CN106701533B - 一种高通量图案诱导细胞筛选芯片的使用方法 - Google Patents

一种高通量图案诱导细胞筛选芯片的使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高通量图案诱导细胞筛选芯片的使用方法，其特征在于：第一步，进样；将相同品种、浓度的干细胞混合液和培养液，分成两组，从四个注射孔加入，并保证进样的流程长度一致。待细胞全部进入第一级圆形培养室和第二级圆形培养室后，停止加样。将加好式样的芯片静止5min–10min，待细胞沉淀后，用等量培养液，从四个注射孔缓缓加入，冲洗各个通道中的细胞到出样口，排出多余的细胞。第二步通气，第三步清洗等。本发明有益效果是芯片能够根据实验要求，灵活设置更多的通道和培养室，增强培养系统。可在芯片有限的面积内，检测多个指标，达到即时、有效、微量检测。能够在检测的时间段内进行实时监测，控制营养物质、或考察药品的输入剂量，保证检测的可靠性，使得结果更能反应真实的细胞生长环境，达到最终需要的检测目的。

Description

一种高通量图案诱导细胞筛选芯片的使用方法
技术领域
本发明涉及一种细胞筛选试验的细胞培养的生物芯片的使用方法，从使用上讲，是一种高通量图案诱导细胞实验的筛选芯片的使用方法。
背景技术
生物芯片是近20年在生物医学工程领域中迅速发展起来的一项高新技术。因为其高通量，微型化和自动化的特点，符合快速、高效、低成本的工业化运作原则，在疾病诊断、药物筛选、细胞培养等领域，具有非常强大的运用前景。目前，在研究多种图案对各类干细胞的分化增殖的实验比较多，但是做此类实验的图案比较复杂，同时细胞对比实验的对相同实验条件的要求也很苛刻，需要有一种易于加工的此类实验的器材。生物芯片运用到此类实验，为解决这一问题，提供了方案。
为此，我们发明一种图案诱导细胞的高通量筛选的对比实验芯片及使用方法。
发明内容
本发明的技术方案为，一种高通量图案诱导细胞筛选芯片的使用方法。所使用的芯片呈矩形，在矩形的一个短边端头，加工有4个注射孔，注射孔①与注射孔②为一组，注射孔③与注射孔④为一组，沿长方形的两条长边，左右对称排布。每两个一组的注射孔连接通道向芯片中心方向呈横向的“Y”字形汇流到两条左右对称的连接通道中；两条左右对称的连接通道拐弯后平行于芯片的长边，伸向芯片的另一端一段距离后与2条左右对称的弧形通道相连。两条弧形通道呈半圆形，半圆的顶端朝向芯片的注射孔一端，半圆底端两条弧形通道的端头连接2个第一级圆形培养室。在2个圆形培养室对应进口的另一侧分别加工有一个出口，出口与一条倒T型分流通道连接，每个倒T型分流通道又分别连接2个第二级圆形培养室组成一对，共两对4个第二级圆形培养室。两对第二级圆形培养室与倒T型分流通道进口对应的另一端，各自加工有出口，出口连接一段直通道，4个直通道连接到一条与其垂直的横通道上。所述矩形芯片对应注射孔一端的另一短边端头，加工有1个出样口，出样口连接1条排样通道，排样通道的另外一端垂直连接在横通道长度的中间位置处。所述芯片的2个第一级圆形培养室左右对称，培养室底部分别加工有均匀分布的大圆形细胞坑和小圆形细胞坑，即，一个圆形培养室底部加工的是均匀分布的大圆形细胞坑，另一个圆形培养室底部加工的是均匀分布的小圆形细胞坑。所述两对4个第二级圆形培养室的底部，一侧的一对分别加工有大矩形细胞坑和小矩形细胞坑，即第二级圆形培养室的这对培养室底部，一个加工的是大矩形细胞坑，另一个加工的是小矩形细胞坑。另外一侧的一对分别加工有大三角细胞坑和小三角细胞坑，即第二级圆形培养室另外一侧的这对培养室底部，一个加工的是大三角细胞坑，另一个加工的是小三角细胞坑。所述芯片的细胞坑的底部低于培养室底部，培养室底部低于各个通道底部0.25mm-3mm。其特征在于，操作步骤如下。
第一步，进样；将相同品种、浓度的干细胞混合液和培养液，分成两组，一组从注射孔①加干细胞混合液，注射孔②加培养液，另一组对应从注射孔④加干细胞混合液，注射孔③加培养液。保证进样的流程长度一致。待细胞全部进入第一级圆形培养室和第二级圆形培养室后，停止加样。将加好试样的芯片静止5min – 10min，待细胞沉淀，用等量培养液，从四个注射孔缓缓加入，冲洗各个通道中的细胞，至出样口排出，排出多余的细胞。
第二步，通气；缓缓通入CO2，直到各个通道无培养液为止，然后将芯片放入培养箱中。保证了各个通道作为气路的畅通。
第三步，清洗；24h后，观察各个细胞坑中的细胞贴壁后，用等量培养液，从四个注射孔缓缓加入，冲洗培养室中的未贴壁细胞，直至废细胞全部从出样口排出。再缓缓通入CO2，直到各个通道无培养液为止，然后将芯片放入培养箱中。
第四步，加药；在需考察药品影响细胞增殖及分化的实验时，从四个注射孔缓缓加入药品溶液，最后，缓缓通入CO2，致各个通道无培养液为止，然后将芯片放入培养箱中。
上述技术方案中，所使用芯片的大圆形细胞坑和小圆形细胞坑、大矩形细胞坑和小矩形细胞坑、大三角细胞坑和小三角细胞坑的表面全部进行了亲水处理，并涂覆有促进细胞粘附生长的因子。所述芯片的第一级圆形培养室、第二级圆形培养室以及各类通道均进行了疏水处理；所述大圆形细胞坑和小圆形细胞坑、大矩形细胞坑和小矩形细胞坑、大三角细胞坑和小三角细胞坑通过二次加工制得，或通过双层芯片贴合加工而成，细胞坑的形状尺寸能够精确加工。
上述技术方案中，所使用芯片的注射孔连接通道为1/4圆弧形，并两两对称均匀分布在芯片一端的两侧；所述芯片的第一级圆形培养室和第二级圆形培养室的数量、级数、圆形的培养室和底部细胞坑的形状，不局限于上述6个圆形培养室、两级、一种圆形的培养室和6种细胞坑的形状。也就是说能够精确加工成各种形状的培养室和细胞坑。培养室也够分为更多级别。
本发明的目的是利用生物芯片良好的细胞培养基础上，通过结构的改进，增加其应用功能。可以通过在一种芯片上操作，提供了不同（相同）的细胞生长环境，在其他变量都不改变的条件下，能单一的控制某种变量，能够起到同时定量定向观测对比，从而使培养周期变短，减少了即时观测的实验时间和误差。
本发明技术特点是通过控制微型泵，从4个注射口注入实验所需要的细胞和培养液。能够定期通过4个注射口补给相应的营养物质和药物，控制营养液运给的时间间隔，保证了细胞正常的新陈代谢。联通的通道将细胞和营养物质或药物运输到培养室，细胞在这里进行生长，即时观测。在特定的培养条件下，各个培养室能够起到一个对比的作用。
与现有的同类实验相比，本发明芯片具有下列有益效果：芯片能够根据实验要求，灵活设置更多的通道和培养室，增强培养系统。可在芯片有限的面积内，检测多个指标，达到即时、有效、微量检测。能够在检测的时间段内进行实时监测，控制营养物质、或考察药品的输入速率，保证检测的可靠性，使得结果更能反应真实的细胞生长环境，达到最终需要的检测目的。
附图说明
图1为本发明的示意图。
图2为本发明的培养室与细胞坑、通道的切面示意图。
图中：1.芯片；2.大矩形细胞坑；3.小矩形细胞坑；4.大圆形细胞坑；5.弧形通道；6. 注射孔①；7.注射孔连接通道；8.注射孔②；9.连接通道（8）；10.注射孔③；11.注射孔④；12.第一级圆形培养室；13.小圆形细胞坑；14.倒T型分流通道。15.第二级圆形培养室；16.大三角细胞坑；17.小三角细胞坑；18.直通道；19.排样通道；20.出样口；21.横通道；22.培养室；23.细胞坑；24.通道。
具体实施方式
下面结合附图和实施例进一步对本实用新型加以说明。
具体实施例一
参照图1至图2芯片形状结构，芯片有2级培养室22。第一级圆形培养室12和第二级圆形培养室15，以及各类通道24，均进行了疏水处理。第一级圆形培养室左右对称，培养室底部加工有均匀分布的大圆形细胞坑4和小圆形细胞坑13。两对4个第二级圆形培养室一对加工大三角细胞坑16和小三角细胞坑17，另一对加工大矩形细胞坑2和小矩形细胞坑3。细胞坑23底表面亲水处理，并涂覆有FN蛋白。
所有通道：宽=150µm，高=100µm；所有圆形的培养室22直径ϕ=10mm；第一级：大圆形细胞坑4的细胞坑23半径r=65µm，深=50µm；小圆形细胞坑13的细胞坑23半径r =25µm，深=50µm。第二级：大矩形各边尺寸，长=350µm，宽=60µm，深50µm，小矩形各边尺寸，长=150µm、宽=20µm，深50µm。大三角细胞坑16的正三角形尺寸为边长=30µm，小三角细胞坑17的正三角形尺寸为边长=10µm，培养室22底部低于各个通道24底部3mm。操作步骤如下。
第一步，进样。将消化稀释成一定浓度的脊髓间质干细胞混合液和细胞培养液，分成两组，一组从注射孔①加干细胞混合液，注射孔②加培养液，另一组对应从注射孔④加干细胞混合液，注射孔③加培养液。保证进样的流程长度一致。待细胞全部进入第一级圆形培养室和第二级圆形培养室后，停止加样。将加好试样的芯片静止5min，待细胞沉淀，用4份10mL培养液，从四个注射孔缓缓加入，冲洗各个通道中的细胞，至出样口排出多余的细胞。
第二步，通气。缓缓通入CO2，直到各个通道无培养液为止，然后将芯片放入培养箱中。
第三步，清洗。24h后，观察各个细胞坑中的细胞贴壁后，用4份10mL培养液，从四个注射孔缓缓加入，冲洗培养室中的未贴壁细胞，直至废细胞全部从出样口排出。再缓缓通入CO2，致各个通道无培养液为止，然后将芯片放入培养箱中。
第四步，加药。从四个注射孔缓缓各加入2µL骨生长因子，最后，缓缓通入CO2，致各个通道无培养液为止，然后将芯片放入培养箱中，12h后观察细胞形态。
具体实施例二
参照图1至图2芯片形状结构，芯片有3级培养室22。第一级一对2个方形边长=5mm的培养室22，第二级4个圆形ϕ=5mm的培养室22，第三级四对共8个菱形边长=5mm的培养室22，以及各类通道24，均进行了疏水处理。第一级方形的培养室底部加工有均匀分布的大圆形细胞坑4和小圆形细胞坑13。两对4个第二级圆形的培养室22一对加工大三角细胞坑16和小三角细胞坑17，另一对加工大矩形细胞坑2和小矩形细胞坑3。四对8个第三级8个菱形培养室22，分别是大/小菱形的细胞坑23，大/小正方形的细胞坑23，大/小大矩形的细胞坑23，大/小五角星形的细胞坑23，细胞坑23底表面亲水处理，并涂覆有FN蛋白。
所有通道：宽=250µm，高=500µm；第一级：大圆形细胞坑4的细胞坑23半径r=45µm，深=45µm；小圆形细胞坑13的细胞坑23半径r =15µm，深=45µm。第二级：大矩形各边尺寸，长=150µm，宽=20µm，深45µm；小矩形各边尺寸，长=80µm、宽=10µm，深45µm。大三角细胞坑16的正三角形尺寸为边长=30µm，小三角细胞坑17的正三角形尺寸为边长=10µm。第三级：大小菱形的细胞坑23各边尺寸=30µm、深45µm，小菱形的细胞坑23各边尺寸=10µm、深45µm；大正方形的细胞坑23各边尺寸=30µm，小正方形的细胞坑23各边尺寸=10µm；大矩形的细胞坑23各边尺寸，长=80µm，宽=20µm，深45µm，小矩形的细胞坑23各边尺寸，长=50µm，宽=10µm，深45µm ；大五角星形的细胞坑23各边尺寸=20µm，深45µm，小五角星形的细胞坑23各边尺寸=10µm，深45µm。培养室22底部低于各个通道24底部2mm。操作步骤同实施例一。

Claims (3)

1.一种高通量图案诱导细胞筛选芯片的使用方法，所使用的芯片（1）呈矩形，在矩形的一个短边端头，加工有4个注射孔，注射孔①（6）与注射孔②（8）为一组，注射孔③（10）与注射孔④（11）为一组，沿长方形的两条长边，左右对称排布；每两个一组的注射孔连接通道（7）向芯片中心方向呈横向的“Y”字形汇流到两条左右对称的连接通道（9）中；两条左右对称的连接通道（9）拐弯后平行于芯片的长边，伸向芯片的另一端一段距离后与2条左右对称的弧形通道（5）相连；两条弧形通道（5）呈半圆形，半圆的顶端朝向芯片的注射孔一端，半圆底端两条弧形通道（5）的端头连接2个第一级圆形培养室（12）；在2个圆形培养室（12）对应进口的另一侧分别加工有一个出口，出口与一条倒T型分流通道（14）连接，每个倒T型分流通道（14）又分别连接2个第二级圆形培养室（15）组成一对，共两对4个第二级圆形培养室（15）；两对第二级圆形培养室（15）与倒T型分流通道（14）进口对应的另一端，各自加工有出口，出口连接一段直通道（18），4个直通道（18）连接到一条与其垂直的横通道（21）上；所述矩形芯片（1）对应注射孔一端的另一短边端头，加工有1个出样口（20）；出样口（20）连接1条排样通道（19），排样通道（19）的另外一端垂直连接在横通道（21）长度的中间位置处；所述芯片（1）的2个第一级圆形培养室（12）左右对称，培养室底部分别加工有均匀分布的大圆形细胞坑（4）和小圆形细胞坑（13）；所述两对4个第二级圆形培养室（15）的底部，一侧的一对分别加工有大矩形细胞坑（2）和小矩形细胞坑（3），另外一侧的一对分别加工有大三角细胞坑（16）和小三角细胞坑（17）；所述芯片（1）的细胞坑（23）的底部低于培养室（22）底部，培养室（22）底部低于各个通道（24）底部0.25mm-3mm；其特征在于，操作步骤如下：
第一步，进样；将相同品种、浓度的干细胞混合液和培养液，分成两组，一组从注射孔①（6）加干细胞混合液，注射孔②（8）加培养液，另一组对应从注射孔④（11）加干细胞混合液，注射孔③（10）加培养液；待细胞全部进入第一级圆形培养室（12）和第二级圆形培养室（15）后，停止加样；将加好试样的芯片（1）静止5min – 10min，待细胞沉淀，用等量培养液，从四个注射孔缓缓加入，冲洗各个通道（24）中的细胞，至出样口（20）排出；
第二步，通气；缓缓通入CO2，直到各个通道（24）无培养液为止，然后将芯片放入培养箱中；
第三步，清洗；24h后，观察各个细胞坑（23）中的细胞贴壁后，用等量培养液，从四个注射孔缓缓加入，冲洗培养室（22）中的未贴壁细胞，直至废细胞全部从出样口（20）排出；再缓缓通入CO2，致各个通道（24）无培养液为止，然后将芯片放入培养箱中；
第四步，加药；在需考察药品影响细胞增殖及分化的实验时，从四个注射孔缓缓加入药品溶液，最后，缓缓通入CO2，直到各个通道（24）无培养液为止，然后将芯片放入培养箱中。
2.根据权利要求1所述的一种高通量图案诱导细胞筛选芯片的使用方法，其特征在于：所使用芯片（1）的大圆形细胞坑（4）和小圆形细胞坑（13）、大矩形细胞坑（2）和小矩形细胞坑（3）、大三角细胞坑（16）和小三角细胞坑（17）的表面全部进行了亲水处理，并涂覆有促进细胞粘附生长的因子；所述芯片（1）的第一级圆形培养室（12）、第二级圆形培养室（15）以及各类通道（24）均进行了疏水处理；所述大圆形细胞坑（4）和小圆形细胞坑（13）、大矩形细胞坑（2）和小矩形细胞坑（3）、大三角细胞坑（16）和小三角细胞坑（17）通过二次加工制得，或通过双层芯片贴合加工而成，细胞坑（23）的形状尺寸能够精确加工。
3.根据权利要求1-2任一所述的一种高通量图案诱导细胞筛选芯片的使用方法，其特征在于：所使用芯片（1）的注射孔连接通道（7）为1/4圆弧形，并两两对称均匀分布在芯片一端的两侧。
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Patentee after: Guangzhou Huansheng Technology Co.,Ltd.

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