CN103197066A - 一种免疫脂质体生物芯片、其制备方法及其在生物检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种免疫脂质体生物芯片、其制备方法及其在生物检测中的应用。本发明所述的免疫脂质体以微阵列形式分布在芯片上，免疫脂质体内包含分子探针，如带荧光的分子信标，免疫脂质体外包负载各种配体。免疫脂质体生物芯片可以特异性的捕获细胞混合物中的靶细胞，同时在不破坏细胞内的生物标志物的情况下，确定靶细胞内的信使RNA和/或小分子RNA。此外，本发明的免疫脂质体生物芯片还可以被用于捕获和拣选病毒和细胞分泌的纳米粒子，如微泡和外泌体。免疫脂质体生物芯片具有操作简便、低成本、快速、灵敏、选择性高的优点，可用在各种疾病、食品安全等领域的分子检测中。

Description

一种免疫脂质体生物芯片、其制备方法及其在生物检测中的应用

技术领域

本发明涉及一种免疫脂质体生物芯片，同时本发明还涉及所述免疫脂质体生物芯片的制备方法及其在生物检测中的应用。

背景技术

抗体和其它细胞表面的配体已被广泛用于生物分析检测领域，如通过磁激活分选细胞（MACS），其中配体被固定到磁性纳米粒子上；另外，如通过荧光激活细胞分选（FACS），其中荧光染料标记的抗体被用来细胞分离，但是，荧光染色的抗体和固定化抗体的磁性纳米粒子昂贵且费时。对于混合细胞中的分离，近年来以固体基板为基础的细胞芯片分选方法是发展趋势，因为它们便于固载各种筛选细胞的表面配体如抗原等，同时具有配体及细胞使用量少的特点。

细胞芯片检测已被用于活癌细胞分析，如对白血病，前列腺癌的癌细胞，利用抗原特异性T细胞和干细胞上表达的特定的表面抗原进行细胞芯片分析。如CN101046448公开了一种利用一维微流控生物芯片检测细胞中基因突变的方法，将总RNA或靶DNA样品于包含有荧光探针的缓冲液中稀释，并在压力驱动下流过微通道进入功能化阵列，根据荧光强度的差别来判断该检测位点的突变类型。然而，它们的检测效率往往受限于靶细胞和芯片表面涂层的配体之间的弱结合力，以及与非靶细胞的非特异性结合。因此，在上述方法中，需要一个单独的检测方法来分析所捕获的细胞其内部的生物标志物。

基于脂质体的芯片，可以通过不同的方法制备。由于直接自组装在固体基板表面的脂质体并不稳定，许多研究者已经开发利用寡核苷酸束缚，生物素-链霉亲和素链接，抗原-抗体对，共价键等的替代方法。然而，这些制备方法其步骤复杂且所用的材料非常昂贵。

含有DNA和RNA的免疫脂质体的已被广泛作为靶向的纳米载体，用在体内外的基因治疗中。如CN101797229A公开了一种基于Isthmin基因的免疫脂质体的制备方法和应用，具有高效、低毒、制备方法简单等优点，可用于制备抗肿瘤血管生成的药物。此外，用于检测在细胞中特定的mRNA和microRNA的分子探针如分子信标（MBS）和锁核酸（LNA）修饰的分子信标可以封装在免疫脂质体中，进行分子诊断。如CN101484139公开了以抗体靶向的免疫脂质体的制备及其应在全身诊断中的应用。

对各种疾病，包括癌症和传染性疾病的早期的方便、快速检测已经成为极其重要的研究方向。一种疾病越早被诊断，就越有可能被治愈。在过去的几十年，虽然已经取得了显著进步，但一些疾病，如艾滋病和癌症的死亡率并没有改变，其中一个重要的原因是在疾病的早期阶段，缺乏方便，快速，非侵入性的检测方法。对于许多感染性疾病，甚至是由病毒感染引起的癌症，目前的病毒检测方法，主要依靠检测针对病毒或病毒在感染细胞的遗传物质（病毒RNA或DNA）产生的抗体，如ELISA法，免疫印迹法和定量RT-PCR法。这些方法繁琐耗时。更重要的是，他们是间接的方法，不能直接检测病毒，防止感染。病毒的直接检测是非常重要的，因为原始感染后，它需要几周甚至几个月的时间，才会在血液或感染的细胞内出现针对病毒或病毒的遗传物质的抗体。在这个时间窗口期，受感染的人仍然可以传播疾病，因此需要直接和简单的检测方法，在早期对病毒进行捕获并鉴定，从而对传感染性疾病进行理想预警。

检测癌细胞血清或血浆中循环的microRNA可以作为一个有用的“液体活检”，用于癌症的早期检测和监控。循环miRNA一般被包装在外泌体中，保护它们免受内源性RNase活性酶的降解。循环外泌体中的microRNA已被用作检查癌症的重要指标。外泌体中microRNA的分离和表征涉及了一系列的离心分离步骤，一般通过在蔗糖梯度超速离心分离，但使用该方法很难获得高纯度的外泌体，且该方法耗时，不适用于在临床上的高通量分析。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种新的免疫脂质体生物芯片。本发明中，免疫脂质体被锚定在固体基板的表面形成微阵列，其中分子信标被封装在免疫脂质体内，和细胞表面的受体（如抗原）相结合的配体，插入到锚定的脂质体上的表面。由于抗体和脂质体的相互作用的增强，与传统的脂质体芯片，我们的免疫脂质体生物芯片具有较强的细胞结合强度，可达到较好的细胞分离效果和较低的抗体试剂消耗。本发明中的免疫脂质体生物芯片还可以被用于捕获和拣选病毒和细胞分泌的纳米粒子，如微泡和外泌体等。

本发明中内含分子信标的免疫脂质体生物芯片，可直接检测在所捕获的活细胞和病毒的核酸或蛋白质，也可测定细胞分泌的纳米粒子（如微泡和外外泌体）内的生物标志物。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

一种免疫脂质体生物芯片，所述免疫脂质体生物芯片含有免疫脂质体和芯片，免疫脂质体被锚定在芯片表面，免疫脂质体内含分子探针，免疫脂质体外载能特异性结合的配体。

优选的，所述芯片为金涂层的固体基板，所述芯片的固体基板为玻璃，硅晶片，聚甲基丙烯酸甲酯、陶瓷或其他固体材料。

优选的，所述分子探针为带有荧光标记的分子信标或核酸分子或量子点。分子信标（molecular beacon，MB）是一种在5'和3'末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针。核酸分子包括各种反义寡核苷酸(anti-sense)，小核酸(siRNA)，或微核酸(miRNA)或用于检测信使RNA的DNA核酸引物。量子点（quantum dot），具体是指一种由II-Vl族或III-V族元素组成的纳米颗粒，尺寸小于或者接近激子波尔半径（一般直径不超过10nm），具有明显的量子效应，通常用胶体化学法制备得到，是一类发光效率高、发光颜色可调性好、对光热稳定性好的生物荧光分子探针。

所述分子探针用于检测细胞内如信使RNA，微RNA和蛋白质的生物标志物，外泌体或病毒。

优选的，所述免疫脂质体包括抗体分子和脂质体，所述脂质体为下述组分中的一种或其混合物：1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基丙烷，1,2-二油酰-3-三甲基-丙烷，3β-[N-（N',

二甲基氨基乙烷盐酸盐）-氨基甲酰基]胆固醇，1,2-二-O-十八碳烯基-3-二甲基的丙烷，1,2-二油酰-3-二甲基-丙烷，蛋磷脂酰胆碱，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素（DSPE-PEG-Biotin），非离子化的脂质，如L-α-磷脂酰胆碱，胆固醇，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，饱和脂肪酸，如1-1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，和其他辅助脂质，如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）]。

优选的，所述免疫脂质体表面的配体为特异性的抗体、小肽（肽链长度3～40）或靶向小分子如叶酸等。

本发明所要解决的技术问题之二在于提供上述免疫脂质体生物芯片的制备方法。

所述的免疫脂质体生物芯片的制备方法包括以下步骤：

（1）在固体基板表面镀上一层金涂层；

（2）在金涂层上再覆盖一层薄薄的自组装单分子层制成芯片，所述自组装单分子层为2-巯基乙醇，16-巯基十六酸，和其他硫醇分子，或其他含巯基的磷脂或含巯基的聚乙二醇(PEG)化合物；

（3）在脂质体中插入配体分子制成免疫脂质体；

（4）将免疫脂质体锚定在芯片表面，免疫脂质体内含分子探针。

优选的，所述脂质体为载药脂质体，所载药物包含单一药物或两种以上药物的混合物，或含药物的磁性粒子。

本发明所要解决的技术问题之三在于提供上述免疫脂质体生物芯片在生物检测中的用途。

具体的，本发明提供了一种简单的方法来制备免疫脂质体生物芯片。将脂质体锚定分子1,2-二肉豆蔻酰基-3-[ω-巯基己基（氧化乙烯）]丙三醇（WC14）和β-巯基乙醇（βME）在乙醇中的混合物作为自组装单分子层（SAM）通过微印刷技术到金涂覆图案化的玻璃基板上。微印刷技术优选为通过使用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）的微阵列图章。

为了防止非特异性的细胞结合，我们选择用末端硫醇化的聚乙二醇分子（PEG-SH）保护芯片中的非阵列区，脂质混合物用于形成脂质体的微阵列。通过动态光散射（DLS）法分析，锚定的脂质体的粒径与常规方法所制备的非锚定的脂质体一致。

我们将用于检测捕获的活细胞内的生物标志物的分子信标封装在锚定的脂质体内，其它生物分子，如药物和成像的试剂或它们的组合物，也可以封装在锚定的脂质体内。通过一个简单的后插入方法或生物素-亲和素的方法将各种配体（如抗体等）固载到脂质体芯片表面上。除了抗体，其他的配体，如小肽，碳水化合物也可以被绑定在用于细胞分离的免疫脂质体上。

相较于常规的抗体芯片，本发明中的免疫脂质体生物芯片用于细胞分离具有以下优点：1）常规的抗体芯片在固体基板表面吸附的抗体只有几纳米左右的高度，而免疫脂质体生物芯片中免疫脂质体的粒径为100nm左右，这样大大提高了与靶细胞的结合能力。2）在达到相同的细胞捕获效果的要求下，免疫脂质体生物芯片较常规的抗体芯片大幅减少用量。3）由于免疫脂质体生物芯片是通过微接触印刷技术先制成脂质体阵列，然后插入与细胞表面结合的配体制备而得，因此可以灵活地选择多种脂质材类和配体。4）被捕获的细胞可摄取免疫脂质体，若预先在免疫脂质体中包载分子探针和/或药物，这样免疫脂质体生物芯片就可以实现一站式地完成细胞拣选和细胞内生物检测。

本发明的免疫脂质体生物芯片，可以扩展到包括一系列微阵列在内的一个更大的芯片中，其中每个小的阵列组成的特异性抗体、小肽、碳水化合物，或它们的混合物的免疫脂质体表面，特定的分子信标或分子信标的混合物包含在免疫脂质体内。这样的复合芯片可以将许多靶细胞在一个组合的设计中捕获和检测。

附图说明

图1为免疫脂质体生物芯片的制备方法流程图。以PDMS（A）作为图章通过微接触印刷技术将SAM印刷到金涂覆的玻璃或其他固体基板上，（B）为WC14与βME形成的SAM，（C）为经过PEG-SH混合物钝化的芯片，（D）为将脂质体锚定在芯片上，（E）为在脂质体上插入抗体，（F）为将制得的免疫脂质体生物芯片与细胞结合。

图2为使用荧光显微镜比较分析一个常规的抗体芯片和免疫脂质体生物芯片在细胞分离效能间的差别。图2中的（A）至（D）是抗-CD20基芯片在分离Raji和Jurkat细胞的对比结果。图2中的（E）至（H）是抗上皮细胞粘附分子（EpCAM）基芯片在分离MCF-7细胞和Raji细胞的对比结果。（A），（C），（E）和（G）洗涤前结果，（B），（D），（F）和（H）为清洗后结果。（A），（B），（E）和（F）常规的抗体芯片结果，（C），（D），（G）和（H）为免疫脂质体生物芯片结果。

图3左边的柱状图为定量比较使用EpCAM作为抗体的免疫脂质体生物芯片（tILN芯片）与常规抗体芯片在不同的细胞孵育时间和不同抗体浓度条件下，对捕获MCF-7细胞和非特异性结合的Raji细胞的数量差别。右边的荧光显微镜照片为4小时后由包含miR21锁核酸分子信标（LNA-MB）和EpCAM抗体的免疫脂质体生物芯片捕获的MCF-7细胞。

图4为使用免疫脂质体生物芯片检测外泌体。（a）为外泌体从全血中分离后施加在免疫脂质体生物芯片上检测分析的示意图；（b）为冷冻透射电镜图，展示了外泌体与免疫脂质体融合的动态过程。

图5为对A549非小细胞肺癌细胞的实时捕获和检测。（a）为免疫脂质体生物芯片捕捉肿瘤细胞所释放的外泌体的示意图。（b）发现miR-21的MB发出的绿色荧光，表明成功的捕获和检测miR-21的含外来发布的A549。（c）生物原子力显微镜（Bio-AFM）图展示了外泌体与免疫脂质体之间的融合情况。

图6（a）为荧光显微镜图，我们的芯片显示miR-21的微RNA和TTF-1mRNA在A549细胞株的培养基比正常HBEC肺癌细胞株为基础的培养基的荧光信号更强。（b）为免疫脂质体生物芯片对肺癌患者和正常人血清中miR-21的微RNA和TTF-1基因的荧光信号的柱状图，显示了免疫脂质体生物芯片表现出在肺癌患者血清比健康人血清miR-21的微RNA和TTF-1基因更强的荧光信号。

图7是荧光显微镜下，本发明的免疫脂质体生物芯片检测慢病毒表达的miR-181a的图片，绿色荧光的miR-181a的分子信标显示了使用我们的免疫脂质体生物芯片可以成功的捕获和检测里面的慢病毒表达的miR-181a。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

实施例1：免疫脂质体（tILN）生物芯片的制作

实施例1描述了一个简单的方法制作的锚定的免疫脂质体生物芯片。如图1所示，使用PDMS图章，将含有7:3(摩尔比)的WC14和β-巯基乙醇（βME）的乙醇溶液，通过微接触印刷技术转移到金涂覆的玻璃基板上，其中PDMS图章的制作使用软蚀刻技术。在原子力显微镜（AFM）图像，图1B示出的直径为15微米的芯片，图案的区域的高度是约4nm。

为了防止非特异性的细胞结合，我们发明了含有摩尔比为4:1的分子量为2,000和20,000道尔顿的PEG-SH的混合物，用以保护80％的非微阵列区域。在AFM图像中，图1C示出的PEG-SH的高度是约10nm。如图1D所示，10毫克/毫升的脂质混合物[蛋磷脂酰胆碱（Egg PC）：胆固醇（CHOL）：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（PEG-DSPE）=68:30:2的摩尔比]形成脂质体。图1E的AFM图像示出的平均直径约100nm的脂质体的荧光显微镜图像。图1F示出在大规模使用绿色染料标记的脂质体芯片。使用动态光散射（DLS）法分析，锚定的脂质体的粒径与常规的方法所制备的非锚定的脂质体一致。

为了在捕获的活细胞中检测细胞内的生物标志物，我们使用封装有分子信标的免疫脂质体生物芯片。通过将抗体插入到预先形成的脂质体的微阵列上形成免疫脂质体。具体是先使上皮细胞粘附分子（EpCAM的）抗体巯基化，然后与马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺（MAL-PEG-DSPE）胶束反应，形成抗EpCAM-PEG-DSPE，然后抗EpCAM-PEG-DSPE，抗EpCAM-PEG-DSPE进一步用罗丹明分子（红色）改性。罗丹明改性的抗EpCAM-PEG-DSPE分子在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中与事先制备的脂质体芯片孵育1小时（37℃）。孵育后，用PBS溶液洗涤免疫脂质体生物芯片，将未插入的抗EpCAM-PEG-DSPE分子冲走。图1E示出的插入后形成的tILN芯片的荧光图像，而图1F显示所捕获抗EpCAM的阳性乳腺癌细胞株MCF-7细胞。

实施例2：用抗CD20基芯片从Jurkat细胞中分离Raji细胞

实施例2包括了应用含Rituximab（抗-CD20单抗利妥西）的细胞表面配体芯片从Jurkat细胞（急性T淋巴细胞白血病细胞株）中分离Raji细胞（Burkitt淋巴瘤B细胞株）。图2中，（A）至（D）荧光显微镜图像展示了用常规抗体和实施例1制备的免疫脂质体生物芯片捕获细胞结果比较。很显然，用免疫脂质体生物芯片分离Raji细胞的效果要好得多。

实施例3：用EpCAM抗体基芯片从Raji细胞中分离MCF-7细胞

实施例3是将实施例1制备的免疫脂质体生物芯片应用于分离罕见的细胞，如血液样本中的循环肿瘤细胞（CTCs），是非常有价值的早期临床诊断和非侵入性癌症转移的预后诊断指标。但目前医学上检测CTCs细胞仍然是一个巨大的挑战，主要是因为患者的血液中这类细胞的数量非常少。由于CTCs的表面上会表达上皮细胞粘附分子（EpCAM），而正常的血液细胞没有，固定化抗EpCAM已被用于从患者血液中分离的CTCs。本实施例中，我们的目标模拟血液细胞从大量的Raji细胞中分离极少量的MCF-7细胞。同时，因为miR-21在乳腺癌细胞的过度表达可以作为一种可行的生物标志物。使用这些细胞株在不同培养时间，对EpCAM抗体基芯片从Raji细胞中分离MCF-7细胞进行了比较（图2中E至H）。很显然，免疫脂质体生物芯片分离细胞的效果要比常规抗体芯片好得多。

图3定量比较了用实施例1制备的免疫脂质体生物芯片与常规抗体芯片分离细胞效果的差异。结果显示，用相同的方式处理芯片和细胞，tILN芯片在洗涤的剪切应力为60gm、细胞孵育时间为30分钟时，能够捕捉到95％MCF-7细胞。当细胞孵育时间缩短为5分钟时，捕获效率下降到55％。另一方面，非特异性结合的Raji细胞的数目在tILN芯片中明显很少，小于5％；而常规抗体芯片明显较高，在5和30分钟的孵育时间时非特异性结合细胞数目大于5％和大于30％。这些结果表明，tILN芯片比常规抗体芯片具有较好的细胞分离效率。

实施例4：免疫脂质体生物芯片用于外泌体检测

在本实施例中，展示了含有微RNA-21（miR-21）的生物标志物的免疫脂质体生物芯片肺癌的早期检测中的应用。如图4a中所示，外泌体可以从全血中分离，然后施加在我们的免疫脂质体生物芯片上。分子检测探针，如分子信标（MB），被封装在免疫脂质体中，检测外泌体，作为疾病早期检测的生物标志物。免疫脂质体由10毫克/毫升脂质混合物[1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷（氯化物盐）（缩写为DOTMA）：胆固醇：生物素-PEG-DSPE=49:49:2（摩尔比）]制备所得。我们使用冷冻透射电镜图展示了外泌体与免疫脂质体融合的动态过程(图4b)。

我们采用了全内反射荧光显微镜可视化实时观察A549非小细胞肺癌细胞所释放和捕捉的外泌体情况（图5a）。如图5b所示，包含miR-21的MB，1小时后，A549细胞的tILN芯片，我们并没有观察到miR-21的MB上tILN芯片的的许多绿色荧光信号。然而，2个小时后，我们发现miR-21的MB发出的绿色荧光，表明成功的捕获和检测从A549细胞释放出的含miR-21的外泌体。此外，我们还观察到包含miR-21的MB的A549细胞的荧光，这表明，该tILN芯片可检测外来的和细胞表达的miR-21。我们进一步使用生物原子力显微镜（Bio-AFM），用PBS缓冲液，观察到图5c所示的外泌体与免疫脂质体之间的融合情况。

最近的研究表明，循环外泌体中miR-21的水平变化与肿瘤恶性程度密切相关。我们用包裹在脂质体的miR-21的分子信标和阴性对照分子信标来检测外泌体中miR-21的表达水平。为了确认是来自肺肿瘤的外泌体，用于检测肺腺癌的临床标志，甲状腺转录因子-1（TTF-1）mRNA表达的分子信标，也被封装在免疫脂质体生物芯片中。

首先，我们使用了tILN芯片检测到肺癌患者A549细胞和正常人支气管上皮细胞（HBEC）产生的外泌体中miR-21和TTF-1mRNA信号。外泌体施加到tILN芯片上，并在37℃下孵育2小时。如图6中所示，在A549细胞中外泌体miR-21和外泌体TTF-1mRNA的表达高于HBEC细胞。从定量RT-PCR结果也表明，在A549细胞中外泌体miR-21的表达是HBEC细胞的12.43倍以上。然而，定量RT-PCR未能够检测到A549和HBEC中外泌体TTF-1mRNA的表达，这表明，我们的免疫脂质体生物芯片分析方法是一个比RT-PCR方法还更敏感的检测方法。

我们使用tILN芯片分别对从一个肺癌病人和健康捐赠者处获得的血清样本进行测试分析。在37℃下孵育2小时。正如在图6中所示，在患者样品中miR-21和TTF-1的荧光信号比在健康者的血液样本的荧光信号强。

实施例5：免疫脂质体生物芯片用于病毒检测

本实施例展示了用免疫脂质体生物芯片在慢病毒检测和鉴定的应用。含miR-181a的分子信标被封装在脂质体中，用于检测慢病毒载体中的编码信使RNA。将含微小RNA-181a的编码的慢病毒加到免疫脂质体生物芯片的移动设备上，并在37℃下孵育2小时。如图7中所示，绿色荧光的miR-181a的MB证明了慢病毒mRNA内的miR-181a被成功的捕获和检测。正如预期的那样，并没有表现出任何的miR-181a的阴性对照分子信标的荧光信号。据我们所知，这是在同一个步骤中直接捕获与表征病毒的第一次成功实验。

Claims (8)

1.一种免疫脂质体生物芯片，其特征在于：所述免疫脂质体生物芯片含有免疫脂质体和芯片，免疫脂质体被锚定在芯片表面，免疫脂质体内含分子探针，免疫脂质体外载具有特异结合能力的配体。

2.如权利要求1所述的免疫脂质体生物芯片，其特征在于：所述芯片为金涂层的固体基板，所述固体基板为玻璃，硅晶片，聚甲基丙烯酸甲酯或陶瓷。

3.如权利要求1所述的免疫脂质体生物芯片，其特征在于：所述免疫脂质体包括抗体分子和脂质体，所述脂质体为下述组分中的一种或其混合物：1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基丙烷，1,2-二油酰-3-三甲基-丙烷，3β-[N-（N',

二甲基氨基乙烷盐酸盐）-氨基甲酰基]胆固醇，1,2-二-O-十八碳烯基-3-二甲基的丙烷，1,2-二油酰-3-二甲基-丙烷，蛋磷脂酰胆碱，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素，L-α-磷脂酰胆碱，胆固醇，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，1-1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）]。

4.如权利要求1所述的免疫脂质体生物芯片，其特征在于：免疫脂质体表面的配体为特异性的抗体、小肽或靶向小分子。

5.如权利要求1所述的免疫脂质体生物芯片，其特征在于，所述分子探针为带荧光标记的分子信标、核酸分子或量子点。

6.一种如权利要求1至5中任一项所述的免疫脂质体生物芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）在固体基板表面镀上一层金涂层；

（2）在金涂层上再覆盖一层薄薄的自组装单分子层制成芯片，所述自组装单分子层为2-巯基乙醇，16-巯基十六酸，含巯基的磷脂或含巯基的聚乙二醇化合物；

（3）在脂质体中插入配体分子制成免疫脂质体；

（4）将免疫脂质体锚定在芯片表面，免疫脂质体内含分子探针。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述脂质体为载药脂质体，所载药物包含单一药物或两种以上药物的混合物，或含药物的磁性粒子。

8.如权利要求1-5中任一项所述的免疫脂质体生物芯片在生物检测中的应用。

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