CN102719352B - 一种用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基，包括基板和封固盖，基板上设有以阵列方式分布的阵列孔，阵列孔的底部透明且位于同一水平面；封固盖上设有与基板的阵列孔相匹配的空心的阵列柱，阵列柱可伸入相应的阵列孔内，阵列柱的底部透明且位于同一水平面。该细胞芯片片基结构简单、易于制备、使用方便，在一张片基上即可包含多种（个）以规则的阵列方式排列的细胞，因此，可一次性同时对多种（个）细胞进行相同或不同指标的检测或实验研究。使用本发明的细胞芯片片基操作步骤简单，可一次完成。

Description

一种用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基及制备方法

技术领域

本发明属于细胞芯片技术领域，涉及一种用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基及制备方法。

背景技术

生物芯片技术，也称生物微阵列技术，是指先将大量分子(基因、蛋白、组织、细胞等分子)以阵列方式固定于支持物上，然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。具有其它传统方法无法比拟的优越性，已被广泛应用于生命科学研究和医学诊断中，主要包括基因芯片、蛋白芯片（包括抗体芯片、抗原芯片）、组织芯片和细胞芯片等等。

其中细胞芯片是一种以细胞作为研究对象的一种生物芯片技术，是对基因芯片和蛋白质芯片技术的重要补充，是适应后基因组时代人类对生命科学探索的要求而产生的。细胞芯片技术既保持传统的细胞研究方法的优点如原位检测等，又满足了高通量获取活细胞信息等方面的要求。可以预见，细胞芯片技术作为一种新兴的高通量细胞水平的研究手段和传统的研究方法相结合,已经在基因检测、基因表达、多态性分析、药物筛选和疾病诊断等诸多领域显示出重要的作用。

按照细胞芯片的功能和制作方式主要分为以下四类：

（1）整合的微流体细胞芯片(an integrated microfluidic system)

这是一种高度平行化、自动化的集成微型芯片装置，对细胞样品具有预处理和分析的能力,又称微全分析系统(integrated micro total analysis system,μTAS)。通过在芯片上构建各种微流路通道体系,并运用不同的方法在流体通道体系中准确控制细胞的传输、平衡与定位,进而实现对细胞样品进行药物刺激等实验过程的原位监测和细胞组分的分析等研究。在此基础上，通过改变流路和分离、排列、定位细胞所需空间的微孔或沟槽等结构而又衍生出不同亚型,用于细胞的多参数检测筛选。整合的微流体细胞芯片制作方法多样，内容涉及细胞的固定培养、鉴定筛选、分化刺激、原位检测、药物开发筛选和组分分析等各个方面。类型不一、发展较快、应用广泛,

（2）微量电穿孔细胞芯片(microelectroporation cell chip)

微量电穿孔细胞芯片是将电穿孔技术与生物芯片技术相结合的产物,是细胞操作调控微型化的一种手段。该技术采用一种微型装置，将细胞与芯片上的电子集成电路相结合,利用细胞膜微孔的渗透性，通过控制电子集成电路使细胞面临一定的电压,电压使细胞膜微孔张开,从而在不影响周围细胞的情况下可将外源DNA、RNA、蛋白质、多肽、氨基酸和药物试剂等生物大分子或制剂等顺利的导入或从靶细胞中提取出来。这种技术为研究细胞间遗传物质的转导、变异、表达以及控制细胞内化学反应提供了可能。Shin等（Shin YS,Anal Chem,2004,76(23):7045-7052.）运用聚二甲基硅氧烷等材料构建了电穿孔细胞芯片,通过指数衰变式脉冲发生器对通道内的细胞进行电穿孔实验,原位观察了碘化丙啶被SKOV3细胞株吸收的全过程,并成功将绿色荧光标志的蛋白基因转染了SKOV3细胞,监测活细胞内DNA逆传的规律。此外,还有学者采用纳米针和纳米管等显微操作在芯片上构建纳米通道,完成单细胞注射或样品提取。

（3）细胞免疫芯片(cell immunochip)

细胞免疫芯片是目前应用范广、经济实用的生物芯片技术，是在蛋白质芯片的基础上发展起来的。严格的讲应属于蛋白芯片，是采用抗体芯片进行目的细胞捕获的微阵列芯片。

细胞免疫芯片的制备主要以玻片为片基,通过将相应的抗原或抗体固相化于经过二维或三维修饰的玻片等载体上制成抗原或抗体芯片，将待检测细胞悬液(荧光标记或非标记)与芯片孵育，利用免疫反应原理,特异性捕获靶细胞，而后通过免疫学、化学方法、酶学等检测方法(如荧光标记、酶标记及放射标记等)完成对捕获细胞进行功能和表型研究。例如Zhang等（ZhangCX,Electrophoresis,2003,24(18):3279-83）将抗体固定在琼脂糖修饰的玻片上捕获目的细胞。Belov等（Belov L,Cancer Res,2001,61(11):4483-9）运和Revzin等（RevzinA,Lab Chip,2005,5(1):30-37）分别利用抗体芯片进行白血病免疫分型实验。显示了细胞免疫芯片应用在白血病免疫诊断及预后判定方面的诱人前景。同样，细胞免疫芯片在新药物的开发筛选等方面亦将提供强有力的技术支持，不仅可以提高药物开发的效率，而且实现了药物筛选的敏感性、高通量和自动化的集成。

（4）微阵列细胞芯片

微阵列细胞芯片是直接将细胞以阵列方式固化于支持物上形成的细胞芯片。目前主要通过以下两种方法制备：

方法一：先将细胞包埋于特殊的载体内，进行细胞处理，再制备细胞蜡块，最后利用病理切片制备的细胞芯片。

例如，中国专利局申请号为200410073348.X的发明专利先将细胞样本通过琼脂糖包埋于阵列管空腔内进行脱水、透明、浸蜡等处理，再将细胞琼脂包埋块包埋入具有阵列孔的石腊块中，制成细胞芯片石蜡包埋块，最后经过切片、染色即可完成细胞芯片的制备。

中国专利局申请号为200410022819.4的专利公开了一种细胞芯片，其制作方法为将经固定、脱水、透明处理后的细胞浸蜡制成条状石蜡细胞芯条，然后直接将其按序放置于受体石蜡块中，利用胶带转移辅助系统进行切片，制成不同密度的细胞芯片。

中国专利局申请号为201010207379.5的专利公开了一种三维细胞芯片的制备方法。该方法先制备细胞-溶胶的悬浮液，细胞以三维培养的方式生长，再制备微孔阵列，最后打印细胞到微孔阵列中制成细胞芯片。

方法二：先制作腔室状细胞培养小池，待细胞培养完成后，拆开腔室状装置，制成细胞微阵列，再进行细胞学检测。

例如，中国专利局申请号为200810114115.8的发明专利公开了一种用于芯片封装的培养池，培养池为经整体注塑成型的不可分割的整体，包括大小两个腔体和与之相匹配的盖，小腔体位于所述大腔体之内，小腔体为一无底的通腔，大腔体有底，且与小腔体的壁完全相连。

目前，已上市的具有腔室状细胞培养小池结构，并可作为微阵列细胞芯片的主要有Lab-Tek^TM腔室载玻片系统（Thermo Scientific Nunc公司）和Falcon细胞培养载玻片（BD公司）。

Lab-Tek^TM腔室载玻片系统由载玻片、一个独特的可拆卸多腔室结构和腔室盖玻片组成，采用医用级硅胶密封垫圈将载玻片腔室结构连接成培养小室，利于贴壁细胞直接在显微镜载玻片上生长，等细胞生长后拆卸掉腔室结构，在同一块载玻片上进行染色和显微镜观察。

与此类似，BD公司的Falcon细胞培养载玻片，也是由经预处理的细胞培养载玻片、塑料槽构成，培养时可盛放培养液，细胞直接在玻片上生长，培养后移除塑料槽，进行基因、蛋白的研究。

显然，采用现有制备微阵列细胞芯片的技术方法均较为繁琐，使用不便。例如，方法一需要先将培养的细胞逐一包埋入特殊的载体内进行处理后，制备细胞蜡块，再利用病理切片技术制备细胞芯片。而方法二中用于细胞培养的腔室状培养小池结构复杂，由不同材质的多个部件构成，还需密封连接，制作工序复杂。而且，细胞培养完成后，还需拆开腔室状装置，方能获得制成细胞微阵列，再进行细胞学检测。可见，采用目前现有的技术制备微阵列细胞芯片仍存在上述所指出的缺陷。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基及制备方法，该细胞芯片片基结构简单，使用制备方便，克服了利用现有技术制备高密度细胞芯片时的局限性的缺陷。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基，包括基板和封固盖，基板上设有以阵列方式分布的阵列孔，阵列孔的底部透明且位于同一水平面；

封固盖上设有与基板的阵列孔相匹配的空心的阵列柱，阵列柱可伸入相应的阵列孔内，阵列柱的底部透明且位于同一水平面。

所述的封固盖上还设有完全覆盖封固盖的保护盖。

所述的阵列孔为柱体形，其底部为圆形、椭圆形、三角形、长方形、菱形或正多边形。

所述的阵列孔的底部厚度为0.15～1.5mm，阵列孔内径为1～20mm，阵列孔深度为1.0～10.0mm；阵列柱的厚度为0.15mm～1.5mm。

所述的阵列孔的底部厚度为0.17～1.2mm，阵列孔内径为1.0～6.4mm，阵列孔深度为2.0mm～10.0mm；阵列柱的厚度为0.17～1.2mm。

所述的阵列柱的外径小于阵列孔的内径且相差不超过1.0mm，阵列柱伸入阵列孔后阵列柱的底部与阵列孔的底部间隙小于1.0mm。

所述的基板和封固盖为一次成型技术制作的基板和封固盖。

所述的基板和封固盖采用耐有机溶剂腐蚀的透明材质制成。

基于所述细胞芯片片基的细胞芯片制备方法，包括以下步骤：

1）将基板和封固盖灭菌后，在阵列孔内加入培养基后接种细胞或者接种经预富集和细胞密度测定的胸腹水细胞悬液进行细胞培养，使细胞粘附于阵列孔的底部；

2）细胞粘附于阵列孔的底部后，弃上清，加入固定剂进行细胞固定，然后进行细胞学实验；或者弃上清后直接进行细胞学研究，操作过程中使用保护盖防止污染；

3）实验结束后，在阵列孔内细胞上滴加水溶性或脂溶性封片试剂，然后盖上封固盖，使阵列柱伸入相应的阵列孔内进行封固；

4）封固后得到微阵列细胞芯片。

所述的细胞学实验包括HE染色、巴氏染色、免疫荧光染色、细胞免疫化学，原位杂交或原位PCR；

封固后的微阵列细胞芯片还可采用正置显微镜、倒置显微镜或数字扫描显微镜进行摄取图像和分析。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基，装置构造简单，使用方便，非常适合于在医学诊断、药物开发、细胞生物学等领域推广使用。使用该细胞芯片片基即可用于细胞芯片的制备，也可直接用于细胞培养和细胞病理学检查。它可同时将多种细胞同时培养并固化于同一片基上的不同阵列孔内制备微阵列细胞芯片，或将细胞悬液种植并固化于阵列孔的底部。这样，在一张片基上即可包含多种（个）以规则的阵列方式排列的细胞，因此，可一次性同时对多种（个）细胞进行相同或不同的检测指标的实验研究。使用本发明的细胞芯片片基操作步骤简单，可一次完成。

使用该细胞芯片片基制备的细胞芯片可直接使用倒置显微镜或正置显微镜或激光共聚焦显微镜或数字化显微镜或扫描仪进行图像摄取和观察、分析。

采用一次成型技术可顺利制备出所需的细胞芯片片基，制备简单，成本低廉，无需将载玻片、密封圈、塑料腔室框等等不同材质的部件联合成一个整体的繁琐工序。而且，由于制作细胞芯片片基的部件（基板、封固盖、保护盖）均采用耐有机溶剂腐蚀的透明材质（如玻璃、聚丙烯等），所以，后续的细胞培养、涂片、实验、封片等均可在片基内进行，免除了移除塑料槽等辅助操作步骤。

采取本发明提供的技术方案，可简单、方便地将细胞以规则的阵列方式固化于细胞芯片片基上，可一次性同时对多种细胞（体液）样本进行实验研究或细胞学检查，不仅可直接进行活细胞的培养、实验干预等，也可直接进行细胞内靶分子的检测和分析，明显减少单个组织样本操作处理的人为误差（如处理时间、温度不等，加样不准确等因素），显著节约实验时间、人力、物力和试剂。

附图说明

图1是细胞芯片片基组合前的结构示意图；

图2是细胞芯片片基的纵剖面的示意图；

图3是细胞芯片片基组合后的纵剖面的示意图；

其中，1-基板  2-封固盖  3-保护盖  4-阵列孔  5-阵列柱  6-阵列孔底部  7-阵列柱底部  8-底部间隙。

图4是采用细胞芯片片基制备的细胞芯片。

图5是采用细胞芯片片基制备的细胞芯片细胞学图片。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

参见图1～图3，一种用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基，包括基板1和封固盖2，基板1上设有以阵列方式分布的阵列孔4，阵列孔4的底部透明且位于同一水平面；

封固盖2上设有与基板1的阵列孔4相匹配的空心的阵列柱5，阵列柱5可伸入相应的阵列孔4内，阵列柱5的底部透明且位于同一水平面。阵列孔的深度均相同，阵列柱的高度也均相同。

基板1的阵列孔4主要用来培养细胞，细胞在培养后粘附在阵列孔的底部，封固盖可以用于实验操作后在阵列孔4内细胞表面滴加封片试剂后封固细胞，用于细胞芯片的显微镜检查和保存。

封固盖2上还设有完全覆盖封固盖2的保护盖3，大小与基板1、封固盖2板相匹配。保护盖3可完整覆盖于基板和封固盖上，或可将封固盖、保护盖依次同时加盖在基板上。在进行实验操作和检测过程中以及基板保存中盖在基板和封固盖上保护阵列孔内的细胞不被污染。

所述的阵列方式排列以规则的阵列方式排布，其横向、纵向可根据具体的要求来设计。

而阵列孔为柱体形，其底部为圆形、椭圆形、三角形、长方形、菱形或正多边形，阵列柱的形状与之相匹配。

所述的阵列孔4的底部厚度为0.15～1.5mm，阵列孔4的内径为1～20mm，阵列孔4的深度为1.0～10.0mm；阵列柱5的厚度为0.15mm～1.5mm。

并且优选为：阵列孔4的底部厚度为0.17～1.2mm，阵列孔4内径为1.0～6.4mm，阵列孔4的深度为2.0mm～10.0mm；阵列柱5的厚度为0.17～1.2mm。

阵列柱5的外径小于阵列孔4的内径且相差不超过1.0mm，阵列柱5伸入阵列孔4后阵列柱底部7与阵列孔底部6之间的底部间隙8小于1.0mm。

该微阵列细胞芯片片基采用耐有机溶剂腐蚀的玻璃或聚丙烯材质，按照上述设计要求，采用吹塑或注塑等一次成型技术分别制备；细胞芯片片基在制作时可以根据需要放大和缩小。

所提供的细胞芯片片基可用于细胞芯片的制备和细胞培养及体液样本的细胞学检查。

使用上述细胞芯片片基，采用如下方法就能十分方便快速的制备出高质量细胞芯片。具体方法如下：

1）在灭菌后的用于制备细胞芯片的片基的基板1的阵列孔4内按照常规方法种植适量密度的细胞悬液进行细胞培养，静止培养，使细胞粘附于细胞芯片片基的阵列孔底部。

2）倒掉上清后，进行固定，再进行细胞学实验，如HE染色、巴氏染色、特殊染色、免疫荧光染色、细胞免疫化学，原位杂交、原位PCR等细胞学染色方法和细胞学研究方法，也可不经过细胞固定而直接进行实验。实验过程中使用保护盖3防止污染。

3）实验结束后，在阵列孔4内细胞上滴加适量的水溶性或脂溶性封片试剂，加盖与之匹配的封固盖2，将封固盖2上的空心阵列柱5插入相对应的基板阵列孔4中，对细胞芯片进行封固；

4）封固后得到微阵列细胞芯片，所制备的微阵列细胞芯片如图4所示；

即可采用相应图像采集仪器（如正置显微镜或倒置显微镜或数字扫描显微镜等）摄取图像，进行诊断和分析。所观察到的细胞学图片如图5所示。

因此，采取本发明所提供的技术方案，可简单、方便地制备出所需的细胞芯片片基，且制备简单，成本低廉。而且制作细胞芯片片基可用于细胞芯片的制备、细胞培养研究和胸腹水等体液的细胞学检查等等。利用制备好的细胞芯片不仅可直接进行活细胞的培养、实验干预等，也可直接进行细胞内靶分子的检测和分析。因此，可一次性同时对多种细胞（体液）样本进行原位杂交，免疫组化分析核酸和蛋白在细胞内的定位和表达等实验研究或细胞学检查，使用本装置及方法能够迅速大量的一次成型制备出所需要的细胞芯片，明显减少单个组织样本操作处理的人为误差，显著节约实验时间、人力、物力和试剂。

Claims (10)

1.一种用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基，其特征在于，包括基板和封固盖，基板上设有以阵列方式分布的阵列孔，阵列孔的底部透明且位于同一水平面；

封固盖上设有与基板的阵列孔相匹配的空心的阵列柱，阵列柱可伸入相应的阵列孔内，阵列柱的底部透明且位于同一水平面。

2.如权利要求1所述的用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基，其特征在于，所述的封固盖上还设有完全覆盖封固盖的保护盖。

3.如权利要求1所述的用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基，其特征在于，所述的阵列孔为柱体形，其底部为圆形、椭圆形、三角形、长方形、菱形或正多边形。

4.如权利要求1所述的用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基，其特征在于，所述的阵列孔的底部厚度为0.15～1.5mm，阵列孔内径为1～20mm，阵列孔深度为1.0～10.0mm；阵列柱的厚度为0.15mm～1.5mm。

5.如权利要求4所述的用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基，其特征在于，所述的阵列孔的底部厚度为0.17～1.2mm，阵列孔内径为1.0～6.4mm，阵列孔深度为2.0mm～10.0mm；阵列柱的厚度为0.17～1.2mm。

6.如权利要求1或4所述的用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基，其特征在于，所述的阵列柱的外径小于阵列孔的内径且相差不超过1.0mm，阵列柱伸入阵列孔后阵列柱的底部与阵列孔的底部间隙小于1.0mm。

7.如权利要求1所述的用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基，其特征在于，所述的基板和封固盖为一次成型技术制作的基板和封固盖。

8.如权利要求1所述的用于制备微阵列细胞芯片的细胞芯片片基，其特征在于，所述的基板和封固盖采用耐有机溶剂腐蚀的透明材质制成。

9.基于权利要求1所述细胞芯片片基的细胞芯片制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将基板和封固盖灭菌后，在阵列孔内加入培养基后接种细胞或者接种经预富集和细胞密度测定的胸腹水细胞悬液进行细胞培养，使细胞粘附于阵列孔的底部；

2）细胞粘附于阵列孔的底部后，弃上清，加入固定剂进行细胞固定，然后进行细胞学实验；或者弃上清后直接进行细胞学观察或研究，操作过程中使用保护盖防止污染；

3）实验结束后，在阵列孔内细胞上滴加水溶性或脂溶性封片试剂，然后盖上封固盖，使阵列柱伸入相应的阵列孔内进行封固；

4）封固后得到微阵列细胞芯片。

10.如权利要求9所述的细胞芯片制备方法，其特征在于，所述的细胞学实验包括HE染色、巴氏染色、免疫荧光染色、细胞免疫化学，原位杂交或原位PCR；

封固后的微阵列细胞芯片还可采用正置显微镜或倒置显微镜或数字扫描显微镜进行摄取图像和分析。

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