CN102105578A - 具有可变表面形状的细胞培养装置 - Google Patents

Abstract

细胞培养装置包括其内形成的微柱孔阵列的基底。微柱孔阵列包括多个微柱孔。每个微柱结构包括多个相互隔开的微柱，微柱的顶端可形成孔。该孔适合于细胞培养。

Description

具有可变表面形状的细胞培养装置

相关申请的交叉参考

本申请要求2008年5月30日提交的、发明名称为“具有可变表面形状的细胞培养装置”的美国临时申请61/130,364的权利。

技术领域

本发明主要涉及培养生物细胞的装置。更具体地，本发明涉及培养三维多细胞群的装置。

背景技术

传统上，生物医学研究的体外模型是基于二维的细胞培养，即细胞在平面表面上培养。然而，尽管二维的细胞培养物具有实验上的方便性及良好的细胞生存力，但是人们通常认为细胞行为，如表型、功能以及信号通路的调节，在二维的细胞层中与在复杂的三维的多细胞群中是根本不同的。癌症研究就是个好的范例，研究人员发现加入特定抗体后，三维的恶性乳腺肿瘤细胞能够回复初始状态——在二维的培养中从未观察到这种治疗效果(Bin Kim J.，Stein R.and O′Hare MJ.，“乳腺癌的三维体外组织培养模型——综述，Breast Cancer Research and Treatment 2004，85(3)：281-291)。由于三维培养系统与在活体中发现的生理环境更为相似，因此开发更为有效的体内三维细胞培养系统对于许多研究领域都至关重要，如新药研发、干细胞和癌症研究以及组织工程学。

细胞外基质的存在是体内细胞的必需环境，它提供了细胞-基底相互作用的支持，且有利于营养和代谢废物的运输。关于细胞-基底相互作用的研究已经表明对于特定的基底表面，不同的细胞可在例如细胞黏附、形态、定向、流动性和生物活性方面表现出显著不同的行为。细胞-基底相互作用研究的最终目的是由此获得引导细胞培养和发育的最优基底表面。然而，目前多数研究停留在通过物理或化学地限制细胞生长来在界定位置获得三维细胞群。在物理的限制中，孔的阵列是组合好的。随后，培养的细胞被限制到每个微孔中来形成多细胞群。通常地，孔具有陡的侧壁和平的底部，以便即使受限制，细胞也在平面上生长。因此，细胞并不与真实的三维的表面相互作用。

发明内容

一方面，本发明涉及细胞培养装置，该装置包括具有其内形成的微柱细胞培养孔的基底。在实施方式中，这些微柱细胞培养孔可处于微柱孔阵列中。微柱孔阵列包含多个微柱孔结构。每个微柱孔结构包含多个相互间隔的微柱，微柱的末端可形成孔。

另一方面，本发明提供了细胞培养装置，由具有多个微孔(micro-well)的基底形成，其中微孔由多个微柱(micro-pillar)形成。在本发明的实施方式中，微孔分组形成多个微孔阵列；微孔阵列可含有具有相同表面形状(topography)的微孔，或者微孔阵列可含有具有不同或可变表面形状的微孔。在进一步的实施方式中，微孔阵列可具有在相邻微孔阵列间的基底中形成的至少一个微通道，从而容许流体在阵列间流动。在更进一步的实施方式中，微孔可相对于基底的表面凹入。

另一方面，本发明涉及制造细胞培养装置的方法，包括在第一基底上形成多个微粒(microdot)，每个微粒是孔的负拷贝。该方法包括在多个微粒上形成多个微柱，以便微柱与多个微粒相互邻接。微柱的数量基本上比微粒的数量多，以便每个微粒与多个微柱邻接。该方法包括将微粒和微柱的相交轮廓转移到第二基底，来在第二基底中形成多个微柱结构。

本发明的其它特征和有益之处在以下的说明和附加的权利要求书中可显而易见。

附图说明

以下描述的附图，阐明了本发明的典型实施方式，并不认为是对本发明范围的限制，因为本发明可允许其它同样有效的实施方式。附图不必成比例，并且为了清晰和简洁，特定的特征与特定的附图的视图的比例可能被特别放大或简化示意。

图1为具有可变表面形状的细胞培养装置的透视图。

图2A-2C描述了包括在具有可变表面形状的细胞培养装置内的孔的几何形状的垂直截面。

图3为图1所示的细胞培养装置的垂直截面。

图4显示了带有凹入的微柱结构的图3的垂直截面。

图5显示了带有在相邻微柱孔之间形成的微通道的图3的垂直截面。

图6为具有多个微柱孔阵列的细胞培养装置的俯视图。

图7为具有在相邻微柱也阵列之间形成的微通道的细胞培养装置的横截面图。

图8A阐明了基底的的光图案化。

图8B显示了蚀刻后图8A所示的光图案化的基底。

图8C显示了经过回流(reflow)处理后的图8B所示的基底。

图8D显示了图8C所示的基底的光图案化。

图8E显示了在图8D所示的基底中形成的微柱。

图8F显示了浇铸到基底中的微柱和微粒。

图8G显示了带微柱孔的基底。

图8H显示了在图8G的基底上生长的金属。

图8I显示了由图8H所示生长的金属形成的复制模型。

具体实施方式

如附图所示，将根据几个优选的实施方式来详细描述本发明。为了提供对本发明的详尽理解，在描述优选的实施方式时会展示许多具体的细节。然而，本领域技术人员显而易见本发明可以在没有一些或全部上述具体细节的情况下获得实施。在其它例子中，没有详细描述一些众所周知的特征和/或过程步骤，以免不必要地搞混本发明。此外，相似或相同的附图标记用来识别相同或相似的元件。

图1描述了包括基底102的细胞培养装置100，该基底可由适合培养生物细胞的任何生物相容材料制成。例如，生物相容材料可以是生物相容聚合物，如聚二甲基硅氧烷、聚乙烯、聚苯乙烯、聚烯烃、聚烯烃共聚物、聚碳酸酯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚丙烯、聚砜、聚四氟乙烯(PTFE)或相容的含氟聚合物、硅橡胶或共聚物、苯乙烯-丁二烯-苯乙烯共聚物、丙烯酸类聚合物、或聚酯或这些材料的组合物。其它合适材料的例子包括玻璃、石英、金、二氧化硅、和涂钛的硅。微柱孔阵列104在基底102中形成。微柱孔阵列104包括多个微柱结构或孔105。每个微柱结构或孔105包括多个相互隔开的微柱112。微柱的末端113形成用于接收和培养生物细胞的凹陷或凹面或贮槽或孔106。例如，微柱结构105具有微柱112。一些微柱形成孔106，即在细胞培养时构成或排列成容纳细胞的凹入或凹陷区域。微柱112可具有多种横截面形状，如圆形的、椭圆形的、三角形的、正方形的、和矩形的。惯常用来制造微柱112的基底材料调整微柱112和细胞培养装置100的机械特性。如图1所示的实施方式，微柱112具有圆形横截面。微柱112可通过多种装填几何形状排列在基底102中，如六边形或立方体的装填几何形状。孔106可具有多种形状。在实施方式中，孔例如可以是，有平坦底部表面的圆柱形、有平坦底部表面的立方形、有尖底的金字塔形、有尖底的圆锥形或有平坦底部表面的截顶圆锥形或截顶金字塔形。在一实施方式中，孔106呈弯曲状。在另一实施方式中，孔106呈凹形。在一实施方式中，孔的凹形是椭圆抛物面。术语“椭圆抛物面”也包括如图1所示的圆形抛物面的特殊情形。图2A-2C显示了凹孔106的其它例子。图2A-2C所示的每个微柱孔具有不同的曲率K。形成的孔，如凹孔，可增强各式尺寸和形态的三维细胞球体的形成。图2显示了三个具有不同或可变表面形状的孔106，例如，图2A-2C所示的三个孔具有不同的曲率K、不同的高度h以及不同的直径d。

图3显示了细胞培养装置100的截面。微柱结构105从基底102的顶部表面108延伸到基底102的底座部分110。在这种情况下，孔106开向基底102的表面108。在如图4所示的可选的实施方式中，微柱结构105相对于基底102的顶部表面108是凹陷的，产生在微柱结构阵列104上方的大孔(macro-well)或腔室114。腔室114具有侧壁115，其在图4中是圆柱形。在可选的实施方式中，腔室114可具有其它形状，如具有或不具有圆角的倒转截锥形状或平行六面体形状。腔室114的深度(h_c)决定了微柱结构阵列105相对于基底102的顶部表面108凹陷的深度。

如图5所示的另一实施方式中，相邻孔106可通过微通道109相互连接。这些微通道109可通过在相邻的微柱结构105之间截去一个或多个微柱112来形成。微通道109可促进相邻孔106中的细胞群之间的交流，并且使位于孔106中的细胞可以自由进入微柱结构阵列105中的细胞培养基，例如，生长因子或刺激物。微通道109的宽度通常由其相互连接的孔106的宽度来决定。通常来说，每个微通道109的宽度(沿着z轴测量)的范围可在5～50微米内。每个微通道109的深度(h_m)是可变化的。通常来说，每个微通道109的深度不比其相互连接的孔106的深度深。如图4所示的凹入的微柱结构阵列104也可包括与图5所示的微通道109相似的相互连接的微通道。

参见图4，每个微柱结构105具有按以下微柱结构参数来描述的表面形状：孔106的直径(d)、孔106的高度(h)、孔106的曲率(k)、界定孔106的微柱112的直径(d_p)、界定孔106的微柱112之间的间隔或缺口(g_p)、界定孔106的每个微柱112的高度(h_p)、界定孔106的微柱112的装填几何形状、在界定孔106的微柱112的顶端113上的任何表面处理、以及界定孔106的微柱112的横截面形状。微柱112之间的间隔(g_p)由在孔106中培养的生物细胞的尺寸来决定。通常地，微柱112之间的间距(g_p)比生物细胞的尺寸小，以便培养后细胞停留在孔106中，并且限制或不渗透到微柱112之间的间隔中。在优选的实施方式中，每个孔106的直径(d)范围在50～500微米间。在优选的实施方式中，每个孔106的高度(h)范围在0～100微米间。在0微米时，孔106是平的。在一实施方式中，每个孔106的高度范围在5～100微米间。在另一实施方式中，每个微柱112的直径范围在0.5～20微米间。在另一实施方式中，相邻微柱112之间的间隔(g_p)范围在5～100微米间。微柱结构阵列104具有通过在阵列中的所有微柱结构105的个体表面形状和以下阵列参数描述的表面形状：相邻微柱结构105之间的间隔(g_m)、腔室114(如有)的高度(h_c)、腔室114(如有)的直径(h_c)以及腔室114(如有)的形状。相邻微柱结构105之间的间隔(g_m)优选范围在10～500微米间。

图1显示了具有带九个微柱孔结构105的单个微柱结构阵列104的细胞培养装置100。在实际操作中，细胞培养装置100可具有排列在多个微柱结构阵列104中的更多个微柱结构105。例如在图6中，细胞培养装置100包括多个微柱结构阵列104，其中每个微柱结构104包括多个微柱结构105。由于绘图的比例，微柱结构105在图中以点的形式出现。通常地说，微柱结构阵列104会与图1所示的相似，除了在图6中有更多的微柱结构105，其具有与图1所示的不同的表面形状。在图6中，微柱结构阵列104可具有相同数量或不同数量的微柱结构105。在图6中，每个微柱结构阵列104为长方形。在可选的实施方式中，可通过排列微柱结构105使得微柱结构阵列104为非长方形，如圆形或六边形。图6中的任何微柱结构阵列104可以是如图4所描述的凹入的微柱结构阵列104。

参见图6，在基底102中微柱结构阵列104被相互分隔。微柱结构阵列104之间的间隔(g_a)可以是均匀或不均匀地贯穿基底102。在基底102中的微柱结构阵列104的任何合适排列都可以被使用，但是以N×M矩形或方形阵列排列微柱结构104的阵列比较方便，其中N＞1，M≥1。在一实例中，N×M的数值选自6、12、16、24、96、和384。在图4所示的实例中，N×M是16。

在细胞培养装置100中的相邻微柱结构阵列104之间可形成一个或多个微通道。微通道在图6中以线111表示，并在图7中相对于两个相邻的微柱结构阵列104更全面地进行了阐明。在图7中，一个或多个微通道111在相邻的微柱结构阵列104之间形成。如果俯视观察微柱结构阵列104，微通道111可以以横跨微柱结构阵列104之间的通道或沟槽的方式出现。微通道111相互连接相邻微柱结构阵列104中的微柱结构105的孔106。相互连接的微通道111也可用在如前所描述的微柱结构阵列104相对于基底102的顶部表面108凹入的地方。微通道111使位于孔106内的细胞可以自由进入细胞培养装置100中的细胞培养基，例如，生长因子或刺激物。微通道111也可促进位于相邻微柱结构阵列104中的孔106内的两个细胞群之间的交流。微通道111的宽度通常由其相互连接的孔106的宽度来决定。通常地说，微通道111的宽度范围可在5～50微米间。微通道111的深度可弹性变化。通常地说，微通道111的深度不比其相互连接的孔106的深度深。图7也显示了在相邻的微柱结构阵列104之间的基底102中的区域117可包括微柱112，即不是完全实心的。

参见图1-7，细胞培养装置100可用作识别培养特定生物细胞的最优微环境的筛选工具。如果细胞培养装置100用作筛选工具，至少两个或多个微柱结构105可具有不同的表面形状。如果上述的微柱结构参数的至少一个数值不同，则两个微柱结构105具有不同的表面形状。例如，如果两个微柱结构105或微孔106具有不同的形状、不同的曲率、不同的高度、深度、孔之间的间隔，或不同的表面处理，则它们可具有不同的或可变的表面形状。至少两个具有不同表面形状的微柱结构105可位于单个阵列104或两个不同阵列104中。例如，细胞培养装置可具有多个微柱孔阵列，在此所有微柱孔阵列中的所有微柱孔具有相同的，或均一的表面形状。或者如图6所示，细胞培养装置可具有多个微柱孔阵列，在此每个阵列中的微柱孔是多种多样的，或非均一的，或可变的，或具有不同表面形状的。或者，细胞培养装置可具有多个阵列，在此每个阵列中的孔是均一的，但是在单个阵列中的孔可与其它阵列的孔不同。

当细胞培养装置100用于特定细胞系时，在细胞培养装置100中的微柱结构105可具有相同的表面形状。为了共同培养多个细胞系，细胞培养装置100可包括多个微柱结构阵列104，其中每个微柱结构阵列104包括适应于特定细胞系的微柱结构105。在这种情况下，在每个微柱结构阵列104中的微柱结构105也可具有相同的表面形状。之前提到了每个微柱结构具有一表面形状，并且每个微柱结构阵列具有表面形状。细胞培养装置100也具有表面形状，其通过它含有的微柱结构阵列104的总体表面形状，以及微柱结构阵列104之间的间隔来描述。

以上图1-7描述的细胞培养装置100可用来培养三维多细胞群。孔106界定了细胞群的形状和直径，同时微柱112控制了细胞-基底的相互作用。孔106和微柱112可模拟体内细胞的必要的生长环境，并方便于营养和代谢废物运输。作为筛选工具，细胞培养装置100可有利于发现不同类型的三维细胞培养的最优或有效的微环境，因为通过在单芯片上比较一系列的细胞培养结果，可快速和有效地研究微环境对细胞培养的影响。特别地，细胞培养装置100使得在单芯片上调查一个或多个微柱结构参数对细胞培养微环境的影响变得容易。基底102中的每个微柱结构105的位置，以及基底102中的微柱结构105的排列是已知的。这些信息可以任何适当的格式存储，以便之后用于识别出根据特定细胞类型的细胞-基底相互作用的最佳地或有效地表现的微柱结构105(或微柱结构阵列104)。在某实例中，微柱结构105的位置和描述信息存储在结构化文件中，如XML文件，或其它的计算机可读的结构格式。之后被存储的微柱结构105的位置及其描述信息之后用于创建细胞培养装置100的初始数字图像。在细胞-基底相互作用研究开始后，细胞培养装置100随后的数字图像便生成了。用这些随后的数字图像可与初始图像相比较，从而帮助识别出最优表现的微柱结构105(或微柱结构阵列104)。

为了完整性，这里展示制造上述细胞培养装置的方法的实例。但是，上述的细胞培养装置可通过任何合适的工艺或现有技术已知的工艺组合来制造。

在实例中，制造上述细胞培养装置的方法包括在第一基底上形成多个微粒。每个微粒是上述孔的负拷贝。多个微粒可通过任何合适的工艺在第一基底上形成，如浇铸或光蚀刻法，随后是回流(reflow)光阻材料。在多个微粒上形成多个微柱，使得微柱与多个微粒相邻接。接着将微粒和微柱的邻接轮廓转移到第二基底，以在第二基底中形成多个微柱结构。如果细胞培养装置包括在微柱结构上形成的腔室，该方法可能包括其它步骤。

在图8A和8B中，描述了通过光蚀刻法，随后回流光阻材料来制造多个微粒阵列的方法。在图8A中，光阻材料134通过现有技术已知的任何适当工艺沉积在第一基底132上，如旋转涂布。第一基底132可由任何适当的基底材料来制成，如玻璃、聚合物，以及硅。优选地，第一基底132具有亲水表面以便于黏附光阻材料134。优选地，光阻材料134是正性光刻胶。在第一基底132上的光阻材料134的厚度通常由形成的孔的最终深度来决定。随后，光阻材料134通过光掩模136曝光在光的图像下。光的图像由形成的微粒的形状和排列来决定。曝光的光阻材料134显影和蚀刻来形成多个微桩(macro-post)。图8B显示了微桩138。应该指出，为了避免图片拥挤，只显示了从微柱的两个相邻阵列而来的几个微桩138。微通道桩139在微柱的两个相邻阵列间形成。微通道桩139可由具有比微桩材料更高熔点的材料制成。图8B的微桩138通过回流光阻材料过程来塑形成图8C的微粒130。如上所述，微粒是形成的孔的负拷贝。回流光阻材料过程包括在第一基底材料的玻璃软化温度之上加热图8B中的微桩138，其中微桩138由于表面张力变形而形成图8C中的微粒130。图8C的微粒130的形状取决于图8B中的微桩138的高度和直径，并且由施加于微桩的热的温度及持续时间来控制。

参见图8D，在微粒130和微通道桩139上形成微柱的方法包括采用现有技术中已知的任何适当工艺来在微粒130、微通道桩139、和第一基底132上沉积光阻材料133，例如旋转涂布工艺。任何适当的光-阻材料均可使用。光阻材料133通过光掩模135曝光在光的图像下。如图8E所示，曝光的光阻材料133接着被显影和蚀刻来在第一基底132、微粒130和微通道桩139上形成微柱137。几个微柱137与每个微粒130及微通道桩139相互连接。

参见图8F，将微粒/微通道桩和微柱的相交轮廓转移到第二基底中的方法包括，将第二基底140与第一基底132上的微粒130、微通道桩139和微柱137接触。将第二基底140压向微粒130和微柱137来产生第二基底140中相交的微粒130、微通道桩139和微柱137的压痕。这些压痕变成微柱结构和相互连接的通道。第二基底140作为最终产品时，第二基底140优选地由生物相容材料制成，如上关于细胞培养装置的基底描述的材料。

图8G显示了分别带着微柱结构142和相互连接通道143的第二基底140。制造细胞培养装置的方法还可包括对微柱结构142进行表面处理。例如，可将表面涂层，如胶原蛋白或其它期望提供所调查的特定微环境的材料，施加于微柱结构的微柱的表面。为了方便细胞培养装置的大规模生产，形成复制模具是合乎需要的。参见图8H，这可例如包括通过电镀之类工艺来在微柱结构142和相互连接通道143内、以及在第二基底140的顶部表面上生长金属144。生长的金属从第二基底140分离，接着用作复制模具，其具有所需微柱结构和相互连接通道的负拷贝。图8I显示了复制模具146。

对于在微柱结构阵列上包括腔室的细胞培养装置，例如可用上述的光蚀刻法或用适于在基底中形成沟槽阵列的任何其它方法形成包括腔室的基底，此时沟槽阵列用作腔室阵列。接着，可用上述形成的复制模具压印带微柱结构的腔室的底部。可选地，被沟槽分离的大柱(macro-pillars)阵列可在第一基底上形成，此时大柱可用作腔室的负拷贝。接着，可在大柱上形成微桩。微桩可重新成形为微粒，微粒又可用作孔的负拷贝。可形成多个与孔处于相交关系的微柱。接着可将大柱、孔和微柱印记到第二基底中来形成细胞培养装置。可选地，可形成包括用作腔室的开口的基底，并将其邻接到包括微柱结构的基底。任何适当的工艺均可用来邻接基底。

在一方面，细胞培养装置100是用来培养生物细胞的，例如，特定的细胞系。在另一方面，具有微柱的细胞培养装置100是用来培养生物细胞或用来发现用于三维细胞群生长的最佳或有效的细胞-基底相互作用载体结构。在后一种情形下，细胞培养装置100包括各式各样的可由微环境域的参数限定的微柱结构105。

虽然参照有限数量的实施方式描述了本发明，但受益于本申请公开内容的本领域技术人员将会意识到可以设想出其它不偏离上述本发明范围的实施方式。因此，本发明的范围应仅局限于附加的权利要求书。

Claims (21)

1.细胞培养装置，它包括具有多个微孔的基底，其中所述微孔由多个微柱形成。

2.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中至少一个所述微孔是凹形的。

3.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中每个微孔直径为50～400微米。

4.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中每个微孔高度为5～100微米。

5.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中每个微柱直径为2～20微米。

6.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中相邻微柱的间距为5～100微米。

7.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中至少两个所述微孔具有不同的表面形状。

8.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中它还包含在相邻微孔间的所述基底中形成的至少一个微通道。

9.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中所述微孔分组形成多个微孔阵列。

10.如权利要求9所述的细胞培养装置，其中在所述多个微孔阵列中的第一个微孔阵列中的至少一个所述微孔具有与所述多个微孔阵列中的第二个微孔阵列中的至少一个所述微孔不同的表面形状。

11.如权利要求9所述的细胞培养装置，其中还包含在所述基底中形成的相邻微孔阵列间的至少一个微通道。

12.如权利要求9所述的细胞培养装置，其中所述多个微孔阵列中的至少一个包含具有均一表面形状的微孔。

13.如权利要求9所述的细胞培养装置，其中所述多个微孔阵列中的至少一个包含具有非均一表面形状的微孔。

14.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中所述微孔对所述基底的表面敞开。

15.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中所述微孔相对于所述基底的表面是凹入的。

16.制造细胞培养装置的方法，包括：

在第一基底上形成多个微粒，每个微粒是微孔的负拷贝；

在所述多个微粒上形成多个微柱，以便所述微柱邻接所述多个微粒，微柱的数量基本上比微粒的数量多，以便每个微粒与多个所述微柱相邻接；并且

转移所述微粒和微柱的邻接轮廓到第二基底中，从而在所述第二基底中形成多个微柱结构。

17.如权利要求16所述的方法，其中每个微粒是凹形孔的负拷贝。

18.如权利要求16所述的方法，其中形成多个微粒包括在所述第一基底上沉积第一光阻材料，把所述第一光阻材料曝光在光的图像下，以及显影和蚀刻所述曝光的第一光阻材料，从而在所述第一基底上形成多个微桩。

19.如权利要求18所述的方法，其中形成多个微粒进一步包括通过回流光阻材料将所述微桩成形为所述微粒。

20.如权利要求18所述的方法，其中在所述多个微粒上形成多个微柱进一步包括在所述微粒上沉积第二光阻材料，把所述第二光阻材料曝光在光的图像下，以及显影和蚀刻所述曝光的第二光阻材料，来在所述微粒上形成所述微柱。

21.如权利要求16所述的方法，其中转移所述微粒和微柱的邻接轮廓到第二基底包括在所述相交的微粒和微柱周围浇铸所述第二基底。

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