JP4332653B2 - 組織体形成方法及び組織体形成キット - Google Patents

Description

本発明は、細胞を含む三次元組織体の形成に関し、特に増殖性の細胞を含む三次元組織体のサイズの制御に関する。

培養細胞は、三次元的に集合して組織体を形成した場合には、例えば、基材表面に二次元的に接着して、いわゆる単層を形成した場合に比べて、より長期間生存し、生体内における本来の機能をより高いレベルで発現することが報告されている。このため、培養細胞から三次元組織体を形成する技術は、例えば、生体の挙動を再現するシミュレータ、薬品開発における動物実験の代替技術、細胞移植による再生医療技術等への応用が期待されている。

そこで、従来、例えば、特許文献１には、基材に形成された細胞非接着性表面をもつウェル内で初代肝細胞を培養することにより、当該ウェル内で当該初代肝細胞が三次元的に集合した組織体を形成させることが記載されている。この特許文献１には、ウェル内に入れる細胞の数を変えることにより、組織体のサイズを制御することが記載されている。

一方、例えば、特許文献２には、基材の表面に規則的に配置された複数の小領域で内皮細胞を二次元的に培養した後、当該内皮細胞の単層上で初代肝細胞を培養することによって、当該単層上で当該初代肝細胞が三次元的に集合した組織体を形成させることが記載されている。この特許文献２には、互いに隣接して形成される複数の組織体同士の接着を防止するために、複数の小領域の間隔を所定値以上にすべきことが記載されている。
特許第３２７０２８６号公報 国際公開第０３／０１０３０２号パンフレット

しかしながら、上記特許文献１に記載の技術においては、例えば、形成された三次元組織体が増殖性の細胞を含む場合には、当該細胞が増殖することにより、培養時間の経過に伴って当該三次元組織体のサイズが増加し続けるため、当該三次元組織体のサイズを一定に制御することは困難であった。また、上記特許文献２に記載の技術において、増殖性の細胞を含む三次元組織体のサイズの増加を抑制する方法については記載されていない。

したがって、従来、例えば、三次元組織体が増殖性の細胞を含む場合には、培養時間の経過に伴う当該三次元組織体の肥大化によって、その深部の細胞への栄養や酸素が次第に枯渇するようになるため、当該三次元組織体に含まれる一部又は全部の細胞が死滅し、又はその機能を失うこととなっていた。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、増殖性の細胞を含む三次元組織体のサイズを制御できる組織体形成方法及び組織体形成キットを提供することをその目的の一つとする。

上記課題を解決するために、本発明の一実施形態に係る組織体形成方法は、増殖性の細胞を含む三次元組織体を形成する組織体形成方法であって、所定面積をもち、前記細胞を保持できる特定表面領域、及び前記特定表面領域に隣接して配置され、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる複数の隣接表面領域であって、その各々の重心点から、前記特定表面領域の重心点までの距離が互いに等しくなるよう配置された複数の隣接表面領域、が形成された基材を少なくとも一つ準備する準備工程と、前記基材のうち、前記特定表面領域及び前記各隣接表面領域のそれぞれで前記細胞を培養することによって、前記特定表面領域及び前記各隣接表面領域のそれぞれで前記細胞を含む三次元組織体を形成させる培養工程と、を含み、前記準備工程で準備する前記基材の前記距離を変化させることによって、前記培養工程で前記特定表面領域に形成される前記三次元組織体のサイズを、前記距離に応じて制御することを特徴とする。

また、前記特定表面領域及び前記隣接表面領域は、細胞接着性であることとしてもよい。また、この場合、前記基材の表面のうち、前記特定表面領域を囲む部分は、細胞非接着性であることとしてもよい。また、前記特定表面領域及び前記隣接表面領域は、前記基材に形成された有底孔の底面であって、細胞非接着性であることとしてもよい。

また、前記準備工程において、前記距離が互いに異なる複数の前記基材を準備し、前記培養工程において、前記複数の基材の前記特定表面領域に、前記距離に応じて、前記複数の基材間で互いに異なるサイズの前記三次元組織体を形成させることとしてもよい。また、この場合、前記準備工程において、前記距離が前記複数の基材間で規則的に変化するよう、前記複数の基材を準備し、前記培養工程において、前記複数の基材の前記特定表面領域に、前記複数の基材間で前記距離に応じてサイズが規則的に変化した三次元組織体を形成させることとしてもよい。

また、前記培養工程において、前記特定表面領域に、前記距離に応じた径の略球形状の三次元組織体を形成させることとしてもよい。また、前記特定表面領域と前記複数の隣接表面領域とは、前記特定表面領域の重心点が、前記複数の隣接表面領域の各々の重心点を結んで形成される多角形の中に位置するよう配置されることとしてもよい。また、前記準備工程で準備する前記基材の前記距離と、前記培養工程で形成される前記三次元組織体のサイズと、の相関関係を示す検量データを取得する工程をさらに含むこととしてもよい。

また、上記課題を解決するために、本発明の一実施形態に係る組織体形成方法は、基材表面に互いに離間して配置された所定面積をもつ複数の表面領域のうち、第一の表面領域と、前記第一の表面領域に隣接して配置された複数の第二の表面領域であって、その各々の重心点から、前記第一の表面領域の重心点までの距離が互いに等しくなるよう配置された複数の第二の表面領域と、のそれぞれで増殖性の細胞を含む三次元組織体を形成させる場合における、前記第一の表面領域で形成される三次元組織体のサイズと、前記距離と、の相関関係を示す検量データに基づいて、所望のサイズの三次元組織体を形成させるための前記距離を決定する決定工程と、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる特定表面領域、及び前記特定表面領域に隣接して配置され、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる複数の隣接表面領域であって、その各々の重心点から、前記特定表面領域の重心点までの距離が、前記決定工程で決定された距離となるよう配置された複数の隣接表面領域、が形成された基材を準備する工程と、前記特定表面領域及び前記各隣接表面領域のそれぞれで前記細胞を培養することにより、前記特定表面領域に、前記細胞を含む、前記所望のサイズの三次元組織体を形成させる工程と、を含むことを特徴とする。また、前記検量データは、前記検量データ取得工程を含む組織体形成方法を用いて取得された検量データであることとしてもよい。

また、上記課題を解決するために、本発明の一実施形態に係る組織体形成キットは、増殖性の細胞を含む三次元組織体を形成するための組織体形成キットであって、所定面積をもち、前記細胞を保持できる第一特定表面領域、及び前記第一特定表面領域に隣接して配置された、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる複数の第一隣接表面領域であって、その各々の重心点から、前記第一特定表面領域の重心点までの距離が互いに等しい第一距離となるよう配置された複数の第一隣接表面領域、が形成された第一基材と、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる第二特定表面領域、及び前記第二特定表面領域に隣接して配置された、前記所定面積をもち、前記細胞を保持できる複数の第二隣接表面領域であって、その各々の重心点から、前記第二特定表面領域の重心点までの距離が互いに等しく、且つ前記第一距離と異なる第二距離となるよう配置された複数の第二隣接表面領域、が形成された第二基材と、を含むことを特徴とする。また、前記第一基材と前記第二基材とは、一つの基材のうち互いに異なる部分であることとしてもよい。

本発明によれば、増殖性の細胞を含む三次元組織体のサイズを制御できる組織体形成方法及び組織体形成キットを提供することができる。

本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる基材表面の一例についての説明図である。 本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる基材表面の他の例についての説明図である。 本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる領域セットの一例についての説明図である。 本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる、重心間隔が互いに異なる複数の領域セットの一例についての説明図である。 本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる、複数の領域セットが形成された基材表面の一例についての説明図である。 本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる領域セットの他の例についての説明図である。 本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる領域セットのさらに他の例についての説明図である。 本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる領域セットのさらに他の例についての説明図である。 本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる領域セットのさらに他の例についての説明図である。 本実施形態に係る組織体形成方法において用いられる基材表面のさらに他の例についての説明図である。 実施例１において、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の一例についての位相差顕微鏡写真である。 実施例１において、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の直径と培養時間との関係の一例を示すグラフである。 実施例１において形成される組織体の直径と中心間隔との直線関係を示す検量データの一例である。 実施例１において、隣接領域との位置関係が互いに異なる特定領域で形成された組織体の一例についての位相差顕微鏡写真である。 実施例１において、隣接領域との位置関係が互いに異なる特定領域で形成された組織体の直径と培養時間との関係の一例を示すグラフである。 実施例２において、中心間隔が互いに等しく、直径が互いに異なる表面領域で形成された組織体の一例についての位相差顕微鏡写真である。 実施例２において、中心間隔が互いに等しく、直径が互いに異なる表面領域で形成された組織体の直径と培養時間との関係の一例を示すグラフである。 実施例３において、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の一例についての位相差顕微鏡写真である。 実施例３において形成される組織体の直径と中心間隔との直線関係を示す検量データの一例である。 実施例４において、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の一例についての位相差顕微鏡写真である。 実施例４において形成される組織体の直径と中心間隔との直線関係を示す検量データの一例である。 実施例５において、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の一例についての位相差顕微鏡写真である。 実施例５において形成される組織体の直径と中心間隔との直線関係を示す検量データの一例である。 実施例６において、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の一例についての位相差顕微鏡写真である。 実施例６において形成される組織体の直径と中心間隔との直線関係を示す検量データの一例である。 実施例７において、中心間隔が互いに異なる表面領域で形成された組織体の一例についての位相差顕微鏡写真である。 実施例７において形成される組織体の直径と中心間隔との直線関係を示す検量データの一例である。

以下に、本発明の一実施形態に係る組織体形成方法及び組織体形成キットについて、図面を参照しつつ説明する。本実施形態に係る組織体形成方法（以下、「本方法」という）は、所定の面積をもつ複数の表面領域が互いに離間して配置された基材表面を少なくとも一つ準備する工程（以下、「準備工程」という）と、当該基材表面のうち、当該各表面領域で増殖性の細胞を培養することにより、当該各表面領域に当該細胞を含む三次元組織体（以下、「組織体」という）を形成させる工程（以下、「培養工程」という）と、を含む。

まず、準備工程について説明する。図１は、この準備工程で準備する基材の一例についての説明図である。また、図２は、この準備工程で準備する基材の他の例についての説明図である。図１及び図２に示すように、準備工程では、直径が互いに等しい円形状の複数の表面領域３ａ，３ｂが規則的に配置された平板状の基材１の表面２を準備する。この基材１の材質は特に限られず、例えば、ガラス、合成樹脂、ＥＰＤＭ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｄｉｅｎｅ Ｍｏｎｏｍｅｒ）等の合成ゴム、天然ゴム、セラミック、ステンレス鋼等から成形される。合成樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニル、シリコン等を好ましく用いることができる。

図１に示す基材１に形成された各表面領域３ａは細胞接着性の表面である。ここで、細胞接着性の表面とは、例えば、培養液等の溶液中において、細胞が接着可能な特性を示す表面である。したがって、例えば、培養液中において、表面領域３ａに沈降した細胞は、その形状を、培養時間の経過に伴って、球形から比較的扁平な形状に変化させつつ、当該表面領域３ａに接着する。

具体的に、この表面領域３ａは、例えば、基材１そのものの表面が、培養液等の溶液中において、細胞が接着可能な荷電状態や親水性・疎水性を示す場合には、当該基材１そのものの表面を露出させた領域として形成できる。また、この表面領域３ａは、例えば、基材表面２の一部に、生体から取得され若しくは合成された細胞接着性物質又はこれらの誘導体が固定された領域として形成できる。

この細胞接着性物質としては、例えば、表面領域３ａで培養する細胞の細胞膜に存する細胞表面分子（例えば、インテグリンや糖鎖受容体等）のうち特定のものに対して結合し得る物質を用いることができる。具体的に、生体から取得された細胞接着性物質としては、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリックスを好ましく用いることができる。また、合成された細胞接着性物質としては、例えば、細胞接着性を示す特定のアミノ酸配列（例えば、アルギニン・グリシン・アスパラギン酸配列（いわゆるＲＧＤ配列）等）や特定の糖鎖配列（例えば、ガラクトース側鎖等）を有する化合物等を好ましく用いることができる。また、これら細胞接着性物質の誘導体としては、例えば、当該細胞接着性物質に任意の官能基や高分子鎖等を、所定の化学反応（例えば、カルボキシル基やアミノ基等の間の縮合反応）等によって結合させたものを好ましく用いることができる。

これら細胞接着性物質又はその誘導体は、例えば、当該細胞接着性物質又はその誘導体を含む水溶液を、基材表面２のうち各表面領域３ａを形成させる部分で乾燥させることにより、当該各部分に固定できる。また、これらの細胞接着性物質又はその誘導体は、例えば、当該細胞接着性物質又はその誘導体を含む水溶液中において、当該細胞接着性物質又はその誘導体が有する官能基と、基材表面２のうち各表面領域３ａを形成させる部分に露出している官能基と、を所定の化学反応（例えば、チオール基と金表面等との化学吸着反応や、カルボキシル基やアミノ基等の間の縮合反応）等によって結合させることにより、当該部分に固定できる。

また、図１に示す基材表面２のうち、複数の表面領域３ａ以外の部分は、細胞非接着性の周辺表面４である。すなわち、各表面領域３ａは、細胞非接着性の周辺表面４によって囲まれている。また、図２に示す基材１には所定の深さをもつ複数の有底孔（以下、「キャビティ１００」という）が規則的に配置するよう形成されており、各表面領域３ｂは、各キャビティ１００の底面として形成されている。そして、この図２に示す基材表面２は、その全体が細胞非接着性である。すなわち、基材表面２のうち、キャビティ１００が形成されている部分以外の部分である周辺表面４と、当該キャビティ１００内の表面領域３ｂと、はいずれも細胞非接着性の表面である。ここで、細胞非接着性の表面とは、例えば、培養液等の水溶液中において、細胞の接着に不適切な特性を示す表面である。したがって、例えば、培養液中において周辺表面４又は表面領域３ｂに沈降した細胞は、その形状を球状からほとんど変化させず、当該周辺表面４又は表面領域３ｂに実質的に接着できない。すなわち、周辺表面４又は表面領域３ｂに沈降した細胞は、当該周辺表面４又は表面領域３ｂに全く接着できずに培養液中で浮遊し、又はいったん接着したとしても、所定の培養時間経過後には培養液の流れ等によって容易に脱着する。

具体的に、この周辺表面４及び表面領域３ｂは、例えば、基材１そのものの表面が、培養液等の水溶液中において、細胞の接着に不適切な荷電状態や親水性・疎水性を示す場合には、当該基材１そのものの表面を露出させた領域として形成できる。また、この周辺表面４及び表面領域３ｂは、例えば、基材表面２の一部に、生体から取得され若しくは合成された細胞非接着性物質又はこれらの誘導体が固定された領域として形成することができる。

この細胞非接着性物質としては、例えば、表面領域３ａ，３ｂで培養する細胞の細胞膜に存する細胞表面分子に対して結合しない物質を用いることができる。具体的に、生体から取得された細胞非接着性物質としては、例えば、アルブミン等の高い親水性を示すたんぱく質等を好ましく用いることができる。また、合成された細胞非接着性物質としては、例えば、ポリエチレングリコール等の極めて高い親水性を示す高分子鎖を含む化合物や、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ｐｏｌｙ―ＨＥＭＡ（ポリヒドロキシエチルメタクリレート）、ＳＰＣ（セグメント化ポリウレタン）等を好ましく用いることができる。また、これら細胞非接着性物質の誘導体としては、例えば、当該細胞非接着性物質に任意の官能基や高分子鎖等を、所定の化学反応等によって結合させたものを好ましく用いることができる。

これら細胞非接着性物質又はその誘導体は、例えば、当該細胞非接着性物質又はその誘導体を含む水溶液を、図１に示す基材表面２のうち各表面領域３ａを囲む部分、又は図２に示す各表面領域３ｂ及び周辺表面４で乾燥させることにより、当該各表面領域３ａを囲む部分、又は当該各表面領域３ｂ及び周辺表面４に固定できる。また、これら細胞非接着性物質又はその誘導体は、例えば、当該細胞非接着性物質又はその誘導体を含む水溶液中において、当該細胞非接着性物質又はその誘導体が有する官能基と、基材表面２のうち各表面領域３ａを囲む部分、又は図２に示す各表面領域３ｂ及び周辺表面４に露出している官能基と、を所定の化学反応等によって結合させることにより、当該各表面領域３ａを囲む部分、又は当該各表面領域３ｂ及び周辺表面４に固定できる。

また、図２に示す基材１のキャビティ１００は、当該基材１の材質等に応じて選択される任意の加工方法を用いて、基材表面２の一部に形成することができる。具体的に、例えば、このキャビティ１００は、マシニングセンタ等を用いた穿孔加工、レーザー等を用いた光微細加工、エッチング加工、エンボス加工等により基材表面２に形成し、又は射出成形、プレス成形、ステレオリソグラフィー等による基材１の成形時に形成することができる。

このような加工方法により、キャビティ１００は、例えば、所定厚さの基材１の表面２に、当該基材１の厚さより小さい深さをもつ有底孔として形成することができる。また、このキャビティ１００は、例えば、基材１を貫通する穴を形成した後に、当該基材１の片面に他の部材を貼り合わせて底面とすることにより有底孔として形成することができる。このキャビティ１００の底面を形成するための部材としては、例えば、当該貫通孔を形成した基材１と同じ又は異なる材質の基板やフィルム等を用いることができる。

また、複数のキャビティ１００は、例えば、ＣＡＤ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｉｄｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ）プログラムにより加工位置を精密に制御するマシニングセンタ等を用いることにより、図２に示すように、基材１上に、円形の底面の中心間の距離が一定の間隔となるよう規則的に形成することができる。

また、図１に示す基材表面２は、各表面領域３ａと周辺表面４とを含むその全体が実質的に平坦な表面となっている。すなわち、各表面領域３ａ及び周辺表面４はそれぞれ実質的に平坦な表面であるとともに、基材表面２の全体が実質的に平坦な表面を構成するよう互いに連なっている。ここで、実質的に平坦な表面とは、例えば、当該表面の凹凸（例えば、各表面領域３ａと周辺表面４との段差）が細胞１個分の厚みより小さい程度に小さい表面をいう。また、図２に示す基材表面２のうち、各表面領域３ｂ及び周辺領域４もまたそれぞれ実質的に平坦な表面として形成されている。

また、各表面領域３ａ及び各表面領域３ｂの面積は、当該各表面領域３ａ及び各表面領域３ｂで培養する細胞のサイズがその種類や状態等によって異なるため一概には言えないが、例えば、３００〜１×１０^６μｍ^２の範囲であることが好ましく、特に５０００〜２×１０^５μｍ^２の範囲であることが好ましい。すなわち、図１及び図２に示す各表面領域３ａ及び各表面領域３ｂの直径は、当該各表面領域３ａ及び各表面領域３ｂで培養する細胞の直径の２〜５０倍程度の範囲であることが好ましく、特に５倍〜３０倍程度の範囲であることが好ましい。これは、細胞は各表面領域３ａ及び各表面領域３ｂ上で三次元的に集合して組織体を形成することから、当該各表面領域３ａ及び各表面領域３ｂの面積は、当該組織体に含まれる細胞の数を規定するためである。すなわち、各表面領域３ａ及び各表面領域３ｂの面積が３００μｍ^２又は細胞の直径の２倍より小さい場合には、例えば、組織体を形成するために必要な数の細胞が当該各表面領域３ａに接着できず、また、当該必要な数の細胞を各表面領域３ｂ上に保持できない。また、各表面領域３ａ及び各表面領域３ｂの面積が１×１０^６μｍ^２又は細胞の直径の５０倍より大きい場合には、当該各表面領域３ａ及び各表面領域３ｂで形成される組織体が大きくなりすぎるため、例えば、当該組織体の深部に含まれる細胞が、当該組織体外の培養液等から栄養や酸素を十分に受けることができずに死滅し、又はその機能を失ってしまうことがあるためである。

また、図２に示す基材１のキャビティ１００の深さは、用いる細胞の径の１〜１００倍程度の範囲であることが好ましく、特に２倍〜５０倍程度の範囲であることが好適である。これは、キャビティ１００の深さが上記下限値より小さい場合には、当該キャビティ１００内から細胞がこぼれることにより、細胞を表面領域３ｂ上に確実に保持することが困難となるためである。また、キャビティ１００の深さが上記上限値より大きい場合には、当該キャビティ１００内の表面領域３ｂ上で保持されている細胞に対する酸素や栄養分の供給が不十分となることがあるためである。

また、基材表面２は、本方法において組織体のサイズを制御するために必要な最低限の数の表面領域３ａ又は表面領域３ｂを有する領域セットを少なくとも１つ含んでいる。すなわち、この領域セットは、複数の表面領域３ａ又は表面領域３ｂの一部分である、１つの特定の表面領域（以下、「特定領域」という）と、当該特定領域の周辺に、当該特定領域に隣接して配置される複数の表面領域（以下、「隣接領域」という）と、を有する。領域セットに含まれる複数の隣接領域は、その各々の重心点（円形の隣接領域における円の中心点、四角形の隣接領域における対角線の交点等）から、当該領域セットに含まれる特定領域の重心点までの距離（以下、「重心間隔」という）が互いに等しくなるよう配置されている。

ここで、本方法に特徴的なことの一つは、準備工程で準備する基材表面２に含まれる領域セットの重心間隔を変化させることによって、培養工程で特定領域に形成される、増殖性の細胞を含む三次元組織体のサイズを、当該重心間隔に応じて制御できる点である。すなわち、例えば、準備工程において所定の重心間隔の領域セットを含む基材表面２を準備することによって、培養工程において、少なくとも当該領域セットの特定領域に、当該重心間隔によって規定される所定のサイズの組織体を形成できる。

具体的に、例えば、準備工程において特定領域と各隣接領域とが第一の重心間隔で互いに離間して配置された領域セットを含む第一の基材表面を準備した場合には、培養工程において当該第一の重心間隔に応じた第一のサイズの組織体を形成でき、準備工程において特定領域と各隣接領域とが当該第一の重心間隔より小さい第二の重心間隔で互いに離間して配置された領域セットを含む第二の基材表面を準備した場合には、培養工程において、当該第二の重心間隔と当該第一の重心間隔との比率に応じた、当該第一のサイズより小さい第二のサイズの組織体を形成できる。したがって、例えば、準備工程において互いに重心間隔が一定の規則に従って段階的に変化する複数の基材表面を準備した場合には、培養工程において、当該複数の基材表面の複数の特定領域に、当該一定の規則に従って当該複数の基材表面間で段階的に変化するサイズの組織体を形成できる。ここで、重心間隔が一定の規則に従って変化する場合としては、例えば、１つの基材表面の重心間隔に対して、他の１又は複数の基材表面の重心間隔が、所定の長さずつ変化し、所定の倍率で変化し、又は所定の関数に従って変化する場合等を挙げることができる。

このように、本方法によれば、例えば、重心間隔によって規定される所望サイズの複数の組織体が規則的且つ高密度に配置された組織体アレイチップを得ることができる。また、本方法によれば、例えば、培養する細胞の種類ごとに、所望のサイズの組織体を形成するために設定すべき重心間隔をスクリーニングすることができる。

なお、特定領域の辺縁部と各隣接領域の辺縁部との最短距離（すなわち、例えば、円形状の表面領域３ａ及び表面領域３ｂについては、特定領域の円周部と各隣接領域の円周部との最短距離）は、当該特定領域及び各隣接領域で培養する細胞のサイズがその種類や状態等によって異なるため一概には言えないが、５０〜１０００μｍの範囲であることが好ましく、特に１００〜７００μｍの範囲であることが好ましい。これは、この最短距離が５０μｍより小さい場合には、例えば、特定領域に形成される組織体と隣接領域に形成される組織体との間で融合や架橋が起こり、当該複数の組織体が互いに接着した組織体が形成されることにより、組織体のサイズを厳密に制御できない場合があるためである。また、最短距離が１０００μｍより大きい場合には、特定領域に形成される組織体と隣接領域に形成される組織体との距離が大きいために、例えば、複数の組織体を高密度に配置した組織体アレイを得ることができない。

図３は、図１及び図２に示す基材表面２に形成された領域セット１０についての説明図である。この領域セット１０は、基材表面２に形成された複数の表面領域３ａ又は表面領域３ｂ（図１及び図２参照）のうちの１つである特定領域１１（図３においてハッチングを施して示す領域）と、当該複数の表面領域３ａ又は表面領域３ｂのうちの他の一部であって、当該特定領域１１を囲むように配置された６つの隣接領域１２と、を有している。特定領域１１及び各隣接領域１２は、互いに等しい直径Ｄ１の円形状である。そして、特定領域１１の中心点１１ｃと、各隣接領域１２の中心点１２ｃと、の距離（以下、「中心間隔」という）は、互いに等しい一定値Ｌ１となっている。また、特定領域１１は、その中心点１１ｃが、６つの隣接領域１２の各々の中心点１２ｃを結んで形成される正六角形Ｐ１の重心点と一致するよう、その全体が当該正六角形Ｐ１の中に位置するよう配置されている。また、この領域セット１０においては、正六角形Ｐ１の６つの辺の各々の長さＭ１は、中心間隔Ｌ１と同一になっている。

図４は、重心間隔が互いに異なる複数の領域セットの一例についての説明図である。図４Ａに示す第一領域セット２０は、互いに等しい一定の直径Ｄ２の円形状領域として形成された１つの特定領域２１及び６つの隣接領域２２を有している。特定領域２１と各隣接領域２２との中心間隔Ｌ２は、互いに等しくなっている。また、図４Ｂに示す第二領域セット３０は、第一領域セット２０に含まれる特定領域２１及び各隣接領域２２と同一の直径Ｄ２の円形状領域として形成された１つの特定領域３１及び６つの隣接領域３２を有し、当該特定領域３１と各隣接領域３２との中心間隔Ｌ３は、当該第一領域セット２０の中心間隔Ｌ２より大きくなっている。また、図４Ｃに示す第三領域セット４０は、第一領域セット２０に含まれる特定領域２１及び各隣接領域２２と同一の直径Ｄ２の円形状領域として形成された１つの特定領域４１及び６つの隣接領域４２を有し、当該特定領域４１と各隣接領域４２との中心間隔Ｌ４は、第二領域セット３０の中心間隔Ｌ３よりさらに大きくなっている。

準備工程においては、例えば、図４に示すような、互いに等しい直径Ｄ２の特定領域２１，３１，４１及び隣接領域２２，３２，４２を有し、各隣接領域２２，３２，４２の中心点２２ｃ，３２ｃ，４２ｃを結んで形成される正六角形Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４が互いに相似となる第一領域セット２０、第二領域セット３０、又は第三領域セット４０のうち、互いに異なるいずれか１つの領域セットが形成された複数の基材表面を準備する。すなわち、この準備工程においては、例えば、第一領域セット２０が少なくとも１つ形成された第一基材表面と、第二領域セット３０が少なくとも一つ形成された第二基材表面と、第三領域セット４０が少なくとも一つ形成された第三基材表面と、を準備する。なお、この場合の第一基材表面、第二基材表面、及び第三基材表面は、例えば、互いに別体に成形された３つの基材の各々の表面として準備されてもよいし、１つの基材の１つの表面のうち互いに異なる３つの部分として準備されてもよい。

なお、領域セットは、複数の表面領域のうちの１つを特定領域として着目することによって便宜的に特定される。したがって、ある領域セットの特定領域が、他の領域セットの複数の隣接領域のうちの１つである場合もある。図５は、基材表面２に形成された複数の表面領域３ｃのうち、複数の領域セットを含む一部分についての説明図である。図５Ａに示す領域セット５０は、複数の表面領域３ｃのうち、ハッチングを施して示す１つの表面領域５１を特定領域として着目するとともに、当該表面領域５１に隣接する６つの表面領域５２ａ，５２ｂ，５２ｃ，５２ｄ，５２ｅ，５２ｆを隣接領域として着目することにより特定される。一方、図５Ｂに示すように、複数の表面領域３ｃのうち、図５Ａに示す領域セット５０に含まれる６つの隣接領域５２ａ，５２ｂ，５２ｃ，５２ｄ，５２ｅ，５２ｆのうち、黒塗りで示す１つの表面領域５２ａを特定領域として着目した場合には、図５Ａに示す領域セットの特定領域５１を６つの隣接領域のうちの１つとして含む他の領域セット５５が特定される。

また、領域セットに含まれる隣接領域の数や特定領域と隣接領域との位置関係は図１〜図５に示すものに限られない。図６は、領域セットの他の例についての説明図である。図６に示す領域セット６０は、互いに等しい直径Ｄ６の円形状に形成された１つの特定領域６１（図６においてハッチングを施して示す領域）と、当該特定領域６１の周辺に配置された３つの隣接領域６２と、を有し、当該特定領域６１と当該各隣接領域６２との中心間隔Ｌ６は互いに等しくなっている。そして、特定領域６１は、その中心点６１ｃが、３つの隣接領域６２の各々の中心点６２ｃを結んで形成される正三角形Ｐ６の重心に一致するよう当該正三角形Ｐ６の中に配置されている。また、この領域セット６０において、正三角形Ｐ６の３つの辺の各々の長さＭ６は、中心間隔Ｌ６より大きくなっている。

また、図７は、領域セットのさらに他の例についての説明図である。図７Ａに示す領域セット７０は、互いに等しい直径Ｄ７の円形状に形成された１つの特定領域７１（図７Ａ及び図７Ｂにおいてハッチングを施して示す領域）と、当該特定領域７１の周辺に配置された４つの隣接領域７２と、を有し、当該特定領域７１と当該各隣接領域７２との中心間隔Ｌ７は互いに等しくなっている。そして、特定領域７１は、その中心点７１ｃが、４つの隣接領域７２の各々の中心点７２ｃを結んで形成される正方形Ｐ７の中に位置するよう当該四角形Ｐ７の中に配置されている。また、この領域セット７０において、正方形Ｐ７の４つの辺の各々の長さＭ７は、中心間隔Ｌ７より大きくなっている。また、この場合、準備工程においては、例えば、図７Ｂに示すように、その一部に図７Ａに示す領域セット７０を含むよう、縦横に一定の中心間隔Ｌ７で規則的に配置される複数の表面領域３ｄが形成された基材表面を準備する。

また、図８は、領域セットのさらに他の例についての説明図である。図８Ａに示す領域セット８０は、互いに等しい直径Ｄ８の円形状に形成された１つの特定領域８１（図８Ａ及び図８Ｂにおいてハッチングを施して示す領域）と、当該特定領域８１を挟むように配置された２つの隣接領域８２と、を有し、当該特定領域８１と当該各隣接領域８２との中心間隔Ｌ８は互いに等しくなっている。そして、特定領域８１は、その中心点８１ｃが、２つの隣接領域８２の各々の中心点８２ｃを結ぶ直線Ｎ８の上に位置するよう配置されている。すなわち、特定領域８１の中心点８１ｃは、直線Ｎ８の中点に位置している。また、この場合、準備工程においては、例えば、図８Ｂに示すように、その一部に図８Ａに示す領域セット８０を含むよう、複数の表面領域３ｅが一定の中心間隔Ｌ８で直列に配置されるとともに、当該複数の表面領域３ｅを含む列が、互いに平行に複数配置された基材表面を準備する。なお、図８Ｂにおいて、隣接する２つの列に含まれる表面領域３ｅの中心点８ｃ間の最短距離Ｑ８は、領域セット８０の中心間隔Ｌ８より大きくなっている。

また、図９は、領域セットのさらに他の例についての説明図である。図９Ａに示す領域セット９０は、互いに等しい直径Ｄ９の円形状に形成された１つの特定領域９１（図９Ａ及び図９Ｂにおいてハッチングを施して示す領域）と、当該特定領域９１の周辺に配置された３つの隣接領域９２と、を有し、当該特定領域９１と当該各隣接領域９２との中心間隔Ｌ９は互いに等しくなっている。そして、特定領域９１は、その中心点９１ｃが、３つの隣接領域９２の各々の中心点９２ｃを結んで形成される二等辺三角形Ｐ９の３つの辺のうち最も長い辺の中点と一致するよう、その半分が当該二等辺三角形Ｐ９の中に配置されている。また、この場合、準備工程においては、例えば、図９Ｂに示すように、その一部に図９Ａに示す領域セット９０を含むよう、複数の表面領域３ｆが縦横に一定の中心間隔Ｌ９で２列に配置されるとともに、当該２列の単位が、互いに平行に複数配置された基材表面を準備する。なお、図９Ｂにおいて、隣接する２つの２列単位に含まれる表面領域３ｆの中心点９ｃ間の最短距離Ｑ９は、領域セット９０の中心間隔Ｌ９より大きくなっている。

なお、各表面領域の形状は、上述のような円形状に限られず、例えば、楕円形状や多角形であってもよい。また、隣接領域の重心点を結んで形成される多角形は、正多角形に限られず、例えば、その他の多角形であってもよい。また、各表面領域が形成される基材は、平板に限られず、例えば、可撓性の高いフィルムや膜等であってもよい。また、細胞非接着性の周辺表面に囲まれた細胞接着性の表面領域は、図２に示すようなキャビティの底面の一部として形成されてもよい。すなわち、例えば、キャビティの円形底面の一部であって、その中央部分に細胞接着性の表面領域を形成するとともに、当該表面領域を囲む当該円形底面の他の一部又は残りの部分全体を細胞非接着性の周辺表面として形成することもできる。

また、細胞接着性の表面領域を含む基材表面は、図１に示すようにその全体が平坦なものに限られない。図１０は、細胞接着性の表面領域が形成された基材表面の他の例についての説明図である。図１０に示す基材１の表面２には、当該表面２に所定の高さをもって凸設された複数の円柱体１０１が規則的に配置され、当該複数の円柱体１０１の各々の上端面として各表面領域３ｇが形成されている。また、基材表面２のうち、各表面領域３ｇが形成された円柱体１０１以外の部分である周辺表面４は細胞非接着性としてもよい。なお、図１０に示す各表面領域３ｇ及び当該各表面領域３ｇを囲む周辺表面４はそれぞれ実質的に平坦な表面となっている。

次に、培養工程について説明する。この培養工程においては、基材表面のうち、各領域セットに含まれる特定領域及び各隣接領域で増殖性の細胞を培養する。ここで、培養する細胞としては、所定の培養条件下で、増殖性を有し、且つ細胞同士が三次元的に集合して立体的な組織体を形成できるものであれば、由来する動物種や臓器・組織の種類等を問わず任意の細胞を用いることができる。具体的に、この細胞としては、例えば、ヒト又はヒト以外の動物（例えば、サル、ブタ、イヌ、ラット、マウス等）由来の肝臓、膵臓、腎臓、神経、皮膚等から採取される初代細胞、未分化な幹細胞、胚由来のＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、樹立されている株化細胞、又はこれらに遺伝子操作等を施した細胞等であって、増殖可能な細胞を好ましく用いることができる。また、一種類の細胞を単独で用いることもできるし、二種類以上の細胞を任意の比率で混在させて用いることもできる。

また、細胞を培養する際に用いる培養液としては、当該細胞の生存状態や機能等を維持することができるよう、必要な塩類や栄養成分等を適切な濃度で含む水溶液であれば任意の組成のものを用いることができる。具体的に、例えば、この培養液としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）等の基礎培地に、増殖因子や抗生物質等を添加した培養培地や、いわゆる生理食塩水等を好ましく用いることができる。

この培養工程において、図１に示す表面領域３ａとして形成された特定領域及び各隣接領域に接着することにより保持された細胞、及び図２に示す表面領域３ｂとして形成された特定領域及び各隣接領域に接着することなく保持された細胞は、培養時間の経過に伴って、当該特定領域及び各隣接領域で次第に重なり合い、三次元的に集合して、立体的な組織体を形成する。すなわち、細胞接着性の表面領域３ａに係る特定領域及び各隣接領域に接着した細胞は、例えば、まず当該特定領域及び当該各隣接領域で二次元的に増殖し、その後、さらに互いに積み重なるように三次元的に増殖することにより、所定の厚みをもった組織体を形成する。また、細胞非接着性の表面領域３ｂに係る特定領域及び各隣接領域上に保持された細胞は、キャビティ１００内の溶液中で互いに三次元的に集合しつつ、当該溶液中で浮遊状態を維持したまま増殖することにより、所定の厚みをもった三次元組織体を形成する。

この特定領域及び各隣接領域で形成される組織体のサイズは、当該組織体に含まれる細胞が増殖することによって、培養時間の経過に伴い増加し得る。しかしながら、本方法においては、少なくとも特定領域に形成された組織体のサイズは、当該特定領域と各隣接領域との重心間隔に応じた一定値に維持される。すなわち、例えば、培養工程において特定領域で形成される組織体のサイズは、培養開始後、所定の期間内は次第に増加するが、当該特定領域と各隣接領域との重心間隔によって規定される所定値に到達した後は、その増加が制限されて、その後の培養期間を通じて当該所定値に維持される。

したがって、例えば、準備工程において、重心間隔が第一の値である領域セットが形成された第一の基材表面と、重心間隔が当該第一の値の所定倍である第二の基材表面と、を準備した場合には、培養工程において、第二の基材表面の特定領域には、第一の基材表面の特定領域に形成される組織体のサイズの当該所定倍のサイズの組織体を形成できる。具体的に、例えば、準備工程において、図４Ａに示す第一の領域セット２０が形成された第一の基材表面と、図４Ｂに示す第二の領域セット３０が形成された第二の基材表面と、を準備した場合には、培養工程において、当該第二の領域セット３０に含まれる第二の特定領域３１に形成される組織体のサイズの、当該第一の領域セット２０に含まれる第一の特定領域２１に形成される組織体のサイズに対する比率は、当該第二の領域セット３０の重心間隔Ｌ３の、当該第一の領域セット２０の重心間隔Ｌ２に対する比率に略等しくなる。

なお、組織体のサイズとは、例えば、当該組織体の外形を基材表面に投影した場合の形状の代表長さや、基材表面における組織体の厚みである。すなわち、例えば、組織体が略球形状である場合（組織体が細胞接着性の表面領域３ａに接着したドーム状又は略球形状である場合、組織体が細胞非接着性の表面領域３ｂで培養液中に浮遊した略球形状である場合を含む）には、当該組織体のサイズは、当該組織体の外形を基材表面に投影した円形状の直径である。このような略球形状の組織体は、表面領域３ａ，３ｂの形状に関わらず形成できるが、円形状又は多角形状の表面領域３ａ，３ｂで好ましく形成でき、特に円形状の表面領域３ａ，３ｂで好ましく形成できる。また、例えば、組織体の外形を基材表面に投影した形状が楕円形である場合には、当該組織体のサイズは、当該楕円形の長軸又は短軸である。また、例えば、組織体が基材表面に沿ってひも状に延びる場合には、当該ひも状の組織体のサイズは、その長軸方向の長さである。また、例えば、組織体が半球形状等のドーム状である場合には、当該組織体のサイズは、当該組織体の外形を基材表面に投影した円形状の直径又は当該基材表面に盛り上がったドーム形状の厚みである。

また、本方法は、準備工程で準備する基材表面の重心間隔と、培養工程で形成される組織体のサイズと、の相関関係を示す検量データを取得する工程（以下、「データ取得工程」という）を含むこととしてもよい。このデータ取得工程においては、まず培養工程で形成された組織体のサイズを測定する。すなわち、例えば、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡等を用いて、基材表面で形成された組織体を撮影した画像を取得し、当該画像を所定の画像解析ソフトウェアを備えたコンピュータ上で解析することにより、当該組織体のサイズを定量的に測定する。

そして、このデータ取得工程においては、測定された組織体のサイズと、当該組織体が形成された特定領域と各隣接領域との重心間隔と、を関連付けた検量データを生成する。すなわち、例えば、図４Ａに示す第一の特定領域２１で第一の直径の球状組織体が形成され、図４Ｂに示す第二の特定領域３１では当該第一の直径より大きい第二の直径の球状組織体が形成された場合には、当該第一の直径と、当該第一の特定領域２１に係る第一の重心間隔Ｌ２と、を関連付けるとともに、当該第二の直径と、当該第二の特定領域３１に係る第二の重心間隔Ｌ３と、を関連付ける。

この検量データは、例えば、所定のサイズの組織体を形成するために設定すべき重心間隔を規定するデータである。すなわち、この検量データは、例えば、組織体のサイズと、当該サイズの組織体を形成するための重心間隔と、を互いに対応付けたデータテーブルや関数等である。

また、本方法は、検量データ取得工程において取得された検量データに基づいて、所望のサイズの組織体を形成させるための重心間隔を決定する工程（以下、「決定工程」という）を含むこととしてもよい。この決定工程においては、例えば、既に取得されている検量データによって規定される組織体のサイズと重心間隔との相関関係から、所望のサイズに関連付けられている重心間隔を決定する。すなわち、例えば、検量データにおいて、図４Ａに示す第一の特定領域２１に係る第一の重心間隔Ｌ２と、当該第一の特定領域２１で形成される組織体のサイズである第一のサイズと、が関連付けられている場合であって、当該第一のサイズの組織体を形成したい場合には、当該検量データに基づいて、準備工程において準備する基材表面の重心間隔を当該第一の重心間隔Ｌ２に決定する。この場合、準備工程において、各隣接領域との重心間隔が決定工程で決定された第一の重心間隔Ｌ２である特定領域を含む領域セットが複数形成された基材表面を準備する。そして、培養工程において、特定領域及び各隣接領域のそれぞれで増殖性の細胞を培養することによって、当該特定領域に、そのサイズが第一のサイズに制御された複数の組織体を形成できる。

また、例えば、組織体のサイズと重心間隔との比例関係を規定する検量データが取得されている場合には、決定工程において、当該比例関係を規定する関係式に基づいて、所望のサイズに対応する重心間隔を決定できる。また、所望のサイズの組織体を形成するための重心間隔が、既に取得されている検量データに基づいて決定できない場合には、例えば、上述のように、重心間隔が互いに異なる複数の領域セットの各特定領域で組織体を形成させることにより、当該所望のサイズの組織体を形成するための重心間隔をスクリーニングする。そして、決定工程では、このスクリーニングにおけるデータ取得工程において取得された検量データに基づいて、所望のサイズの組織体が形成された領域セットの重心間隔を当該所望のサイズに対応する重心間隔として決定する。

なお、本方法においては、例えば、重心間隔が互いに異なる複数の基材表面について一度に各工程を実施してもよいし、又は、重心間隔が互いに異なる複数の基材表面のうち、各重心間隔の基材表面について各工程を繰り返してもよい。すなわち、例えば、第一の重心間隔の第一の基材表面を準備して、当該第一の基材表面で組織体を形成させる第一のサイクルを実施した後、当該第一の重心間隔とは異なる第二の重心間隔の第二の基材表面を準備して、当該第二の基材表面で組織体を形成させる第二のサイクルをさらに実施することとしてもよい。

また、本実施形態に係る組織体形成キット（以下、「本キット」という）は、重心間隔が第一の距離となるよう特定領域及び複数の隣接領域が形成された第一の基材と、重心間隔が当該第一の距離と異なる第二の距離となるよう特定領域及び複数の隣接領域が形成された第二の基材と、を含む。すなわち、本キットは、重心間隔が互いに異なる複数の領域セットのうち、互いに異なるいずれか１つの領域セットが形成された複数の基材表面を含む。具体的に、例えば、本キットは、図４Ａに示す第一の領域セット２０が形成された第一の基材表面と、図４Ｂに示す第二の領域セット３０が形成された第二の基材表面と、図４Ｃに示す第三の領域セット４０が形成された第三の基材表面と、を含む。

本キットは、領域セットの重心間隔が互いに異なる複数の基材を、一つの基材のうち互いに異なる部分として含むこととしてもよい。すなわち、本キットに含まれる、領域セットの重心間隔が互いに異なる複数の基材表面の各々は、一つの基材の表面のうち、互いに異なる部分であってもよい。具体的に、例えば、本キットに含まれる基材の表面の一部には、図４Ａに示す第一の領域セット２０が少なくとも一つ形成され、当該表面の他の一部には、図４Ｂに示す第二の領域セット３０が少なくとも一つ形成され、当該表面のさらに他の一部には、図４Ｃに示す第三の領域セット４０が少なくとも一つ形成される。なお、本キットは、このように重心間隔の互いに異なる複数の領域セットが互いに異なる表面部分に形成された基材を、複数含むこととしてもよい。

また、本キットに含まれる、形成されている領域セットの重心間隔が互いに異なる複数の基材表面の各々は、互いに別体に成形された複数の基材の各々の表面であってもよい。すなわち、この場合、例えば、本キットは、図４Ａに示す第一の領域セット２０が少なくとも一つ形成された表面を有する第一の基材と、当該第一の基材とは別体に成形され、図４Ｂに示す第二の領域セット３０が少なくとも一つ形成された表面を有する第二の基材と、当該第一の基材及び当該第二の基材とは別体に成形され、図４Ｃに示す第三の領域セット４０が少なくとも一つ形成された表面を有する第三の基材と、を含むこととなる。

そして、本キットに含まれる複数の基材表面に形成された特定領域及び各隣接領域において増殖性の細胞を培養することによって、当該各基材表面の特定領域に、当該各基材表面の重心間隔によって規定されるサイズの組織体を形成させることができる。すなわち、上述のように、例えば、本キットが、重心間隔が複数の基材表面間で規則的に変化するよう、当該複数の基材表面を含む場合には、当該複数の基材表面の各々の特定領域に形成される組織体のサイズは、当該複数の基材表面間で、当該重心間隔に応じて規則的に変化することとなる。具体的に、例えば、本キットが、図４Ａに示す第一の領域セット２０が形成された第一の基材表面と、図４Ｂに示す第二の領域セット３０が形成された第二の基材表面と、図４Ｃに示す第三の領域セット４０が形成された第三の基材表面と、を含み、当該第一の領域セット２０の中心間隔Ｌ２、当該第二の領域セット３０の中心間隔Ｌ３、当該第三の領域セット４０の中心間隔Ｌ４、が一定の割合で順次増加する場合には、当該第一の領域セット２０に形成される第一の組織体、当該第二の領域セット３０で形成される第二の組織体、当該第三の領域セット４０で形成される第三の組織体、のサイズもまた、当該一定の割合で順次増加するものとすることができる。したがって、本キットによれば、例えば、各基材表面に、その重心間隔に応じて制御されたサイズの組織体が規則的且つ高密度に配置された組織体アレイチップを得ることができる。そして、このような組織体アレイチップを用いることにより、例えば、細胞の薬剤に対する応答性（感受性、毒性等）と、当該細胞から形成された組織体のサイズと、の相関関係を簡便且つ正確に検討することができる。具体的に、例えば、本キットの基材上に、癌由来細胞からなり、重心間隔に応じてサイズが一定の割合で変化する複数の組織を形成させ、抗癌剤を含む培養液中における当該組織の応答性（各組織に含まれる細胞の増殖速度、生存率、形態の変化等）を測定することにより、生体における腫瘍塊のサイズと、当該抗癌剤の薬効と、の相関関係を予測評価することができる。また、本キットによれば、所望のサイズの組織体を形成するための重心間隔を簡便且つ正確にスクリーニングできる。また、本キットに含まれる基材が細胞接着性の表面領域を有する場合には、各表面領域で形成された組織体を当該各表面領域に接着させた状態で保持することができる。また、本キットに含まれる基材が細胞非接着性の表面領域を有する場合には、各表面領域で形成された組織体は溶液中に浮遊するため、容易に回収することができる。

［実施例１］
次に、本方法を用いて組織体を形成した第一の実施例について説明する。この実施例１では、ガラス製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ２００μｍ）を基材として用い、図１に示すような基材表面２を作製した。すなわち、図３に示すような、特定領域の中心点の位置が、６つの隣接領域の中心点を結んで形成される正六角形の重心点の位置と一致する領域セット（以下、「六角セット」という）が複数形成された基材表面と、図７に示すような、特定領域の中心点の位置が、４つの隣接領域の中心点を結んで形成される正方形の重心点の位置と一致する領域セット（以下、「四角セット」という）が複数形成された基材表面と、を作製した。

具体的に、まず、この基材の表面に、スパッタリング装置（Ｅ―１０３０、日立株式会社）を用いて、厚さ９ｎｍのプラチナ（Ｐｔ）の薄膜を形成した。一方、直径が１００μｍであって、長さが２００μｍの円筒状突起を複数有するポリジメチルシロキサン（Ｐｏｌｙ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）製のスタンプをモールド成形により作製した。すなわち、１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲に、六角セットの各表面領域の位置に対応して、その先端の直径１００μｍの円形断面の中心点間の距離が、それぞれ１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、５００μｍ、又は６００μｍのいずれかとなるよう、複数の円筒状突起が形成された８種類のスタンプと、四角セットの各表面領域の位置に対応して、その先端の直径１００μｍの円形断面の中心点間の距離が４００μｍとなるよう、複数の円筒状突起が形成されたスタンプと、を作製した。

そして、各スタンプを用いたマイクロコンタクトプリンティングにより、次のようにして、複数種類の基材表面を作製した。すなわち、各表面領域に固定する細胞接着性物質として準備したコラーゲン（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ、新田ゼラチン株式会社）を１．５ｍｇ/ｍＬの濃度で含むコラーゲン溶液を調製し、上記作製した各スタンプの各円筒状突起の先端を当該コラーゲン溶液に浸すことにより、当該各円筒状突起の円形先端面に当該コラーゲン溶液を塗布した。そして、各スタンプの各円筒状突起の先端を、上記プラチナが蒸着された基材表面に押し当てることにより、当該各円筒状突起の先端に塗布されていたコラーゲン溶液を、当該基材表面に塗布した。さらに、この基材表面に塗布したコラーゲン溶液を窒素雰囲気下において乾燥させることにより、スタンプの各円筒状突起の先端に対応した位置に、コラーゲンが固定された表面領域を形成した。

また、基材表面のうち、表面領域以外の部分には、次のようにして細胞非接着性物質を固定した。すなわち、各表面領域を囲む表面に固定する細胞非接着性物質として、分子量３００００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖とチオール基とを有する合成高分子（化学式：ＣＨ_３Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ-ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＨ、日本油脂株式会社）を準備した。そして、上述のように表面領域を形成した基材表面を、この細胞非接着性物質を５ｍＭの濃度で含むエタノール溶液中に浸漬し、窒素雰囲気下において当該細胞非接着性物質のチオール基と、基材表面に形成したプラチナ薄膜のうち露出している部分（すなわち、基材表面のうち表面領域以外の部分）と、の間に特異的な化学結合を形成させることにより、当該プラチナ薄膜表面に当該細胞非接着性物質を固定した。その後、窒素雰囲気下において、この細胞非接着性物質を固定した基材表面を十分に乾燥させ、次いで、当該基材表面を、７０％エタノール中に浸漬することにより、余剰の細胞非接着性物質を当該基材表面から除去するとともに、当該基材表面を滅菌した。

このようにして、基材表面のうち１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲内で、細胞非接着性表面の中に直径１００μｍの複数の表面領域が、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、５００μｍ又は６００μｍのいずれかの中心間隔で規則的に配置された六角セットを複数含む８種類の基材表面と、細胞非接着性表面の中に直径１００μｍの表面領域が中心間隔４００μｍで配置された四角セットを複数含む基材表面と、を作製した。

次に、上述のように作製した８種類の基材表面のうち各表面領域で、増殖性の細胞を培養した。この実施例１においては、増殖性の細胞として、ヒト肝臓癌由来の細胞株であるＨｅｐＧ２細胞（ＲＣＢ１６４８、理化学研究所セルバンク）を用いた。また、培養液としては、ウィリアムズＥ培地（Ｗｉｌｌｉａｍｓ‘ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、シグマ社）１０．８ｇ／Ｌに、５８．８ｍｇ／Ｌのペニシリン（明治製菓株式会社）、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン（明治製菓株式会社）、２．２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業株式会社）、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、インビトロジェン株式会社）、を加えた血清添加培養液を調製して用いた。

そして、ポリスチレン製の培養容器（直径３５ｍｍ、日本ベクトンディッキンソン株式会社）の底部に上記滅菌処理後の各基材を載置し、当該培養容器内の当該各基材の表面に、ＨｅｐＧ２細胞を２.５×１０^５個／ｍＬの密度となるように分散した培養液を２．０ｍＬ加えた。この培養容器内の各基材表面で、５％炭酸ガス、９５％空気の雰囲気下、３７℃にて、静置状態でＨｅｐＧ２細胞の培養を行った。培養開始から４時間経過後、各基材を新鮮培養液２.０ｍＬを含む新しい培養容器に移すことによって、基材表面に接着しなかった細胞を取り除いた。その後、培養容器内の培養液は、２日毎に新鮮な培養液に交換した。そして、培養開始後１、３、５、７、１０、１４、２１及び２８日目に、各基材表面の各表面領域に形成された組織体を位相差顕微鏡下で観察し、当該組織体の写真を撮影するとともに、当該顕微鏡写真に基づいて、各組織体の直径を測定することにより検量データを取得した。

図１１は、培養１４日目において、８種類の基材表面の各々の表面領域に形成された組織体の一部についての位相差顕微鏡写真である。図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ、図１１Ｆ、図１１Ｇ、及び図１１Ｈには、それぞれ、中心間隔が１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、５００μｍ及び６００μｍの基材表面において、直径１００μｍの特定領域で形成された組織体Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７及びＴ８を示す。図１１Ａ〜Ｈに示すように、各基材表面の各表面領域において、ドーム状又は略球形状の組織体が１つずつ形成された。各基材表面に形成された複数の組織体の直径は、互いに略等しかった。また、表面領域の直径が互いに等しく、中心間隔が互いに異なる８種類の基材表面では、当該中心間隔の減少に伴って、当該表面領域で形成される組織体の直径も減少した。すなわち、中心間隔を低減させることにより、組織体の直径の増加を抑制できた。このように、各中心間隔によって規定される均一な直径の複数の組織体が高密度且つ規則的に配置された８種類の組織体アレイが得られた。

図１２は、中心間隔が互いに異なる８種類の基材表面の各々の特定領域で形成された組織体の直径と、培養時間と、の関係を示すグラフである。図１２において、横軸は培養日数（日）、縦軸は組織体の直径（μｍ）をそれぞれ示す。また、黒塗り三角、白抜き三角、黒塗り四角、白抜き四角、黒塗り丸、白抜き丸、黒塗り菱形、及び白抜き菱形のシンボルは、それぞれ、中心間隔が１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、５００μｍ及び６００μｍの基材表面で形成された組織体についての実測値の平均値を示す。この図１２に示すように、８種類の中心間隔のいずれについても、組織体の直径は、培養７日目までは、培養日数の経過に伴って増加したが、培養１０日目にはそれぞれ中心間隔に応じた互いに異なる一定値に到達し、その後は増加が抑制されて、少なくとも培養２８日目まで当該一定値に維持できた。

図１３は、この実施例１のデータ取得工程において取得された、８種類の基材表面の各々の特定領域で形成された組織体の直径と中心間隔との相関関係を示す検量データの一例である。図１３において、横軸は組織体が形成された特定領域と各隣接領域との中心間隔（μｍ）、縦軸は組織体の直径（μｍ）をそれぞれ示す。また、各シンボルは実測値の平均値を示す。図１３に示すように、特定領域で形成される組織体の直径は、当該特定領域と各隣接領域との中心間隔に略比例していた。すなわち、中心間隔が少なくとも１５０μｍから６００μｍまでの範囲においては、特定領域で形成される組織体の直径は、１０８±１０μｍから２６７±２５μｍの範囲で当該中心間隔の増加に伴って直線的に増加した。このように、本方法によれば、中心間隔を変化させることによって、当該中心間隔の変化に比例して組織体の直径を増加させ又は減少させるよう、当該直径を制御することができた。

また、図１３に示す検量データにおける、中心間隔Ｘ（μｍ）と、組織体の直径Ｙ（μｍ）と、の相関関係を定式化すると、Ｙ＝０．３５５Ｘ＋６４．８９８（相関係数Ｒ^２＝０．９８３）と表された。したがって、例えば、決定工程において、この関係式のＹ値に、所望の組織体の直径を代入することにより、当該所望の直径の組織体を形成させるための中心間隔をＸ値として決定できる。すなわち、この場合、検量データの直線関係を内挿又は外挿することにより、任意の組織体の直径に関連付けられた中心間隔を決定できる。そして、この検量データに基づいて、所望の直径Ｙに対応して決定された中心間隔Ｘで配置された直径１００μｍの特定領域でＨｅｐＧ２細胞を培養することにより、当該特定領域に当該直径Ｙの球状組織体を形成できる。

図１４は、表面領域の直径が１００μｍであって中心間隔が４００μｍの六角セット又は四角セットが形成された基材表面で培養１４日目に形成された組織体の一例についての位相差顕微鏡写真である。図１４Ａ及び図１４Ｂは、それぞれ六角セットの表面領域で形成された複数の組織体Ｔ９及び四角セットの表面領域で形成された複数の組織体Ｔ１０を示す。図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように、六角セット及び四角セットのいずれの領域セットにおいても、互いに略等しい直径の略球状であって、規則的に配置された複数の組織体が形成された。

図１５は、表面領域の直径が１００μｍであって中心間隔が４００μｍの六角セット又は四角セットの特定領域で形成された組織体の直径と、培養時間と、の関係を示すグラフである。図１５において、横軸は培養日数（日）、縦軸は組織体の直径（μｍ）をそれぞれ示す。また、黒塗り丸及び白抜き丸のシンボルは、それぞれ、六角セットの特定領域で形成された組織体及び四角セットの特定領域で形成された組織体についての実測値の平均値を示す。この図１５に示すように、四角セットで形成された組織体の直径と、六角セットで形成された組織体の直径と、はいずれも培養７日目まで、培養日数の経過に伴って増加したが、培養１０日目には互いに略等しい一定値に収束し、その後は増加が抑制されて、少なくとも培養２８日目まで当該一定値に維持できた。すなわち、表面領域の中心間隔が互いに等しい六角セット及び四角セットにおいては、各領域セットに含まれる隣接領域の数及び特定領域と各隣接領域との位置関係の違いに関わらず、当該中心間隔によって規定される互いに略等しい直径の球状組織体を形成できた。

［実施例２］
次に、本方法において、中心間隔を一定とした場合には、各表面領域の面積を変化させても、形成される組織体のサイズを略一定に制御できることを確認した第二の実施例を示す。この実施例２においては、中心間隔が６００μｍであって、表面領域の直径が１００μｍ、２００μｍ、又は３００μｍのいずれかである３種類の基材表面を作製した。そして、これら３種類の基材表面の各々の表面領域でＨｅｐＧ２細胞を培養し、特定領域で形成された組織体の直径を測定した。なお、各基材表面の作製及び当該各基材表面の表面領域でのＨｅｐＧ２細胞の培養は、上述の第一の実施例の場合と同様に行った。

図１６は、３種類の基材表面の各々の表面領域において形成された組織体の一例についての位相差顕微鏡写真である。図１６Ａ及び図１６Ｂには直径１００μｍの表面領域で培養５日目及び１０日目に形成された略球形状の組織体Ｓ１，Ｓ２を示し、図１６Ｃ及び図１６Ｄには直径２００μｍの表面領域で培養５日目及び１０日目に形成された略球形状の組織体Ｓ３，Ｓ４を示し、図１６Ｅ及び図１６Ｆには直径３００μｍの表面領域で培養５日目及び１０日目に形成された略球形状の組織体Ｓ５，Ｓ６を示す。図１６Ａ，図１６Ｃ及び図１６Ｅに示すように、培養５日目においては、表面領域の直径の増加に伴って、形成される組織体Ｓ１，Ｓ３，Ｓ５の直径も増加した。これに対し、図１６Ｂ，図１６Ｄ及び図１６Ｆに示すように、培養１０日目においては、直径１００μｍの表面領域で形成された組織体Ｓ２、直径２００μｍの表面領域で形成された組織体Ｓ４、及び直径３００μｍの表面領域で形成された組織体Ｓ６、の直径は互いに略等しく制御された。

図１７は、直径が１００μｍ、２００μｍ、又は３００μｍの特定領域で形成された組織体の直径と、培養時間と、の関係を示すグラフである。図１７において、横軸は培養日数（日）、縦軸は組織体の直径（μｍ）をそれぞれ示す。また、丸形、菱形、及び四角形のシンボルは、それぞれ、直径が１００μｍ、２００μｍ、及び３００μｍの特定領域で形成された組織体についての実測値の平均値を示す。この図１７に示すように、直径が１００μｍ及び２００μｍの特定領域で形成された組織体の直径は、培養７日目までは培養時間の経過に伴って次第に増加し、培養１０日目には２５０μｍ〜３００μｍの範囲で略一定値に到達したが、その後は増加が抑制されて、少なくとも培養２８日目まで当該略一定値に維持された。これに対し、直径が３００μｍの特定領域で形成された組織体の直径は、２８日間の培養期間を通じてほとんど変化せず、略３００μｍに維持された。このように、中心間隔を互いに等しい６００μｍとした場合には、当該表面領域の直径が少なくとも１００μｍから３００μｍの範囲では、当該表面領域の直径の違いに関わらず、特定領域に形成される組織体の直径は培養１０日目以降、少なくとも培養２８日目まで互いに略等しい一定値に制御された。

［実施例３］
実施例３においては、上述の実施例１と同様に、細胞非接着性表面の中に直径１００μｍの複数の表面領域が、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、又は５００μｍのいずれかの中心間隔で規則的に配置された六角セットを複数含む４種類の基材表面を作製し、各基材表面の各表面領域で、増殖性の細胞として、ヒト子宮頚部癌由来の細胞株であるＨｅＬａ細胞（ＲＣＢ０００７、理化学研究所セルバンク）を培養した。すなわち、上述の実施例１と同様、底部に１つの基材（２４ｍｍ×２４ｍｍ）を載置した直径３５ｍｍの培養皿内に、ＨｅＬａ細胞を２.５×１０^５個／ｍＬの密度となるように分散した培養液を２．０ｍＬ加えることにより、培養を開始した。培養液としては、ＤＭＥＭ（インビトロジェン株式会社）１３．５ｇ／Ｌに、５８．８ｍｇ／Ｌのペニシリン（明治製菓株式会社）、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン（明治製菓株式会社）、２．２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業株式会社）、１０％のウシ胎児血清（インビトロジェン株式会社）を加えた血清添加培養液を用いた。

図１８は、培養７日目において、４種類の基材表面の各々の表面領域に形成された組織体の一部についての位相差顕微鏡写真である。図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ、及び図１８Ｄには、それぞれ、中心間隔が２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、及び５００μｍの基材表面において、直径１００μｍの特定領域で形成された組織体Ｔ２０、Ｔ２１、Ｔ２２、及びＴ２３を示す。図１８Ａ〜Ｄに示すように、各基材表面の各表面領域において、ドーム状又は略球形状の組織体が１つずつ形成された。そして、表面領域の中心間隔が互いに異なる４種類の基材表面のうち、中心間隔が小さい基材表面では、中心間隔が大きい基材表面に比べて、より小さい直径の組織体が形成された。

図１９は、この実施例３で取得された、４種類の基材表面の各々の特定領域で形成された組織体の直径と中心間隔との相関関係を示す検量データの一例である。図１９において、横軸は組織体が形成された特定領域と各隣接領域との中心間隔（μｍ）、縦軸は組織体の直径（μｍ）をそれぞれ示す。また、各シンボルは実測値の平均値を示す。図１９に示すように、特定領域で形成される組織体の直径は、当該特定領域と各隣接領域との中心間隔に略比例していた。すなわち、中心間隔が少なくとも２００μｍから５００μｍまでの範囲においては、特定領域で形成される組織体の直径は、１００±９μｍから１５４±１５μｍの範囲で当該中心間隔の増加に伴って直線的に増加した。また、図１９に示す検量データにおける、中心間隔Ｘ（μｍ）と、組織体の直径Ｙ（μｍ）と、の相関関係を定式化すると、Ｙ＝０．１７８Ｘ＋６７．９１４（相関係数Ｒ^２＝０．９７０）と表された。

［実施例４］
実施例４においては、上述の実施例３と同様に、表面領域の中心間隔が互いに異なる４種類の基材表面を作製し、各基材表面の各表面領域で、増殖性の細胞として、マウス胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）（１２９ＳＶ系統、大日本住友製薬株式会社）を培養した。すなわち、上述の実施例１と同様、底部に１つの基材を載置した直径３５ｍｍの培養皿内に、ＥＳ細胞を２.５×１０^５個／ｍＬの密度となるように分散した培養液を２．０ｍＬ加えることにより、培養を開始した。培養液としては、ノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ−ＤＭＥＭ ｍｅｄｉｕｍ、インビトロジェン株式会社）５００ｍＬに、２５０Ｕ／ｍＬの白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ（登録商標）、インビトロジェン株式会社）、１％の非必須アミノ酸（Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ：ＮＥＡＡ、大日本住友製薬株式会社）、２ｍＭのＬ−グルタミン（インビトロジェン株式会社）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（インビトロジェン株式会社）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（インビトロジェン株式会社）、３００μＭのモノチオグリセロール（Ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ、株式会社シグマ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（同仁化学研究所）、１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、大日本住友製薬株式会社）を加えた血清添加培養液を用いた。

図２０は、培養７日目において、４種類の基材表面の各々の表面領域に形成された組織体の一部についての位相差顕微鏡写真である。図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、及び図２０Ｄには、それぞれ、中心間隔が２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、及び５００μｍの基材表面において、直径１００μｍの特定領域で形成された組織体Ｔ３０、Ｔ３１、Ｔ３２、及びＴ３３を示す。図２０Ａ〜Ｄに示すように、各基材表面の各表面領域において、ドーム状又は略球形状の組織体が１つずつ形成された。そして、表面領域の中心間隔が互いに異なる４種類の基材表面のうち、中心間隔が小さい基材表面では、中心間隔が大きい基材表面に比べて、より小さい直径の組織体が形成された。

図２１は、この実施例４で取得された、４種類の基材表面の各々の特定領域で形成された組織体の直径と中心間隔との相関関係を示す検量データの一例である。図２１において、横軸は組織体が形成された特定領域と各隣接領域との中心間隔（μｍ）、縦軸は組織体の直径（μｍ）をそれぞれ示す。また、各シンボルは実測値の平均値を示す。図２１に示すように、特定領域で形成される組織体の直径は、当該特定領域と各隣接領域との中心間隔に略比例していた。すなわち、中心間隔が少なくとも２００μｍから５００μｍまでの範囲においては、特定領域で形成される組織体の直径は、１３５±１０μｍから２２８±１５μｍの範囲で当該中心間隔の増加に伴って直線的に増加した。また、図２１に示す検量データにおける、中心間隔Ｘ（μｍ）と、組織体の直径Ｙ（μｍ）と、の相関関係を定式化すると、Ｙ＝０．３１１Ｘ＋７５．５４４（相関係数Ｒ^２＝０．９９２）と表された。

［実施例５］
この実施例５では、ポリメチルメタクリレート（ＰｏｌｙＭｅｔｈｙｌ ＭｅｔｈＡｃｒｙｌａｔｅ：ＰＭＭＡ）製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ４００μｍ）を基材として用い、図２に示すような基材表面を作製した。すなわち、キャビティ１００の底面である表面領域３ｂからなる六角セットが複数形成された基材表面を作製した。

具体的に、このポリメチルメタクリレート平板の表面の一部に、１０ｍｍ角の矩形範囲にわたって、マシニングセンタ（卓上型ＮＣ微細加工機、株式会社ピーエムティー製）を用いた穿孔加工処理を施すことにより、直径３００μｍの円形状からなる底面が３３０μｍ、４４０μｍ、又は５５０μｍのいずれかの中心間隔で規則的に配置されるよう、深さ２００μｍのキャビティ１００を複数形成した。

次に、このキャビティ１００が形成された平板の全体（すなわち、図２に示す表面領域３ｂ及び周辺表面４を含む基材表面２の全体）に、上述の実施例１と同様にして、厚さ９ｎｍのプラチナ（Ｐｔ）の薄膜を形成した。そして、細胞非接着性物質として、上述の実施例１で用いた分子量３００００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖とチオール基とを有する合成高分子を５ｍＭの濃度で含むエタノール溶液中に、プラチナ薄膜が形成された平板の全体を浸漬した。そして、窒素雰囲気下において細胞非接着性物質のチオール基と、基材表面に形成したプラチナ薄膜表面（すなわち図２に示す表面領域３ｂ及び周辺表面４を含む基材表面２）と、の間に特異的な化学結合を形成させることにより、当該プラチナ薄膜表面に当該細胞非接着性物質を固定した。その後、窒素雰囲気下において、この細胞非接着性物質を固定した基材表面を十分に乾燥させ、次いで、当該基材表面を、７０％エタノール中に浸漬することにより、余剰の細胞非接着性物質を当該基材表面から除去するとともに、当該基材表面を滅菌した。

このようにして、基材表面のうち１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲内で、細胞非接着性表面の中に形成されたキャビティの底面として、直径３００μｍの複数の表面領域が、３３０μｍ、４４０μｍ、又は５５０μｍのいずれかの中心間隔で規則的に配置された六角セットを複数含む３種類の基材表面を作製し、上述の実施例１と同様に、各基材表面のうち各表面領域で、増殖性の細胞としてＨｅｐＧ２細胞を培養した。すなわち、基材表面のうち、キャビティが形成されている１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲あたり、１．０×１０^５個のＨｅｐＧ２細胞を播種することにより、培養を開始した。培養液は、上述の実施例１と同様のものを用いた。

図２２は、培養１０日目において、３種類の基材表面の各々の表面領域に形成された組織体の一部についての位相差顕微鏡写真である。図２２Ａ、図２２Ｂ、及び図２２Ｃには、それぞれ、中心間隔が３３０μｍ、４４０μｍ、及び５５０μｍの基材表面において、直径３００μｍの特定領域で形成された組織体Ｔ４０、Ｔ４１、及びＴ４２を示す。図２２Ａ〜Ｃに示すように、各基材表面の各キャビティ１００内において、略球形状の組織体が浮遊状態で１つずつ形成された。各基材表面に形成された複数の組織体の直径は、互いに略等しかった。また、表面領域の直径が互いに等しく、中心間隔が互いに異なる３種類の基材表面では、当該中心間隔の減少に伴って、当該表面領域で形成される組織体の直径も減少した。すなわち、中心間隔を低減させることにより、組織体の直径の増加を抑制できた。このように、各中心間隔によって規定される均一な直径の複数の組織体が高密度且つ規則的に配置された３種類の組織体アレイが得られた。

図２３は、この実施例５のデータ取得工程において取得された、３種類の基材表面の各々の特定領域で形成された組織体の直径と中心間隔との相関関係を示す検量データの一例である。図２３において、横軸は組織体が形成された特定領域と各隣接領域との中心間隔（μｍ）、縦軸は組織体の直径（μｍ）をそれぞれ示す。また、各シンボルは実測値の平均値を示す。図２３に示すように、特定領域で形成される組織体の直径は、当該特定領域と各隣接領域との中心間隔に略比例していた。すなわち、中心間隔が少なくとも３３０μｍから５５０μｍまでの範囲においては、特定領域で形成される組織体の直径は、１８３±６μｍから２３６±８μｍの範囲で当該中心間隔の増加に伴って直線的に増加した。このように、本方法によれば、中心間隔を変化させることによって、当該中心間隔の変化に比例して組織体の直径を増加させ又は減少させるよう、当該直径を制御することができた。

また、図２３に示す検量データにおける、中心間隔Ｘ（μｍ）と、組織体の直径Ｙ（μｍ）と、の相関関係を定式化すると、Ｙ＝０．２４３Ｘ＋１０５．０７（相関係数Ｒ^２＝０．９８０）と表された。したがって、例えば、決定工程において、この関係式のＹ値に、所望の組織体の直径を代入することにより、当該所望の直径の組織体を形成させるための中心間隔をＸ値として決定できる。すなわち、この場合、検量データの直線関係を内挿又は外挿することにより、任意の組織体の直径に関連付けられた中心間隔を決定できる。そして、この検量データに基づいて、所望の直径Ｙに対応して決定された中心間隔Ｘで配置された直径３００μｍの特定領域でＨｅｐＧ２細胞を培養することにより、当該特定領域に当該直径Ｙの球状組織体を形成できる。

［実施例６］
実施例６においては、上述の実施例５と同様に、キャビティの底面として直径３００μｍの複数の表面領域が、３３０μｍ、４４０μｍ、又は５５０μｍのいずれかの中心間隔で規則的に配置された六角セットを複数含む３種類の基材表面を作製し、各基材表面の各表面領域で、増殖性の細胞として、ラットランゲルハンス島腫瘍由来の細胞株であるＲＩＮ−５Ｆ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０５８、大日本住友製薬株式会社）を培養した。すなわち、上述の実施例５と同様に、基材表面のうち、キャビティが形成されている１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲あたり、１．０×１０^５個のＲＩＮ−５Ｆ細胞を播種することにより、培養を開始した。培養液としては、ＲＩＭＩ１６４０培地（インビトロジェン株式会社）５００ｍＬに、２ｍＭのＬ−グルタミン（インビトロジェン株式会社）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（インビトロジェン株式会社）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（インビトロジェン株式会社）、１０％のウシ胎児血清（インビトロジェン株式会社）を加えた血清添加培養液を用いた。

図２４は、培養１０日目において、３種類の基材表面の各々の表面領域に形成された組織体の一部についての位相差顕微鏡写真である。図２４Ａ、図２４Ｂ、及び図２４Ｃには、それぞれ、中心間隔が３３０μｍ、４４０μｍ、及び５５０μｍの基材表面において、直径３００μｍの特定領域で形成された組織体Ｔ５０、Ｔ５１、及びＴ５２を示す。図２４Ａ〜Ｃに示すように、各基材表面の各キャビティ１００内において、略球形状の組織体が浮遊状態で１つずつ形成された。そして、上述の実施例５と同様に、表面領域の中心間隔が小さい基材表面では、中心間隔が大きい基材表面に比べて、より小さい直径の組織体が形成された。

図２５は、この実施例６で取得された、３種類の基材表面の各々の特定領域で形成された組織体の直径と中心間隔との相関関係を示す検量データの一例である。図２５において、横軸は組織体が形成された特定領域と各隣接領域との中心間隔（μｍ）、縦軸は組織体の直径（μｍ）をそれぞれ示す。また、各シンボルは実測値の平均値を示す。図２５に示すように、特定領域で形成される組織体の直径は、当該特定領域と各隣接領域との中心間隔に略比例していた。すなわち、中心間隔が少なくとも３３０μｍから５５０μｍまでの範囲においては、特定領域で形成される組織体の直径は、１５２±９μｍから１９２±７μｍの範囲で当該中心間隔の増加に伴って直線的に増加した。また、図２５に示す検量データにおける、中心間隔Ｘ（μｍ）と、組織体の直径Ｙ（μｍ）と、の相関関係を定式化すると、Ｙ＝０．１８３Ｘ＋９２．９６６（相関係数Ｒ^２＝０．９８１）と表された。

［実施例７］
実施例７においては、上述の実施例５と同様に、キャビティの底面として直径３００μｍの複数の表面領域が、３３０μｍ、４４０μｍ、又は５５０μｍのいずれかの中心間隔で規則的に配置された六角セットを複数含む３種類の基材表面を作製し、各基材表面の各表面領域で、増殖性の細胞として、上述の実施例４で用いたものと同様のマウスＥＳ細胞（１２９ＳＶ系統、大日本住友製薬株式会社）を培養した。すなわち、上述の実施例５と同様に、基材表面のうち、キャビティが形成されている１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲あたり、１．０×１０^５個のマウスＥＳ細胞を播種することにより、培養を開始した。培養液は、上述の実施例４と同様のものを用いた。

図２６は、培養１０日目において、３種類の基材表面の各々の表面領域に形成された組織体の一部についての位相差顕微鏡写真である。図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃには、それぞれ、中心間隔が３３０μｍ、４４０μｍ、及び５５０μｍの基材表面において、直径３００μｍの特定領域で形成された組織体Ｔ６０、Ｔ６１、及びＴ６２を示す。図２６Ａ〜Ｃに示すように、各基材表面の各キャビティ１００内において、略球形状の組織体が浮遊状態で１つずつ形成された。そして、上述の実施例５と同様に、表面領域の中心間隔が小さい基材表面では、中心間隔が大きい基材表面に比べて、より小さい直径の組織体が形成された。

図２７は、この実施例７で取得された、３種類の基材表面の各々の特定領域で形成された組織体の直径と中心間隔との相関関係を示す検量データの一例である。図２７において、横軸は組織体が形成された特定領域と各隣接領域との中心間隔（μｍ）、縦軸は組織体の直径（μｍ）をそれぞれ示す。また、各シンボルは実測値の平均値を示す。図２７に示すように、特定領域で形成される組織体の直径は、当該特定領域と各隣接領域との中心間隔に略比例していた。すなわち、中心間隔が少なくとも３３０μｍから５５０μｍまでの範囲においては、特定領域で形成される組織体の直径は、１８２±１２μｍから２１５±１１μｍの範囲で当該中心間隔の増加に伴って直線的に増加した。また、図２５に示す検量データにおける、中心間隔Ｘ（μｍ）と、組織体の直径Ｙ（μｍ）と、の相関関係を定式化すると、Ｙ＝０．１５１Ｘ＋１３３．７（相関係数Ｒ^２＝０．９８６）と表された。

Claims (6)

1. 次の（ａ）〜（ｄ）：
   （ａ）第一の表面領域と、各々の重心点から前記第一の表面領域の重心点までの距離が互いに等しくなるよう前記第一の表面領域に隣接して配置された複数の第二の表面領域と、が形成されている；
   （ｂ）前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域は３００〜１×１０ ^６ μｍ ^２ の範囲内の同一の所定面積をもつ；
   （ｃ）前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域は細胞接着性である；
   （ｄ）前記第一の表面領域を囲む部分及び前記第二の表面領域を囲む部分は細胞非接着性である；
   を備えた基材を用いて増殖性の細胞を含む三次元組織体を形成する組織体形成方法であって、
   前記第一の表面領域と前記第二の表面領域との重心点間距離が互いに異なり、表面積が同一の複数の前記基材を用い前記基材あたり同数の前記細胞を播種し培養して前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域で前記細胞を含む三次元組織体を形成させる予備培養により得られた、前記第一の表面領域と前記第二の表面領域との重心点間距離と、前記第一の表面領域で形成された前記三次元組織体の収束したサイズと、の直線関係を示す検量データに基づいて、所望の収束したサイズの三次元組織体を形成させるための特定距離を決定する距離決定工程と、
   前記距離が前記特定距離である前記基材を少なくとも一つ準備する準備工程と、
   準備された前記基材の前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域で前記細胞を培養して前記細胞を含む三次元組織体を形成させるとともに、前記第一の表面領域に前記特定距離に応じた収束したサイズの三次元組織体を形成させる培養工程と、
   を含む
   ことを特徴とする組織体形成方法。
2. 次の（ａ）〜（ｄ）：
   （ａ）第一の表面領域と、各々の重心点から前記第一の表面領域の重心点までの距離が互いに等しくなるよう前記第一の表面領域に隣接して配置された複数の第二の表面領域と、が形成されている；
   （ｂ）前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域は３００〜１×１０ ^６ μｍ ^２ の範囲内の同一の所定面積をもつ；
   （ｃ）前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域は有底孔の底面であって細胞非接着性である；
   （ｄ）前記第一の表面領域を囲む部分及び前記第二の表面領域を囲む部分は細胞非接着性である；
   を備えた基材を用いて増殖性の細胞を含む三次元組織体を形成する組織体形成方法であって、
   前記第一の表面領域と前記第二の表面領域との重心点間距離が互いに異なり、表面積が同一の複数の前記基材を用い前記基材あたり同数の前記細胞を播種し培養して前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域で前記細胞を含む三次元組織体を形成させる予備培養により得られた、前記第一の表面領域と前記第二の表面領域との重心点間距離と、前記第一の表面領域で形成された前記三次元組織体の収束したサイズと、の直線関係を示す検量データに基づいて、所望の収束したサイズの三次元組織体を形成させるための特定距離を決定する距離決定工程と、
   前記距離が前記特定距離である前記基材を少なくとも一つ準備する準備工程と、
   準備された前記基材の前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域で前記細胞を培養して前記細胞を含む三次元組織体を形成させるとともに、前記第一の表面領域に前記特定距離に応じた収束したサイズの三次元組織体を形成させる培養工程と、
   を含む
   ことを特徴とする組織体形成方法。
3. 前記予備培養を、前記距離が互いに異なり表面積が同一の複数の前記基材を用い前記基材あたり同数の前記細胞を播種して実施して、前記検量データを生成する予備工程をさらに含み、
   前記距離決定工程では、前記予備工程で生成された前記検量データに基づいて、前記特定距離を決定する
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載の組織体形成方法。
4. 前記予備工程において、前記距離が前記複数の基材間で規則的に変化する前記複数の基材を用いて前記予備培養を実施し、前記複数の基材の前記第一の表面領域に、前記複数の基材間で前記距離に応じて収束したサイズが規則的に変化した三次元組織体を形成させる
   ことを特徴とする請求項３に記載の組織体形成方法。
5. 前記培養工程において、前記第一の表面領域に、前記特定距離に応じた収束した径の略球形状の三次元組織体を形成させる
   ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の組織体形成方法。
6. 前記第一の表面領域と前記複数の第二の表面領域とは、前記第一の表面領域の重心点が、前記複数の第二の表面領域の各々の重心点を結んで形成される多角形の中に位置するよう配置される
   ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の組織体形成方法。