CN112779329B - 病毒性脑膜炎辅助诊断分子标记物及其应用和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种病毒性脑膜炎辅助临床诊断分子标记物及其应用和试剂盒。首先采用miSeq高通量测序技术对病毒性脑膜炎和正常对照两大组脑脊液样本进行系统基因芯片分析，筛选差异miRNA表达，进而采用RT‑qPCR技术对筛选出的差异表达miRNA逐个验证，最终发现，miR‑RNA 18_41385，hsa‑miR‑486‑5p，hsa‑miR‑4497和hsa‑miR‑3178可作为病毒性脑膜炎早期辅助临床诊断的特异性标记物。这些标记物还能对其它脑膜炎进行鉴别诊断。本发明试剂盒具有稳定性好，检测方法简便、敏感性高和具有特异性等优点，实现了对临床现有病毒性脑膜炎诊断方法的有效补充和对病毒性脑膜炎患者的快速确诊，对降低病毒性脑膜炎的死亡率、改善治疗效果及预后具有重要意义。

Description

病毒性脑膜炎辅助诊断分子标记物及其应用和试剂盒
技术领域
本发明属于病毒性脑膜炎诊断技术领域，具体涉及病毒性脑膜炎诊断的脑脊液特异性分子标记物，及其应用和配套的检测试剂盒。
背景技术
在我国乃至全世界，病毒性脑膜炎是比较常见而严重的中枢神经系统感染性疾病，可由各种病毒侵犯脑膜所致。病毒性脑膜炎可引起发热、头痛、呕吐，严重时可造成永久性脑损伤，甚至死亡。与其它类型中枢神经系统感染的临床表现极为相似，需要结合病史、脑脊液检查及病原学分析进行鉴别；同时一些非病毒感染性疾病如化脓性脑膜炎、真菌性脑膜炎、结核性脑膜炎等所表现出的症状也与病毒性脑膜炎相似，所以临床上经常导致很多病毒性脑膜炎患者早期误诊误治，错过早期的最佳抗病毒治疗时间，到后期又难以治愈，很多病人由于没有得到及时而有效的治疗,造成死亡或者留下严重的后遗症。目前，病毒性脑膜炎早期的脑脊液及影像学检查也缺乏特异性，极易误诊。如果可以在早期对患者进行有效的抗病毒治疗，大部分患者将效果良好，而若延误治疗则致残率、致死率很高。因此，早期能快速、准确地从脑膜炎患者脑脊液等临床标本中检测出病毒性脑膜炎的感染特征性标记分子和核酸，对病毒性脑膜炎的早期诊断和治疗、预后具有重要的临床指导意义和市场开发价值。
目前关于病毒性脑膜炎的确诊，大多数医院临床检验师、临床医师、研究者主要还是在影像学证据的基础上依靠临床表现和实验室检查结果等来进行综合经验判断。
(1)苏木精—伊红染色法(简称HE染色)，苏木精染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色，可观察到细胞的一般形态结特点。虽然HE染色广泛应用在病毒性脑膜炎的辅助诊断，但其诊断特异性较差，准确率与检查者的技术与经验直接有关，具有一定的不确定性。
(2)脑脊液或脑组织病原检测是确诊病毒性脑膜炎的金标准。然而，脑膜炎过程常局限在颞叶的中央和深层，如果取材不到位即达不到目的，而且病毒种类较多，新发或不明原因病毒性脑膜炎的增多，病毒分离常规开展很困难，且缺乏特异、敏感的分子生物学检测方法。①用脑组织作病毒分离是目前公认的最可靠确诊手段，但不能作为常规诊断手段，首先是诊断时间，部分病毒(如单纯疱疹病毒)可短时间内即可从神经组织中消失，其次活检还可能对大脑造成伤害，偶尔引起大出血或并发感染。②目前应用最多的是脑脊液中多种病毒特异性抗体(IgG、IgA、IgM)检测，在病毒性脑膜炎诊断中其阳性率为88.9％，而在病毒性脑膜炎早期诊断中其阳性率仅为32.5％。③PCR技术检测脑脊液中病毒基因是新兴的分子基因检测技术，检测方法快速、便捷，但是脑脊液CSF中病毒或其抗原含量微量，导致检测阳性率极低，容易出现假阳性，且依赖于基因组测序平台。④免疫学和血清学方法也具有一定的局限性，同时受实验室条件所限尚未普遍开展，确诊往往无特异性。
(3)CT、MRI等影像学技术在病毒性脑膜炎早期诊断检查，其阳性率极低，一般早期很难发现病灶或无异常表现，病毒性脑膜炎的脑电图波型主要为弥漫性不规则高波幅慢波,对局灶性病变,脑电图常表现为一侧较重,可协助判断病变部位，病毒性脑膜炎患者脑功能异常早于结构异常，而且病灶边缘的清晰度不一，容易造成与其他疾病的混淆，而且在发病的初期，其影像学特异性表现并不明显，CT、MRI等影像学技术对于病毒性脑膜炎的诊断的准确率主要是在发病的中、晚期，且其检查价格高昂，不适合作为大众人群的常规筛查手段。
microRNA(miRNA)是真核生物中一类长度约为22个核苷酸的参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA，机体内大多数miRNA的主要功能是调节内源性基因表达、参与细胞周期调控及个体发育过程。在神经系统中miRNA可调节不同发育阶段及不同部位的病生理条件下神经细胞的增殖、分化与凋亡，并对人类的认知和记忆能力的形成起重要作用。
本发明从临床脑脊液标本中在基因组水平进行筛选，从而建立病毒性脑膜炎差异表达的miRNA特异表达谱，将显著提高对病毒性脑膜炎的早期诊断率。研究发现多个特异性miRNA组合后其检测效率可比单个特异性miRNA大幅提高。本发明由4种经初筛和鉴定验证的病毒特异相关miRNA联合组成，诊断病毒性脑膜炎具有较高的诊断价值，诊断标记物特异度可达91％。miRNA作为病毒性脑膜炎分子标志物具有稳定、易得、高效的优点：miRNA序列保守，在脑脊液中稳定存在，可长期保存。本发明试剂盒在早期基因诊断病毒性脑膜炎过程中具有稳定性好、检测方法简便和高敏感性、高特异性等优点，实现了对现有病毒性脑膜炎早期诊断方法的有效补充和对病毒性脑膜炎患者的快速精确确诊，使那些原本可能错过最佳治疗时机的早中期病毒性脑膜炎患者受益，对降低结病毒性脑膜炎的死亡率、改善治疗效果和预后具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的是针对背景技术中现有技术存在的问题，提供新型病毒性脑膜炎诊断分子标记物，包含以下4种miRNA中至少一种：miR-RNA 18_41385、hsa-miR-486-5p，hsa-miR-4497和hsa-miR-3178。
miR-RNA 18_41385序列如SEQ ID NO.1所示；
hsa-miR-486-5p序列如SEQ ID NO.2所示；
hsa-miR-4497序列如SEQ ID NO.3所示；
hsa-miR-3178序列如SEQ ID NO.4所示。
所述的病毒性脑膜炎诊断分子标记物用于辅助诊断时，在脑脊液检测中
miR-RNA 18_41385在病毒性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人升高。
hsa-miR-486-5p在病毒性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人升高。
hsa-miR-4497在病毒性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人降低。
hsa-miR-3178在病毒性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人降低。
miR-RNA 18_41385在结核性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人降低。
hsa-miR-486-5p在结核性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人降低。
hsa-miR-4497在结核性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人升高。
hsa-miR-3178在结核性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人升高。
miR-RNA 18_41385在隐球菌性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人降低。
hsa-miR-486-5p在隐球菌性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人降低。
hsa-miR-4497在隐球菌性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人升高。
hsa-miR-3178在隐球菌性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人升高。
miR-RNA 18_41385在化脓性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人降低。
hsa-miR-486-5p在化脓性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人降低。
hsa-miR-4497在化脓性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人升高。
hsa-miR-3178在化脓性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人升高。
本发明的第二个目的是提供检测四种miRNA中至少一种表达量的试剂在制备病毒性脑膜炎诊断制剂中的应用，所述的四种miRNA为：miR-RNA 18_41385、hsa-miR-486-5p，hsa-miR-4497和hsa-miR-3178；
miR-RNA 18_41385序列如SEQ ID NO.1所示；
hsa-miR-486-5p序列如SEQ ID NO.2所示；
hsa-miR-4497序列如SEQ ID NO.3所示；
hsa-miR-3178序列如SEQ ID NO.4所示。
所述的检测四种miRNA中至少一种表达量的试剂包括PCR检测试剂或原位杂交检测试剂。
PCR检测试剂包括扩增四种miRNA的引物，序列如下：
miR-RNA 18_41385引物序列如SEQ ID NO.5所示；
hsa-miR-486-5p引物序列如SEQ ID NO.6所示；
hsa-miR-4497引物序列如SEQ ID NO.7所示；
hsa-miR-3178引物序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的第三个目的是提供一种病毒性脑膜炎诊断试剂盒，包括检测四种miRNA中至少一种表达量的试剂；四种miRNA为：miR-RNA 18_41385、hsa-miR-486-5p，hsa-miR-4497和hsa-miR-3178；
miR-RNA 18_41385序列如SEQ ID NO.1所示；
hsa-miR-486-5p序列如SEQ ID NO.2所示；
hsa-miR-4497序列如SEQ ID NO.3所示；
hsa-miR-3178序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明在临床脑脊液标本中，从基因组水平进行筛选，快速建立病毒性脑膜炎差异表达的miRNA特异表达谱以提高对病毒性脑膜炎的早期诊断率。miRNA序列保守，在脑脊液中稳定存在，可长期保存，因此本发明试剂盒具有稳定、易得、高效的优点。本发明试剂盒在早期基因诊断病毒性脑膜炎过程中具有检测方法简便、高敏感性、特异性高等优点，有效避免了临床诊断中病原学病毒分离培养耗时且难以分离，和血清学检测阳性率低的实际问题，实现了对现有病毒性脑膜炎诊断方法的有效补充和对病毒性脑膜炎患者的快速精确确诊。
本发明首先采用miSeq高通量测序技术对病毒性脑膜炎和正常对照两大组脑脊液样本(病毒性脑膜炎患者脑脊液样本25例，相对正常脑脊液样本20例)进行系统基因芯片分析，筛选差异miRNA表达，进而采用RT-qPCR技术对筛选出的差异表达miRNA逐个验证，最终发现，miR-RNA 18_41385，hsa-miR-486-5p，hsa-miR-4497和hsa-miR-3178可作为病毒性脑膜炎早期诊断的特异性标记物。本发明研究测序和RT-qPCR结果中均显示miR-RNA 18_41385、hsa-miR-486-5p与健康对照组相比，在病毒性脑膜炎脑脊液中高表达，hsa-miR-4497和hsa-miR-3178在病毒性脑膜炎脑脊液中低表达，可以区别病毒性脑膜炎和健康对照组，还能对其它脑膜炎进行鉴别诊断，miR-RNA 18_41385、hsa-miR-486-5p在结核性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎、化脓性脑膜炎脑脊液中与健康对照组相比均低表达，hsa-miR-4497和hsa-miR-3178在结核性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎、化脓性脑膜炎脑脊液中与健康对照组相比均高表达，进而可以区别病毒性脑膜炎和结核性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎、化脓性脑膜炎三种脑膜炎。
本发明RT-qPCR方法扩增出来的产物经过测序验证，证实就是miR-RNA 18_41385，hsa-miR-486-5p，hsa-miR-4497和hsa-miR-3178。
本发明通过对病毒性脑膜炎感染患者、正常对照的脑脊液中小RNA提取，通过高通量测序后对miRNA进行鉴定及表达分析，将各样本的small RNA序列与miRBase数据库进行比对，然后对miRNA差异表达进行筛选，P<0.05且log2(fold change)≠0被定义为两组之间的差异表达miRNA，其中log2(fold change)>0标记为miRNA上调；log2(fold change)<0标记为miRNA下调。结果显示在病毒性脑膜炎患者与正常对照比较显示有6例miRNAs高表达，有8例miRNAs低表达，随即用已临床诊断的脑脊液标本采用qRT-PCR技术对筛选出的差异表达miRNA逐个验证，从而选出4种显著差异表达的miRNA作为早期诊断病毒性脑膜炎的生物标志。即miR-RNA 18_41385，hsa-miR-486-5p，hsa-miR-4497和hsa-miR-3178(表1)。本发明测序和RT-qPCR结果中均显示这4种miRNA联合表达谱系在病毒性脑膜炎脑脊液中差异表达，可以区别病毒性脑膜炎和健康对照组，还能对其进行鉴别诊断。
microRNAs长度大约是22nt，具有能形成分子内茎环结构的前体，成熟的miRNA的5’端有一个磷酸基团，3’端为羟基，它们可以和上游或下游的序列不完全配对形成茎环结构，呈二级茎环结构相对稳定不易被降解，可通过血脑屏障，使得microRNAs可作为新的生物标志物应用于病毒性脑(膜)炎的早期诊断。本发明筛选得到miRNAs中miR-RNA 18_41385(即18_41385‘Mir-7911家族’)和hsa-miR-486-5p有3个二级茎环结构，hsa-miR-3178有7个二级茎环结构，hsa-miR-4497有4个二级茎环结构(图1)，即选取的miRNAs结构稳定不易降解，可在人体中稳定存在。
总之，本发明通过实验得到的4种特异性标记物microRNAs，长度大约是19-25nt，而其前体碱基序列一般在60-80nt，呈现二级茎环结构，其上游或下游的序列不完全配对形成的茎环结构，结构稳定，不易被降解，其中miR-RNA 18_41385和hsa-miR-486-5p有3个二级茎环结构，hsa-miR-3178有7个二级茎环结构，hsa-miR-4497有4个二级茎环结构。miRNA基因在基因组中有多种存在形式，如单拷贝，多拷贝或基因簇等形式，其位置大多落于基因间隔区，并且转录独立于其他基因，具有本身的转录调控机制。本发明通过对病毒性脑膜炎感染患者、正常对照的脑脊液中差异microRNAs分析，构建了microRNAs表达谱，该诊断特异度可达91％。miRNA作为病毒性脑膜炎分子标志物具有稳定、易得、高效的优点：miRNA序列保守，在脑脊液中稳定存在，可长期保存，具有较高的诊断价值。进行生物信息学分析，发现：①新miR-RNA 18_41385(是本发明首次发现的一种新的miR-RNA有其结构和序列)经过序列比对，其位于人18号染色体，即18q21.33(图12a-c)，和新miR-RNA 18_41385在NCBISequence Viewer软件中RNA-Seq分析，其外显子覆盖率和内含子跨读结果(图12d)；②mir-4497位于12号染色体，即12q24.11(图13a-c)，和其在NCBI Sequence Viewer软件中dbSNP及其RNA-Seq分析外显子覆盖率和内含子跨读结果(图13d)，及mir-4497的名称MIMAT0019032，发夹结构序列，深度测序结果及其在基因组中的位置(图13e)；③mir-486-5p位于8号染色体，即8p11.21(图14a-c)，和其在NCBI Sequence Viewer软件中dbSNP及其RNA-Seq分析外显子覆盖率和内含子跨读结果(图14d)，及mir-486-5p的名称为MIMAT0002177，发夹结构序列，深度测序结果及其在基因组中的位置(图14e)；④mir-3178位于16号染色体，即16p13.3(图15a-c)，和其在NCBI Sequence Viewer软件中dbSNP及其RNA-Seq分析外显子覆盖率和内含子跨读结果(图15d)，及mir-3178的名称为MIMAT0015055，发夹结构序列，深度测序结果及其在基因组中的位置(图15e)。
表1：病毒性脑膜炎感染患者、正常对照的脑脊液中miRNAs的差异性对比
Probe Set ID mirbase Accession No FoldChange_Log2 Active_Sequence
miR-RNA18_41385 AC025656.7 5.918642 uugcgaaugcagacauga
hsa-miR-486-5p MIMAT0006344 5.019704 uccuguacugagcugccccgagg
hsa-miR-3178 MIMAT0015055 -5.3172 ggggcgcggccggaucg
hsa-miR-4497 MIMAT0019032 -5.68099 cuccgggacggcugggc
表2：PCR检测试剂包括扩增四种miRNA的引物，序列如下
miRNA name Primer Sequence
miR-RNA18_41385 cgccttgcgaatgcagacatg
hsa-miR-486-5p tatatatcctgtactgagctgccccga
hsa-miR-3178 tatataggggcgcggccg
hsa-miR-4497 tatatactccgggacggctggg
本发明效果、优点
病毒性脑膜炎可引起发热、头痛、呕吐，严重时可造成永久性脑损伤，甚至死亡，临床表现多样，并且不具有典型性。而常见的临床诊断手段如HE染色、脑脊液常规检测、常规毒理学检验等不仅检测手段耗费人力、时间多，错过最佳治疗时间，且灵敏性不高，缺乏特异性，假阳性率较高，容易出现误检、漏检情况。
而本发明从临床脑脊液标本中在基因组水平进行筛选，从而建立病毒性脑膜炎差异表达的miRNA特异表达谱，将显著提高对病毒性脑膜炎的早期诊断率。研究发现单个miRNA对于病毒性脑膜炎的诊断效率由于受到个体差异，实验方法的影响，结果重复性会比组合多种miRNA差一些，组合后其效率可大幅提高。本发明由4种miRNA联合诊断病毒性脑膜炎具有较高的诊断价值，诊断标记物特异度可达91％(图11)。miRNA作为病毒性脑膜炎分子标志物具有稳定、易得、高效的优点：miRNA序列保守，在脑脊液中稳定存在，可长期保存。本发明试剂盒在早期基因诊断病毒性脑膜炎过程中具有稳定性好、检测方法简便和高敏感性、特异性等优点，实现了对现有病毒性脑膜炎诊断方法的有效补充和对病毒性脑膜炎患者的快速精确确诊，使那些原本可能错过最佳治疗时机的患者受益，对降低结病毒性脑膜炎的死亡率、改善治疗效果及预后具有重要意义。
附图说明
图1：新miR-RNA 18_41385和mir-486-5p，mir-3178，mir-4497的序列和结构；
图2：病毒性脑炎患者脑脊液miRNA鉴定结果：density和boxplot分析图；
图3：病毒性脑膜炎患者脑脊液miRNA鉴定结果：PCA和volcano plot分析图；
图4：病毒性脑炎患者脑脊液miRNA鉴定结果：Heatmap图；
图5：病毒性脑炎患者脑脊液miRNA-4497和miRNA-18验证结果(NC:对照，EV:病毒性脑膜炎患者)；
图6：病毒性脑炎患者脑脊液miRNA-486-5p和mir-3178验证结果(NC:对照，EV:病毒性脑膜炎患者)；
图7：结核性脑炎、隐球菌性脑炎、化脓性脑炎患者脑脊液miRNA-4497和miRNA-18验证结果；
图8：结核性脑炎、隐球菌性脑炎、化脓性脑炎患者脑脊液miRNA-486-5p和mir-3178验证结果；
图9：细胞模型：miRNA-4497和新miR-RNA 18验证结果；
图10：细胞模型：miRNA-486-5p和mir-3178验证结果；
图11:ROC曲线分析脑脊液miRNAs在病毒性脑炎中的意义及其诊断价值；
图12:miRNA 18_41385的生物信息分析结果；
图13：miR-4497的生物信息分析结果；
图14：miR-486-5p的生物信息分析结果；
图15：miR-3178的生物信息分析结果；
图16：病毒性脑膜炎患者脑脊液miRNA功能分析：GO和KEGG结果。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
本发明通过实验对病毒性脑膜炎感染患者、正常对照的脑脊液中小RNA提取，通过高通量测序后对miRNA进行鉴定及表达分析，将各样本的small RNA序列与miRBase数据库进行比对，然后对miRNA差异表达进行筛选，P<0.05且log2(fold change)≠0被定义为两组之间的差异表达miRNA，其中log2(fold change)>2标记为miRNA上调；log2(fold change)<0标记为miRNA下调。结果显示在病毒性脑膜炎患者与正常对照比较显示有6例miRNAs高表达，有8例miRNAs低表达，本发明从中选出4例显著差异表达的miRNA作为早期诊断病毒性脑膜炎的生物标志，即miR-RNA18_41385，hsa-miR-486-5p，hsa-miR-4497和hsa-miR-3178，并采用RT-qPCR技术对筛选出的差异表达miRNA逐个验证，最终发现，miR-RNA18_41385，hsa-miR-486-5p，hsa-miR-4497和hsa-miR-3178可作为病毒性脑膜炎早期诊断的标记物。
本发明病毒性脑膜炎患者、结核性脑膜炎患者、隐球菌性脑膜炎患者、化脓性脑膜炎患者的入组标准：1.已在临床医生根据临床症状、脑脊液常规生化检测、HE染色等手段确诊的脑炎患者；2.选取的患者脑脊液为早期诊断，未经任何药物治疗的标本。
实施例1：density和boxplot分析结果图
通过对病毒性脑膜炎感染患者、健康成人的脑脊液中小RNA提取，进行miRNA鉴定，生物信息学分析统计为density和boxplot分析图(图2)，结果发现病脑组和对照组中miRNAs整体种类数量上并无差异。
实施例2：density和boxplot分析图PCA和volcano plot分析结果图
通过对病毒性脑膜炎感染患者、非病毒性感染患者、健康成人的脑脊液中小RNA提取，进行miRNA鉴定，生物信息学分析统计为PCA和volcano plot分析图(如图3)，结果发现病脑组和对照组中miRNAs整体数量上相差无几。
实施例3Heatmap图
通过对病毒性脑膜炎感染患者、健康成人的脑脊液中小RNA提取，进行miRNA鉴定，通过Heatmap图来可视化差异表达基因在不同样本中的差异表达情况(如图4)。
实施例4临床确诊样品miRNA验证结果
提取病毒性脑膜炎和正常对照组脑脊液miRNA，对miR-4497(选取正常对照14例，病毒性脑膜炎患者23例)，miR-RNA 18即miR-RNA18_41385(选取正常对照18例，病毒性脑膜炎患者21例)(如图5)和miR-RNA-486-5p(选取正常对照15例，病毒性脑膜炎患者15例)，miR-RNA-3178(选取正常对照16例，病毒性脑膜炎患者18例)(如图6)进行验证，发现与miRNA测序分析相匹配。提取结核性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎、化脓性脑膜炎脑脊液miRNA，对miR-4497和miR-RNA 18(如图7)、miR-RNA-486-5p和miR-RNA-3178(如图8)进行鉴别性诊断，发现其表达情况与病毒性脑膜炎患者有差异。
实施例5细胞模型—miRNA验证结果
建立细胞模型，以水疱性口炎病毒(VSV)感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)4小时，模拟病毒性脑膜炎患者，对miRNA-4497和新miR-RNA 18(图9)、miR-RNA-486-5p和miR-RNA-3178(图10)进行验证，发现miRNA-4497和新miR-RNA 18、miR-RNA-486-5p和miR-RNA-3178的结果与检测结果一致。
图中MOI：(multiplicity of infection)，即感染复数，指的是感染时病毒与细胞数量的比值。
实施例6：miRNAs的生物信息学分析
为了评估脑脊液miRNAs表达水平在病毒性脑炎诊断中的临床价值，我们通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)来评估区分不同群体的能力和效率，作为对“病”和“非病”等二元状态的诊断，对其作为病毒性脑炎潜在诊断标志或药物靶点进行评估。图11A显示应用脑脊液miR-4497辨别正常人群和病毒性脑炎患者的ROC曲线下面积(Area under curve，AUC)为0.927(p<0.001)，95％的可信区间(Confidence interval，CI)为0.848-1.006，以68.32％为诊断临界值(cut-off)时，其诊断的敏感性为82.61％和特异性为85.71％；miR-RNA 18(即mir-18_41385)在病毒性脑炎患者中显著升高，图11B脑脊液miR-RNA 18能有效区分病毒性脑炎患者和正常人群，结果显示AUC为0.939(p<0.001)，95％CI为0.870-1.009，以80.95％为cut-off值，其诊断的敏感性为80.95％和特异性为100％。图11C脑脊液miR-486-5p能有效区分病毒性脑炎患者和正常对照人群，结果显示AUC为0.753(p＝0.018)，95％CI为0.577-0.930,以33.34％为cut-off值，其诊断的敏感性为66.67％和特异性为66.67％。此外，图11D脑脊液miR-3178也能辨别正常人群和病毒性脑炎患者，结果显示AUC为0.785(p＝0.005)，95％的可信区间(CI)为0.627-0.942,以40.28％为cut-off值，其诊断的敏感性为77.78％和特异性为62.50％。四种miRNA一起检测，联合运用，其敏感度和特异性则较高。
实施例7：miRNAs的生物信息学分析
将新miRNAs在NCBI、miRBase软件中进行生物信息学分析，发现：①新miR-RNA 18_41385经过序列比对，其位于人18号染色体，即18q21.33(图12a-c)，和新miR-RNA 18_41385在NCBI Sequence Viewer软件中RNA-Seq分析，其外显子覆盖率和内含子跨读结果(图12d)；②mir-4497位于12号染色体，即12q24.11(图13a-c)，和其在NCBI Sequence Viewer软件中dbSNP及其RNA-Seq分析外显子覆盖率和内含子跨读结果(图13d)，及mir-4497的名称MIMAT0019032，发夹结构序列，深度测序结果及其在基因组中的位置(图13e)；③mir-486-5p位于8号染色体，即8p11.21(图14a-c)，和其在NCBI Sequence Viewer软件中dbSNP及其RNA-Seq分析外显子覆盖率和内含子跨读结果(图14d)，及mir-486-5p的名称为MIMAT0002177，发夹结构序列，深度测序结果及其在基因组中的位置(图14e)；④mir-3178位于16号染色体，即16p13.3(图15a-c)，和其在NCBI Sequence Viewer软件中dbSNP及其RNA-Seq分析外显子覆盖率和内含子跨读结果(图15d)，及mir-3178的名称为MIMAT0015055，发夹结构序列，深度测序结果及其在基因组中的位置(图15e)。
实施例8miRNAs的生物信息学分析—GO、KEGG通路分析
通过对病毒性脑膜炎感染患者、健康成人的脑脊液中小RNA提取，进行miRNA鉴定，对miRNAs进行生物信息学分析-GO功能分析、KEGG通路分析(图16)。
在本发明中，对miRNA预测的靶基因进行GO富集分析，通过富集到的60个条目来推断miRNA的功能，结果显示在分子功能中催化活性(catalytic activity)和核苷磷酸盐结合(nucleoside phosphate binding)条目中富集靶基因最多且与靶基因关系最为密切。此外，在细胞组分部分，细胞内组分(intracellular part)、细胞内膜-有界细胞器(intracellular membrane-bounded organelle)和在生物学功能部分，核苷酸结合(nucleotide binding)、小分子结合(small molecule binding)、ATP结合(ATP binding)、腺苷核糖核苷酸结合(adenyl ribonucleotide binding)位于富集的前几位，它们与病毒性脑炎分子标志物的探寻及其机制作用值得进一步深入研究。对病毒性脑炎脑脊液中的miRNA靶基因进行KEGG通路分析，通过分析参与信号通路中差异表达miRNA靶基因的数目和比例，结果显示溶酶体(Lysosome)、同源重组(Homologous recombination)、神经营养素信号通路(Neurotrophin signaling pathway)、赖氨酸降解(Lysine degradation)、內吞作用(Endocytosis)等信号通路所占比例较高。因此，这些miRNA靶向调控的靶基因可能通过上述信号通路参与到病毒性脑炎疾病发生和发展过程中，特别是KEGG通路分析显示溶酶体通路位于第一位，提示该信号通路可能与病毒性脑炎发生发展过程最相关，研究发现，溶酶体是动态细胞器，主要功能有分泌、内吞、自噬和吞噬、降解大分子等，影响组织蛋白酶的成熟，并抑制由内吞作用介导的表皮生长因子受体的降解。
本发明的临床应用与试剂盒开发
本发明发现了病毒性脑炎脑脊液早期诊断的高特异性、高灵敏度的诊断标志物：miR-4497、mir-18_41385、miR-486-5p和miR-3178，这四种miRNA联合运用可以用于早期病毒性脑炎的分子辅助诊断以及疑似病毒性脑炎病例的鉴别诊断。本发明试剂盒通过经典的q-PCR技术检测患者脑脊液中的miRNA，即通过4种miRNA联合检测试剂盒运用，确保了样本检测的可信度与准确性，同时需求样本量较少(小RNA为50ng)，分析简单。为临床提供了可简便使用的早期辅助诊断试剂盒，具有早期快速检测(5-6小时)、灵敏度高、特应性好、易于使用、分析简单等优点。
序列表
<110> 中南大学湘雅三医院
<120> 病毒性脑膜炎辅助诊断分子标记物及其应用和试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
uugcgaaugc agacauga 18
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
uccuguacug agcugccccg agg 23
<210> 3
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
cuccgggacg gcugggc 17
<210> 4
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
ggggcgcggc cggaucg 17
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgccttgcga atgcagacat g 21
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tatatatcct gtactgagct gccccga 27
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tatatactcc gggacggctg gg 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tatatagggg cgcggccg 18

Claims (9)

1.病毒性脑膜炎辅助诊断分子标记物，其特征在于，为miR-RNA 18_41385；miR-RNA18_41385序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的病毒性脑膜炎辅助诊断分子标记物，其特征在于，miR-RNA18_41385 在病毒性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人脑脊液升高。
3.检测四种miRNA中至少一种表达量的试剂在制备病毒性脑膜炎辅助诊断制剂中的应用，所述的四种miRNA为：miR-RNA 18_41385、hsa-miR-486-5p，hsa-miR-4497和hsa-miR-3178；
miR-RNA 18_41385序列如SEQ ID NO.1所示；
hsa-miR-486-5p序列如SEQ ID NO.2所示；
hsa-miR-4497序列如SEQ ID NO.3所示；
hsa-miR-3178序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
miR-RNA 18_41385 在病毒性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人脑脊液升高；miR-RNA 18_41385在非病毒性脑炎患者中的表达量相较于正常人脑脊液降低；
hsa-miR-486-5p 在病毒性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人脑脊液升高；
hsa-miR-486-5p在非病毒性脑炎患者中的表达量相较于正常人脑脊液降低；
hsa-miR-4497在病毒性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人脑脊液降低；
hsa-miR-4497在非病毒性脑炎患者中的表达量相较于正常人脑脊液升高；
hsa-miR-3178在病毒性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人脑脊液降低；
hsa-miR-3178在非病毒性脑炎患者中的表达量相较于正常人脑脊液降低升高；
所述的非病毒性脑炎为结核性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎或化脓性脑膜炎。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测四种miRNA中至少一种表达量的试剂包括PCR检测试剂或原位杂交检测试剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，PCR检测试剂包括扩增四种miRNA的引物，序列如下：
miR-RNA 18_41385引物序列如SEQ ID NO.5所示；
hsa-miR-486-5p引物序列如SEQ ID NO.6所示；
hsa-miR-4497引物序列如SEQ ID NO.7所示；
hsa-miR-3178引物序列如SEQ ID NO.8所示。
7.一种病毒性脑膜炎辅助诊断试剂盒，其特征在于，包括检测miR-RNA 18_41385表达量的试剂，
miR-RNA 18_41385序列如SEQ ID NO.1所示。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，
miR-RNA 18_41385 在病毒性脑膜炎患者中的表达量相较于正常人脑脊液升高。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测miR-RNA 18_41385表达量的试剂包括PCR检测试剂或原位杂交检测试剂。
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