JP5234428B2 - 細胞集合体形成器具、細胞集合体培養器具、細胞集合体転写キット及び細胞集合体の培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞集合体形成器具、細胞集合体培養器具、細胞集合体転写キット及び細胞集合体の培養方法に関し、特に、浮遊する細胞集合体を細胞接着性表面に精密に配置するための器具及び方法に関する。

ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）やｉＰＳ細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）等の未分化な幹細胞を、肝細胞、心筋細胞、神経細胞等の様々な機能性の細胞に分化誘導することが試みられている。この分化誘導方法としては、まず、培養液中において、幹細胞から胚様体と呼ばれる細胞集合体を浮遊状態で形成させ、次に、当該胚様体を細胞接着性の表面に接着させ、その後、胚様体に分化誘導因子を添加するという方法が用いられている（例えば、非特許文献１、非特許文献２）。

このような分化誘導方法において、従来、浮遊した胚様体の細胞接着性表面への接着は、ハンギングドロップ法や、細胞非接着性の培養容器内で形成させた浮遊状態の胚様体を回収し、次いで当該胚様体を分散した培養液を、ピペット等の器具を用いて、細胞接着性の培養ディッシュに入れる方法により行われていた。

Exp. Physiol. 85, 645-651, 2000 Mol. Med. 6, 88-95, 2000

しかしながら、上記従来技術においては、浮遊する多数の胚様体をまとめて細胞接着性表面に移すため、例えば、浮遊状態の複数の胚様体が培養液中で互いに接着して融合するといった問題や、当該細胞接着性表面上に複数の胚様体が不均一な分布で接着するという問題があった。

本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、浮遊する細胞集合体を細胞接着性表面に精密に配置することができる細胞集合体形成器具、細胞集合体培養器具、細胞集合体転写キット及び細胞集合体の培養方法を提供することをその目的の一つとする。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る細胞集合体形成器具は、貫通穴が形成された第一基材と、前記第一基材の一方側の表面に剥離可能に接着されて前記貫通穴の前記一方側を覆う第二基材と、前記貫通穴の前記一方側を前記第二基材で覆うことにより形成された細胞非接着性のウェルと、を有することを特徴とする。本発明によれば、浮遊する細胞集合体を細胞接着性表面に精密に配置することができる細胞集合体形成器具を提供することができる。

また、前記ウェルの底面の面積は、１×１０^２〜２×１０^６μｍ^２の範囲であることとしてもよい。こうすれば、適切なサイズの細胞集合体を効率よく形成することができる。また、前記ウェルは、その底面の面積よりも前記第一基材の他方側の表面における開口の面積が小さくなるテーパ形状に形成されていることとしてもよい。こうすれば、細胞集合体を転写する位置をより精密に制御することができる。また、前記細胞集合体形成器具は、細胞接着性表面を有する培養器具と組み合わせて使用される細胞集合体形成器具であって、前記第一基材の他方側の表面を前記細胞接着性表面に当接させた状態で前記培養器具と接触して互いの相対的な位置を固定する位置決め構造を有することとしてもよい。こうすれば、細胞集合体を転写する位置をより精密に制御することができる。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る細胞集合体転写キットは、上記いずれかの細胞集合体形成器具と、前記細胞集合体形成器具の前記第一基材の他方側の表面を当接させる細胞接着性表面を有する培養器具と、を含むことを特徴とする。本発明によれば、浮遊する細胞集合体を細胞接着性表面に精密に配置することができる細胞集合体転写キットを提供することができる。

また、前記細胞集合体形成器具及び前記培養器具の少なくとも一方は、前記第一基材の前記他方側の表面を前記細胞接着性表面に当接させた状態で他方と接触して互いの相対的な位置を固定する位置決め構造を有することとしてもよい。こうすれば、細胞集合体を転写する位置をより精密に制御することができる。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る細胞集合体培養器具は、上記いずれかの細胞集合体形成器具の前記第一基材の他方側の表面を当接させる細胞接着性表面と、前記第一基材の他方側の表面を前記細胞接着性表面に当接させた状態で前記細胞集合体形成器具と接触して互いの相対的な位置を固定する位置決め構造と、を有することを特徴とする。本発明によれば、浮遊する細胞集合体を細胞接着性表面に精密に配置することができる細胞集合体培養器具を提供することができる。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る細胞集合体の培養方法は、上記いずれかの細胞集合体形成器具の前記ウェル内で浮遊状態の細胞集合体を形成する集合体形成工程と、前記細胞集合体形成器具の前記第一基材の他方側の表面を所定の細胞接着性表面に当接させて、前記ウェル内の前記細胞集合体を前記細胞接着性表面上に沈降させるとともに前記第一基材から前記第二基材を剥離する転写工程と、前記細胞接着性表面に接着した前記細胞集合体を培養する集合体培養工程と、を含むことを特徴とする。本発明によれば、浮遊する細胞集合体を細胞接着性表面に精密に配置することができる細胞集合体の培養方法を提供することができる。

本発明によれば、浮遊する細胞集合体を細胞接着性表面に精密に配置することができる細胞集合体形成器具、細胞集合体培養器具、細胞集合体転写キット及び細胞集合体の培養方法を提供することができる。

本発明の一実施形態に係る細胞集合体形成器具の一例を構成する第一基材及び第二基材を示す斜視図である。 図１に示すＩＩ−ＩＩ線を通る面で切断した第一基材及び第二基材の断面図である。 本発明の一実施形態に係る細胞集合体形成器具の一例を示す斜視図である。 図３に示すＩＶ−ＩＶ線を通る面で切断した細胞集合体形成器具の断面図である。 図３に示す細胞集合体形成器具を第二基材側から見た斜視図である。 図５に示す細胞集合体形成器具の第二基材を第一基材から剥離する様子を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係る細胞集合体形成器具の他の例を構成する第一基材を示す断面図である。 本発明の一実施形態に係る細胞集合体形成器具の他の例を示す断面図である。 本発明の一実施形態に係る細胞集合体の培養方法の一例に含まれる主な工程を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る細胞集合体形成器具を培養容器内で培養液中に浸漬して培養を行う様子を示す斜視図である。 図１０に示すＸＩ−ＸＩ線を通る面で切断した細胞集合体形成器具及び培養容器の断面図である。 図８に示す細胞集合体形成器具及び培養容器の断面図である。 本発明の一実施形態に係る位置決め構造を有する細胞集合体形成器具の一例を示す斜視図である。 図１３に示す細胞集合体形成器具と位置決め構造を有する細胞集合体培養器具の一例を示す斜視図である。 図１４に示す細胞集合体形成器具を細胞集合体培養器具に当接させた様子を示す斜視図である。 図１４に示す細胞集合体培養器具で細胞集合体を培養する様子を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係る位置決め構造を有する細胞集合体培養器具の一例を示す斜視図である。 図１７に示す細胞集合体培養器具に細胞集合体形成器具を当接させた様子を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係る細胞集合体形成器具及びマウスＥＳ細胞を用いて細胞集合体の形成及び転写を行った実施例で撮影した顕微鏡写真の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る細胞集合体形成器具及び初代ラット肝細胞を用いて細胞集合体の形成及び転写を行った実施例で撮影した顕微鏡写真の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る細胞集合体形成器具及びＨｅｐＧ２細胞を用いて細胞集合体の形成及び転写を行った実施例で撮影した顕微鏡写真の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る細胞集合体形成器具及びＨｅｐＧ２細胞を用いて細胞集合体の形成及び転写を行った実施例で撮影した顕微鏡写真の他の例を示す説明図である。

以下に、本発明の一実施形態に係る細胞集合体形成器具、細胞集合体培養器具、細胞集合体転写キット及び細胞集合体の培養方法について、図面を参照しながら説明する。

図１は、本実施形態に係る細胞集合体形成器具（以下、「形成器具１」という。）の一例を構成する第一基材１０及び第二基材２０を示す斜視図である。図２は、図１に示すＩＩ−ＩＩ線を通る面で切断した第一基材１０及び第二基材２０の断面図である。図３は、図１及び図２に示す第一基材１０及び第二基材２０を有する形成器具１の斜視図である。図４は、図３に示すＩＶ−ＩＶ線を通る面で切断した形成器具１の断面図である。図５は、図３に示す形成器具１を第二基材２０側から見た斜視図である。図６は、図５に示す形成器具１の第二基材２０を第一基材１０から剥離する様子を示す斜視図である。

図１〜図６に示すように、形成器具１は、第一基材１０及び第二基材２０を有している。本実施形態において、第一基材１０及び第二基材２０は、いずれも所定厚さの平板状の成形体である。すなわち、第一基材１０は、平坦な上面１１及び下面１２を有し、第二基材２０もまた、平坦な上面２１及び下面２２を有している。なお、第一基材１０及び第二基材２０の形状は四角形に限られず、例えば、他の多角形、円形、楕円形その他の形状とすることができる。

第一基材１０及び第二基材２０を構成する材料は特に限られないが、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート（ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等）、ポリビニル等の合成樹脂、ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）等のシリコン系樹脂、ＥＰＤＭ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｄｉｅｎｅ Ｍｏｎｏｍｅｒ）等の合成ゴム、天然ゴム、ガラス、セラミックス、ステンレス鋼等の金属材料からなる群より選択される１種類又は２種類以上を用いることができる。第一基材１０を構成する材料と第二基材２０を構成する材料とは同一であってもよいし、異なってもよい。

第一基材１０には、貫通穴１３が形成されている。この貫通穴１３は、第一基材１０の上面１１から下面１２まで貫通して形成されている。本実施形態においては、複数の貫通穴１３が形成されている。複数の貫通穴１３は、一定の間隔で規則的に配置されている。

貫通穴１３の形成には、目的に応じて選択される任意の加工方法を用いることができる。すなわち、例えば、マシニングセンタ等を用いた穿孔加工、レーザー等を用いた光微細加工、エッチング加工、エンボス加工等により、予め成形された第一基材１０に貫通穴１３を形成することができる。また、例えば、射出成形、プレス成形、ステレオリソグラフィー等により、第一基材１０の成形と同時に、当該第一基材１０に貫通穴１３を形成することができる。

第二基材２０は、第一基材１０の下面１２に剥離可能に接着される。ここで、「剥離可能な接着」とは、後述するように、形成器具１を使用して細胞集合体を形成する間は、第二基材２０が第一基材１０から剥離しない程度の強さの接着であり、且つ、図６に示すように、ピンセットＰ等の器具や操作者の手によれば当該第二基材２０を当該第一基材１０から剥離できる程度の強さの接着である。

このような「剥離可能な接着」は、第一基材１０及び第二基材２０を構成する材料の選択や、適度な強さの接着力を発揮する接着剤の使用等、任意の技術的手段を採用することにより達成することができる。

すなわち、例えば、第一基材１０の下面１２のうち貫通穴１３の下方側の開口１３ｂの周辺部分、又は第二基材２０の上面２１のうち当該周辺部分に接着する部分を、相手表面に圧接されるだけで密着できる密着性の材料で形成することができる。

この場合、例えば、第一基材１０の下面１２と第二基材２０の上面２１とを合わせて、当該第一基材１０と第二基材２０とを圧接するだけで、接着剤を使用することなく、当該第二基材２０を当該第一基材１０に剥離可能に接着させることができる。

このような密着性の材料は、相手表面を構成する材料との組み合わせにより、適宜決定することができる。具体的に、例えば、上述の材料のうち、ＰＤＭＳ等のシリコン系樹脂、ＥＰＤＭ等の合成ゴム、天然ゴムを用いることができ、これらの中でも、シリコン系樹脂を好ましく用いることができ、ＰＤＭＳを特に好ましく用いることができる。

なお、第一基材１０の全体、第二基材２０の全体、当該第一基材１０の下面１２の全体又は当該第二基材２０の上面２１の全体を密着性の材料で形成することもできる。具体的には、例えば、第一基材１０の全体を合成樹脂、シリコン系樹脂又はガラスで形成するとともに、第二基材２０の全体をシリコン系樹脂で形成することができる。

また、熱圧着により、接着剤を使用することなく、第二基材２０を第一基材１０に剥離可能に接着させることもできる。すなわち、例えば、第一基材１０の下面１２のうち貫通穴１３の開口１３ｂの周辺部分と、第二基材２０の上面２１のうち当該周辺部分に接着する部分と、を熱圧着可能な組み合わせの熱可塑性樹脂で形成することができる。具体的に、例えば、第一基材１０及び第二基材２０をＰＭＭＡで形成し、当該第一基材１０の下面１２と当該第二基材２０の上面２１とを、ＰＭＭＡの軟化点付近の温度（例えば、１００〜１３０℃の範囲の温度）に加熱した状態で圧着し所定時間（例えば、１〜２時間）保持することにより、当該第二基材２０を当該第一基材１０に剥離可能に接着させることができる。

また、例えば、所定の接着剤を使用して、第二基材２０を第一基材１０の下面１２に剥離可能に接着させることもできる。このような接着剤としては、上述の剥離可能な接着を実現できる適度な強さの接着力を発揮するものを適宜選択して使用することができる。具体的に、例えば、ＰＤＭＳ等のシリコーン系樹脂、歯科用接着性レジン、ＵＶ（紫外線）硬化性樹脂を有効成分とする公知の接着剤を使用することができる。

第二基材２０は、図６に示すように、第一基材１０から剥離する際に、端部から徐々に剥離できる可とう性を有することが好ましい。本実施形態において、第二基材２０は、可とう性のシート状に形成されている。したがって、例えば、図６に示すように、ピンセットＰ等の器具や操作者の手で第二基材２０の端部２０ａを捕捉することにより、当該第二基材２０を当該端部２０ａから徐々に剥離させることができる。

このような可とう性のシート状の第二基材２０を構成する材料としては、例えば、ＰＤＭＳ等のシリコン系樹脂、可とう性の合成樹脂、合成ゴム、天然ゴムを用いることができる。また、第二基材２０の厚さは、例えば、５〜５０００μｍの範囲とすることができ、５０〜１０００μｍの範囲とすることが好ましい。

第二基材２０は、ガス透過性に優れていることが好ましい。すなわち、第二基材２０は、例えば、シリコン系樹脂（例えば、ＰＤＭＳ）等のガス透過性に優れた材料で構成することができる。この場合、第二基材２０の厚さが上述の範囲である場合には、当該第二基材のガス透過性を特に優れたものとすることができる。また、第二基材２０は、例えば、使用する細胞を通過させない微小な孔が所定の開口率で形成されることによりガス透過性が高められた基材とすることもできる。第二基材２０がガス透過性に優れている場合には、第一基材１０の貫通穴１３内に保持されている細胞に対して、その生存を維持する上で十分な酸素を確実に供給することができる。

第二基材２０が接着剤を使用することなく第一基材１０に接着されている場合、図６に示すように、ピンセットＰ等の器具を当該第二基材２０の端部２０ａと当該第一基材１０との間に挿入することにより、当該端部２０ａを容易に捕捉することができる。また、第二基材２０が接着剤を介して第一基材１０に接着されている場合であっても、当該第二基材２０の辺縁部の一部（例えば、図６に示す角部分である端部２０ａ）又は全部（全周）を非接着部分として残しておく（すなわち、当該辺縁部の一部又は全部を第一基材１０に接着しない）ことにより、当該非接着部分を容易に捕捉して、図６に示すように当該第二基材２０を剥離することができる。

また、後述のように、形成器具１を使用して培養された細胞や細胞集合体を顕微鏡等の光学的な手段により観察する際の利便性の観点から、第一基材１０及び第二基材２０を構成する材料は、透光性の材料とすることが好ましく、透明な材料とすることが特に好ましい。すなわち、例えば、第一基材１０の全体を透明な合成樹脂（例えば、ＰＭＭＡ）、シリコン系樹脂（例えば、ＰＤＭＳ）又はガラスで形成するとともに、第二基材２０の全体を透明なシリコン系樹脂（例えば、ＰＤＭＳ）で形成することが好ましい。

このような第二基材２０は、第一基材１０の貫通穴１３の下方側を覆うように当該第一基材１０の下面１２に接着される。この結果、形成器具１は、第一基材１０の貫通穴１３の下方側を第二基材２０で覆うことにより形成された細胞非接着性のウェル３０を有することとなる。すなわち、本実施形態において、形成器具１は、図３及び図４に示すように、複数のウェル３０を有している。これら複数のウェル３０は、一定の間隔で規則的に配置されている。

ウェル３０は、上面１１に開口する有底の穴として形成されている。すなわち、ウェル３０の底面３０ｂ（図４参照）は、貫通穴１３内に露出した第二基材２０の上面２１の一部である。また、ウェル３０の内側面３０ｃは、貫通穴１３の内面１３ｃ（図２参照）である。

そして、これら底面３０ｂ及び内側面３０ｃは細胞非接着性となっている。ここで、細胞接着性の表面及び細胞非接着性の表面について説明する。細胞接着性の表面とは、例えば、培養に用いる溶液中において、細胞が当該表面上に沈降した場合に、当該細胞が、その形状を球形から変化させて、比較的扁平な形状で接着することができる表面である。

これに対し、細胞非接着性の表面とは、例えば、培養に用いる溶液中において、細胞が当該表面上に沈降した場合に、当該細胞が、その形状を球状からほとんど変化させず、全く接着しないか、又は極めて弱く接着する表面である。細胞非接着性表面上の細胞は、当該表面に全く接着できないため球形のまま溶液中で浮遊状態を維持し、又は当該表面に極めて弱く接着しているため培養液の流れ等によって当該表面から容易に脱離する。

形成器具１における細胞非接着性の表面は、例えば、第一基材１０を構成する材料や第二基材２０を構成する材料の表面に細胞非接着性物質を物理的又は化学的に固定することにより形成された表面とすることができる。細胞非接着性物質としては、用いる細胞の細胞膜に存在するたんぱく質や糖鎖等の細胞表面分子に対して結合しない物質であれば特に限られず用いることができる。

すなわち、例えば、溶液中で極めて高い親水性を示す高分子（ポリエチレングリコール及びその誘導体等）、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ｐｏｌｙ―ＨＥＭＡ（ポリヒドロキシエチルメタクリレート）、ＳＰＣ（セグメント化ポリウレタン）等の化合物や、生体から取得されたタンパク質（アルブミン等）を、細胞の種類に応じて適宜選択して用いることができる。

これら細胞非接着性物質は、例えば、これらを含有する水溶液をウェル３０の底面３０ｂ及び内側面３０ｃ上で乾燥させる方法、当該水溶液中において当該物質が有する官能基と当該底面３０ｂ及び内側面３０ｃに結合している官能基との間で化学反応（例えば、カルボキシル基やアミノ基等の官能基間の縮合反応等）を起こさせて共有結合を形成させる方法、又は当該水溶液中において当該物質が有するチオール基と当該底面３０ｂ及び内側面３０ｃに予め形成された金属（プラチナ、金等）薄膜とを結合させる方法により、当該底面３０ｂ及び内側面３０ｃ上に固定化することができる。

このようなウェル３０の底面３０ｂ及び内側面３０ｃに細胞非接着性を付与する処理は、第一基材１０に第二基材２０を接着させて組み立てられた形成器具１に対して施すことができ、又は当該形成器具１の組み立てに先立って当該第一基材１０及び第二基材２０のそれぞれに施すこともできる。例えば、形成器具１の組み立て後に細胞非接着性の処理を行うことにより、第一基材１０及び第二基材２０のうち、形成器具１において露出している部分（例えば、ウェル３０の底面３０ｂ及び内側面３０ｃ、第一基材１０の上面１１）に対して選択的に効率よく細胞非接着性を付与することができる。

ウェル３０の底面３０ｂの面積（すなわち、第一基材１０の下面１２における貫通穴１３の開口１３ｂの面積）は、例えば、１×１０^２〜２×１０^６μｍ^２の範囲とすることができ、好ましくは７×１０^３〜８×１０^５μｍ^２の範囲とすることができる。

また、本実施形態のようにウェル３０の底面３０ｂが円形である場合には、その直径は、例えば、１０〜１５００μｍの範囲とすることができ、好ましくは１００〜１０００μｍの範囲とすることができる。なお、ウェル３０の底面３０ｂの形状は、円形に限られず、例えば、多角形や楕円とすることもできる。

ウェル３０の底面３０ｂの面積が上記範囲の下限値より小さい場合には、当該ウェル３０内に細胞を確実に保持させることが容易でなくなる。また、ウェル３０の底面３０ｂの面積が上記範囲の上限値より大きい場合には、当該ウェル３０内に播種される細胞の数が多くなることにより、当該ウェル３０内で形成される細胞集合体のサイズが大きくなりすぎることがある。細胞集合体のサイズが大きくなりすぎると、当該細胞集合体の内部に位置する細胞が、当該細胞集合体外の培養液から栄養や酸素を十分に受けることができず、死滅してしまうことがある。

また、ウェル３０内に播種される細胞の数が多くなることにより、１つのウェル３０内に複数個の細胞集合体が形成されてしまうことがある。複数個の細胞集合体は、通常、互いにサイズが異なる不均一な集団となり、また、浮遊状態で互いに融合して、いびつな形状の巨大な細胞集合体を形成してしまう。

これに対し、ウェル３０の底面３０ｂの面積が上記範囲内である場合には、当該ウェル３０内で、所定範囲の均一なサイズの細胞集合体（例えば、直径が所定範囲である球状の細胞集合体）を１つずつ確実に形成することができる。また、この場合、形成器具１は、多数の微小なウェル３０を有することができる。このため、稀少な細胞を使用する場合であっても、均一なサイズの細胞集合体を多数、効率よく形成することができる。

ウェル３０の上面１１における開口３０ａの面積（すなわち、第一基材１０の上面１１における貫通穴１３の開口１３ａの面積）もまた、上記の底面３０ｂと同様の範囲とすることが好ましい。

また、ウェル３０の開口３０ａの面積は、底面３０ｂの面積と同程度とすることもできるが、例えば、当該底面３０ｂの面積より小さくすることもできる。

図７及び図８は、この場合の第一基材１０及び形成器具１をそれぞれ示す断面図である。図７及び図８に示す例において、ウェル３０（貫通穴１３）は、その底面３０ｂ（貫通穴１３の開口１３ｂ）の面積よりも、第一基材１０の上面１１における開口３０ａ（貫通穴１３の開口１３ａ）の面積が小さくなるテーパ形状に形成されている。

さらに、この例では、ウェル３０の開口３０ａが、底面３０ｂよりも直径の小さい同心円となるよう形成されている。すなわち、開口３０ａは、底面３０ｂの中央部分に対応する位置に形成されている。ウェル３０をこのようなテーパ形状に形成した場合には、後述のように、当該ウェル３０内で形成された細胞集合体の転写を極めて精密に行うことができる。

ウェル３０の深さ（すなわち、上面１１から下面１２までの長さ、第一基材１０の厚さ）は、例えば、２．５〜３０００μｍの範囲とすることが好ましく、５０〜２０００μｍの範囲とすることがより好ましい。

ウェル３０の深さが上記範囲の下限値より小さい場合には、当該ウェル３０内に保持された細胞又は細胞集合体が、培養の操作中に当該ウェル３０外に脱離してしまうことがある。また、ウェル３０の深さが上記範囲の上限値より大きい場合には、当該ウェル３０内に保持された細胞や細胞集合体に対して、当該ウェル３０外の培養液から酸素や栄養素を十分に供給できないことがある。これに対し、ウェル３０の深さが上記範囲内である場合には、当該ウェル３０内で細胞及び細胞集合体を良好な状態で安定して培養することができる。

ウェル３０の底面３０ｂの代表長さ（底面３０ｂが円形又は多角形の場合には、それぞれ当該円の直径又は当該多角形の対角線長さ）に対する、当該ウェル３０の深さの比率（アスペクト比）は、例えば、０．５〜２．０の範囲とすることが好ましい。具体的に、例えば、円形の底面３０ｂの直径が、上記範囲の下限値である１０μｍの円形である場合には、ウェル３０の深さは、５μｍ〜２０μｍとすることが好ましい。また、例えば、円形の底面３０ｂの直径が、上記範囲の上限値である１５００μｍである場合には、ウェル３０の深さは、７５０μｍ〜３０００μｍとすることが好ましい。

アスペクト比が上記範囲の下限値より小さい場合には、ウェル３０内に保持された細胞又は細胞集合体が、培養の操作中に当該ウェル３０外に脱離してしまうことがある。また、アスペクト比が上記範囲の上限値より大きい場合には、ウェル３０内に保持された細胞又は細胞集合体に対して、当該ウェル３０外の培養液から酸素や栄養素を十分に供給できないことがある。これに対し、ウェル３０のアスペクト比が上記範囲内である場合には、当該ウェル３０内で細胞及び細胞集合体を良好な状態で安定して培養することができる。

また、本実施形態において、第二基材２０の上面２１の面積は、第一基材１０の下面１２の面積よりも小さくなっている。すなわち、図５に示すように、形成器具１において、第一基材１０の下面１２の一部は、第二基材２０で覆われていない。したがって、例えば、図６に示すように、第二基材２０を第一基材１０から剥離する操作においては、当該第一基材１０のうち当該第二基材２０で覆われていない部分を押さえる一方で、ピンセットＰ等の器具や操作者の手によって、当該第二基材２０の端部２０ａをつまんで引き剥がすことにより、当該第二基材２０の剥離を確実に効率よく行うことができる。なお、第一基材１０を押さえる方法は特に限られず、例えば、当該第一基材１０の下面１２のうち第二基材２０で覆われていない部分にのみ所定の形状の重りを載せておく方法や、ピンセットＰ等の器具や操作者の手で押さえる方法を採用することができる。

次に、本実施形態に係る細胞集合体の培養方法（以下、「本培養方法」という。）について説明する。図９は、本培養方法の一例に含まれる主な工程を示す説明図である。図１０は、形成器具１を所定の培養容器４０内で培養液中に浸漬して培養を行う様子を示す斜視図である。図１１Ａ〜Ｅは、図１０に示すＸＩ−ＸＩ線を通る面で切断した形成器具１及び培養容器４０の断面図である。

図９に示すように、本培養方法は、集合体形成工程Ｓ１００と、転写工程Ｓ２００と、集合体培養工程Ｓ３００と、を含む。集合体形成工程Ｓ１００においては、形成器具１のウェル３０内で浮遊状態の細胞集合体を形成する。

すなわち、まず、形成器具１のウェル３０内に細胞を播種して培養する。ここで、細胞は、互いに結合を形成して細胞集合体を形成できるものであれば特に限られない。すなわち、由来とする動物、臓器、組織の種類を問わず、目的に応じた任意の種類の細胞を適宜選択して用いることができる。

具体的に、例えば、ヒト又はヒト以外の動物（サル、ブタ、イヌ、ラット、マウス等）の任意の臓器又は組織（肝臓、膵臓、心臓、軟骨、骨、脂肪、腎臓、神経、皮膚、骨髄、胚等）に由来する初代細胞、樹立された株化細胞、又はこれらに遺伝子操作等を施した細胞を用いることができる。

より具体的に、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、組織幹細胞（体性幹細胞）、造血系幹細胞、癌幹細胞その他の未分化な幹細胞又は前駆細胞を用いることができる。また、例えば、肝臓系細胞や膵臓系細胞等の消化器系臓器由来の細胞、腎臓系細胞、神経系細胞、心筋細胞等の循環器系臓器由来の細胞、脂肪細胞、皮膚真皮等の結合組織由来の線維芽細胞、皮膚表皮等の上皮系組織由来の上皮細胞、骨系細胞、軟骨系細胞、網膜等の眼組織由来の細胞、血管系細胞、血球系細胞、生殖系細胞等の分化した細胞を用いることもできる。また、癌化した細胞を用いることもできる。このような細胞としては、１種類の細胞を単独で用いることができ、又は２種類以上の細胞を任意の比率で混在させて用いることもできる。

ウェル３０あたりに播種する細胞の数は、当該ウェル３０のサイズ、個々の細胞のサイズ、形成すべき細胞集合体のサイズ等の条件に応じて適宜決定することができる。すなわち、ウェル３０に播種する細胞の密度は、当該ウェル３０の底面３０ｂの単位面積あたり、例えば、２個〜１．０×１０^５個／ｍｍ^２の範囲とすることが好ましく、１０個〜５．０×１０^４個／ｍｍ^２の範囲とすることがより好ましい。また、ウェル３０に播種する細胞の数は、当該ウェル３０あたり、例えば、２個〜１．５×１０^５個の範囲とすることが好ましく、１０個〜５．０×１０^４個の範囲とすることがより好ましい。

これは、ウェル３０あたりに細胞集合体を形成するために必要な数の細胞を播種する必要があり、また、播種細胞の数が多すぎると、当該細胞から形成される細胞集合体が巨大なものとなり、その内部の細胞が栄養や酸素の不足により壊死してしまうことがあるためである。

形成器具１のウェル３０は、その容積が小さいため、集合体形成工程Ｓ１００においては、当該形成器具１の全体を培養液中に浸漬して培養を行うことが好ましい。すなわち、例えば、図１０に示すように、形成器具１を所定の培養容器４０の底面４１に載置するとともに、当該形成器具１の全体を培養液Ｍ中に浸漬して、細胞の培養を行う。このような培養容器４０としては、例えば、細胞の培養に汎用されている、透明な合成樹脂製の培養ディッシュを用いることができる。

培養液Ｍとしては、用いる細胞の生存状態や機能を維持することができるよう、必要な塩類や栄養成分を適切な濃度で含む任意の水溶液を用いることができる。具体的に、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）等の基礎培地に抗生物質や血清を添加した培養液や、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）等の緩衝液、いわゆる生理食塩水を用いることができる。

図１１Ａは、ウェル３０内で分散された状態の個々の細胞Ｃが培養される様子を示す形成器具１及び培養容器４０の断面図である。細胞の培養において、形成器具１は、図１０及び図１１Ａに示すように、第二基材２０が下方側になるよう配置される。したがって、形成器具１を静置すると、図１１Ａに示すように、ウェル３０内に播種された個々の細胞Ｃは、当該ウェル３０の底面３０ｂ上に沈降する。なお、上述のとおり、ウェル３０の底面３０ｂ及び内側面３０ｃは細胞非接着性であるため、細胞Ｃは当該底面３０ｂ及び内側面３０ｃには実質的に接着せず、浮遊状態で培養される。

そして、集合体形成工程Ｓ１００においては、ウェル３０内で細胞Ｃを所定期間培養することにより、当該細胞Ｃを三次元的に集合させて、細胞集合体を形成する。図１１Ｂは、ウェル３０内で細胞集合体Ｔが形成された様子を示す形成器具１及び培養容器４０の断面図である。

ウェル３０の底面３０ｂ及び内側面３０ｃが細胞非接着性であり、且つ細胞Ｃは互いに結合を形成できるため、培養時間が経過するにつれて、細胞Ｃは互いに結合を形成し、徐々に集合する。そして、最終的には、図１１Ｂに示すように、三次元的に集合した複数の細胞Ｃを含む細胞集合体Ｔが形成される。なお、この細胞集合体Ｔにおいては、個々の細胞Ｃが三次元的に集合することで、より高度な組織を形成しているともいえる。したがって、細胞集合体Ｔは、細胞組織体と呼ぶこともできる。

細胞集合体Ｔの形状は特に限られないが、例えば、図１１Ｂに示すように、球状とすることができる。また、ウェル３０は細胞非接着性であるため、細胞集合体Ｔは当該ウェル３０内で培養液Ｍ中に浮遊した状態で保持される。

このような細胞集合体Ｔは、図１１Ａに示すように、細胞Ｃをウェル３０の底面３０ｂ上に沈降させた状態で培養する、いわゆる静置培養により形成することができる。また、形成器具１を、ウェル３０内から細胞がこぼれない程度に傾け、重力の作用によって当該ウェル３０内の一部（例えば、底面３０ｂの辺縁部分）に細胞を集めて保持することによって、静置状態における細胞組織体Ｔの形成を促進することもできる。また、細胞集合体Ｔは、形成器具１を、上方から見て円弧を描くように一定の角速度で旋回させながら培養を行うこと（いわゆる旋回培養）によっても形成することができる。いずれの場合にも、ウェル３０内で接触した複数の細胞Ｃは、互いに結合を形成し、所定の培養期間内に細胞集合体を形成する。

集合体形成工程Ｓ１００において形成される細胞集合体Ｔのサイズは、当該細胞集合体Ｔを構成する細胞の生存及び機能を所定のレベルで維持できる範囲であれば特に限られない。すなわち、細胞集合体Ｔが球状体である場合、その直径は、例えば、３０〜１０００μｍの範囲とすることができ、５０〜７００μｍの範囲とすることが好ましい。集合体形成工程Ｓ１００においては、このような範囲のサイズの細胞集合体Ｔを各ウェル３０内で１つずつ形成する。なお、細胞集合体Ｔのサイズは、例えば、上述のように、ウェル３０に播種する細胞の数によって調節することができる。

続く転写工程Ｓ２００においては、細胞集合体Ｔを、形成器具１から細胞接着性表面に転写する。すなわち、まず、形成器具１の第一基材１０の上面１１を所定の細胞接着性表面に当接させる。

細胞集合体Ｔを転写する細胞接着性表面は、当該細胞集合体Ｔを構成する細胞Ｃが接着できる表面であれば特に限られない。すなわち、この細胞接着性表面は、例えば、合成樹脂等の材料そのものの表面や、当該材料の表面に細胞接着性物質を物理的又は化学的に固定することにより形成された表面とすることができる。細胞接着性物質としては、用いる細胞の細胞膜に存在するたんぱく質等の細胞表面分子（例えば、インテグリンや糖鎖受容体等）のうち特定のものに対して結合し得る物質であれば特に限られず用いることができる。

すなわち、例えば、生体から取得されたタンパク質（コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等）や、細胞接着性を示す特定のアミノ酸配列（アルギニン・グリシン・アスパラギン酸（いわゆるＲＧＤ）配列等）や、特定の糖鎖配列（ガラクトース側鎖等）を有する合成された細胞接着性物質を、細胞の種類に応じて適宜選択して用いることができる。

これら細胞接着性物質は、例えば、これらを含有する水溶液を所定の材料表面上で乾燥させる方法、当該水溶液中において当該物質が有する官能基と当該材料表面に結合している官能基との間で化学反応（例えば、カルボキシル基やアミノ基等の間の縮合反応等）を起こさせて共有結合を形成させる方法、又は当該水溶液中において当該物質が有するチオール基と当該材料表面に予め形成された金属（プラチナ、金等）薄膜とを結合させる方法により、当該材料表面上に固定化することができる。このような細胞接着性表面としては、例えば、培養ディッシュ等の培養容器の底面や、所定の培養基材の表面を用いることができる。

図１１Ｃは、形成器具１の第一基材１０の上面１１を、培養容器５０の底面である細胞接着性表面５１に当接させた様子を示す断面図である。この培養容器５０としては、例えば、図１０、図１１Ａ及び図１１Ｂに示す培養容器４０と同様の透明な合成樹脂製の培養ディッシュであって、その底面にコラーゲン等の細胞接着性物質が固定されているものを用いることができる。

図１１Ｃに示すように、転写工程Ｓ２００においては、形成器具１の上下をひっくり返して、ウェル３０の開口３０ａが形成されている上面１１を下方側に向けた状態で当該形成器具１を細胞接着性表面５１に載置する。そして、形成器具１のウェル３０内の細胞集合体Ｔを、重力の作用によって、細胞接着性表面５１上に沈降させる。なお、第二基材２０が上述したようなガス透過性に優れたものである場合には、ウェル３０外の培養液Ｍから、当該ウェル３０内の細胞集合体Ｔに対して、酸素を十分に供給することができる。

さらに、転写工程Ｓ２００においては、細胞接着性表面５１に当接している第一基材１０から第二基材２０を剥離する。この剥離は、第二基材２０が可とう性のシート状に形成されている場合、例えば、図６に示す要領で行うことができる。すなわち、まず、ピンセットＰ等の器具や操作者の手により、第二基材２０の端部２０ａを第一基材１０の下面１２から剥離させるとともにつまむ。

次いで、この端部２０ａから徐々に第二基材２０を第一基材１０から引き剥がす。そして、最終的に、第二基材２０の全体を第一基材１０から除去する。このように、第二基材２０をゆっくり徐々にめくり上げることで、細胞集合体Ｔをウェル３０から脱離させることなく、当該第二基材２０を剥離することができる。

図１１Ｄは、第二基材２０が剥離された第一基材１０及び培養容器５０の断面図である。上述のようにウェル３０の底面３０ｂを構成する第二基材２０を剥離及び除去することによって、図１１Ｄに示すように、第一基材１０の貫通穴１３の下面１２側における開口１３ｂが再び開放される。

この結果、貫通穴１３内に保持された細胞集合体Ｔは、開口１３ｂを介して、培養液Ｍから酸素や栄養分の十分な供給を受けることができるようになる。したがって、貫通穴１３内に保持された細胞集合体Ｔの生存及び機能を維持しつつ、当該細胞集合体Ｔを細胞接着性表面５１に十分に接着させることができる。

転写工程Ｓ２００において第二基材２０を剥離するタイミングは、細胞集合体Ｔが細胞接着性表面５１に沈降した後であって、当該細胞集合体Ｔに含まれる細胞の生存率を所定のレベル以上に維持できる期間内であれば特に限られない。このタイミングは、細胞集合体Ｔの状態、培養液Ｍの温度、培養液Ｍに含有される酸素や栄養分の濃度等の条件によって異なるが、例えば、細胞集合体Ｔが細胞接着性表面５１上に沈降してから１〜１８０分の範囲とすることができる。

続く集合体培養工程Ｓ３００においては、細胞接着性表面５１に接着した細胞集合体Ｔを培養する。すなわち、例えば、図１１Ｄに示すように、細胞接着性表面５１上に載置された第一基材１０の貫通穴１３内において、細胞集合体Ｔをそのまま培養することができる。

また、第一基材１０が除去された細胞接着性表面５１で細胞集合体Ｔを培養することもできる。すなわち、この場合、転写工程Ｓ２００において第二基材２０を第一基材１０から剥離した後、さらに当該第一基材１０を細胞接着性表面５１から脱離させて、細胞集合体Ｔを培養する。図１１Ｅは、細胞接着性表面５１から第一基材１０が除去された状態で細胞集合体Ｔを培養する様子を示す培養容器５０の断面図である。

第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去するタイミングは、細胞集合体Ｔが培養液Ｍ中に浮遊しない程度に、当該細胞接着性表面５１に接着した後であれば特に限られない。すなわち、例えば、細胞集合体Ｔが第一基材１０の貫通穴１３内で細胞接着性表面５１に接着した後、当該第一基材１０を当該細胞接着性表面５１に当接させたまま所定期間培養し、次いで、当該第一基材１０を当該細胞接着性表面５１から除去し、さらに培養を継続することもできる。

こうして、集合体培養工程Ｓ３００において、細胞集合体Ｔは、細胞接着性表面５１のうち、当該細胞集合体Ｔが収容されていたウェル３０に対応する位置に接着した状態で培養される。すなわち、本実施形態においては、規則的に配置された複数のウェル３０で形成された複数の細胞集合体Ｔは、細胞接着性表面５１のうち、当該複数のウェル３０に対応する位置に規則的に配置された状態で培養される。

ここで、形成器具１のウェル３０が、図７及び図８に示すようなテーパ形状で形成されている場合には、細胞接着性表面５１のうち細胞集合体Ｔを接着させる位置をより精密に制御することができる。

図１２Ａは、集合体形成工程Ｓ１００において図８に示す形成器具１を使用した場合の当該形成器具１及び培養容器４０の断面図である。図１２Ｂは、転写工程Ｓ２００において図８に示す形成器具１を使用した場合の当該形成器具１及び培養容器５０の断面図である。なお、図１２Ａ及び図１２Ｂは、それぞれ図１１Ｂ及び図１１Ｃに対応している。

この場合、まず培養工程Ｓ１００においては、図１２Ａに示すように、上述の場合と同様、形成器具１のウェル３０内で細胞集合体Ｔを形成する。そして、続く転写工程Ｓ２００においては、図１２Ｂに示すように、形成器具１の上下をひっくり返して、第一基材１０の上面１１を培養容器５０の細胞接着性表面５１に当接させる。

ここで、上述のとおり、ウェル３０の上面１１における開口３０ａは、底面３０ｂよりも面積が小さく、且つ当該底面３０ｂの中央部分に相当する位置に同心円状に形成されている。そして、細胞集合体Ｔは、ウェル３０内において、テーパ形状の内側面３０ｃに案内されながら、重力の作用によって、底面３０ｂ側から開口３０ａ側に向けて沈降する。

したがって、細胞集合体Ｔは、図１２Ｂに示すように、細胞接着性表面５１のうち、ウェル３０の底面３０ｂの中央部分に相当する位置（開口３０ａ内）に沈降し接着する。このように、テーパ形状のウェル３０を用いることにより、細胞集合体Ｔのサイズがウェル３０の底面３０ｂに比べて小さい場合であっても、当該細胞集合体Ｔを、細胞接着性表面５１のうち、より狭い開口３０ａの範囲の位置に精密に転写することができる。

このように、形成器具１は、細胞接着性表面を有する培養器具と組み合わせて使用される。そこで、本実施形態に係る細胞集合体転写キット（以下、「転写キット」という。）は、上述のような形成器具１と、当該形成器具１の第一基材１０の上面１１を当接させる細胞接着性表面を有する培養器具（例えば、上述の培養容器５０）と、を含む。

また、本実施形態に係る細胞集合体培養器具（以下、「培養器具」という。）は、形成器具１と組み合わせて使用される器具であり、細胞集合体Ｔを接着させて培養するための細胞接着性表面を有する。この培養器具は、形成器具１の上面１１を当接させることのできる細胞接着性表面を有する構造体であれば特に限られない。すなわち、この培養器具は、例えば、上述のように細胞接着性の底面を有する培養容器５０とすることができ、また、後述するような、第一基材１０と同様の平板状の培養基材とすることもできる。

また、形成器具１及び培養器具の少なくとも一方は、第一基材１０の上面１１を当該培養器具の細胞接着性表面に当接させた状態で他方と接触して互いの相対的な位置を固定する位置決め構造を有することとしてもよい。すなわち、形成器具１及び培養器具は、例えば、一方が他方に嵌合又は係止する形状で対応する位置に形成された位置決め構造を有することができる。

図１３〜図１６には、このような場合の一例を示す。図１３は、位置決め構造を有する形成器具１の一例を示す斜視図である。図１４は、図１３に示す形成器具１、及び当該形成器具１に対応する位置決め構造を有する培養器具６０の一例を示す斜視図である。図１５は、図１４に示す形成器具１を培養器具６０に当接させた様子を示す斜視図である。図１６は、形成器具１で形成された細胞集合体Ｔを、培養器具６０の細胞接着性表面６１で培養する様子を示す斜視図である。なお、転写キットは、例えば、図１４及び図１５に示すような形成器具１と培養器具６０とを含んで構成することができる。

この例において、形成器具１は、図１３に示すように、その第一基材１０の上面１１に所定高さで突出する複数の凸部１４を有している。これに対し、培養器具６０は、図１４に示すように、その上面６１のうち、形成器具１の凸部１４に対応する位置に、当該凸部１４と嵌合する所定深さの複数の凹部６２を有している。

そして、転写工程Ｓ２００においては、図１４に示す対応する凸部１４と凹部６２とを嵌合させて、図１５に示すように、形成器具１の上面１１を、培養器具６０の上面６１に当接させる。この結果、第一基材１０と第二基材２０とを、予め定められた位置関係で、簡便且つ確実に固定することができる。

すなわち、細胞接着性表面６１のうち、予め定められた位置に、形成器具１のウェル３０を配置することができる。したがって、図１６に示すように、細胞接着性表面６１のうち、予め定められた位置に、細胞集合体Ｔを転写することができる。このように、位置決め構造を有する形成器具１と培養器具６０とを用いることによって、細胞接着性表面６１の所望の位置に、細胞集合体Ｔを精密に且つ確実に配置することができる。

なお、図１４〜図１６に示すような培養器具６０を使用する場合、当該培養器具６０及び形成器具１を、図１０に示す培養容器４０のような所定の培養容器内で、培養液Ｍ中に浸漬した状態で、細胞集合体Ｔの転写や培養を行うことが好ましい。

図１３に示すように、形成器具１の上面１１又は他の部分に凸部がある場合、当該凸部は取っ手として利用することもできる。すなわち、例えば、操作者は、この凸部をピンセット等の器具でつまむことにより、形成器具１の移動等の操作を簡便に行うことができる。なお、形成器具１が凹部を有し、培養器具６０が当該凹部に嵌合する凸部を有することとしてもよい。

また、培養器具６０には、形成器具１の複数のウェル３０の各々に対応する領域（すなわち、細胞集合体Ｔが転写されるべき領域）を区画する格子状の模様を形成してもよい。すなわち、図１４〜図１６に示す例において、培養器具６０には、互いに直交する複数の縦線６３ａ及び複数の横線６３ｂを含む格子状の模様６３が形成されている。そして、互いに交差する２本の縦線６３ａと２本の横線６３ｂとによって矩形領域である格子の目６３ｃが形成されている。この格子の目６３ｃの位置は、形成器具１のウェル３０の位置に対応している。

したがって、図１５に示すように、形成器具１を細胞接着性表面６１に当接させた状態において、当該形成器具１の各ウェル３０は、当該細胞接着性表面６１のうち、各格子の目６３ｃの範囲内に配置される。そして、図１６に示すように、各細胞集合体Ｔは、細胞接着性表面６１のうち、各格子の目６３ｃの範囲内に転写される。この結果、各格子の目６３ｃの範囲内で、細胞集合体Ｔを１つずつ培養することができる。

このような格子状の模様６３は、例えば、位相差顕微鏡等の光学的観察装置を使用して観察する際に、細胞接着性表面６１に接着した各細胞集合体Ｔを識別する上で便利である。なお、格子状の模様６３は、例えば、細胞接着性表面６１又はその裏側の表面に描画（印刷）された模様として形成することができ、又は当該細胞接着性表面６１上に形成された溝として形成することができる。

また、形成器具１及び培養器具６０の一方は、他方の外周部に当接して互いの相対的な位置関係を固定するよう形成された位置決め構造を有することもできる。図１７及び図１８には、この場合の一例を示す。図１７は、第一基材１０の外周部に当接する複数の凸部６４を有する培養器具６０の一例を示す斜視図である。図１８は、図１７に示す培養器具６０の細胞接着性表面６１に、図５に示す形成器具１を当接させた様子を示す斜視図である。

図１７に示すように、培養器具６０の複数の凸部６４は、形成器具１の第一基材１０の側面１５（図１８参照）に当接する形状及び位置で形成されている。具体的に、各凸部６４は、第一基材１０の側面１５のうち屈曲した角部分を囲むように当接する枠形状に形成されている。

したがって、図１８に示すように、複数の凸部６４と、第一基材１０の側面１５と、を当接させることにより、第一基材１０と第二基材２０とを、予め定められた位置関係で、簡便且つ確実に固定することができる。

以上説明した細胞集合体形成器具、細胞集合体培養器具、細胞集合体転写キット及び細胞集合体の培養方法によれば、例えば、稀少な試薬を用いた稀少な細胞の培養を簡便且つ確実に実現することができ、培養細胞を利用した創薬、再生医療、基礎研究等の様々な産業利用に応用できる。

具体的に、例えば、形成器具１を用いて形成した浮遊状態の複数の胚様体を、培養器具５０，６０の細胞接着性表面５１，６１上に、予め定められた規則的な配置で、精密にマイクロパターニングすることができる。

また、細胞接着性表面５１，６１における胚様体の間隔を規則的に一定にすることにより、当該胚様体を構成する細胞の状態を均一に揃えて維持することができる。更に、隣接する胚様体間の距離を予め定められた値に維持できるため、接着後の胚様体同士の相互干渉による悪影響を低減した培養系を構築できる。また、対象となる胚様体の遺伝子発現や細胞形態を均一とした状態で細胞分化誘導実験や薬剤応答試験を行うことができる等、重要な基礎研究を効率よく且つ確実に実施することができる。

次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。

まず、ＰＭＭＡ製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ８００μｍ）からなる第一基材１０に、マシニングセンタを用いた穿孔加工処理により、直径８００μｍの円形の貫通穴１３を１４３個形成した。この貫通穴１３は、互いにその中心間距離が８８０μｍとなるよう規則的に配置した。

一方、ＰＤＭＳ製のシート（１３ｍｍ×１３ｍｍ、厚さ４００μｍ）からなる第二基材２０を準備した。そして、第一基材１０の貫通穴１３の下方側の開口１３ｂを覆うよう第二基材２０を位置合わせし、接着剤を使用することなく、当該第二基材２０を当該第一基材１０の下面１２に押し付けた。こうして、図３〜図５に示すように、第二基材２０を第一基材１０の下面１２に剥離可能に接着した。

次に、第一基材１０の上面１１側から、スパッタリング装置を用いたスパッタリング処理を施した。このスパッタリング処理により、第一基材１０の上面１１、ウェル３０の底面３０ｂ及び内側面３０ｃに、チオール基が結合可能な金属薄膜を形成した。

そして、分子量３００００のＰＥＧ鎖及びチオール基を有する細胞非接着性の合成高分子（化学式：ＣＨ_３（ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＳＨ）を５ｍＭの濃度で含むエタノール溶液を、ウェル３０内に注入すると共に、第一基材１０の上面１１に塗布した。

その後、第一基材１０及び第二基材２０を窒素雰囲気下で所定時間放置することにより、細胞非接着性高分子を、当該第一基材１０の上面１１、ウェル３０の底面３０ｂ及び内側面３０ｃに固定化した。この結果、第一基材１０の上面１１、ウェル３０の底面３０ｂ（第二基材２０の上面２１のうち貫通穴１３内に露出する部分）及び内側面３０ｃは細胞非接着性表面となった。

こうして、ＰＭＭＡ製の透明な第一基材１０と、ＰＤＭＳ製の透明な第二基材２０と、底面３０ｂの直径が８００μｍである１４３個のウェル３０と、を有する形成器具１を製造した。

この形成器具１の各ウェル３０内に、マウスＥＳ細胞（大日本住友製薬）を５×１０^２個ずつ播種した。培養液としては、１５％ウシ胎児血清、１％ヌクレオシド、１％非必須アミノ酸、１％２−メルカプトエタノール、１％グルタミンを含むＤＭＥＭ培地を用いた。

そして、このマウスＥＳ細胞を３日間培養することにより、三次元的に集合したマウスＥＳ細胞を含む球状の細胞集合体である胚様体を各ウェル３０内に１つずつ形成させた。図１９Ａは、培養３日目の形成器具１のウェル３０内に保持された浮遊状態の胚様体Ｔを位相差顕微鏡下で撮影した写真の一例である。形成された胚様体Ｔの直径は、１５５〜１９５μｍの範囲（１７２±８μｍ：算術平均±標準偏差）であった。

次に、培養容器５０として、市販の培養ディッシュ（直径３５ｍｍ、ＡＧＣテクノグラス株式会社）を準備した。この培養ディッシュのコラーゲンがコーティングされた底面を細胞接着性表面５１として使用した。

そして、形成器具１の上面１１を培養容器５０の細胞接着性表面５１に当接させて、当該形成器具１のウェル３０内の胚様体Ｔを当該細胞接着性表面５１に沈降させた。図１９Ｂは、形成器具１の上面１１を細胞接着性表面５１に当接させた直後の写真の一例である。

形成器具１の細胞接着性表面５１への当接は次のようにして行った。すなわち、まず、培養容器５０に培養液を入れ、次いで当該培養液を捨てることにより、細胞接着性表面５１を当該培養液で濡らした。そして、ウェル３０から胚様体Ｔがこぼれ出ない程度に傾斜させた形成器具１の上面１１と、培養液で濡らした細胞接着性表面５１と、を合わせた。こうして、胚様体Ｔをウェル３０内に保持したまま形成器具１の上面１１を細胞接着性表面５１に当接させた。

また、形成器具１を細胞接着性表面５１に当接させた状態で、当該形成器具１に金属製のリング状の重りを載せた。この重りによって、形成器具１の第一基材１０のうち第二基材２０で覆われていない４つの角部分を押さえた。これにより、形成器具１の上面１１と細胞接着性表面５１とを密着させた。

この当接後、１０分が経過した時点で、図６に示すように、ピンセットＰを用いて、第二基材２０を端部２０ａから徐々に剥離し、第一基材１０から除去した。図１９Ｃは、第一基材１０から第二基材２０を剥離した直後の写真の一例である。

その後、培養容器５０を３７℃で６０分間維持することにより、各ウェル３０内の胚様体Ｔを細胞接着性表面５１に接着させた。そして、胚様体Ｔの接着後、第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去した。図１９Ｄは、第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去した直後の写真の一例である。

この結果、図１０Ｄに示すように、細胞接着性表面５１には、所定の間隔で規則的に配置された均一なサイズの複数の胚様体Ｔが残された。図１９Ｅは、第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去してから、当該細胞接着性表面５１に接着した状態で１時間培養した胚様体Ｔの写真の一例である。図１９Ｆは、第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去してから、当該細胞接着性表面５１に接着した状態で３時間培養した胚様体Ｔの写真の一例である。

胚様体Ｔは、細胞接着性表面５１に接着した状態でさらに培養を継続することができた。培養時間が経過するにつれて、胚様体Ｔを構成する細胞が細胞接着性表面５１に接着すると共に遊走して広がった。

上述の実施例１と同様の方法で形成器具１を作製した。すなわち、まず、ＰＭＭＡ製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ８００μｍ）からなる第一基材１０に、マシニングセンタを用いた穿孔加工処理により、直径８００μｍの円形の貫通穴１３を１４３個形成した。この貫通穴１３は、互いにその中心間距離が８８０μｍとなるよう規則的に配置した。

一方、ＰＤＭＳ製のシート（１３ｍｍ×１３ｍｍ、厚さ４００μｍ）からなる第二基材２０を準備した。そして、接着剤を使用することなく、第二基材２０を第一基材１０の下面１２に剥離可能に接着した。また、上述の実施例１と同様に、細胞非接着性物質の固定を行い、ウェル３０に細胞非接着性を付与した。こうして、ＰＭＭＡ製の透明な第一基材１０と、ＰＤＭＳ製の透明な第二基材２０と、底面３０ｂの直径が８００μｍである１４３個のウェル３０と、を有する形成器具１を製造した。

この形成器具１の各ウェル３０内に、初代ラット肝細胞を１．４×１０^３個ずつ播種した。培養液としては、６０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０μｇ／ＬのＥＧＦ、１０ｍｇ／Ｌのインシュリン、７．５ｍｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、０．１μＭの硫酸銅・５水和物、３μｇ／Ｌのセレン酸、５０ｐＭの硫酸亜鉛・７水和物、５０μｇ／Ｌのリノール酸、５８．８ｍｇ／Ｌのペニシリン、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、１．０５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、１．１９ｇ／ＬのＨＥＰＥＳを加えたＤＭＥＭ無血清培地を用いた。なお、初代ラット肝細胞は、公知のコラゲナーゼ灌流法によりラットの肝臓から調製した。

そして、この初代ラット肝細胞を７日間、旋回培養（４０ｒｐｍ）することにより、三次元的に集合した初代ラット肝細胞を含む球状の細胞集合体であるスフェロイドを各ウェル３０内に１つずつ形成させた。図２０Ａは、培養７日目の形成器具１のウェル３０内に保持された浮遊状態のスフェロイドＴを位相差顕微鏡下で撮影した写真の一例である。形成されたスフェロイドＴの直径は、２３５〜２８５μｍの範囲（２５９±１０μｍ：算術平均±標準偏差）であった。

次に、培養容器５０として、上述の実施例１と同様、細胞接着性表面５１である底面を備えた市販の培養ディッシュを準備した。そして、形成器具１の上面１１を培養容器５０の細胞接着性表面５１に当接させて、当該形成器具１のウェル３０内のスフェロイドＴを当該細胞接着性表面５１に沈降させた。図２０Ｂは、形成器具１の上面１１を細胞接着性表面５１に当接させた直後の写真の一例である。

この当接後、１０分が経過した時点で、ピンセットＰを用いて、第二基材２０を端部から徐々に剥離し、第一基材１０から除去した。図２０Ｃは、第一基材１０から第二基材２０を剥離した直後の写真の一例である。

その後、培養容器５０を３７℃で１日間維持することにより、各ウェル３０内でスフェロイドＴを細胞接着性表面５１に接着させた。そして、スフェロイドＴの接着後、第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去した。図２０Ｄは、第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去した直後の写真の一例である。

この結果、細胞接着性表面５１には、所定の間隔で規則的に配置された均一なサイズの複数のスフェロイドＴが残された。図２０Ｅは、第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去してから、当該細胞接着性表面５１に接着した状態で１日培養したスフェロイドＴの写真の一例である。図２０Ｆは、第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去してから、当該細胞接着性表面５１に接着した状態で２日培養したスフェロイドＴの写真の一例である。

スフェロイドＴは、細胞接着性表面５１に接着した状態でさらに培養を継続することができた。培養時間が経過するにつれて、スフェロイドＴを構成する細胞が細胞接着性表面５１に接着すると共に遊走して広がった。

上述の実施例１と同様の方法で形成器具１を作製した。すなわち、まず、ＰＭＭＡ製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ６００μｍ）からなる第一基材１０に、マシニングセンタを用いた穿孔加工処理により、直径６００μｍの円形の貫通穴１３を２７０個形成した。この貫通穴１３は、互いにその中心間距離が６６０μｍとなるよう規則的に配置した。

一方、ＰＤＭＳ製のシート（１３ｍｍ×１３ｍｍ、厚さ４００μｍ）からなる第二基材２０を準備した。そして、接着剤を使用することなく、第二基材２０を第一基材１０の下面１２に剥離可能に接着した。また、上述の実施例１と同様に、細胞非接着性物質の固定を行い、ウェル３０に細胞非接着性を付与した。こうして、ＰＭＭＡ製の透明な第一基材１０と、ＰＤＭＳ製の透明な第二基材２０と、底面３０ｂの直径が６００μｍである２７０個のウェル３０と、を有する形成器具１を製造した。

この形成器具１の各ウェル３０内に、ＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所・バイオリソースセンター）を１．０×１０^３個ずつ播種した。培養液としては、５８．８ｍｇ／Ｌのペニシリン、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、２．２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム及び１０％のウシ胎児血清を添加したＷｉｌｌｉａｍｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ培地を用いた。

そして、このＨｅｐＧ２細胞を５日間培養することにより、三次元的に集合したＨｅｐＧ２細胞を含む球状の細胞集合体であるスフェロイドを各ウェル３０内に１つずつ形成させた。図２１Ａは、培養７日目の形成器具１のウェル３０内に保持された浮遊状態のスフェロイドＴを位相差顕微鏡下で撮影した写真の一例である。形成されたスフェロイドＴの直径は、２４０〜２８０μｍの範囲（２５９±８μｍ：算術平均±標準偏差）であった。

次に、培養容器５０として、上述の実施例１と同様、コラーゲンがコーティングされた細胞接着性表面５１である底面を備えた市販の培養ディッシュを準備した。そして、形成器具１の上面１１を培養器具５０の細胞接着性表面５１に当接させて、当該形成器具１のウェル３０内のスフェロイドＴを当該細胞接着性表面５１に沈降させた。図２１Ｂは、形成器具１の上面１１を細胞接着性表面５１に当接させた直後の写真の一例である。

この当接後、１０分が経過した時点で、ピンセットＰを用いて、第二基材２０を端部から徐々に剥離し、第一基材１０から除去した。図２１Ｃは、第一基材１０から第二基材２０を剥離した直後の写真の一例である。

その後、培養容器５０を３７℃で１日間維持することにより、各ウェル３０内でスフェロイドＴを細胞接着性表面５１に接着させた。そして、スフェロイドＴの接着後、第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去した。図２１Ｄは、第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去した直後の写真の一例である。

この結果、細胞接着性表面５１には、所定の間隔で規則的に配置された均一なサイズの複数のスフェロイドＴが残された。図２１Ｅは、第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去してから、当該細胞接着性表面５１に接着した状態で２日培養したスフェロイドＴの写真の一例である。図２１Ｆは、第一基材１０を細胞接着性表面５１から除去してから、当該細胞接着性表面５１に接着した状態で４日培養したスフェロイドＴの写真の一例である。

スフェロイドＴは、細胞接着性表面５１に接着した状態でさらに培養を継続することができた。培養時間が経過するにつれて、スフェロイドＴを構成する細胞が細胞接着性表面５１に接着すると共に遊走して広がった。

上述の実施例１と同様の方法で形成器具１を作製した。すなわち、まず、ＰＭＭＡ製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ４００μｍ）からなる第一基材１０に、マシニングセンタを用いた穿孔加工処理により、直径３００μｍの円形の貫通穴１３を６７２個形成した。この貫通穴１３は、互いにその中心間距離が４００μｍとなるよう規則的に配置した。

一方、ＰＤＭＳ製のシート（１３ｍｍ×１３ｍｍ、厚さ４００μｍ）からなる第二基材２０を準備した。そして、接着剤を使用することなく、第二基材２０を第一基材１０の下面１２に剥離可能に接着した。また、上述の実施例１と同様に、細胞非接着性物質の固定を行い、ウェル３０に細胞非接着性を付与した。こうして、ＰＭＭＡ製の透明な第一基材１０と、ＰＤＭＳ製の透明な第二基材２０と、底面３０ｂの直径が３００μｍである６７２個のウェル３０と、を有する形成器具１を製造した。

この形成器具１の各ウェル内に、ＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所・バイオリソースセンター）を５．６×１０^２個ずつ播種した。培養液としては、５８．８ｍｇ／Ｌのペニシリン、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、２．２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム及び１０％のウシ胎児血清を添加したＷｉｌｌｉａｍｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ培地を用いた。

そして、このＨｅｐＧ２細胞を７日間培養することにより、三次元的に集合したＨｅｐＧ２細胞を含む球状の細胞集合体であるスフェロイドを各ウェル３０内に１つずつ形成させた。図２２Ａは、培養７日目の形成器具１のウェル３０内に保持された浮遊状態のスフェロイドＴを位相差顕微鏡下で撮影した写真の一例である。形成されたスフェロイドＴの直径は、１９５〜２３５μｍの範囲（２０８±８μｍ：算術平均±標準偏差）であった。

次に、培養容器５０として、上述の実施例１と同様、細胞接着性表面５１である底面を備えた市販の培養ディッシュを準備した。そして、形成器具１の上面１１を培養容器５０の細胞接着性表面５１に当接させて、当該形成器具１のウェル３０内のスフェロイドＴを当該細胞接着性表面５１に沈降させた。図２２Ｂは、形成器具１の上面１１を細胞接着性表面５１に当接させた直後の写真の一例である。

この当接後、１０分が経過した時点で、ピンセットＰを用いて、第二基材２０を端部から徐々に剥離し、第一基材１０から除去した。図２２Ｃは、第一基材１０から第二基材２０を剥離した直後の写真の一例である。

その後、培養容器５０を３７℃で維持することにより、各ウェル３０内でスフェロイドＴを細胞接着性表面５１に接着させた。また、この実施例４では、細胞接着性表面５１に第一基材１０を当接させたまま、当該第一基材１０の貫通穴１３内でスフェロイドＴを培養した。図２２Ｄは、スフェロイドＴを細胞接着性表面５１に転写してから第一基材１０の貫通穴１３内で３日間培養した後の写真の一例である。図２２Ｅは、スフェロイドＴを細胞接着性表面５１に転写してから第一基材１０の貫通穴１３内で１０日間培養した後の写真の一例である。培養時間が経過するにつれて、スフェロイドＴを構成する細胞が細胞接着性表面５１に接着すると共に遊走して広がった。

１ 細胞集合体形成器具、１０ 第一基材、１１ 上面、１２ 下面、１３ 貫通穴、１３ａ 開口、１３ｂ 開口、１３ｃ 内側面、１４ 凸部、１５ 側面、２０ 第二基材、２１ 上面、２２ 下面、３０ ウェル、３０ａ 開口、３０ｂ 底面、３０ｃ 内側面、４０ 培養容器、４１ 底面、５０ 培養容器、５１ 細胞接着性表面、６０ 細胞集合体培養器具、６１ 細胞接着性表面、６２ 凹部、６３ 格子状模様、６３ａ 縦線、６３ｂ 横線、６３ｃ 格子の目、６４ 凸部、Ｃ 細胞、Ｍ 培養液、Ｐ ピンセット、Ｔ 細胞集合体（胚様体、スフェロイド）。

Claims (8)

1. 貫通穴が形成された第一基材と、
   前記貫通穴の一方側を第二基材で覆うことにより形成された、細胞を培養して浮遊状態の細胞集合体を形成するための細胞非接着性のウェルと、
   を有する、
   細胞接着性表面を有する培養器具と組み合わせて使用される細胞集合体形成器具であって、
   前記貫通穴内に露出した前記第二基材の一部は、前記ウェル内に播種された前記細胞が沈降する前記ウェルの底面を形成し、
   前記第二基材は、前記第一基材の他方側の表面を前記細胞接着性表面に当接させて前記ウェル内の前記細胞集合体を前記細胞接着性表面上に沈降させた後に前記第一基材から剥離されるよう前記第一基材の前記一方側の表面に剥離可能に接着されている
   ことを特徴とする細胞集合体形成器具。
2. 前記ウェルの底面の面積は、１×１０^２〜２×１０^６μｍ^２の範囲である
   ことを特徴とする請求項１に記載された細胞集合体形成器具。
3. 前記ウェルは、その底面の面積よりも前記第一基材の他方側の表面における開口の面積が小さくなるテーパ形状に形成されている
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載された細胞集合体形成器具。
4. 前記第一基材の他方側の表面を前記細胞接着性表面に当接させた状態で前記培養器具と接触して互いの相対的な位置を固定する位置決め構造を有する
   ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載された細胞集合体形成器具。
5. 請求項１乃至４のいずれかに記載された細胞集合体形成器具と、
   前記細胞集合体形成器具の前記第一基材の前記他方側の表面を当接させて前記細胞集合体形成器具の前記ウェル内の前記細胞集合体を沈降させる細胞接着性表面を有する培養器具と、
   を含む
   ことを特徴とする細胞集合体転写キット。
6. 前記細胞集合体形成器具及び前記培養器具の少なくとも一方は、前記第一基材の前記他方側の表面を前記細胞接着性表面に当接させた状態で他方と接触して互いの相対的な位置を固定する位置決め構造を有する
   ことを特徴とする請求項５に記載された細胞集合体転写キット。
7. 請求項１乃至４のいずれかに記載された細胞集合体形成器具の前記第一基材の前記他方側の表面を当接させて前記細胞集合体形成器具の前記ウェル内の前記細胞集合体を沈降させる細胞接着性表面と、
   前記第一基材の前記他方側の表面を前記細胞接着性表面に当接させた状態で前記細胞集合体形成器具と接触して互いの相対的な位置を固定する位置決め構造と、
   を有する
   ことを特徴とする細胞集合体培養器具。
8. 請求項１乃至４のいずれかに記載された細胞集合体形成器具の前記ウェル内で浮遊状態の細胞集合体を形成する集合体形成工程と、
   前記細胞集合体形成器具の前記第一基材の前記他方側の表面を所定の細胞接着性表面に当接させて、前記ウェル内の前記細胞集合体を前記細胞接着性表面上に沈降させるとともに、前記細胞接着性表面に当接している前記第一基材から前記第二基材を剥離する転写工程と、
   前記細胞接着性表面に接着した前記細胞集合体を培養する集合体培養工程と、
   を含む
   ことを特徴とする細胞集合体の培養方法。