JP4332653B2 - 組織体形成方法及び組織体形成キット - Google Patents
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次に、本方法を用いて組織体を形成した第一の実施例について説明する。この実施例1では、ガラス製の平板(24mm×24mm、厚さ200μm)を基材として用い、図1に示すような基材表面2を作製した。すなわち、図3に示すような、特定領域の中心点の位置が、6つの隣接領域の中心点を結んで形成される正六角形の重心点の位置と一致する領域セット(以下、「六角セット」という)が複数形成された基材表面と、図7に示すような、特定領域の中心点の位置が、4つの隣接領域の中心点を結んで形成される正方形の重心点の位置と一致する領域セット(以下、「四角セット」という)が複数形成された基材表面と、を作製した。
次に、本方法において、中心間隔を一定とした場合には、各表面領域の面積を変化させても、形成される組織体のサイズを略一定に制御できることを確認した第二の実施例を示す。この実施例2においては、中心間隔が600μmであって、表面領域の直径が100μm、200μm、又は300μmのいずれかである3種類の基材表面を作製した。そして、これら3種類の基材表面の各々の表面領域でHepG2細胞を培養し、特定領域で形成された組織体の直径を測定した。なお、各基材表面の作製及び当該各基材表面の表面領域でのHepG2細胞の培養は、上述の第一の実施例の場合と同様に行った。
実施例3においては、上述の実施例1と同様に、細胞非接着性表面の中に直径100μmの複数の表面領域が、200μm、300μm、400μm、又は500μmのいずれかの中心間隔で規則的に配置された六角セットを複数含む4種類の基材表面を作製し、各基材表面の各表面領域で、増殖性の細胞として、ヒト子宮頚部癌由来の細胞株であるHeLa細胞(RCB0007、理化学研究所セルバンク)を培養した。すなわち、上述の実施例1と同様、底部に1つの基材(24mm×24mm)を載置した直径35mmの培養皿内に、HeLa細胞を2.5×105個/mLの密度となるように分散した培養液を2.0mL加えることにより、培養を開始した。培養液としては、DMEM(インビトロジェン株式会社)13.5g/Lに、58.8mg/Lのペニシリン(明治製菓株式会社)、100mg/Lのストレプトマイシン(明治製菓株式会社)、2.2g/Lの炭酸水素ナトリウム(和光純薬工業株式会社)、10%のウシ胎児血清(インビトロジェン株式会社)を加えた血清添加培養液を用いた。
実施例4においては、上述の実施例3と同様に、表面領域の中心間隔が互いに異なる4種類の基材表面を作製し、各基材表面の各表面領域で、増殖性の細胞として、マウス胚性幹細胞(Embryonic Stem Cell:ES細胞)(129SV系統、大日本住友製薬株式会社)を培養した。すなわち、上述の実施例1と同様、底部に1つの基材を載置した直径35mmの培養皿内に、ES細胞を2.5×105個/mLの密度となるように分散した培養液を2.0mL加えることにより、培養を開始した。培養液としては、ノックアウトDMEM培地(Knock Out−DMEM medium、インビトロジェン株式会社)500mLに、250U/mLの白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor:LIF)(ESGRO(登録商標)、インビトロジェン株式会社)、1%の非必須アミノ酸(Non−Essential Amino Acids:NEAA、大日本住友製薬株式会社)、2mMのL−グルタミン(インビトロジェン株式会社)、100U/mLのペニシリン(インビトロジェン株式会社)、100μg/mLのストレプトマイシン(インビトロジェン株式会社)、300μMのモノチオグリセロール(Monothioglycerol、株式会社シグマ)、25mMのHEPES(同仁化学研究所)、15%のウシ胎児血清(FBS、大日本住友製薬株式会社)を加えた血清添加培養液を用いた。
この実施例5では、ポリメチルメタクリレート(PolyMethyl MethAcrylate:PMMA)製の平板(24mm×24mm、厚さ400μm)を基材として用い、図2に示すような基材表面を作製した。すなわち、キャビティ100の底面である表面領域3bからなる六角セットが複数形成された基材表面を作製した。
実施例6においては、上述の実施例5と同様に、キャビティの底面として直径300μmの複数の表面領域が、330μm、440μm、又は550μmのいずれかの中心間隔で規則的に配置された六角セットを複数含む3種類の基材表面を作製し、各基材表面の各表面領域で、増殖性の細胞として、ラットランゲルハンス島腫瘍由来の細胞株であるRIN−5F細胞(ATCC CRL−2058、大日本住友製薬株式会社)を培養した。すなわち、上述の実施例5と同様に、基材表面のうち、キャビティが形成されている10mm×10mmの矩形範囲あたり、1.0×105個のRIN−5F細胞を播種することにより、培養を開始した。培養液としては、RIMI1640培地(インビトロジェン株式会社)500mLに、2mMのL−グルタミン(インビトロジェン株式会社)、100U/mLのペニシリン(インビトロジェン株式会社)、100μg/mLのストレプトマイシン(インビトロジェン株式会社)、10%のウシ胎児血清(インビトロジェン株式会社)を加えた血清添加培養液を用いた。
実施例7においては、上述の実施例5と同様に、キャビティの底面として直径300μmの複数の表面領域が、330μm、440μm、又は550μmのいずれかの中心間隔で規則的に配置された六角セットを複数含む3種類の基材表面を作製し、各基材表面の各表面領域で、増殖性の細胞として、上述の実施例4で用いたものと同様のマウスES細胞(129SV系統、大日本住友製薬株式会社)を培養した。すなわち、上述の実施例5と同様に、基材表面のうち、キャビティが形成されている10mm×10mmの矩形範囲あたり、1.0×105個のマウスES細胞を播種することにより、培養を開始した。培養液は、上述の実施例4と同様のものを用いた。
Claims (6)
- 次の(a)〜(d):
(a)第一の表面領域と、各々の重心点から前記第一の表面領域の重心点までの距離が互いに等しくなるよう前記第一の表面領域に隣接して配置された複数の第二の表面領域と、が形成されている;
(b)前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域は300〜1×10 6 μm 2 の範囲内の同一の所定面積をもつ;
(c)前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域は細胞接着性である;
(d)前記第一の表面領域を囲む部分及び前記第二の表面領域を囲む部分は細胞非接着性である;
を備えた基材を用いて増殖性の細胞を含む三次元組織体を形成する組織体形成方法であって、
前記第一の表面領域と前記第二の表面領域との重心点間距離が互いに異なり、表面積が同一の複数の前記基材を用い前記基材あたり同数の前記細胞を播種し培養して前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域で前記細胞を含む三次元組織体を形成させる予備培養により得られた、前記第一の表面領域と前記第二の表面領域との重心点間距離と、前記第一の表面領域で形成された前記三次元組織体の収束したサイズと、の直線関係を示す検量データに基づいて、所望の収束したサイズの三次元組織体を形成させるための特定距離を決定する距離決定工程と、
前記距離が前記特定距離である前記基材を少なくとも一つ準備する準備工程と、
準備された前記基材の前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域で前記細胞を培養して前記細胞を含む三次元組織体を形成させるとともに、前記第一の表面領域に前記特定距離に応じた収束したサイズの三次元組織体を形成させる培養工程と、
を含む
ことを特徴とする組織体形成方法。 - 次の(a)〜(d):
(a)第一の表面領域と、各々の重心点から前記第一の表面領域の重心点までの距離が互いに等しくなるよう前記第一の表面領域に隣接して配置された複数の第二の表面領域と、が形成されている;
(b)前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域は300〜1×10 6 μm 2 の範囲内の同一の所定面積をもつ;
(c)前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域は有底孔の底面であって細胞非接着性である;
(d)前記第一の表面領域を囲む部分及び前記第二の表面領域を囲む部分は細胞非接着性である;
を備えた基材を用いて増殖性の細胞を含む三次元組織体を形成する組織体形成方法であって、
前記第一の表面領域と前記第二の表面領域との重心点間距離が互いに異なり、表面積が同一の複数の前記基材を用い前記基材あたり同数の前記細胞を播種し培養して前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域で前記細胞を含む三次元組織体を形成させる予備培養により得られた、前記第一の表面領域と前記第二の表面領域との重心点間距離と、前記第一の表面領域で形成された前記三次元組織体の収束したサイズと、の直線関係を示す検量データに基づいて、所望の収束したサイズの三次元組織体を形成させるための特定距離を決定する距離決定工程と、
前記距離が前記特定距離である前記基材を少なくとも一つ準備する準備工程と、
準備された前記基材の前記第一の表面領域及び前記第二の表面領域で前記細胞を培養して前記細胞を含む三次元組織体を形成させるとともに、前記第一の表面領域に前記特定距離に応じた収束したサイズの三次元組織体を形成させる培養工程と、
を含む
ことを特徴とする組織体形成方法。 - 前記予備培養を、前記距離が互いに異なり表面積が同一の複数の前記基材を用い前記基材あたり同数の前記細胞を播種して実施して、前記検量データを生成する予備工程をさらに含み、
前記距離決定工程では、前記予備工程で生成された前記検量データに基づいて、前記特定距離を決定する
ことを特徴とする請求項1又は2に記載の組織体形成方法。 - 前記予備工程において、前記距離が前記複数の基材間で規則的に変化する前記複数の基材を用いて前記予備培養を実施し、前記複数の基材の前記第一の表面領域に、前記複数の基材間で前記距離に応じて収束したサイズが規則的に変化した三次元組織体を形成させる
ことを特徴とする請求項3に記載の組織体形成方法。 - 前記培養工程において、前記第一の表面領域に、前記特定距離に応じた収束した径の略球形状の三次元組織体を形成させる
ことを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の組織体形成方法。 - 前記第一の表面領域と前記複数の第二の表面領域とは、前記第一の表面領域の重心点が、前記複数の第二の表面領域の各々の重心点を結んで形成される多角形の中に位置するよう配置される
ことを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載の組織体形成方法。
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