表达水平的中位数，将化疗耐药SCLC患者分为低Hsa_circ_0041150组和高Hsa_circ_0041150h组。我们分析Hsa_circ_0041150表达水平与各种临床病理参数的关系，包括年龄、性别、临床分期、淋巴转移、远处转移、吸烟史以及从SD到PD的进展时间。结果显示，血清和血清EVsHsa_circ_0041150表达水平与SD到PD进展时间之间存在显著相关性，见图13。同时SCLC患者出现耐药后血清和血清EVs中hsa_circ_0041150水平越高，出现化疗耐药的时间越短，见图12。
7、Hsa_circ_0041150促进SCLC细胞的增殖、侵袭、迁移和顺铂耐药
为了研究Hsa_circ_0041150在SCLC化疗耐药中的作用，我们在H446细胞中建立了Hsa_circ_0041150稳定过表达细胞株(H446-overexpressing)，在H446和SHP77细胞中建立了Hsa_circ_0041150稳定敲低细胞株(H446-knockdown和SHP77-knockdown)。细胞增殖实验显示，过表达Hsa_circ_0041150显著增加SCLC细胞的增殖，而敲低Hsa_circ_0041150则产生相反的效果。此外，细胞划痕实验表明，过表达Hsa_circ_0041150显著增强了SCLC细胞伤口愈合的迁移能力，而敲低Hsa_circ_0041150则减缓了伤口愈合和细胞迁移。transwell实验结果显示，过表达Hsa_circ_0041150显著增强了SCLC细胞的侵袭能力，而敲低Hsa_circ_0041150则削弱了SCLC细胞的侵袭能力。此外，在顺铂耐药实验中，我们观察到过表达Hsa_circ_0041150显著增强了SCLC细胞对顺铂的耐受能力，而敲低Hsa_circ_0041150导致对顺铂的耐受能力降低，见图14。总之，我们的研究结果表明Hsa_circ_0041150促进SCLC细胞的增殖、迁移、侵袭和顺铂耐药性。
以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (8)

1.一种用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物，其特征在于，所述标志物为Hsa_circ_0041150，序列如：SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物在小细胞肺癌铂类耐药诊断中应用。
3.权利要求1所述用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的标志物在小细胞肺癌铂类耐药治疗中应用。
4.一种用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含Hsa_circ_0041150的上、下游引物；上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8所示。
5.如权利要求4所述用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂、RNA提取所需试剂和荧光定量PCR反应所需试剂。
6.如权利要求4所述用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的试剂盒，其特征在于，所述诊断标志物的检测样本为患者的临床生物样本。
7.如权利要求4所述用于小细胞肺癌铂类耐药诊断的试剂盒，其特征在于，所述临床生物样本包括血清。
8.一种抑制小细胞肺癌铂类耐药的制剂，其特征在于，包括降低Hsa_circ_0041150表达的抑制剂，所述Hsa_circ_0041150的序列如：SEQ ID NO.1所示。
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