CN113167794A - 使用光学生物传感器分析胞外囊泡的系统和方法 - Google Patents

Abstract

公开了具有多个创新性特征的用于分析胞外囊泡(EV)的系统和方法的各种实施方案。在一个实施方案中，用于分析EV的方法包括使EV与光学波导生物传感器结合以及对结合的EV进行表型。表型可包括使经标记的配体与EV结合和/或破裂EV并分析它们的载物。在另一个实施方案中，用于分析EV的系统包括与光学波导生物传感器结合的EV以及与EV结合的经标记的配体。在另一个实施方案中，用于分析EV的试剂盒包括具有孔的微板，所述孔容纳光学波导生物传感器，所述光学波导生物传感器与结合剂一起起作用，所述结合剂被构造用于结合到EV和以下中的至少一种：(a)被构造用于与胞外囊泡结合的经标记的配体，或者(b)被构造用于使胞外囊泡破裂的试剂。

Description

使用光学生物传感器分析胞外囊泡的系统和方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C§120要求2018年11月30日提交的系列号为62/773,753的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并通过引用将其全文纳入本文。

技术领域

本申请涉及使用光学生物传感器分析胞外囊泡的系统和方法，尤其涉及使用光学生物传感器对胞外囊泡进行纯化、表型和定量的系统和方法。

背景技术

胞外囊泡(EV)是膜包封的囊泡的异质群体。EV被认为是细胞间通信的重要组分，并且参与多种生物学和病理学过程。EV与疾病的发展和进展有关，这构成了在临床环境中使用EV分析的基础。随着对EV的兴趣增加，已经开发了一些技术来表征EV。这些技术表征EV的不同特征，例如尺寸分布、计数、蛋白质组成和囊内内容物。

尽管这些技术得到了发展，分离和/或区分各种EV仍是主要的挑战。例如，常规方法(例如，超速离心)需要高度专业化的设备，这在许多实验室不可获得，并且使EV承受可能损伤它们的极端力。诸如超滤之类的方法依赖于具有特定截留分子量或孔径的膜，由于EV与膜材料的非特异性结合，可能导致EV损失。涉及EV沉淀的方法常得到被蛋白质或其他分子污染的结果。涉及色谱柱的方法基于亲和力、尺寸排阻或离子交换来分离EV，这些方法费力且费时。使用微流体装置的方法具有极低的通量。

期望开发更易使用和/或提供更优结果的表征技术。尤其期望开发微板形式的同时可用于分离和分析EV的技术。

发明内容

公开了使用光学生物传感器，尤其是光学波导生物传感器分析或测定胞外囊泡(EV)的多种方法。所述方法可用于纯化EV和/或分析EV的各种特征。例如，所述方法可用于定量和/或识别样品介质中的EV，尤其是具有一种或多种特定标志物的那些。所述方法可使用合适的EV分析系统来实施。在一个实施方案中，EV分析系统包括光学读取器，其被构造用于接收和分析具有多个孔的微板，其中，每个孔包括光学波导生物传感器。

所述方法和对应的系统可以各种方式来实施以实现以下一个或多个潜在的优点。一个优点在于，可在EV结合于光学波导生物传感器的表面时，分离、纯化和分析EV，这使得这些过程更简单且更容易。另一个优点是当使用对已知的EV表面标志物或受体特异的结合剂(例如抗体)将EV结合到光学波导生物传感器的表面时，可在单个步骤中捕获和表型EV。另一个优点是，可使用微板来执行EV分析系统，由于微板处理设备在大多数实验室盛行，这使得易被采用。另一个优点是可以基于高通量来分析EV。

所述EV分析方法的一个创新方面可以通过使用对某些EV表面标志物特异的结合剂将EV结合到光学波导生物传感器的表面来实现。可对结合剂进行选择以仅捕获具有目标标志物的那些EV。通过这种方式，可以使用将EV结合到光学波导生物传感器的过程来将感兴趣的EV与包含不具有目标标志物的其他EV的样品介质的剩余部分分离。这使得可从样品直接对EV进行表型而不需要标记物。

所述EV分析方法的另一个创新方面可以通过在EV已经结合到光学波导生物传感器后，对EV进行额外的表型分析来实现。所述额外的分析可包括：对EV进行定量，基于存在或不存在一种或多种额外的标志物，对EV进行分类和分离，和/或分析EV的囊内内容物。

在一个实施方式中，样品中的EV的量或者结合到光学波导生物传感器表面的EV的量可通过将样品的测量值与一个或多个具有已知量的相同EV或标志物相同的EV的样品的测量值进行比较来确定。例如，可使用具有已知量的特定EV的样品来创建标准曲线，并且与由具有未知量的相同EV(或具有相同标志物的EV)所产生的曲线进行比较来确定该未知样品中的EV的量。

在另一个实施方案中，通过将一个或多个标记的配体与EV上存在的额外的标志物或受体结合，可进一步分析EV。所述配体可通过荧光标记物、比色标记物和/或发光标记物来标记。标记的配体可用于进一步表征结合到光学波导生物传感器表面的EV的类型。

在另一个实施方式中，可分析结合的EV的囊内内容物。这可通过使用合适的试剂将EV破裂，以及分析内容物来进行，所述内容物可包括蛋白质、DNA和/或RNA。在一个实施方案中，可使用裂解试剂(例如TRIzol)等来破裂EV。

应注意，术语“表型”是指在任何水平下——物理、形态、生物化学或分子水平——EV的可观察到的特征。

本公开的系统、方法和装置各自具有若干个创新方面，没有任何一者单独地负责所述的期望属性。所述发明内容以简化的形式介绍了一些构思的选择，这些构思将在下面的具体实施方式中进一步描述。发明内容和背景并不旨在显示所公开的主题的关键构思或必要方面，并且它们也不应用于约束或限制权利要求的范围。例如，不应基于所述的主题是否包含了发明内容中提到的任何方面或所有方面以及/或者是否解决了背景技术中提到的任何问题来限制权利要求的范围。

附图说明

结合附图公开了优选的实施方案和其他实施方案，其中：

图1是根据本公开的实施方式所述的用于分析胞外囊泡(EV)的系统的透视图。

图2是根据本公开的实施方式，在顶表面上具有结合剂的光学波导生物传感器的截面图。

图3是根据本公开的实施方式，具有与结合剂结合的EV的图2的光学波导生物传感器的截面图。

图4根据本公开的实施方式示出了共振波导光栅(RWG)生物传感器的操作。

图5示出了根据本公开的实施方式，示出了用于分析EV的一种程序。

图6是光学波导生物传感器的截面图，其中结合剂结合到EV并且利用表面化学层结合到生物传感器的表面，所述表面化学层包括聚(乙烯-交替-马来酐)(EMA)。

图7是光学波导生物传感器的截面图，其中结合剂结合到EV并且利用表面化学层结合到生物传感器的表面，所述表面化学层包括链霉亲和素(Streptavidin)。

图8是光学波导生物传感器的截面图，其中，结合的EV通过与标记的配体结合而得到了进一步的表征。

图9是光学波导生物传感器的截面图，其中，结合的EV经过了破裂，使得可分析囊内内容物。

具体实施方式

EV分析系统

参考图1，其示出了用于分析胞外囊泡(EV)的系统10的透视图(所述系统10或者被称为EV分析系统或EV测定系统)。系统10包括微板12、光学读取器14(或者被称为光学板读取器)和膝上型计算机16。微板12被构造用于保持包含EV的样品。样品读取器14被构造用于分析微板12中的样品。计算机16包括用于仪器操作和数据分析的软件。计算机16可以用于控制光学读取器14和其他相关实验室设备的操作。

系统10可被构造成具有任何合适的样品通量。在一些实施方案中，系统10可被认为是在8小时的时间内能够测量几百或者甚至几千个孔的高通量系统(HTS)。例如，系统10可被构造成在8小时的时间内测量至少500个孔，在8小时的时间内测量至少1,000个孔，在8小时的时间内测量至少2,000个孔，在8小时的时间内测量至少3,000个孔，在8小时的时间内测量至少4,000个孔，或者在8小时的时间内测量至少5,000个孔。

在高通量实施方案中，系统10可被构造成易于与其他设备集成，所述其他设备促进快速处理和分析大量的微板12。额外的设备可包括液体处理系统、调度器等。在这些实施方案中，系统10的操作即使不是全部自动化，也是有很多可以自动化的。

图1示出了作为独立部件的光学读取器14和计算机16。但应理解，在其他实施方案中，光学读取器14和计算机16可组合成单个单元。可对光学读取器14和计算机16的构造进行许多其他改变。

微板

微板12(或称为微孔板或多孔件)是具有多个孔18的大致平坦的板，所述孔18起到小试管的作用。每个孔18包括被集成在孔18的底部中的光学波导生物传感器20。图1所示的微板12包括384个孔18。

但应理解，微板12可包括以任何合适方式布置的任何合适数目的孔18。例如，微板12可包括6、12、24、48、96、384、768、或1536个孔18。而且，孔18可以各种方式来布置，例如，以2:3矩形矩阵来布置。

各个孔18可被构造用于保持从纳升到毫升的各种量的液体。一般地，孔18的尺寸随着微板12上的孔18的数目增加而减小。应理解，这不是硬性规定。可存在微板12具有小数目的小孔18或者大数目的大孔18的情况。

孔18还可具有任何合适的形状并且可由任何合适的材料制成。在一些实施方案中，孔18可以是圆形、正方形、多边形等。在一些实施方案中，孔18至少部分可由聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、环烯烃、金属、玻璃、陶瓷、石英等制成。

微板12可具有任何合适的构造，条件是其能够保持住样品。在一些实施方案中，根据生物分子筛选学会(SBS)制定的标准规范，例如，SBS标准384孔规范来构建微板12。

光学波导生物传感器

参考图2-3，其示出了光学波导生物传感器20的一个实施方案的截面图。光学波导生物传感器20包括基材层22，在基材层22上的波导层24(或者称为波导涂层或波导薄膜)，以及在波导层24上的表面化学层26(或者称为结合层或结合表面)。基材层22包括嵌在基材材料(例如玻璃)中的光栅。波导层24是具有高折射率的电介质材料。

应理解，光学波导生物传感器20可以是具有任何合适构造的任何合适类型的波导生物传感器。例如，光学波导生物传感器20可以是单模或多模光学波导生物传感器。其还可包括任何合适类型的波导，例如共振波导光栅、纳米结构化光栅、平面波导等。光学光栅可嵌在基材层22、波导层24中或者层22、24的界面处。在一个实施方案中，光学波导生物传感器20是共振波导光栅生物传感器(RWG生物传感器)。

表面化学层26包括表面化学(或者称为结合化学)薄层，其在光学波导生物传感器20的顶部上提供活性表面30以用于附接和固定EV特异性结合剂或靶标28。表面化学提供了高结合能力的表面，并且具有低的非特异性结合水平。应注意，术语“结合”和“结合的”用于指各种连接技术，包括吸附、共价键合、非共价键合、化学吸着等。

任何合适的表面化学可用于将结合剂28结合到光学波导生物传感器20的表面30。在一个实施方案中，表面化学与结合剂28上的伯胺基团形成了共价键。在另一个实施方案中，表面化学与生物素化的结合剂28结合。

在一个实施方案中，表面化学层26包括聚(乙烯-交替-马来酐)(EMA)。EMA通过在结合剂28上的胺基与光学波导生物传感器20的表面30之间建立共价键，采用直接胺连接来固定结合剂28。

在另一个实施方案中，表面化学层26包括链霉亲和素，其可用于将生物素化的分子结合到表面30，例如，结合剂28的生物素化的形式(结合剂28附接有生物素)。链霉亲和素对生物素具有极高的亲和结合，其强度与共价键近似。

在另一些实施方案中，表面化学层26可包括说明书结尾处列出的专利文件中所述的任何表面化学。

光学波导生物传感器20被构造用于检测生物传感器20的顶表面30附近的折射率变化，该变化指示了生物化学结合事件，例如EV 32结合到顶表面30。光学波导生物传感器20可检测顶表面30上方约150–200nm的区域中的折射率变化。以下是光学波导生物传感器20是RWG生物传感器的一个实施方案的深入描述。

参考图4，该图例示了光学RWG生物传感器20的操作。光源34利用宽带、偏振光对每个RWG生物传感器20的下侧进行照明。特定波长(共振波长)——此时实现了最大的耦合中效率——的光被耦合到波导层24中并且沿着波导层24传播。这在顶表面30与本质上倏逝的溶液的界面处产生了电磁场36，这意味着光从顶表面30呈指数衰减。光衰减到其初始值的1/e(e是等于2.71828的常数)时的距离被称为穿透距离，并且其根据具体的RWG生物传感器20的设计而变化，但是通常是150–200nm。

共振光最终从波导层24漏出，并且反射回到RWG生物传感器20下方的检测器38(或者称为检测头或检测单元)。反射光的波长是构成波导的材料以及在表面30的约200nm内的生物分子的组合折射率的函数。当分析物(例如EV 32)结合到表面30时，其改变局部折射率，这诱导了从RWG生物传感器20反射的光的波长位移。波长位移与结合到表面30的分析物的量成比例。

RWG生物传感器20的使用可提供多个优点。相比于表面等离子体共振(SPR)生物传感器，RWG生物传感器20的一个优点是可使用标称法向入射角的光对RWG生物传感器20进行照明。当同时取样大量生物传感器时，这可以是重要的。

光学读取器

光学读取器14包括检测器系统40，其使用集成光纤光学器件来测量入射光的波长位移。检测器系统40包括以线性方式布置的一系列照明头42和检测头38，使得可从微板12中的每个孔18同时收集反射光谱。可扫描整个微板12，使得可多次寻址每个光学波导生物传感器20，并且依次寻址每列。测量入射光的波长并用于进行分析。光学读取器14还可包括温度控制单元，其用于减少或最小化由于温度波动导致的入射波长的假性位移。

检测头38可包括分光计，其被构造用于测量反射光的波长。分光计也可用于测量峰值功率或共振强度，以确定光源34是否在光学波导传感器20上。

光学读取器14可用于测量以下任何状况时的反射光的波长(图5在左图中例示了状况)。测量值可用于建立样品曲线和参比曲线，它们也示于图5。

参比波长44——仅缓冲溶液，并且在表面30上没有经固定的结合剂28。

参比波长46——缓冲溶液中有未结合的EV 32，并且在表面30上没有经固定的结合剂28。

样品波长48——仅缓冲溶液，并且在表面30上具有经固定的结合剂28。

样品波长50——缓冲溶液中有结合的和未结合的EV 32，并且表面30上具有经固定的结合剂28。

波长测量值可用于获得关于EV 32的额外的信息。例如，通过从样品波长50中减去参比波长46，可确定EV结合信号52。在一些实施方案中，对于EV 32的量已知的样品，可测量标准波长，并且可创建对应的曲线。可将标准波长与样品波长50进行比较来确定给定样品中的EV 32的量。

EV分析方法

参考图6-7，其示出了光学波导生物传感器20的截面图。图6中的光学波导生物传感器20包括作为表面化学层26的聚(乙烯-交替-马来酐)，并且图7的生物传感器20包括作为表面化学层26的链霉亲和素。

表面化学层26将结合剂28结合到光学波导生物传感器20的表面30。在一些实施方案中，微板12可配备有已经就位的表面化学层26和/或结合剂28。在这种情况中，微板12准备好在收到时立即使用。在另一些实施方案中，微板12可不配备有就位的表面化学层26和或结合剂28。在这种情况中，使用者将需要向表面30施涂期望的化学表面层26和/或结合剂28。

结合剂

结合剂28可以是能够结合到EV 32上的标志物或受体54的任何合适材料。合适材料的实例包括蛋白质、抗体、抗体片段等。在一些实施方案中，结合剂28可以是对EV 32上的表面标志物特异的抗体或抗体片段。

术语“抗体”指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。四聚体可以是天然存在的或者由单链抗体或抗体片段重构。

抗体还包括二聚体，所述二聚体可以是天然存在的或者由单链抗体或抗体片段构造。抗体可以各种形式存在，例如，包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab')₂，以及单链抗体(scFv)、人源化抗体和人抗体。

术语“抗体片段”指完整抗体的一部分，并且指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')₂、Fv片段，线性抗体，scFv抗体，单域抗体(例如骆驼科抗体，其由VL或VH结构域组成，其对靶标表现出足够的亲和力)，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段还包括人抗体或人源化抗体，或者一部分人抗体或人源化抗体。

术语“片段”是指蛋白质或核酸分子的一部分(例如，至少10、25、50、100、125、150、200、250、300、350、400或500个氨基酸或核酸)，其与参比蛋白质或核酸基本上相同并且保留了参比物的生物活性。

可以对结合剂28进行选择，以与EV 32上的特异性、膜结合的受体54结合。EV 32可包括各种不同的表面分子，其可与各种EV特异性结合剂28结合。

胞外囊泡

术语“胞外囊泡”(EV)是指被各种细胞类型，例如，内皮细胞、上皮细胞、血小板和肿瘤细胞释放到胞外空间中的膜包封的小结构。通常，EV 32的至少部分的膜从细胞(也称为供体细胞)直接获得。EV 32可通过膜转化、胞吐、脱落、出泡和/或出芽而源自细胞。取决于产生的方式(例如，膜转化、胞吐、出泡或出芽)，EV 32可表现出不同的表面/脂质特性。

EV 32可以包括在EV 32的膜内的蛋白质、脂质、核酸或其他生物分子的异质组合物。EV 32的分子内容物可以代表其起源细胞，包括表面和细胞质蛋白、信使RNA和微RNA。EV32可将这些分子运输到体内或生物系统中的各种靶细胞和位置。EV 32内的遗传信息可通过与受体细胞的膜融合并将遗传信息释放到细胞内部来传递。

EV32可以具有各种尺寸。例如，EV 32的直径(或者结构不是球体的情况下的最大尺寸)可以为10–5,000nm、20–3,000nm或30–2,000nm。EV 32的直径(或者结构不是球体的情况下的最大尺寸)也可以为至少10nm，至少20nm，或者至少30nm。EV 32的直径(或者结构不是球体的情况下的最大尺寸)还可以不超过5,000nm，不超过3,000nm，或者不超过2,000nm。

EV 32可从各种生物来源分离出，这些生物来源包括哺乳动物，例如、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗、猫、牛、马、山羊、绵羊、灵长类或人。EV 32可以从生物液体中分离出，例如血清、血浆、全血、尿、唾液、母乳、眼泪、汗液、关节液、脑脊液、精液、阴道分泌物、腹水和羊水。EV 32也可以从实验样品中分离出，例如取自培养细胞的培养基(“条件培养基”、细胞培养基和细胞培养介质)。

EV 32还可从组织样品中分离出，例如，手术样品、活检样品和培养的细胞。当从组织来源中分离EV 32时，将组织均质化以获得单细胞悬浮液，然后裂解细胞以释放EV 32可以是有益的。当从组织样品中分离EV 32时，应使用不会导致EVs 32被破坏的均质化和裂解程序。

基于具体的特征，例如，尺寸、生物起源、细胞来源、蛋白质组成、生物学功能等，可将EV 32分类为多个亚群。根据EV 32的细胞来源，EV 32可大致分为三种主要亚型，即，外泌体、微泡(MV)(也称为脱落囊泡)和凋亡小体，如下表所示。

表1

外泌体通常是胞吞来源的并且由内体膜内陷形成，其在内体隔室内形成囊泡，产生多泡体(MVB)。当MVB与质膜融合时，外泌体被释放到胞外空间中。外泌体的尺寸通常为30-100nm，密度为1.13–1.19g/ml。

由于外泌体的生物起源，外泌体膜蛋白的定向与质膜的定向相似。除了相似的定向外，外泌体膜的脂质组成与质膜的脂质组成相似，并包含胆固醇、神经酰胺和磷脂酰丝氨酸(PS)以及可用于识别外泌体的几种蛋白质标志物。这些包括参与MVB形成机制的蛋白质(例如，Alix和Tsg101)，来自膜和融合机制的蛋白质(例如，GTP酶、膜联蛋白和筏蛋白)以及四跨膜蛋白(CD9、CD63和CD81)。外泌体还可以在其表面上展示糖化基团。

不同的标志物可能不会普遍存在于所有外泌体上，而是存在于大部分外泌体上，这就是为何它们被普遍接受为外泌体标志物的原因。除了外泌体蛋白质外，外泌体通常呈现出反映母细胞的分子特征的分子组成。在某些情况下，外泌体的分子内容物可能不是从母细胞中随意采样的分子所产生，而是可能因为能够将特定分子加载到外泌体中而产生。外泌体还可以包含大量的RNA，包括miRNA、非编码RNA、mRNA、miRNA等。

微泡通常由质膜向外出芽形成，使得将MV直接释放到胞外空间中。一些MV在膜的外叶中存在PS，并且该特征可用于分离和识别生物样品中的MV。MV可以包括标志物，例如CD40配体、二磷酸腺苷核糖基化因子6和某些整合素和选择素。MV的囊内内容物可包括膜和胞质蛋白、mRNA、miRNA等。MV的尺寸可以为50–1,000nm。

凋亡小体通常在细胞凋亡时释放，它们通过质膜起泡形成，这将凋亡小体直接释放到胞外空间中。类似于EV 32的其他亚型，凋亡小体在脂质双层的外叶中存在PS。此外，它们提供血小板反应蛋白和补体成分C3b，其可用于识别凋亡小体。此外，除了来自母细胞的胞质液的蛋白质和其他分子外，凋亡小体还可以通过包含作为部分囊内载物的细胞器、DNA片段和组蛋白而与其他EV亚型区分开来。凋亡小何的尺寸可以为500–4,000nm并且密度为1.16–1.28g/ml。

术语“microRNA”、“miRNA”或“miR”是指在转录后发挥功能以调节基因表达的RNA，通常通过与靶标信使RNA(mRNA)转录子的三撇(3')非翻译区(3'UTR)中的互补序列结合来发挥功能，其常导致基因沉默。miRNA通常是小的调节RNA分子，例如，21或22个核苷酸长(不超过100个核苷酸长，或不超过50个核苷酸长)。术语“microRNA”、“miRNA”和“miR”可互换使用。

EV分离

可使用以下过程从样品中分离EV 32。如果结合剂28未附接于微板12，那么第一步是附接结合剂28。这可通过下述实现：向每个孔18添加包含结合剂28的固定缓冲溶液，并且孵育微板12直到结合剂28被固定在表面化学层26上。

除去固定缓冲溶液并且用阻断缓冲溶液替换，所述阻断缓冲溶液使表面化学层26上的任何剩余的固定位点失活。去除阻断缓冲溶液并且清洗孔18。微板12现在开始接收和分析包含EV 32的样品。

将包含EV 32的样品放到孔18中。EV 32与结合剂28结合，其以图6-7所示的方式结合到生物传感器20的表面30。从孔18冲掉剩余的样品物质，从而在微板12上仅留下结合的EV 32。以这种方式，可分离结合的EV 32，并且基于能够与结合剂28结合的标志物的存在来进行表型。而且，所有这些可在单个步骤中完成。

EV定量

给定样品中的EV 32的量可通过测量样品的波长，并且将其与一个或多个标准波长进行比较来确定，所述标准波长获自具有相同EV 32并且该EV 32浓度已知的样品。上文描述了测量具有EV 32并且该EV 32的浓度已知的样品的标准波长，并且将其与EV 32的浓度未知的样品所测得的波长进行比较的程序。

EV二级表型

参考图8，可以使用一个或多个带标记的或带标签的配体56来对结合的EV32进一步分离和分类，所述配体56被构造成与EV 32上的另一标志物或受体60结合。配体56可包括任何合适类型的标记物或标签58。例如，配体56可包括荧光标记物、比色标记物或发光标记物。

配体56可以是能够与EV 32上的特定标志物结合的任何合适的蛋白质、化合物、分子等。在一些实施方案中，配体56可以是上文结合EV 32或结合剂28描述的任何抗体。在一些实施方案中，可使用两种、三种、四种或更多种不同的配体56，其各自具有不同的标记物58，以对EV 32进行进一步的分离和分类。

可使用与结合的EV 32相关的上述相同的技术来对结合到给定配体56的EV 32的数目进行定量。即，可使用相关EV 32的量已知的样品来获得标准波长测量值，并且将其与标记的EV 32的波长测量值进行比较。

EV囊内内容物

参考图9，使用以下程序可分析结合的EV 32的囊内内容物。可向孔18中添加试剂62以破裂或裂解EV 32并且暴露出它们的内容物用于进一步分析。可使用任何合适的试剂62来破裂EV 32。在一些实施方案中，试剂62是裂解试剂，例如TRIzol裂解试剂。

EV 32的囊内内容物可包括蛋白质、DNA、RNA(微RNA)等。可将这些分子取出放到另一个容器中，并且通过完成标准的相提取方案进行提取。可对这些分子进行分析以诊断疾病，确定疾病的预后等。

用于分析EV 32的方法可提供多个优点。一个优点是该技术可用于对来自复杂生物样品的EV 32直接进行分离、定量和表型而不需要任何中间的纯化步骤，所述复杂生物样品例如体液，例如，血清、细胞培养基、尿等。

EV分析试剂盒

用于分析EV 32的试剂盒可包括上述任何材料和部件。在一个实施方案中，试剂盒可包括标记的配体56或试剂62中的至少一种以及微板12。在另一些实施方案中，试剂盒可包括包装，其被构造用于将试剂盒的部件保持在一起或者指示部件是试剂盒的部分。

实施例

提供下列实施例以进一步说明所公开的主题。这些实施例不应以任何方式用于约束或限制权利要求的范围。

实施例1

在该实施例中，使用康宁(Corning)Epic系统(其是无需标记物的高通量筛选系统)来分析样品中的具有特定生物标志物的胞外囊泡(EV)的量。所述系统包括生物传感器微板，其具有384个样品孔。每个样品孔具有定位在底部中的共振波导光栅生物传感器(RWG生物传感器)。RWG生物传感器包括纳米级光栅，其嵌在基材以及施涂于基材的高折射率波导层或涂层中。所述系统还包括光学读取器，其利用宽带光源对RWG生物传感器进行照明。

处于共振波长的光耦合到波导层中并且沿着波导层传播。由光的共振耦合产生的倏逝场穿透约150nm而进入到RWG生物传感器上方的层中，并且探测局部折射率。在共振波长不与RWG生物传感器耦合后，通过CMOS摄像机来检测共振波长。由于在感测区中由EV结合到RWG生物传感器所造成的折射率变化，光的共振波长发生位移。

RWG生物传感器包括在顶表面上的表面化学层。表面化学层包括聚乙烯-马来酐(EMA)，其通过在抗体上的胺基与顶表面之间建立共价键而将抗体固定在RWG生物传感器上。

如下在微板的孔中建立EV特异性抗体的阵列。在缓冲溶液中稀释抗体并将其添加到微板中的大多数孔中。向剩余的孔添加对照缓冲溶液，以形成仅有缓冲溶液的对照孔，其用于对抗体固定化水平进行定量。孵育微板以促进抗体固定在RWG生物传感器的顶表面上。除去缓冲溶液并且用阻断缓冲溶液替换，所述阻断缓冲溶液使任何剩余的固定位点失活。去除阻断缓冲溶液并且清洗孔。

按下述将EV结合到RWG生物传感器。向孔添加不具有血清的新鲜细胞培养基。将微板装载到光学读取器中并且平衡约2小时以稳定传感器。测量孔的共振波长以创建基线。向固定有抗体的孔添加包含具有特定标志物的EV并且其量已知的细胞培养基，以及包含相同EV并且其量未知的细胞培养基，其中，留下一些孔不添加任何EV以用作对照。孵育微板约1小时以允许EV结合到抗体。测量孔的共振波长。

使用对照和EV的量已知的细胞培养基的测量值创建标准曲线。通过将标准曲线与使用EV的量未知的细胞培养基所创建的曲线进行比较，确定在未知的细胞培养基中具有标志物的EV的量。

实施例2

在该实施例中，使用康宁Epic系统和标记的抗体来获得EV的额外表型信息。以实施例1所述的方式将EV结合到RWG生物传感器并进行分析。在测量了包含结合的EV的孔的共振波长后，从孔去除培养基，并且加入包含荧光标记抗体的缓冲溶液(可使用比色标记物或发光标记物来重复本实施例)。标记的抗体结合到某些EV的第二标志物或表位。标记的抗体通过识别其他表面标志物而提供了关于EV的额外的表型信息，所述其他表面标志物包括对特定疾病可能是潜在的标志物的那些。通过以实施例1所述的方式创建标准曲线，并且将该标准曲线与使用具有相同标志物的EV并且其量未知的细胞培养基所创建的曲线进行比较，确定具有第二标志物的结合的EV的量。

实施例3

在该实施例中，通过检查EV的胞内内容物来获得额外的表型信息。以实施例1或实施例2所述的方式将EV结合到RWG生物传感器并进行分析。通过向孔中的结合的EV添加TRIzol试剂(苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液)，使EV裂解。这释放了EV的胞内内容物，包括蛋白质、DNA、RNA(例如miRNA)等。将孔的内容物取出放到另一个容器中，并且通过以下标准相提取方案进行分离。对miRNA进行分析以诊断疾病，和/或确定疾病的预后。

示例性实施方案

以下是对所公开的主题的各个实施方案的描述。每个实施方案可以包括所公开的主题的各种特征、特性或优点中的一种或多种。实施方案旨在例示所公开的主题的几个方面，并且不应被认为是对所有可能的实施方案的全面或详尽的描述。

P1：一种方法，其包括：将样品定位在光学波导生物传感器上，所述样品包括胞外囊泡；使胞外囊泡与光学波导生物传感器结合；检测与光学波导生物传感器结合的胞外囊泡；以及分析与光学波导生物传感器结合的胞外囊泡的特征。

P2：如P1段所述的方法，其中，胞外囊泡的特征包括样品中的胞外囊泡数目。

P3：如P1-P2段中任一段所述的方法，其中，胞外囊泡的特征包括样品中的胞外囊泡的尺寸。

P4：如P1-P3段中任一段所述的方法，其中，胞外囊泡的特征包括样品中的胞外囊泡的类型。

P5：如P1-P4段中任一段所述的方法，其中，分析胞外囊泡的特征包括：使配体与胞外囊泡结合。

P6：如P5段所述的方法，其中，所述配体包括与胞外囊泡上的第一标志物结合的第一配体，以及与胞外囊泡上的第二标志物结合的第二配体。

P7：如P5-P6段中任一段所述的方法，其包括：在胞外囊泡与光学波导生物传感器结合时，使配体与胞外囊泡结合。

P8：如P5-P7段中任一段所述的方法，其中，所述配体包括标记物。

P9：如P8段所述的方法，其中，所述标记物是荧光标记物。

P10：如P8-P9段中任一段所述的方法，其中，所述标记物是比色标记物。

P11：如P8-P10段中任一段所述的方法，其中，所述标记物是发光标记物。

P12：如P1-P11段中任一段所述的方法，其中，分析胞外囊泡的特征包括：分析胞外囊泡的囊内内容物。

P13：如P12段所述的方法，其中，分析胞外囊泡的囊内内容物包括：分析囊内内容物中的蛋白质、RNA和/或DNA。

P14：如P12-P13段中任一段所述的方法，其中，分析胞外囊泡的胞内内容物包括：分析囊内内容物的组成。

P15：如P12-P14段中任一段所述的方法，其中，分析胞外囊泡的囊内内容物包括：使胞外囊泡破裂。

P16：如P15段所述的方法，其包括：在胞外囊泡与光学波导生物传感器结合时，使胞外囊泡破裂。

P17：如P12-P16段中任一段所述的方法，其中，分析胞外囊泡的囊内内容物包括：使胞外囊泡裂解。

P18：如P17段所述的方法，其包括：在胞外囊泡与光学波导生物传感器结合时，使胞外囊泡裂解。

P19：如P1-P18段中任一段所述的方法，其中，所述样品是未经纯化的生物样品。

P20：如P1-P19段中任一段所述的方法，其中，所述样品是未经纯化的体液。

P21：如P1-P20段中任一段所述的方法，其中，检测胞外囊泡包括：对光学波导生物传感器进行照明，并且检测从光学波导生物传感器反射的光的共振波长的变化。

P22：如P1-P21段中任一段所述的方法，其包括：使结合剂与光学波导生物传感器结合，以及使胞外囊泡与结合剂结合。

P23：如P22段所述的方法，其中，结合剂包括抗体。

P24：如P1-P23段中任一段所述的方法，其中，所述光学波导生物传感器是共振波导光栅生物传感器。

P25：一种用于分析胞外囊泡的系统，其包括：光学波导生物传感器；与光学波导生物传感器结合的胞外囊泡；以及与胞外囊泡结合的配体，所述配体包括标记物。

P26：如P25段所述的系统，其中，所述配体包括抗体，所述抗体被构造成与胞外囊泡上的标志物结合。

P27：如P25-P26段中任一段所述的系统，其中，所述配体是第一配体，并且所述标记物是第一标记物，所述系统包括与胞外囊泡结合的第二配体，所述第二配体包括第二标记物。

P28：如P27段所述的系统，其中，第一配体被构造成与胞外囊泡上的一种标志物结合，并且第二配体被构造成与胞外囊泡上的另一种标志物结合。

P29：如P25-P28段中任一段所述的系统，其中，所述标记物是荧光标记物。

P30：如P25-P29段中任一段所述的系统，其中，所述标记物是比色标记物。

P31：如P25-P30段中任一段所述的系统，其中，所述标记物是发光标记物。

P32：如P25-P31段中任一段所述的系统，其包括光学读取器，所述光学读取器被构造用于检测与光学波导生物传感器结合的胞外囊泡。

P33：如P32段所述的系统，其中，光学读取器包括光源，其被构造用于对光学波导生物传感器进行照明。

P34：如P33段所述的系统，其中，所述光源是宽带光源。

P35：如P25-P34段中任一段所述的系统，其包括光学读取器，所述光学读取器被构造用于对光学波导生物传感器进行照明，以及检测从光学波导生物传感器反射的光的共振波长的变化。

P36：如P25-P35段中任一段所述的系统，其中，所述光学波导生物传感器是共振波导光栅生物传感器。

P37：如P25-P36段中任一段所述的系统，其中，胞外囊泡是外泌体。

P38：如P25-P37段中任一段所述的系统，其中，胞外囊泡是微泡。

P39：如P25-P38段中任一段所述的系统，其中，胞外囊泡是凋亡小体。

P40：如P25-P39段中任一段所述的系统，其包括：多个光学波导生物传感器；以及包括多个孔的微板，所述多个孔中的每个孔包括所述多个光学波导生物传感器中的至少一个光学波导生物传感器。

P41：如P40段所述的系统，其中，微板包括至少24个孔。

P42：如P40段所述的系统，其中，微板包括至少96个孔。

P43：如P40段所述的系统，其中，微板包括至少384个孔。

P44：一种用于分析胞外囊泡的系统，其包括：包含多个孔的微板；位于所述多个孔的每个孔中的光学波导生物传感器；以及位于所述多个孔的每个孔中的样品；其中，所述样品各自包括与光学波导生物传感器结合的经破裂的胞外囊泡的囊内内容物。

P45：如P44段所述的系统，其中，样品各自包括与光学波导生物传感器结合的经裂解的胞外囊泡的囊内内容物。

P46：如P44-P45段中任一段所述的系统，其中，所述样品包括裂解试剂。

P47：如P44-P46段中任一段所述的系统，其中，经破裂的胞外囊泡的囊内内容物包括：蛋白质、RNA和/或DNA。

P48：如P44-P47段中任一段所述的系统，其包括光学读取器，所述光学读取器被构造用于检测与光学波导生物传感器结合的胞外囊泡。

P49：如P48段所述的系统，其中，光学读取器包括光源，其被构造用于对光学波导生物传感器进行照明。

P50：如P49段所述的系统，其中，所述光源是宽带光源。

P51：如P44-P50段中任一段所述的系统，其包括光学读取器，所述光学读取器被构造用于对光学波导生物传感器进行照明，以及检测从光学波导生物传感器反射的光的共振波长的变化。

P52：如P44-P51段中任一段所述的系统，其中，所述光学波导生物传感器是共振波导光栅生物传感器。

P53：如P44-P52段中任一段所述的系统，其中，经破裂的胞外囊泡是外泌体。

P54：如P44-P53段中任一段所述的系统，其中，经破裂的胞外囊泡是微泡。

P55：如P44-P54段中任一段所述的系统，其中，经破裂的胞外囊泡是凋亡小体。

P56：如P44-P55段中任一段所述的系统，其中，微板包括至少24个孔。

P57：如P44-P56段中任一段所述的系统，其中，微板包括至少96个孔。

P58：如P44-P57段中任一段所述的系统，其中，微板包括至少384个孔。

P59：一种用于分析胞外囊泡的试剂盒，其包括：包括多个孔的微板；位于所述多个孔的每个孔中的光学波导生物传感器；与每个光学波导生物传感器结合的结合剂，所述结合剂被构造用于与胞外囊泡结合；以及以下中的至少一种：(a)被构造用于与胞外囊泡结合的配体，所述配体包括标记物；或者(b)被构造用于使胞外囊泡破裂的试剂。

P60：如P59段所述的试剂盒，其中，与每个光学波导生物传感器结合的结合剂包括抗体，所述抗体被构造成与胞外囊泡上的标志物结合。

P61：如P59-P60段中任一段所述的试剂盒，其中，所述配体包括被构造成与胞外囊泡上的第一标志物结合的第一配体，以及被构造成与胞外囊泡上的第二标志物结合的第二配体。

P62：如P59-P61段中任一段所述的试剂盒，其中，所述试剂包括被构造用于使胞外囊泡裂解的裂解试剂。

P63：如P59-P62段中任一段所述的试剂盒，其包括(a)和(b)两者。

P64：如P59-P63段中任一段所述的试剂盒，其包括光学读取器，所述光学读取器被构造用于检测与光学波导生物传感器结合的胞外囊泡。

P65：如P59-P64段中任一段所述的试剂盒，其包括指定微板与(a)或(b)中的至少一种为单元的包装。

P66：如P59-P65段中任一段所述的试剂盒，其包括将微板与(a)或(b)中的至少一种作为单元保持在一起的包装。

P67：如P59-P66段中任一段所述的试剂盒，其中，所述光学波导生物传感器是共振波导光栅生物传感器。

P68：如P59-P67段中任一段所述的试剂盒，其中，胞外囊泡是外泌体。

P69：如P59-P68段中任一段所述的试剂盒，其中，胞外囊泡是微泡。

P70：如P59-P69段中任一段所述的试剂盒，其中，胞外囊泡是凋亡小体。

P71：如P59-P70段中任一段所述的试剂盒，其中，微板包括至少24个孔。

P72：如P59-P71段中任一段所述的试剂盒，其中，微板包括至少96个孔。

P73：如P59-P72段中任一段所述的试剂盒，其中，微板包括至少384个孔。

通用术语和解释惯例

除非另有明确说明，否则不应将权利要求书或说明书中描述的任何方法解释为要求以特定顺序进行步骤。而且，除非另有明确说明，否则所述方法应理解为对以任何顺序执行所述步骤提供支持。

在单独的实施方案的上下文中描述的某些特征也可以单个实施方式组合起来实施。相反，在单个实施方式的上下文中描述的各个特征也可以单独或以任何合适的子项组合在多个实施方式中实施。另外，虽然上述特征被描述成以某些组合的形式起作用，而且甚至最初也是这样要求权利的，但所要求权利的组合中的一种或多种特征在一些情况下可以从该组合中去除，所要求权利的组合可以针对次级组合或者次级组合的变化。

修饰语，例如“该/所述”、“一个”和“一种”可意味着单数形式或复数形式。并且，当在词语“或”的后面没有“任一”(或指示“或”明确表示为排他性的其他类似语言——例如，x或y中的仅一种等)的情况下使用词语“或”时，其应被解释为包含性的(例如，“x或y”表示x或y中的一种或两种)。

术语“和/或”也应被解释为包含性的(例如“x和/或y”意为x或y中的一种或两种)。在“和/或”或者“或”用作三个或更多个条目的组的连接的情况下，该组应被解释为仅包括一个条目，所有条目在一起，或这些条目的任何组合或数量。

术语具有、具备、涵盖和含有应被理解为与术语包含和包括同义。这些术语的使用也应理解为公开和支持这些术语被“由……组成”或“基本上由……组成”代替的较窄的替代实施方案。

除非另有说明，否则本说明书(除权利要求外)中所用的表示尺寸、物理特性等的所有数值或措辞应理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。至少不是为了将等同原则的应用限制在权利要求，本说明书或权利要求所描述的被术语“约”修饰的每个数值参数应根据所记录的有效数字的位数并运用常用的四舍五入规则进行解释。

所公开的范围应理解为包含所述任何子范围或各个范围包含的任何和所有的单个值，并且为描述这些子范围或单个值的权利要求提供支持。例如，陈述的1至10的范围应理解为在最小值1与最大值10之间的任何及所有子范围或者它们之间的单个值(包括和/或不包括端点)，并且为描述这些子范围或单个值的权利要求提供支持；也即，以最小值1或更大的数值开始并以最大值10或更小的数值结束的所有子范围(例如5.5至10、2.34至3.56等)或者1至10的任何值(例如3、5.8、9.9994等)，这些值可单独表示或者作为最小值(例如，至少5.8)或者最大值(例如，不超过9.9994)。

所有公开的数值应理解是在任一个方向上可变化0-100％，并因此对描述这些数值(单独的数值或者作为最小值或最大值，例如，至少<某数值>或不超过<某数值>)或者可由这些数值形成的任何范围或子范围的权利要求提供支持。例如，陈述的数值8应被理解成在0至16之间变化(在任一个方向上变化100％)，并且为描述该范围自身(例如0至16)、该范围中的任何子范围(例如2至12.5)或该范围中的任何单个数值(例如15.2)，作为最小值(例如，至少4.3)，或者作为最大值(例如，不超过12.4)的权利要求提供支持。

权利要求中所述的术语应当通过参考广泛使用的通用词典和/或相关技术词典中的相关条目，本领域技术人员通常理解的含义等来确定它们的普通和惯用含义，并且应理解为，由这些来源中的任何一个或组合所赋予的最广泛的含义(例如，应组合两个或更多个相关词典的条目以提供条目组合的最广泛含义等)仅受以下例外的约束：(a)如果术语的使用方式比其普通和惯用含义更广泛，则该术语应具有其普通和惯用含义加上额外的扩展含义，或(b)如果术语已明确定义为通过在术语后面的短语“本文件中使用的术语应意为”或类似的语言(例如，“该术语意为”、“该术语定义为”、“出于本公开的目的，该术语是指”等等)来描述该术语，则该术语明确定义为具有不同的含义。提到具体实例时使用的“即”、词语“发明”等并不意味着援引例外情况(b)或以其他方式来限制所述的要求保护的术语的范围。除了例外情况(b)所适用的情形外，本文件中的任何内容均不应视为放弃或拒绝权利要求的范围。

权利要求中所述的主题不与本文件中描述或例示的任何实施方案、特征或特征的组合同范围，并且不应被解释为与其同范围。即使仅例示及描述了特征或特征组合的一个实施方案也如此。

参考文献的引用

下文列出的每份文件的全部内容通过引用纳入本文件中。如果本文件和一份或多份纳入的文件中使用相同术语，则应将其解释为具有这些来源中任何一个或组合所赋予的最广泛含义，除非该术语在本文件中已明确定义为具有不同含义。如果下列文件与本文件不一致，则以本文件为准。所纳入的主题不应用于限制或缩小明确陈述或描述主题的范围。

-1986年5月29日提交，1989年3月28日授权的题为“Optical Sensor forSelective Detection of Substances and/or for the Detection of RefractiveIndex Changes in Gaseous,Liquid,Solid and Porous Samples”(用于选择性检测底物和/或用于检测气态、液体、固体和多孔样品的折射率变化的光学传感器)的第4,815,843号美国专利(申请号07/019,557)。

-1994年7月18日提交，1998年4月14日授权的题为“Optical Biosensor Matrix”(光学生物传感器基质)的第5,738,825号美国专利(申请号08/854,586)。

-2003年6月24日提交，2006年6月6日授权的题为“Optical InterrogationSystem and Method for Using Same”(光拾取系统及其使用方法)的第7,057,720号美国专利(申请号10/602,304)。

-2004年10月28日提交，2006年11月14日授权的题为“Single-Fiber Launch/Receive System for Biosensing Applications”(用于生物传感应用的单光纤发射/接收系统)的第7,136,550号美国专利(申请号10/977,520)。

-2004年9月21日提交，2007年4月10日授权的题为“Self-Referencing WaveguideGrating Sensors”(自参比波导光栅传感器)的第7,203,386号美国专利(申请号10/947,021)。

-2004年5月27日提交，2007年7月3日授权的题为“Optical InterrogationSystems with Reduced Parasitic Reflections and a Method for FilteringParasitic Reflections”(一种寄生反射减少的光拾取系统及用于过滤寄生反射的方法)的第7,239,395号美国专利(申请号10/856,572)。

-2004年12月21日提交，2007年10月23日授权的题为“Arrayed SensorMeasurement System and Method”(阵列传感器测量系统和方法)的第7,286,221号美国专利(申请号11/019,439)。

-2005年4月5日提交，2007年11月6日授权的题为“Optical InterrogationSystem and Method for 2-D Sensor Arrays”(用于2-D传感器阵列的光拾取系统和方法)的第7,292,333号美国专利(申请号11/100,199)。

-2005年2月14日提交，2008年3月18日授权的题为“Single Mode(SM)FiberOptical Reader System and Method for Interrogating Resonant Waveguide-GratingSensor(s)”(用于询问共振波导光栅传感器的单模(SM)光纤光学读取系统和方法)的第7,346,233号美国专利(申请号11/058,155)。

-2004年12月29日提交，2009年10月20日授权的题为“Spatially ScannedOptical Reader System and Method for Using Same”(空间扫描光学读取系统及其使用方法)的第7,604,984号美国专利(申请号11/027,547)。

-2009年6月9日提交，2012年2月14日授权的题为“Label-Free High ThroughputBiomolecular Screening System and Method”(无标记物的高通量生物分子筛选系统和方法)的第8,114,348号美国专利(申请号12/480,886)。

-2004年11月24日提交，2006年5月25日公开的题为“Polymer-Coated Substratesfor Binding Biomolecules and Methods of Making and Using Thereof”(用于结合生物分子的经聚合物涂覆的基材及其制造和使用方法)的美国专利公开号2006/0110594(申请号10/996,952)。

-2004年12月29日提交，2006年6月29日公开的题为“Method for Creating aReference Region and a Sample Region on a Biosensor and the ResultingBiosensor”(用于在生物传感器上建立参比区域和样品区域的方法及所得的生物传感器)的美国专利公开号2006/0141527(申请号11/027,509)。

Claims (22)

1.一种方法，其包括：

将样品定位在光学波导生物传感器上，所述样品包括胞外囊泡；

使胞外囊泡与光学波导生物传感器结合；

检测与光学波导生物传感器结合的胞外囊泡；以及

分析与光学波导生物传感器结合的胞外囊泡的特征。

2.如权利要求1所述的方法，其中，胞外囊泡的特征包括样品中的胞外囊泡数目，样品中的胞外囊泡的尺寸，和/或样品中的胞外囊泡的类型。

3.如权利要求1所述的方法，其中，分析胞外囊泡的特征包括：使配体与胞外囊泡结合。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述配体包括与胞外囊泡上的第一标志物结合的第一配体，以及与胞外囊泡上的第二标志物结合的第二配体。

5.如权利要求3所述的方法，其中，所述配体包括标记物。

6.如权利要求1所述的方法，其中，分析胞外囊泡的特征包括：分析胞外囊泡的囊内内容物。

7.如权利要求6所述的方法，其中，分析胞外囊泡的囊内内容物包括：分析囊内内容物中的蛋白质、RNA和/或DNA。

8.如权利要求6所述的方法，其中，分析胞外囊泡的囊内内容物包括：使胞外囊泡裂解。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述样品是未经纯化的生物样品。

10.如权利要求1所述的方法，其中，检测胞外囊泡包括：对光学波导生物传感器进行照明，以及检测从光学波导生物传感器反射的光的共振波长的变化。

11.如权利要求1所述的方法，其中，所述光学波导生物传感器是共振波导光栅生物传感器。

12.一种用于分析胞外囊泡的系统，其包括：

光学波导生物传感器；

与光学波导生物传感器结合的胞外囊泡；和

与胞外囊泡结合的配体，所述配体包括标记物。

13.如权利要求12所述的系统，其中，所述配体是第一配体，并且所述标记物是第一标记物，所述系统包括与胞外囊泡结合的第二配体，所述第二配体包括第二标记物。

14.如权利要求13所述的系统，其中，第一配体被构造成与胞外囊泡上的一种标志物结合，并且第二配体被构造成与胞外囊泡上的另一种标志物结合。

15.如权利要求12所述的系统，其包括光学读取器，所述光学读取器被构造用于检测与光学波导生物传感器结合的胞外囊泡。

16.如权利要求12所述的系统，其包括：

多个光学波导生物传感器；和

包括多个孔的微板，所述多个孔中的每个孔包括所述多个光学波导生物传感器中的至少一个光学波导生物传感器。

17.一种用于分析胞外囊泡的系统，其包括：

包含多个孔的微板；

位于所述多个孔的每个孔中的光学波导生物传感器；和

位于所述多个孔的每个孔中的样品；

其中，样品各自包括与光学波导生物传感器结合的经破裂的胞外囊泡的囊内内容物。

18.如权利要求17所述的系统，其中，所述样品包括裂解试剂。

19.如权利要求17所述的系统，其中，经破裂的胞外囊泡的囊内内容物包括：蛋白质、RNA和/或DNA。

20.一种用于分析胞外囊泡的试剂盒，其包括：

包含多个孔的微板；

位于所述多个孔的每个孔中的光学波导生物传感器；

与每个光学波导生物传感器结合的结合试剂，所述结合试剂被构造用于与胞外囊泡结合；和

以下中的至少一种：

(a)与胞外囊泡结合的配体，所述配体包括标记物；或者

(b)被构造用于使胞外囊泡破裂的试剂。

21.如权利要求20所述的试剂盒，其中，配体包括：含有第一标记物的第一配体和含有第二标记物的第二配体，其中，第一配体被构造用于与胞外囊泡上的第一标志物结合，并且第二配体被构造用于与胞外囊泡上的第二标志物结合。

22.如权利要求20所述的试剂盒，其包括(a)和(b)两者。

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