CN109777873B - 一种非侵入式检测患膀胱癌的概率的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种非侵入式检测患膀胱癌的概率的试剂盒，包含标志物CK20和UCA1的基因的引物和探针。本发明可用于疑似膀胱癌的初步筛选及术后随访，减少膀胱镜检查频率，减少患者痛苦和风险，对填补国内膀胱癌体外分子诊断产品的空白有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂盒领域，具体涉及一种非侵入式检测患膀胱癌的概率的试剂盒。
背景技术
膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的泌尿系统最常见的恶性肿瘤，平均发病年龄约为65岁，其中约90％是移行细胞癌，其它10％主要为鳞癌和腺癌，其在2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的第9位。由于存在明显的预后差、易复发特征，且早发现、早治疗的膀胱癌患者5年存活率大于90％，因此早诊断对该病的治疗具有重要的意义。膀胱镜检查是目前诊断膀胱癌最可靠的方法，通过膀胱镜检查可以发现膀胱是否有肿瘤，但因其有创性且价格昂贵，病人依从性较差，且易刺激膀胱壁肿瘤，可能造成肿瘤的恶性膨胀和转移，不适合大规模筛查；尿脱落细胞学检查对尿路上皮癌诊断特异性高，但对分级低的膀胱癌敏感度低，易形成假阴性结果，且细胞的不典型或退行性变、泌尿系统感染、结石、膀胱灌注治疗及不同检查者间观察偏倚较大等因素也会对尿细胞学检查有影响。因此，无创简便、标本易获取的肿瘤标志物法在膀胱癌的早期诊断和术后检测方面的应用引起了更多研究者的关注。
目前市场上膀胱癌相关产品有膀胱癌细胞染色体及基因异常检测试剂盒(荧光原位杂交法)检测脱落细胞中3，7，17号染色体非整倍体以及P16(9p21)的缺失，以及相关肿瘤标志物产品如膀胱肿瘤相关抗原BTA定量测定试剂盒(微孔板化学发光法)、尿核基质蛋白22(NMP-22)检测试剂盒(胶体金法)等。其中尿脱落上皮细胞FISH技术较适用于尿路上皮癌术后复发的检测，但对低级别尿路上皮癌，缺乏与尿路上皮癌相关的遗传学异常会导致漏诊，易形成假阴性结果。NMP-22是参与维持细胞核功能的一种三维网状结构蛋白，可通过细胞凋亡而释放到尿液中，因而被认为与尿路上皮肿瘤密切相关，有研究表明其在膀胱癌上皮细胞内含量要比正常尿路上皮高数十倍。文献对NMP-22敏感度及特异性报道不一(47％～90％)，存在较大争议。膀胱肿瘤相关抗原(BTA)又称补体因子H相关蛋白，由尿路上皮肿瘤细胞和巨噬细胞产生，是膀胱肿瘤生长过程中释放进入膀胱的复合物，当尿液BTA水平较高时，提示尿路上皮肿瘤的发生，因此其可用于尿路上皮肿瘤的早期检测和复发监测。膀胱癌诊断治疗指南指出：BTA是较早用于检测膀胱癌的肿瘤标记物，多采用BTA Stat和BTATrak方法检测，其中BTA Stat是一种快速定性方法，根据相关文献报道敏感度和特异性分别为29％～74％和56％～86％；BTATrak是酶联免疫定量方法，敏感度和特异性分别为60％～83％和60％～79％，敏感度随着肿瘤分级和分期上升而提高。NMP-22及BTA检测无创、方便、快捷，但当出现血尿、尿路感染、泌尿系结石、前列腺增生等泌尿系统疾病，特别是行膀胱灌注化疗后，NMP-22及BTA检测假阳性率较高，因此高特异性及敏感度的膀胱癌肿瘤标志物仍亟待开发。
外泌体是细胞主动分泌的一类穿梭于细胞间，直径为30～150nm、密度为1.10～1.18g/ml的双分子层结构囊泡样小体，其可由不同类型细胞(包括肿瘤细胞)脱落释放，在大多数体液如外周血、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液等中均可检测到。由于外泌体包含蛋白质、DNA、RNA等成分，能选择性的包裹/释放其细胞中的遗传信息，且现已有较多的文献报道外泌体内含物在细胞间通讯、肿瘤免疫及治疗等领域研究成果，因此提取细胞外的外泌体在疾病、肿瘤等方面的诊断、监控有巨大的应用潜能。目前国内关于外泌体的专利主要集中在外泌体的分离和检测层面，但尿液中提取外泌体应用于膀胱癌辅助诊断的公开报道较少，只浙江大学公布了一种尿液外泌体分离、富集及检测的集成检测方法及检测芯片，通过检测尿液外泌体中的癌症信息以期用于膀胱癌的无创诊断、监控，该方法利用外泌体跨膜蛋白CD63这一特有的标志物建立了一种芯片ELISA快速诊断方法，但并未进行膀胱癌特异性肿瘤标志物的筛选。
若能在提取的尿液样本外泌体中寻找并筛选出高特异性和敏感度的肿瘤标志物并借助分子手段进行快速检测，对于辅助膀胱癌的早期诊断和术后检测意义重大。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种利用尿液外泌体进行非侵入式检测患膀胱癌的概率的试剂盒，包含标志物CK20、CA9、IGF2和UCA1的基因的引物和探针。
CA9的正向引物为SEQ.4：CATCCTAGCCCTGGTTTTTGG，
CA9的反向引物为SEQ.5：CCTTCTGTGCTGCCTTCTCAT，
CA9的TaqMan探针为SEQ.6：CTGTCACCAGCGTCGCGTTCCTT，
UCA1的正向引物为SEQ.7：GCCCTCATTCCGTGAAGAGA，
UCA1的反向引物为SEQ.8：ATTTGAAATTGGTGAGATGTTCCTT，
UCA1的TaqMan探针为SEQ.9：CCACCTGCGACCTCGGGTCCT。
a和d分别代表CA9和UCA14个基因中每个基因的荧光定量结果，
Logit(P)＝1.168*a+0.855*d-1.177，或，
Logit(P)＝1.048*a+0.679*d-1.344，
Logit(P)的值用来判断患膀胱癌的概率。
所述的可以用来判断患膀胱癌的概率的意思是指，被检测的人检测出来的Logit(P)的值就是其患癌症的概率。
优选的，试剂盒中还包括内源对照基因GAPDH和β-act in的引物和针序。
GAPDH的正向引物为SEQ.13：CACATGGCCTCCAAGGAGTAA，
GAPDH的反向引物为SEQ.14：TGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT，
GAPDH的TaqMan探针为SEQ.15：CTGGACCACCAGCCCCAGCAAG，
β-actin的正向引物为SEQ.16：TGCCGACAGGATGCAGAAG，
β-actin的反向引物为SEQ.17：CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGA，
β-actin的TaqMan探针为SEQ.18：ATCACTGCCCTGGCACCCAGCA。
本发明通过检测尿液外泌体的信息可用于膀胱癌的的无创辅助诊断，同时尿脱落细胞中一些肿瘤标志物(如CA9、CK20和UCA1等)是用于诊断膀胱癌的良好标志物，可以通过检测尿液外泌体中肿瘤标志物的表达量来实现膀胱癌的非侵入式诊断。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明将尿液外泌体用于膀胱癌的诊断，是一种非侵入式的诊断方法，取材方便可重复，患者易于接受且容易操作，虽不能完全替代膀胱镜检查，但能配合膀胱镜检，减少膀胱镜检查频率，减少患者痛苦和风险。
(2)本发明的研究对象是尿液中的外泌体，由于肿瘤细胞分泌的外泌体较正常细胞的分泌量更多，其本身也可充当肿瘤标志物的角色，且外泌体囊泡结构稳定，其携带的肿瘤特异相关的核酸、蛋白质等分子稳定性优于细胞的复杂环境和血液游离状态，能真实反映分泌细胞的生理及病理功能状态，特异性更好。
(3)本发明首次同时检测尿液外泌体中CA9、CK20和UCA1这4个肿瘤标志物，并通过建立膀胱癌诊断模型，将特异性提高到95％以上，敏感度达到71％以上，阳性预测率大于92％，与临床中的尿脱落细胞学检查(敏感性13％-75％，特异性85％-95％)及其他膀胱癌免疫诊断产品如NMP22(敏感性47％-90％，特异性55％-98％)相比显示出更优的诊断性能。
(4)本发明是对现有膀胱肿瘤诊断技术有力的补充，对填补国内膀胱癌体外分子诊断产品的空白有重要意义。
附图说明
图1是具体实施案例中膀胱癌组和对照组外泌体RNA的浓度散点图和内源对照基因的表达CT值的散点图；
图2是具体实施案例中膀胱癌组和对照组外泌体内基因CA9(图2A)、CK20(图2B)、IGF2(图2C)和UCA1(图2D)表达差异的散点图；
图3是具体实施案例中膀胱癌组和对照组外泌体内基因CA9(图3A)、CK20(图3B)、IGF2(图3C)和UCA1(图3D)ROC曲线分析。
图4是具体实施案例中外泌体CA9、CK20、IGF2和UCA1四个基因两两组合分析膀胱癌组和对照组之间的表达差异；
图5是具体实施案例中外泌体CA9、CK20、IGF2和UCA1基因三个组合分析膀胱癌组和对照组之间的表达差异；
图6是具体实施案例中CA9、CK20、IGF2和UCA1四个基因两两组合的ROC曲线分析(图6A)和3个基因、4个基因组合的ROC曲线分析(图6B)。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明基于尿液外泌体膀胱癌的非侵入式检测方法进行详细的描述说明。
发明人于2017年9月至2018年3月期间在中山大学肿瘤防治中心收集了176例经膀胱镜和病理诊断确诊为膀胱癌患者的尿液样本，定义为膀胱癌组，另外还收集了123例健康志愿者的尿液样本，定义为对照组。本研究中的样本提供者均被告知了本研究的目的，并签署了知情同意书。
基于尿液外泌体膀胱癌的非侵入式检测方法的具体检测步骤如下：
1、尿液样本处理
膀胱癌患者术前晨尿及健康对照组晨尿均收集30ml，共获得176例膀胱癌组样本和123例健康对照组样本，其中符合要求的样本分别为170例病人样本和111例健康对照样本。尿液样本3000g离心15分钟，取上清液备用。
2、外泌体富集
依照供应商的说明,使用外泌体提取试剂盒(System Biosciences，ExoQuick-TC，cat.no.EXOTC50A-1)从尿液上清中提取外泌体。具体步骤如下：
(1)取样本处理后所得的尿液上清20ml，加入4ml外泌体提取试剂，充分混匀，4℃放置16小时。
(2)混合液5000g，4℃，离心30分钟；小心彻底去除上清液，收集沉淀为外泌体。
3、外泌体RNA提取
使用RNA提取试剂盒(Qiagen,miRNeasy Micro Kit,cat.no.217084)从外泌体沉淀中提取外泌体总RNA：
(1)收集的外泌体沉淀加入700uL QIAzol Lysis Reagent充分吹打混匀，混合液转移至新的RNase-free 1.5mL离心管中；
(2)室温放置5min，充分裂解；
(3)混合液中加入140uL氯仿，剧烈混匀15s；
(4)室温静置2-3min；
(5)使用离心机4℃，12000xg离心15min；
(6)小心吸取上层水相溶液至新的1.5mL离心管中；
(7)加入1.5倍体积的无水乙醇，充分混匀；
(8)将混合液转入吸附柱(RNeasy MinElute spin column)中，吸附柱放在收集管中，使用离心机4℃，12000xg离心15s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(9)向吸附柱中加入700uL Buffer RWT(使用前检查是否按要求加入无水乙醇)，4℃，12000xg离心15s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(10)向吸附柱中加入500uL Buffer RPE(使用前检查是否按要求加入无水乙醇)，4℃，12000xg离心15s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(11)向吸附柱中加入500uL 80％乙醇，4℃，12000xg离心2min，弃废液；
(12)将吸附柱转移至新的收集管中，4℃，12000xg离心5min；
(13)将吸附柱转移至新的1.5mL RNase-free离心管中，加入14uL RNase-freeH2O，4℃，12000xg离心1min，1.5mL离心管中即为所得RNA溶液。
使用分光光度计(NanoDrop)测定所获得的RNA浓度。考虑到下一步定量PCR实验的可行性，将RNA测定浓度低于8ng/uL的样本从研究中排除，获得168例膀胱癌患者和100例健康对照的样本，并对其进行下一步的研究。
4、引物和探针的设计
根据引物和探针设计原则，对4个靶基因CK20，CA9，UCA1，IGF2和2个内源对照基因β-actin，GAPDH设计引物和探针，具体基因信息见表1，引物探针序列见表2。
表1：本发明申请所分析的4个靶基因和2个内源对照的列表
表2：本发明申请中所分析的4个靶基因和2个内源对照的引物和探针序列
5、实时定量PCR
根据可用性，使用100ng至500ng从尿样获得的总RNA借助RNA逆转录酶(Invitrogen,TaqMan Reverse Transcription Reagents,货号：4304134)来获得互补DNA(cDNA)。使用PCR Taq酶(Applied Biosystems，TaqMan Universal PCR MasterMix，货号:4304437)对4个靶基因和2个内源对照基因的cDNA进行荧光定量PCR反应扩增，扩增仪器为Applied Biosystems ABI 7500型实时荧光定量PCR仪。
表3：荧光定量PCR反应体系
荧光定量PCR条件如下：
6、数据分析
用扩增仪配置的7500Software v2.3软件处理定量PCR数据，建立每个基因的阈值和基线，获得每个样本反应对应基因的CT值。用2个内源对照基因(β-actin和GAPDH)几何平均值标准化数据。为了确保结果数据的可靠性，认为内源对照基因CT值大于30的样品RNA质量较低，并将其从分析中排除，最终得到158例膀胱癌患者样本和88例健康对照样本的有效数据。样品中靶基因的相对表达量采用2-ΔΔct的算法，最后结果用RQ表示。
认为CT值大于36的基因表达较差，其ΔCT按该基因的最小ΔCT来计算。利用SPSS软件对所有数据的RQ值进行统计学分析，t检验观察膀胱癌组和对照组的表达是否具有显著性差异，并构建相应基因的散点图；ROC曲线计算基因的敏感度和特异性；logistic回归分析来构建基于4个基因的膀胱癌诊断模型，结合ROC曲线分析和评价模型的敏感度和特异性。
7、结果
对176例膀胱癌组和123例对照组样本分析，外泌体RNA的浓度和内源对照基因的表达在两组之间有显著性差异(如图1所示)。对CA9、CK20、IGF2和UCA1这4个基因的表达分析发现4个基因在两组的表达均具有显著性差异(如图2所示)，ROC分析4个基因的AUC面积介于0.7304-0.8076之间(如图3所示)，其中CK20的特异性达到97.73％，但敏感度较低，CA9的敏感度相对较高，IGF2的AUC面积最大，UCA1在膀胱癌中低表达，与其他三个基因与膀胱癌的关系相反。鉴于每种基因数据的不同表现，利用logistic回归方程将4个基因进行组合分析，建立基于2种(C1-C6)或3种(C7-C10)或4种(C11)基因组合的11种计算模型，每种模型在膀胱癌组和对照组之间均具有显著性差异(图4-5)，ROC对每种模型方程计算的结果进行分析得出AUC面积介于0.6988-0.9064之间，其中C11C8组合诊断性能最高，其AUC面积为0.9064，敏感度为71.52％，且特异性为95.45％(表4、图6)，总符合率为81.7％。根据C11模型得出的logistic回归方程Logit(P)＝1.146*a-0.068*b+0.692*d-0.924可预测未知样本患膀胱癌的概率。
表4：本发明申请分析的4个基因及其组合的诊断性能
SN：敏感度；SP：特异性；PPV：阳性预测率；NPV：阴性预测率；cutoff：截断值；a、b、c、d分别代表CA9、CK20、IGF2和UCA14个基因中每个基因的荧光定量结果
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明构思在现有技术基础上通过逻辑分析、推理或者根据有限的实验可以得到的技术方案，均应该在由本权利要求书所确定的保护范围之中。
序列表
<110> 广州恒泰生物科技有限公司
<120> 一种非侵入式检测患膀胱癌的概率的试剂盒
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Claims (3)
1.CA9基因和UCA1基因的引物和探针在制备非侵入式检测患膀胱癌的概率的试剂盒中的应用；其特征在于，
CA9基因的引物和探针如下所示：
CA9的正向引物为SEQ .4：CATCCTAGCCCTGGTTTTTGG，
CA9的反向引物为SEQ .5：CCTTCTGTGCTGCCTTCTCAT，
CA9的TaqMan探针为SEQ .6：CTGTCACCAGCGTCGCGTTCCTT，
UCA1基因的引物和探针如下所示：
UCA1的正向引物为SEQ .7：GCCCTCATTCCGTGAAGAGA，
UCA1的反向引物为SEQ .8：ATTTGAAATTGGTGAGATGTTCCTT，
UCA1的TaqMan探针为SEQ .9：CCACCTGCGACCTCGGGTCCT。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括内源对照基因GAPDH和β-actin的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，
GAPDH基因的引物和探针如下所示：
GAPDH的正向引物为SEQ .13：CACATGGCCTCCAAGGAGTAA，
GAPDH的反向引物为SEQ .14：TGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT，
GAPDH的TaqMan探针为SEQ .15：CTGGACCACCAGCCCCAGCAAG，
β-actin基因的引物和探针如下所示：
β-actin的正向引物为SEQ .16：TGCCGACAGGATGCAGAAG，
β-actin的反向引物为SEQ .17：CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGA，
β-actin的TaqMan探针为SEQ .18：ATCACTGCCCTGGCACCCAGCA。
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Inventor after: Wen Jin Inventor after: Li Guorong Inventor after: Cao Yan Inventor after: Zhang Shuyi Inventor after: Xu Jianhua Inventor after: Deng Min Inventor after: Liu Wanli Inventor after: Zhang Peng Inventor after: Zhang Yang Inventor before: Li Guorong Inventor before: Cao Yan Inventor before: Zhang Shuyi Inventor before: Xu Jianhua Inventor before: Deng Min Inventor before: Liu Wanli Inventor before: Zhang Peng Inventor before: Zhang Yang |
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| GR01 | Patent grant | ||
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