CN112048554A - 脂质体纳米颗粒芯片及其在制备胰腺癌诊断产品中的应用和相应标志物 - Google Patents

脂质体纳米颗粒芯片及其在制备胰腺癌诊断产品中的应用和相应标志物 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种基于脂质体纳米颗粒芯片技术用于胰腺癌诊断的外泌体microRNA标志物及其应用。本发明公开了一种血浆中用于诊断胰腺癌的标志物，所述标志物为exmiR‑21、exmiR‑10b中的至少一种；本发明还同时公开了上述标志物在制备用于诊断胰腺癌产品中的应用。

Description

脂质体纳米颗粒芯片及其在制备胰腺癌诊断产品中的应用和 相应标志物
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种基于脂质体纳米颗粒芯片技术用于胰腺癌诊断的外泌体microRNA标志物及其应用。
背景技术
胰腺癌是临床常见的高度恶性肿瘤，由于其特殊的解剖位置和肿瘤生物学行为，胰腺癌恶性程度极高，预后极差，五年生存率仅为8％左右。胰腺癌病例数将急剧增加，预计到2030 年，胰腺癌将成为美国癌症相关死亡的第二大原因。手术是目前有望根治胰腺癌的唯一方法，但由于胰腺癌早期诊断率较低，因此临床上只有10％-15％的病人有获行根治性手术的机会， 85％左右的胰腺癌患者在确诊时因局部重要血管侵犯或远处转移而失去手术根治的机会，辅助化疗、放疗、介入、生物免疫治疗等手段在胰腺癌患者中的应用也日益普遍，在一定程度上延长了患者的生存时间，但总体来讲疗效有限。因此，进一步开发较高灵敏度和特异性的测胰腺癌的新型非侵入性生物标志物非常重要和紧迫。
MicroRNA在许多生物过程中发挥关键作用，例如细胞增殖，细胞分化和细胞凋亡。最近的研究表明，microRNA还可以作为癌症检测的潜在生物标志物。外泌体是一种由脂质双层包围的细胞外囊泡，可内含多种成分，包括蛋白质，脂质，DNA，mRNA，microRNA和非编码RNA等。许多研究表明，外泌体中含有的microRNA在肿瘤的发展，转移和耐药性中起重要作用。外泌体的脂质双层结构可以防止其中的microRNA被降解，因此检测其中的 microRNA就更加稳定和准确。检测外泌体中microRNA的表达水平成为非侵入性检测癌症生物标志物的有前景的方法。
目前常见的分析外泌体miRNA拷贝数的方法主要是通过抽提外泌体RNA并逆转录成 cDNA后，采用qRT-PCR(或结合二代基因测序)的方法分析miRNA拷贝数。在PCR过程中外泌体需经过破碎混合均质，并多次放大信号以增加目标分子的数量以利检测。而血清中的外泌体来自多种/多个细胞，因而破碎混合均质过程将不可避免的造成癌细胞分泌的外泌体所含的RNA遭到稀释，严重降低分析的特异性和灵敏度。脂质体纳米颗粒芯片技术是一项新颖的、能对单个外泌体内的miRNA进行直接分析的方法。省去了繁琐冗长的RNA提取、cDNA逆转录和PCR放大步骤，且检测结果较PCR相比具有更高的可靠性，在新兴的液体活检领域具有重大的价值。目前为止，尚未见利用脂质体纳米颗粒芯片技术来检测血浆外泌体microRNA作为诊断胰腺癌诊断标记物的相关报道。
血浆miR-21、miR-10b能用于胰腺癌的诊断，但是由于血浆microRNA的浓度受到诸多因素的影响，且来源不确定等，其用于疾病诊断存在一定局限性。因此进一步开发较高灵敏度和特异性的检测胰腺癌的新型非侵入性生物标志物非常重要和紧迫。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于脂质体纳米颗粒芯片技术用于胰腺癌诊断的外泌体microRNA标志物及其应用---用于诊断胰腺癌。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种血浆中用于诊断胰腺癌的标志物，所述标志物为exmiR-21、exmiR-10b中的至少一种(即，为任意一种或两种组合)。
本发明还同时提供了上述标志物在制备用于诊断胰腺癌产品中的应用。
作为本发明应用的改进：所述诊断胰腺癌产品为脂质体纳米颗粒生物芯片；
所述脂质体纳米颗粒生物芯片的制备方法为：
1)、制备分子信标(MBs)
miR-21–MB，5'-6FAM-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATT ATCAGACTGA-BHQ1-3'；
miR-10b–MB，5'-6FAM-ATACCACACAAATTCGGTTCTA CAACCGAATTTGTG -BHQ1-3'；
2)、制备含MBs的阳离子脂质体纳米颗粒
将等质量比的miR-21-MB和miR-10b-MB溶于PH＝7.0的PBS缓冲液，得miR-21和miR-10b的PBS溶液；
将三甲基氯化铵、胆固醇、生物素按照49:49:2的摩尔比溶于乙醇中，得乙醇脂质混合物；
按照(三甲基氯化铵+胆固醇+生物素)：(miR-21-MB+miR-10b-MB)＝12.5:1的质量比，将miR-21和miR-10b的PBS溶液与乙醇脂质混合物混合，得MBs/脂质混合物；
将MBs/脂质混合物与PH＝7.0的PBS缓冲液按照1:8～10的体积比混合，于室温下孵育(15 ±2)分钟，得包含分子信标(MBs)的阳离子脂质体纳米颗粒；
3)、制备脂质体纳米颗粒芯片：
利用包含分子信标(MBs)的阳离子脂质体纳米颗粒制备获得制备脂质体纳米颗粒芯片。
作为本发明应用的改进的进一步改进：乙醇脂质混合物中，三甲基氯化铵、胆固醇、生物素的浓度之和为10mg/ml。
本发明还同时提供了上述脂质体纳米颗粒生物芯片的用途：用于诊断胰腺癌。具体为：检测血浆中exmiR-21、exmiR-10b表达水平来诊断胰腺癌，检测结果显示exmiR-21、exmiR-10b 在胰腺癌组表达较正常人组显著上调。
在本发明中，提供血浆exmiR-21、exmiR10b中的一种或两种组合作为胰腺癌诊断标志物在制备诊断胰腺癌产品中的应用。在本发明中，提供exmiR-21、exmiR-10b中的一种或两种组合的脂质体纳米颗粒芯片在制备用于诊断胰腺癌产品中的应用。在本发明中，所述脂质体纳米颗粒芯片至少包括与miR-21和miR-10b中的一种或两种核酸序列杂交的探针。在本发明中，所述产品能够通过检测血浆中的exmiR-21、exmiR10b中的至少一种的表达水平来诊断患者是否患有胰腺癌，exmiR-21、exmiR10b高表达与胰腺癌的发生发展相关。
在本发明，分子信标两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团，没有靶分子的时候，分子信标的荧光和淬灭基团靠得很近，荧光被淬灭。与靶分子结合后，分子信标的空间构型发生改变，导致荧光恢复。因此本发明中，将血浆涂抹于已制备好的脂质体纳米颗粒芯片上后， MBs与靶exmiR结合，荧光恢复，而荧光强度由(TIRF)显微镜进行摄像。无需传统PCR 的反应体系。
目前为止，尚未见利用脂质体纳米颗粒芯片技术来检测血浆外泌体microRNA作为诊断胰腺癌诊断标记物的相关报道。
本发明的exmiR-21、exmiR-10b与现有的miR-21、miR-10b相比，存在着以下区别：
1、本发明检测的是外泌体中miR-21和miR-10b；由于外泌体具有脂质双层结构可以防止其中的microRNA被降解，因此检测其中的microRNA就更加稳定和准确；
2、本发明利用脂质体纳米颗粒芯片技术对于血浆中的外泌体microRNA进行直接检测，可避免因为传统qRT-PCR检测过程中破碎均质造成癌细胞分泌的RNA的稀释而造成分析灵敏度和特异度的降低。
综上所述，本发明具有如下技术优势：
1)、样本为血浆，相对较易获得；
2)、与健康对照组相比，发现2种外泌体microRNA(exmiR-21、exmiR-10b)在胰腺癌血浆中表达上调。ROC曲线分析显示其可以较好地区分乳腺癌患者与健康者，两者的曲线下面积分别为0.7171、0.6543，敏感性分别为52.78％、41.67％，特异性分别为98.46％、98.46％。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为2种血浆外泌体microRNA在胰腺癌患者及健康对照组中利用脂质体纳米颗粒芯片技术进行定量检测；
左图为血浆exmiR-21在健康人和胰腺癌患者中的表达水平；
右图为血浆exmiR-10b在健康人和胰腺癌患者中的表达水平。
图2为2种血浆外泌体microRNA的ROC曲线图及两种血浆外泌体microRNA联合诊断ROC曲线图；
左图为exmiR-21作为胰腺癌诊断中的ROC曲线分析；
中图为exmiR-10b作为胰腺癌诊断中的ROC曲线分析；
右图为exmiR-21联合exmiR-10b作为胰腺癌诊断中的ROC曲线分析。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
miR-21和miR-10b的序列信息分别如SEQ ID NO.1～2所示；具体的，
miR-21序列如下所示：
UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA；
miR-10b的序列如下所示：
CCAGAGGUUGUAACGUUGUCUAUAUAUACCCUGUAGAACCGAAUUUGUGUGGU AUCCGUAUAGUCACAGAUUCGAUUCUAGGGGAAUAUAUGGUCGAUGCAAAAACUUC A。
为了使得该领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1、一种基于脂质体纳米颗粒芯片技术用于胰腺癌诊断的外泌体microRNA标志物及其应用。该技术包括miR-21、miR-10b特异性探针纳米颗粒的制备、检测体系及全反射荧光显微镜检测荧光强度以示microRNA拷贝数。
实施例2
一、临床样本：
在2017年11月至2018年12月期间，由浙江大学医学院附属邵逸夫医院提供36名胰腺癌患者和65名健康个体的外周血。在抽样之前所有的参与者均签署了书面知情同意书，研究方案经浙江大学邵逸夫医院临床研究伦理委员会批准。
所有胰腺癌患者血样均在手术或任何治疗前收集；且所述胰腺癌患者均由两位病理医生在手术或超声内镜引导细针穿刺活检后证实为胰腺癌。对照组样本为过去和现在均无恶性病史或炎症的健康人。实验中的血液样本在手术和药物治疗前用EDTA抗凝剂收集在真空血液管中，并在收集后1小时内处理。将血液样品在4℃下以5000rpm离心10分钟。然后将血浆储存在-80℃。
二、构建胰腺癌特异的外泌体miRNA脂质体纳米颗粒芯片：
(1)分子信标(MBs)准备
首先分别设计带有荧光信号标记的exmiR-21、exmiR-10b特异性探针，并在探针的3’和5’末端分别组装一个荧光基团(BHQ1)和一个荧光淬灭基团(6FAM)，探针的中央是一段特别设计的单链的碱基序列用于识别目标miRNA。
exmiR-21的特异性探针为：MiR-21-MB,5'-6FAM-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATTATCAGACTGA-BHQ1-3'；
exmiR-10b的特异性探针为：MiR-10b-MB,5'-6FAM-ATACCACACAAATTCGGTTCTACAACCGAATTTGTG-BHQ1-3'；
上述特异性探针即分子信标(MBs)。
(2)制备含MB的阳离子脂质体纳米颗粒
配制miR-21-MB和miR-10b-MB的PBS溶液，将等质量比的miR-21-MB和miR-10b-MB溶于PBS缓冲液(PH＝7.0)配成30μl溶液；
配制乙醇脂质混合物：将三甲基氯化铵、胆固醇、生物素按照49:49:2的摩尔比溶于乙醇中，配置成20μl的溶液。三甲基氯化铵、胆固醇、生物素的浓度之和为10mg/ml；
将30μl的miR-21和miR-10b的PBS溶液加入到20μl乙醇脂质混合物中，使脂质体(三甲基氯化铵+胆固醇+生物素)与MBs(miR-21-MB+miR-10b-MB)的质量比为12.5。通过将50μL MBs/脂质混合物注入450μL PBS(PH＝7.0的PBS缓冲液)，然后于室温下孵育15分钟，所得沉淀物为包含分子信标(MBs)的阳离子脂质体纳米颗粒，并立即使用。
(3)制备脂质体纳米颗粒芯片
使用Denton电子束蒸发器将薄的Au层(15nm)沉积在MPTMS层上的玻璃盖玻片上作为胶层。清洁基板表面并制造脂质体纳米颗粒芯片的MPTMS分子气相盐化。在光滑、平坦的金层上形成混合硫醇自组装单分子膜(SAMs)作为锚定膜。简而言之，将新制备的镀金的载玻片暴露于摩尔比为30:70:1的环氧乙烷脂质铆钉分子WC14、β-巯基乙醇(βME)和生物素的混合物中大于12小时(室温)。然后，将载玻片与抗生物素蛋白在室温下孵育5分钟。未反应的抗生物素蛋白用PBS缓冲溶液洗涤。在室温下孵育10分钟，通过生物素-抗生物素蛋白连接将包含分子信标(MBs)的阳离子脂质体纳米颗粒束缚在载玻片表面上，并用PBS 缓冲溶液(PH＝7.0)将未结合的脂质体纳米颗粒洗净；得包含靶标miRNA分子探针的束缚于基板上的脂质体纳米颗粒生物芯片。
即，通过生物素-抗生物素蛋白-生物素三明治夹心系统，将包含MBs的脂质体纳米颗粒锚定在基板上，从而形成脂质体纳米颗粒生物芯片。
三、定量检测外泌体miRNA表达量
利用包含靶标miRNA分子探针的束缚于基板上的脂质体纳米颗粒生物芯片，直接捕捉血浆外泌体，当分子探针识别到目标miRNA时，利用内全反射荧光显微镜进行摄片，通过软件分析进一步荧光信号值转化为该miRNA的拷贝数。
具体如下：
将70μl血浆均匀涂覆在步骤二所得的胰腺癌特异的外泌体miRNA脂质体纳米颗粒芯片上，并在37℃下封闭2小时。全内反射荧光(TIRF)显微镜用于样品成像。TIRF显微镜通过将入射激光角度调整到临界点来实现，在该临界点处，光在玻璃-液体界面处反射，从而产生激发光的消逝波，其在300nm以内呈指数衰减。使用功率为10％的50Mw/488nm激光器激发标记有FAM的miR-21MB和miR-10b MB的分子信标。在具有100倍镜头和60毫秒曝光时间的Andor iXon EMCCD相机上收集图像。使用Image J和MATLAB软件对图像进行统计分析，将荧光强度转化为数值以代表该miRNA的拷贝数。
四、统计分析
使用GraphPad Prism 7.0(San Diego，CA)进行统计学分析。
Student t检验用于分析两组之间的差异。受试者工作曲线(ROC)分析用于确定外泌体 microRNA的诊断价值。双尾p<0.05被认为具有统计学意义。
具体如下：
一、健康组与胰腺癌组血浆exmiR-21和exmiR-10b表达存在差异。
1、图1左图t检验提示健康组与胰腺癌组血浆exmiR-21表达存在显著性差异，p<0.0001；
2、图1右图t检验提示健康组与胰腺癌组血浆exmiR10b表达存在显著性差异，p<0.0001；
二、对exmiR-21和exmiR-10b进行受试者工作曲线(ROC)分析并计算曲线下面积(AUC)。通过计算其约登指数(敏感性+特异性-1)，计算最佳临界点对应的敏感性和特异性及鉴别胰腺癌患者及健康人的exmiRs临界值。
1、图2左图ROC分析提示exmiR-21的AUC＝0.7171，p＝0.0003。最佳临界点时的敏感性52.8％，特异性98.5％，exmiR-21的临界值为12491002。
2、图2中图ROC分析提示exmiR-10b的AUC＝0.6543，p＝0.0105。最佳临界点时的敏感性41.7％，特异性100％，exmiR-10b的临界值为14352313。
五、结果
五、结果
胰腺癌患者与健康对照组相比，血浆2种外泌体microRNA表达上调：通过内全反射荧光显微镜荧光信号值显示的外泌体microRNA的拷贝数，与健康组相比，2种外泌体microRNA 在胰腺癌患者中显著高表达。
差异表达的血浆外泌体microRNA的诊断价值：
使用ROC曲线分析并计算受试者工作特征曲线下面积(AUC)来检测差异性表达血浆外泌体microRNA的诊断性能。结果显示，2种血浆外泌体microRNA可鉴别胰腺癌和健康对照，两者的曲线下面积分别为0.7171、0.6543，敏感性分别为52.78％、41.7％，特异性分别为98.5％、 100％。且exmiR-21和exmiR-10b联合诊断有助于提高诊断效能，其曲线下面积为0.791，最佳临界点对应的敏感性为敏感性75％，特异性80％。
因此，可以得出以下结果：
当exmiR-21检测结果满足大于12491002条件时，可判定成为胰腺癌患者；当exmiR-10b 检测结果满足大于14352313条件时，可判定成为胰腺癌患者；
反之，可判定成为健康人。
还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 脂质体纳米颗粒芯片及其在制备胰腺癌诊断产品中的应用和相应标志物
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 72
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ugucggguag cuuaucagac ugauguugac uguugaaucu cauggcaaca ccagucgaug 60
ggcugucuga ca 72
<210> 2
<211> 110
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagagguug uaacguuguc uauauauacc cuguagaacc gaauuugugu gguauccgua 60
uagucacaga uucgauucua ggggaauaua uggucgaugc aaaaacuuca 110

Claims (6)

1.血浆中用于诊断胰腺癌的标志物，其特征在于：所述标志物为exmiR-21、exmiR-10b中的至少一种。
2.如权利要求1所述的标志物在制备用于诊断胰腺癌产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的标志物在制备用于诊断胰腺癌产品中的应用，其特征在于：所述诊断胰腺癌产品为脂质体纳米颗粒生物芯片；
所述脂质体纳米颗粒生物芯片的制备方法为：
1)、制备分子信标
miR-21–MB，5'-6FAM-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATT ATCAGACTGA-BHQ1-3'；
miR-10b–MB，5'-6FAM-ATACCACACAAATTCGGTTCTA CAACCGAATTTGTG-BHQ1-3'；
2)、制备含MBs的阳离子脂质体纳米颗粒
将等质量比的miR-21-MB和miR-10b-MB溶于PH＝7.0的PBS缓冲液，得miR-21和miR-10b的PBS溶液；
将三甲基氯化铵、胆固醇、生物素按照49:49:2的摩尔比溶于乙醇中，得乙醇脂质混合物；
按照(三甲基氯化铵+胆固醇+生物素)：(miR-21-MB+miR-10b-MB)＝12.5:1的质量比，将miR-21和miR-10b的PBS溶液与乙醇脂质混合物混合，得MBs/脂质混合物；
将MBs/脂质混合物与PH＝7.0的PBS缓冲液按照1:8～10的体积比混合，于室温下孵育(15±2)分钟，得包含分子信标的阳离子脂质体纳米颗粒；
3)、制备脂质体纳米颗粒芯片：
利用包含分子信标的阳离子脂质体纳米颗粒制备获得制备脂质体纳米颗粒芯片。
4.根据权利要求3所述的标志物在制备用于诊断胰腺癌产品中的应用，其特征在于：
乙醇脂质混合物中，三甲基氯化铵、胆固醇、生物素的浓度之和为10mg/ml。
5.根据权利要求3或4所述的制备而得的脂质体纳米颗粒生物芯片的用途，其特征在于：用于诊断胰腺癌。
6.根据权利要求5所述的脂质体纳米颗粒生物芯片的用途，其特征在于：检测血浆中exmiR-21、exmiR-10b表达水平来诊断胰腺癌，检测结果显示exmiR-21、exmiR-10b在胰腺癌组表达较正常人组显著上调。
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