CN101696449A - 核酸芯片、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸芯片、其制备方法及用途，属于酶、微生物或者核酸分子的检测领域。本发明的核酸芯片包括基底，该基底的一部分表面附着有核酸分子，基底上未附着核酸分子的区域被可抑制细胞生长的材料覆盖，该材料可以是非生物相容性材料，例如可以是聚-N-异丙基丙烯酰胺、聚乙烯基己内酰胺、聚丙烯酸、壳聚糖、海藻酸钠等，核酸分子可以是DNA、siRNA、esiRNA、质粒等。本发明的核酸芯片特别适于进行细胞增值、细胞分化、细胞凋亡、细胞迁移等功能基因筛选方面的研究。
Description
技术领域
本发明涉及酶、微生物或者核酸分子的检测领域。具体地说，本发明涉及可用于细胞迁移、细胞增值、细胞分化、细胞凋亡等功能基因筛选的核酸芯片、其制备方法及用途。
背景技术
RNA干扰(RNA interfering，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发引起同源mRNA高效特异性降解的现象，是生物界一种古老而且进化上高度保守的基因表达调控机制。1998年研究者发现在C.elegans或果蝇中注入dsRNA可特异性抑制基因表达，并将这种由dsRNA引发的抑制特定基因表达的现象成为RNAi。随后RNAi的基础研究和应用迅速成为生命科学的热点领域之一。RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。两位科学家也因此获得了2006年诺贝尔生理或医学奖。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。
RNA干扰技术沉默基因具备简单、高效、快速等特点。根据实验的要求，实现特定基因的沉默，可以使用化学合成的siRNA，也可以使用esiRNA，或者shRNA表达质粒，或者表达shRNA的病毒等不同形式核酸分子。因为绝大多数模式生物和人的全基因组序列完全已知，所以针对每一条基因，都可以方便地合成几条对应的siRNA或构建几个对应的shRNA质粒。近年来，有不同规模和形式的siRNA文库已建立起来。Dharmacon，Ambion以及Sigma等公司甚至提供人、小鼠等生物的全基因组siRNA文库，这使得大规模使用RNA干扰技术成为现实。近年来，利用siRNA文库在全基因组筛选功能基因已经取得一些令人瞩目的结果。但是，由于其昂贵的筛选成本和繁琐的操作过程，大大限制了RNA干扰技术的进一步推广和应用。
在研究如何降低siRNA生产成本的同时，科学家和企业家也致力于开发新的方法来降低siRNA文库的使用成本。例如，几个课题组最近开发一种所谓的反向转染技术(Wheeler，D.et al.Nature Genetics Supplement，2005；Bailey，S.et al.Nature Methods，2006；Erfle，H.et al.Nature Protocols，2007)。简单讲，这种方法就是将化学合成的siRNA，或者将shRNA质粒，或者将表达shRNA的病毒通过点样的方式固定在玻片表面，形成一个点阵列，然后直接在玻片表面上铺长细胞。由于阵列中每个siRNA或者shRNA只能特异地转染到一定区域的细胞内，不会形成相互污染。这样使得在一个10厘米见方的玻璃片上制备出上千个siRNA点阵，能同时进行研究，因此大大降低地研究成本。这些方法同样具有很多缺点。比如，细胞在玻片或硅片上长成一片，很难区分或辨别siRNA的点阵位置，对后期采集分析信号造成极大的困难；siRNA点阵之间的细胞也会对相邻点阵中的细胞造成一定影响；而且，对一些细胞现象如迁移不适用。
发明内容
本发明的目的正是为了解决上述技术问题，提供一种新型的核酸芯片及其制备方法以及用途。
通过采用表面修饰手段和微纳米技术，本发明不仅很好解决传统反向转染芯片的问题，还大大拓展它们的应用范围，比如对细胞迁移等功能基因的筛选。
本发明所称的“非生物相容性材料”是指细胞不能在该材料表面进行正常生长、增殖等活动的材料，若将细胞置于该材料表面培养，则细胞会产生明显的凋亡或死亡。
“智能材料(intelligent materials or smart materials)”是指在温度、pH值、化学、压力、电荷、磁场等参数变化时，材料的物理或化学性会发生变化的所有材料，包括但不限于聚-N-异丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))、聚乙烯基己内酰胺(Poly(N-vinylcaprolactam))、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚醚(Polyethylene-polypropyleneglycol，如BASF公司的
F-87、
F-88、F-108或
F127)、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物(Polyoxypropylene-polyoxyethylene Block Copolymer)、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物(Polyethylene glycol polypropylene glycol block copolymer)、壳聚糖、海藻酸钠，以及它们的衍生物或混合物。
“光刻胶材料(photoresist)”又称光致抗蚀剂，由感光树脂、增感剂和溶剂三种主要成分组成的对光敏感的混合液体。感光树脂经光照后，在曝光区能很快地发生光固化反应，使得这种材料的物理性能，特别是溶解性、亲合性等发生明显变化。经适当的溶剂处理，溶去可溶性部分，得到所需图像。根据其化学反应机理和显影原理，可分负性胶和正性胶两类。包括但不限于
光刻胶系列(Microchemicals)，TI 35E光刻胶(Microchemicals)，TI 35ES光刻胶(Microchemicals)，PMGI光刻胶(MicroChem Corp.)，LOR光刻胶(MicroChem Corp.)，SU-8光刻胶(MicroChem Corp.)，
1000光刻胶(MicroChem Corp.)，PMMA光刻胶(MicroChem Corp.)等。
“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其衍生物组成的材料。包括但不限于DNA、siRNA、esiRNA、shRNA载体、质粒载体、或以病毒形式存在的载体等。
“核酸-转染试剂脂质体”是指当两性分子如磷脂、鞘脂、聚合物等分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有单层或双分子层结构的封闭囊泡，核酸分子可以包封在这些囊泡内或吸附在这些囊泡表面。由于这种囊泡膜层具有生物膜特征，可与细胞融合，能将脂质体囊泡中的核酸或其他成份导入细胞中。脂质体大小直径0.02毫米～5毫米之间。常用转染试剂包括但不限于Lipofectamine 2000(Invitrogen)、DharmaconFECT转染试剂等。
本发明是通过如下的技术方案实现的。第一步，用去垢剂和超纯水清洗芯片。该芯片可以是任何形状的固态物质，例如玻片、硅片、塑料片、甚至纸片等。第二步，制备覆盖层材料溶液。该覆盖层材料可以为任何非生物相容性材料。优选地，覆盖材料为智能材料、光刻胶材料、pH敏感材料或温度敏感材料。更为优选地，覆盖材料为聚-N-异丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))或其衍生物或混合物。比如，制备成6％(w/v)的Poly(N-isopropylacrylamide)(Sigma)乙醇溶液。第三步，在芯片表面铺覆一层覆盖材料，并制备出不同大小或形状的微结构图案。根据覆盖材料的性能，可使用等离子刻蚀技术、光刻法、压印技术等制备图案。例如，使用光敏材料时，可利用光刻法工艺(photolithography)制备不同形状的微孔。优选地，利用氧气刻蚀机和掩膜保护，刻蚀Poly(N-isopropylacrylamide)的图案。例如，刻蚀条件为50pa氧压，200W功率，刻蚀时间约3-5分钟。刻蚀完毕，将芯片放入超净台中紫外照射消毒。
下一步是在有图案的芯片上点制核酸阵列。核酸包括但不限于DNA、siRNA、esiRNA、shRNA载体、质粒载体、或以病毒形式存在的载体等。优选地，核酸为siRNA分子。将核酸-转染试剂混合制备成脂质体，然后将脂质体混合包裹在转染载体溶液中。该转染载体溶液包含但不限于明胶(gelatin)。转染载体的作用是在干燥条件下或培养液中能稳定核酸-转染试剂脂质体结构，而且在培养液中可以缓释核酸-转染试剂脂质体，进入细胞中。优选地，制备核酸-转染试剂脂质体，并包裹在核酸转染载体溶液的方法如下：1)制备核酸-转染试剂脂质体：将0.1M蔗糖的3微升OptiMEM(Invitrogen)以及2.5微升Lipofectamine 2000(Invitrogen)加入200微升实验管中并且充分混匀；然后加入1微升100μM的siRNA，混匀后室温孵育20分钟；2)制备转染载体溶液：配制0.1％(w/v)的明胶(gelatin，Sigma，Type B)水溶液，其中包含有0.01％(w/v)fibronectin(Invitrogen)；3)将脂质体混合包裹在转染载体溶液中：在孵育20分钟后的核酸-转染试剂脂质体的试管中，加入7.5微升转染载体溶液并充分混匀。然后，将包裹核酸的转染载体溶液点加在不同的图案位置。例如，利用针式或喷墨式点样仪，同时将包含不同核酸分子的上千种转染载体溶液点加在芯片对应的图案位置上。又例如，也可使用液体分装仪器(Wang，J.et al.Lap Chip，2009)来完成点阵制备。
最后，将核酸芯片固定在3.5cm的培养皿中室温干燥保存以备使用。使用时将培养皿置于37℃控温台上，加入2-3ml包含1X 105至5X 106个细胞的37℃培养基。细胞培养完成后(约48小时)，将培养皿室温放置5分钟使得聚合物完全溶解，再加入PBS清洗三次，随时进行相应的实验，并通过显微镜从事观察或记录。
与现有基于孔板(如96孔板或384孔板或1536孔板等)筛选技术相比，本发明提供的核酸芯片具有成本低、便于使用等优点。
与现有技术中已有的核酸芯片相比，本发明提供的核酸芯片在至少以下三个方面具有特别优异的效果。传统的核酸芯片仅简单地将核酸分子附着于基底表面的特定部位(一般这些特定部位排列成点阵)，在进行细胞培养的时候，细胞会无任何区别地在基底的全部表面生长，这样会带来两个问题：一是基底全部表面都被细胞覆盖，使得对核酸分子位置的确定变得困难，不利于信号采集与分析；二是核酸分子点阵中的细胞会受到点阵之间的细胞的干扰，从而影响到观测结果的准确度和可靠性。但是，使用本发明提供的核酸芯片进行细胞功能基因筛选研究的时候就不会遇到以上的问题。由于点阵之间的基底表面被非生物相容性材料覆盖，细胞只会在核酸分子点阵区域内生长，，不会形成相互干扰。因而，通过观察细胞生长的部位便能容易地确定核酸分子点阵的分布区域。最后，当上述非生物相容性材料去除，细胞能从点阵内向外的扩散便不会再受到其他细胞的干扰，因此本发明提供的芯片，可以用于准确、可靠地研究细胞迁移的相关试验。
本发明技术方案总结如下：
1.一种核酸芯片，包括基底，该基底的一部分表面附着有核酸分子，其特征在于所述基底上未附着核酸分子的区域被可抑制细胞生长的材料覆盖。
2.根据第1项所述的核酸芯片，其特征在于该材料为非生物相容性材料。
3.根据第1或2项所述的核酸芯片，其特征在于该材料容易制备成微结构图案。
4.根据1-3的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于该材料为智能材料。
5.根据1-3的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于该材料为光刻胶、温度敏感材料或pH敏感材料。
6.根据1-5的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于该材料为聚-N-异丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))、聚乙烯基己内酰胺(Poly(N-vinylcaprolactam))、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚氨酯、聚醚(Polyethylene-polypropylene glycol)、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物(Polyoxypropylene-polyoxyethylene block copolymer)、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物(Polyethylene glycol polypropylene glycol block copolymer)、壳聚糖、海藻酸钠，以及它们的衍生物或混合物。
7.根据1-6的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于该材料层的厚度为1-500微米。
8.根据1-7的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子分布在基底表面多个彼此分立的区域内。
9.根据第8项所述的核酸芯片，其特征在于所述多个彼此分立的区域排列成规则的点阵。
10.根据第8或9项所述的核酸芯片，其特征在于所述多个彼此分立的区域为圆形，其直径在50微米-1毫米之间，彼此间距在50微米-10毫米之间。
11.根据1-10的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子被包裹在转染载体中，通过转染载体附着在基底表面。
12.根据1-11的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子与转染试剂形成核酸-转染试剂脂质体被包裹在转染载体中，通过转染载体附着在基底表面。
13.根据第11或12项所述的核酸芯片，其特征在于所述转染载体为在干燥条件下或培养液中能保护核酸或核酸-转染试剂脂质体结构不被破坏的材料或混合物。
14.根据11-13的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述转染载体为能在培养液中使得核酸或核酸-转染试剂脂质体缓释进入细胞的材料或混合物。
15.根据11-14的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述转染载体为明胶(gelatin)、纤粘连蛋白(fibronectin)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(RGD)、透明质酸(Hyaluronicacid，HA)、琼脂糖、水凝胶(hydrogel)、聚乳酸(polylactide，PLA)、聚乙二醇(Polyglycolide)、聚乳酸-羟基乙酸(Polylactide-glycolide，PLGA)、聚烯烃(polyolefins)、聚酯(polyesters)、聚酰胺(polyamides)、聚碳酸酯(polycarbonates)或聚砜树脂(polysulfones)，或它们的衍生物或混合物。
16.根据第15项所述的核酸芯片，其特征在于所述明胶的溶液浓度范围为质量百分比0.05％到1％。
17.根据第16项所述的核酸芯片，其特征在于所述明胶中含有蔗糖或纤粘连蛋白(fibronectin)，其中蔗糖的摩尔浓度范围为0.05M到1M，纤粘连蛋白的浓度范围为质量百分比0.005％到0.05％。
18.根据1-17的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子为DNA、siRNA、esiRNA、质粒或以病毒形式存在的载体。
19.根据1-18的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述基底的材料为玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯、塑料、硅片、陶瓷或纸张。
20.一种制备根据1-19的任意一项所述的核酸芯片的方法，其特征在于其包括如下步骤：
1)将基底清洗干净，干燥后在其表面制备可抑制细胞生长材料的图案；
2)将核酸分子或核酸-转染试剂脂质体包裹在转染载体中；
3)将包裹核酸分子或核酸-转染试剂脂质体的转染载体固定到基底上未被可抑制细胞生长的材料覆盖的区域中。
21.根据第20项所述的制备核酸芯片的方法，其特征在于步骤1操作方法如下：将基底清洗干净晾干后，将可抑制细胞生长的材料溶于水、乙醇或其它溶剂中形成溶液，将所述溶液均匀覆盖基底表面并干燥，然后将预先准备好的掩模覆盖在所述可抑制细胞生长的材料上，将未被掩模遮盖的部分刻蚀除去，露出基底。
22.根据第21项所述的制备核酸芯片的方法，其特征在于所述刻蚀为氧气等离子体刻蚀。
23.根据第20项所述的制备核酸芯片的方法，其特征在于步骤1操作方法如下：将基底清洗干净，干燥后，将可抑制细胞生长的材料溶于乙醇或水中形成溶液，利用压印技术(stampfabrication)直接在基底表面印出所需图案。
24.根据第20项所述的制备核酸芯片的方法，其特征在于步骤1操作方法如下：将基底清洗干净，干燥后，利用光刻胶在表面制备出相反的图案，然后在基底涂镀或共价键连接一种可抑制细胞生长的材料，最后去除光刻胶，保留可抑制细胞生长材料的图案。
25.一种使用根据1-19的任意一项所述的核酸芯片进行细胞功能基因筛选的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将细胞与核酸芯片上的转染载体接触，使核酸或核酸-转染试剂脂质体缓释进入细胞；
2)观测核酸分子对细胞功能的影响。
26.根据第25项所述的使用核酸芯片进行细胞功能基因筛选的方法，其特征在于步骤1所述核酸或核酸-转染试剂脂质体缓释进入细胞的过程为：在芯片上加入细胞和培养液后开始的2小时，核酸或核酸-转染试剂脂质体释放量少于10％，而在随后的12至24小时内，逐渐释放至少40％。
27.根据第25或26项所述的使用核酸芯片进行细胞功能基因筛选的方法，其特征在于步骤2中所述的细胞功能为细胞增值、细胞分化、细胞凋亡、细胞迁移或细胞自噬。
28.根据第27项所述的使用核酸芯片进行细胞功能基因筛选的方法，其特征在于所述细胞迁移可通过单位时间内细胞小岛面积变化来评估。
附图说明
图1本发明的核酸芯片制备以及细胞小岛阵列形成示意图。在干净的玻璃片表面上铺覆一层聚-N-异丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide)，PNIAAm，Sigma)。待干燥后利用等离子刻蚀机，刻蚀出上百个500或800微米直径的小孔。因为图案的大小和形状完全由掩膜上图案的大小和形状决定，所以可以方便地设计、刻蚀出任何形状或大小的聚-N-异丙基丙烯酰胺材料图案。然后，含不同核酸分子转染载体溶液点加在对应的图案位置，制成核酸芯片。加入细胞后培养两到三天，将培养基温度降低至室温移去异-N-丙基丙烯酰胺，细胞自组装形成小岛。每个小岛对应一个核酸点阵，点阵中的核酸将有效地转染到对应的小岛细胞中。观察细胞的形态、数目、特定蛋白(利用免疫荧光标记等办法)、细胞核等参数，可以达到筛选或研究特定核酸功能的目的。
图2相差显微镜照片显示细胞小岛形状。左图显示四个小岛，右图显示一个小岛。
图3利用荧光标记的siRNA(如FAM-siRNA，上图)和GFP质粒(下图)验证小岛之间没有明显的交叉污染。左图为相差显微镜照片，右图为对应的荧光显微镜照片。FAM-siRNA或GFP质粒只点在左上角和右下角。
图4通过细胞小岛面积随时间的变化，来评估细胞的迁移速度。上图为相差显微镜照片显示0小时，8小时，15小时三个时间点细胞小岛面积变化。下图为细胞小岛面积随时间按的变化曲线。每小时测量一次细胞小岛面积变化。
图5三种不同细胞，Hela细胞，HepG2细胞，U2-OS细胞，迁移速度的比较。同一实验重复五次，求平均值。结果表明：Hela细胞＜HepG2细胞＜U2-OS细胞。
图6模拟传统划痕法(Wound healing assay)研究细胞迁移。从左到右不同分别是0小时，6小时，10小时拍得照片。
图7研究三条基因Pten，Rhog，Sgef分别抑制后对Hela细胞迁移的影响。左图为实时荧光定量PCR结果，表明合成的三条基因的siRNA能有效的抑制相应的基因。抑制Pten基因能提高Hela细胞的迁移速度，相反抑制Rhog或Sgef基因将降低Hela细胞的迁移速度(右图)。NC为不相关siRNA序列，为对照实验使用。
图8研究三条基因Pten，Rhog，Sgef分别抑制后对U2-OS细胞迁移的影响。左图为实时荧光定量PCR结果，表明合成的三条基因的siRNA能有效的抑制相应的基因。抑制Pten基因能提高U2-OS细胞的迁移速度，相反抑制Rhog或Sgef基因将降低U2-OS细胞的迁移速度(右图)。NC为不相关siRNA序列，为对照实验使用。
具体实施方式
以下将通过具体的实施例说明本发明，但是这些具体的实施例不应当理解为对本发明的限制，对某些细节进行修改将仍然落入本发明的保护范围之内。
实例1细胞培养：
实验中用到的细胞包括Hela，HepG2和U2-OS。细胞培养基是Dulbecco’s ModifiedEagle Medium(DMEM，Invitrogen)，其中包含10％胎牛血清和1％双抗。培养条件：湿度95％，温度37℃，5％CO2。细胞传代时，先用PBS清洗一遍，再加入包含5mM EDTA的0.25％胰酶，观察细胞边缘浮起外观变圆时加入血清终止消化。使用移液器将贴壁细胞吹下来，离心除去上清液，获得沉积的细胞。加入适量的培养基稀释后使用细胞计数板计数，然后培养。
实例2利用分配器制备核酸点阵
使用基于微流体技术的分配器(Wang，et al.Lap Chip，2009)进行核酸点阵制备。根据不同的实验要求，也可以使用其它点样仪。分配器设计成带有六个独立的管道，因此可以同时分配六个不同的样品。压缩空气产生的气压脉冲(0.04兆帕，15毫秒)可以驱动大约110纳升液体试剂填充在没有聚合物覆盖的一个孔表面。点样时芯片放置在37℃控温台上以免液体试剂溶解聚合物。点样结束，用超纯水清洗分配器管道并且用压缩空气吹干以便下次使用。
实例3细胞自组装小岛
用去垢剂和超纯水清洗实验室常用的玻片(25毫米 X 25毫米)表面。干燥后在其表面滴一层聚合物薄膜，使用65微升6％(w/v)的Poly(N-isopropylacrylamide)(Sigma或PolySciences)乙醇溶液，干燥后，在室温中保存12小时。根据实验要求制备硅片掩模，利用微加工技术可在其上刻出不同大小或形状微孔。具体讲，将硅片掩模盖在薄膜干燥后的玻片上，放入氧气等离子刻蚀机中刻蚀。刻蚀条件为50pa氧压，200W功率，刻蚀时间约3.5分钟。刻蚀完毕，将玻片放入超净台中紫外照射消毒，然后使用分配器在其上加工出siRNA微阵列。玻片可以用蜡固定在3.5cm的培养皿中室温干燥保存以备使用。使用时将培养皿置于37℃控温台上，加入3ml包含1×106个细胞的37℃培养基。细胞培养完成后(约48小时)，将培养皿室温放置5分钟使得聚合物完全溶解，再加入PBS清洗三次，随时进行相关实验(图2)。
实例4核酸点阵间的交叉污染研究
我们利用荧光标记的siRNA和GFP质粒来研究核酸阵列是否会形成交叉污染。例如，在两个对角(如左上角和右下角)点制FAM-siRNA阵列，另外两个对角(如左下角和右上角)点制两个没有标记siRNA阵列，点阵直径大小为0.8毫米，点之间相隔距离为2毫米。加入细胞培养两天后，在FAM-siRNA点的细胞中可检测到荧光信号；相反，在没有标记siRNA的细胞中，没有检测任何荧光信号(图3)。同样，我们利用GFP质粒和普通质粒重复上述实验，只在GFP质粒阵列点中发现细胞有荧光信号。这些结果说明，核酸点阵没有形成交叉污染。
实例5细胞迁移
细胞迁移在生理学和病理学过程中扮演着非常重要的角色，包括胚胎发育，伤口愈合，炎症反应，癌症细胞侵染和转移等过程。在过去的这几年当中，细胞迁移领域取得了极大的研究进展。细胞迁移是一个多步骤的循环过程，以细胞极化为开端，前端向外突出延展并且紧密贴壁，后端贴壁松脱并且向前端收缩。然而，这些步骤的分子机理还不是很清楚，这使得治疗癌症，尤其是当癌细胞发生转移时，仍然是一项棘手的任务。系统性地鉴别调控细胞迁移的新型分子，可以帮助我们更好地了解细胞迁移相关的复杂信号网络。以此项技术为基础，就可以找到一些可行的靶点用于治疗和诊断。
传统的大规模RNA干扰筛选主要是在96或384孔板中完成的，并不适合细胞迁移的结果分析。传统检测细胞迁移的技术，包括体外划线实验、Boyden小室实验，都需要额外的熟练的操作或者特殊的器具，这就导致大规模筛选时不够精确和低效率。利用本发明制备的siRNA细胞微阵列芯片，可以用于高通量的筛选调控细胞迁移的功能基因。由于使用了一种热敏感的聚合物——聚N-异丙基丙烯酰胺，我们可以轻易的制作出大小和形状标准化的图形。这些填充了小RNA的图形被细胞所覆盖。添加细胞培养2到3天后，在室温下去除聚N-异丙基丙烯酰胺，组成细胞小岛阵列(图3)。不同时间测量细胞小岛面积的变化，可以计算面积的变化，除以时间间隔来衡量细胞的迁移速度(图4)。很明显，在一定的时间段内(如不超过16小时)，细胞的速度为线性。我们比较发现Hela细胞的迁移速度小于HepG2细胞，而HepG2细胞迁移速度小于U2-OS细胞(图5)。
实例6模拟划痕法(wound healing assay)研究细胞的迁移
如果掩膜上的图案是长方型，本发明可以制备长方型细胞小岛(图6)。当去除聚N-异丙基丙烯酰胺，细胞开始向周边移动，最终在中间会合。这些实验能模拟传统的划痕法(woundhealing assay)，用于细胞迁移的研究。
实例7
为了考察siRNA芯片研究细胞迁移的可能性，我们合成三条基因Pten，Rhog，Sgef的siRNA。序列如下：
PTEN siRNA
sense： 5’-pGUUAGCAGAAACAAAAGGAGdTdT
antisense 5’-pCUCCUUUUGUUUCUGCUAACdTdT
RhoG siRNA
sense： 5’-pGCAACAGGAUGGUGUCAAGdTdT
antisense，5’-pUCGUCCAAGAUCGACAUCCdTdT
sGEF siRNA
sense 5’-pCAAAUGGCCUUGCCGCUAAdTdT
antisense 5’-pUUAGCGGCAAGGCCAUUUGdTdT
我们选取两种细胞Hela和U2-OS细胞进行研究。首先，检测三条基因siRNA的抑制效果。利用实时荧光定量PCR方法，定量检测了分别转染三条基因siRNA后48小时，各自基因mRNA表达水平的变化。图7表明合成的三条基因的siRNA能有效的抑制相应的基因(左图)。其次，考察三条基因被抑制后细胞的迁移行为变化。结果表明抑制Pten后能提高Hela细胞的迁移速度，相反抑制Rhog或Sgef将降低Hela细胞的迁移速度(右图)。利用U2-OS细胞，重复了上述实验，发现了同样的规律。这些结果与先前其他研究小组的报道完全一致(Czauderna，F.et al.Nucleic Acids Research，2003；Ellerbroek，S.et al.Molecular Biology ofthe Cell，2004；Katoh，H.et al.Journal of Cell Science，2006)。因此，有力地证明本发明提供的siRNA芯片研究细胞迁移的有效性。
Claims (28)
1.一种核酸芯片，包括基底，该基底的一部分表面附着有核酸分子，其特征在于所述基底上未附着核酸分子的区域被可抑制细胞生长的材料覆盖。
2.根据权利要求1所述的核酸芯片，其特征在于该材料为非生物相容性材料。
3.根据权利要求1或2所述的核酸芯片，其特征在于该材料容易制备成微结构图案。
4.根据权利要求1-3的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于该材料为智能材料。
5.根据权利要求1-3的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于该材料为光刻胶、温度敏感材料或pH敏感材料。
6.根据权利要求1-5的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于该材料为聚-N-异丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))、聚乙烯基己内酰胺(Poly(N-vinylcaprolactam))、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚氨酯、聚醚(Polyethylene-polypropylene glycol)、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物(Polyoxypropylene-polyoxyethylene block copolymer)、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物(Polyethylene glycol polypropylene glycol block copolymer)、壳聚糖、海藻酸钠，以及它们的衍生物或混合物。
7.根据权利要求1-6的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于该材料层的厚度为1-500微米。
8.根据权利要求1-7的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子分布在基底表面多个彼此分立的区域内。
9.根据权利要求8所述的核酸芯片，其特征在于所述多个彼此分立的区域排列成规则的点阵。
10.根据权利要求8或9所述的核酸芯片，其特征在于所述多个彼此分立的区域为圆形，其直径在50微米-1毫米之间，彼此间距在50微米-10毫米之间。
11.根据权利要求1-10的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子被包裹在转染载体中，通过转染载体附着在基底表面。
12.根据权利要求1-11的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子与转染试剂形成核酸-转染试剂脂质体被包裹在转染载体中，通过转染载体附着在基底表面。
13.根据权利要求11或12所述的核酸芯片，其特征在于所述转染载体为在干燥条件下或培养液中能保护核酸或核酸-转染试剂脂质体结构不被破坏的材料或混合物。
14.根据权利要求11-13的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述转染载体为能在培养液中使得核酸或核酸-转染试剂脂质体缓释进入细胞的材料或混合物。
15.根据权利要求11-14的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述转染载体为明胶(gelatin)、纤粘连蛋白(fibronectin)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(RGD)、透明质酸(Hyaluronic acid，HA)、琼脂糖、水凝胶(hydrogel)、聚乳酸(polylactide，PLA)、聚乙二醇(Polyglycolide)、聚乳酸-羟基乙酸(Polylactide-glycolide，PLGA)、聚烯烃(polyolefins)、聚酯(polyesters)、聚酰胺(polyamides)、聚碳酸酯(polycarbonates)或聚砜树脂(polysulfones)，或它们的衍生物或混合物。
16.根据权利要求15所述的核酸芯片，其特征在于所述明胶的溶液浓度范围为质量百分比0.05％到1％。
17.根据权利要求16所述的核酸芯片，其特征在于所述明胶中含有蔗糖或纤粘连蛋白(fibronectin)，其中蔗糖的摩尔浓度范围为0.05M到1M，纤粘连蛋白的浓度范围为质量百分比0.005％到0.05％。
18.根据权利要求1-17的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子为DNA、siRNA、esiRNA、质粒或以病毒形式存在的载体。
19.根据权利要求1-18的任意一项所述的核酸芯片，其特征在于所述基底的材料为玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯、塑料、硅片、陶瓷或纸张。
20.一种制备根据权利要求1-19的任意一项所述的核酸芯片的方法，其特征在于其包括如下步骤：
1)将基底清洗干净，干燥后在其表面制备可抑制细胞生长材料的图案；
2)将核酸分子或核酸-转染试剂脂质体包裹在转染载体中；
3)将包裹核酸分子或核酸-转染试剂脂质体的转染载体固定到基底上未被可抑制细胞生长的材料覆盖的区域中。
21.根据权利要求20所述的制备核酸芯片的方法，其特征在于步骤1操作方法如下：将基底清洗干净晾干后，将可抑制细胞生长的材料溶于水、乙醇或其它溶剂中形成溶液，将所述溶液均匀覆盖基底表面并干燥，然后将预先准备好的掩模覆盖在所述可抑制细胞生长的材料上，将未被掩模遮盖的部分刻蚀除去，露出基底。
22.根据权利要求21所述的制备核酸芯片的方法，其特征在于所述刻蚀为氧气等离子体刻蚀。
23.根据权利要求20所述的制备核酸芯片的方法，其特征在于步骤1操作方法如下：将基底清洗干净，干燥后，将可抑制细胞生长的材料溶于乙醇或水中形成溶液，利用压印技术(stamp fabrication)直接在基底表面印出所需图案。
24.根据权利要求20所述的制备核酸芯片的方法，其特征在于步骤1操作方法如下：将基底清洗干净，干燥后，利用光刻胶在表面制备出相反的图案，然后在基底涂镀或共价键连接一种可抑制细胞生长的材料，最后去除光刻胶，保留可抑制细胞生长材料的图案。
25.一种使用根据权利要求1-19的任意一项所述的核酸芯片进行细胞功能基因筛选的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将细胞与核酸芯片上的转染载体接触，使核酸或核酸-转染试剂脂质体缓释进入细胞；
2)观测核酸分子对细胞功能的影响。
26.根据权利要求25所述的使用核酸芯片进行细胞功能基因筛选的方法，其特征在于步骤1所述核酸或核酸-转染试剂脂质体缓释进入细胞的过程为：在芯片上加入细胞和培养液后开始的2小时，核酸或核酸-转染试剂脂质体释放量少于10％，而在随后的12至24小时内，逐渐释放至少40％。
27.根据权利要求25或26所述的使用核酸芯片进行细胞功能基因筛选的方法，其特征在于步骤2中所述的细胞功能为细胞增值、细胞分化、细胞凋亡、细胞迁移或细胞自噬。
28.根据权利要求27所述的使用核酸芯片进行细胞功能基因筛选的方法，其特征在于所述细胞迁移可通过单位时间内细胞小岛面积变化来评估。
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