JP4576539B2 - 細胞培養器具及びこれを用いた細胞培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養器具及びこれを用いた細胞培養方法に関し、特に、細胞を保持可能な複数のウェルが形成された細胞培養器具及びこれを用いた細胞培養方法に関する。

従来、細胞を保持可能な多数のウェルが形成された汎用的な細胞培養器具としては、例えば、直径３ｍｍ程度のウェルが９６個形成された９６ウェルプレートがあった（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。また、より小さなウェルが３８４個形成された３８４ウェルプレートや、さらに小さなウェルが１５３６個形成された１５３６ウェルプレートもあった。
Hiroshi Kurosawa, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol.103,No.5, 389-398,2007 Celeste H. Campbell et al., The FASEBJournal Vol. 16 1917-1927,2002. Scott W. Allen et al., DRUG METABOLISM AND DISPOSITION Vol.29,No.8,1074-1079, 2001.

しかしながら、上記ウェルプレートはいずれも、ウェルごとに操作を行うことが前提であった。すなわち、９６ウェルプレートについては、操作者は、ピペット等の器具を用いた手作業で、ウェルごとに細胞の播種や培養液の交換等の操作を行っていた。また、３８４ウェルプレートや１５３６ウェルプレートについては、専用のロボットを使用して、ウェルごとに溶液の注入や回収等の操作を行う必要があった。

一方、例えば、細胞を保持可能な多数の微小なウェルを基板の表面に形成し、当該ウェル内で細胞を培養する場合には、当該基板の全体を培養液中に浸漬し、当該多数のウェルについて、まとめて一度に細胞の播種や培養液の交換等の細胞培養操作を行うことも考えられる。しかしながら、この場合、例えば、複数の条件で培養するためには、複数の基板を使用する必要があり、さらに、各基板の全体を浸漬するために十分な量の培養液を使用する必要がある。このため、例えば、稀少な細胞や試薬を使用する場合には、可能な培養条件の数が制限されてしまう。

本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、細胞を保持可能な複数のウェルを備えながら操作性に優れた細胞培養器具及びこれを用いた細胞培養方法を提供することをその目的の一つとする。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る細胞培養器具は、細胞を保持可能な複数の第一のウェルを含むウェル群が形成された基部と、前記基部の前記ウェル群の周囲に立設されて、溶液を保持可能な第二のウェルを形成する枠部と、を備えたことを特徴とする。本発明によれば、細胞を保持可能な複数のウェルを備えながら操作性に優れた細胞培養器具を提供することができる。

また、前記第一のウェルの開口部の面積は、１００〜１×１０^６μｍ^２の範囲であることとしてもよい。こうすれば、多数の微小なウェルを備えながら操作性に優れた細胞培養器具を提供することができる。

また、前記基部及び前記枠部は、互いに別体に形成された基部材及び枠部材からそれぞれ構成され、前記枠部材は、前記ウェル群に対応する貫通穴が形成されるとともに、前記基部材に着脱可能に構成され、前記枠部材が前記基部材に取り付けられた状態において、前記貫通穴の内壁が前記ウェル群の周囲に立設されて前記第二のウェルが形成されることとしてもよい。こうすれば、細胞を培養する上での操作性をさらに向上させることができる。

また、この場合、前記基部材には、複数の前記ウェル群が互いに離間して形成され、前記枠部材には、その各々が前記複数のウェル群のうち一つに対応する前記貫通穴が少なくとも一つ形成されていることとしてもよい。さらに、前記枠部材には、その各々が前記複数のウェル群のうち一つに対応する前記貫通穴が複数形成され、前記枠部材が前記基部材に取り付けられた状態において、前記複数の貫通穴の各々の内壁が対応する一つの前記ウェル群の周囲に立設されて複数の前記第二のウェルが形成されることとしてもよい。こうすれば、複数のウェル群の全部又は一部について独立した操作を行うことができる。

また、前記基部材と前記枠部材とには、対応する位置に互いに結合可能な第一結合部と第二結合部とがそれぞれ形成されていることとしてもよい。こうすれば、基部材への枠部材の取り付けを簡便且つ確実に行うことができる。また、この場合、前記基部材には、複数の前記ウェル群が互いに離間して形成され、前記第一結合部は、前記複数のウェル群の各々の周囲に形成されていることとしてもよい。こうすれば、基部材への枠部材の取り付けを簡便且つより確実に行うことができる。また、複数のウェル群の全部又は一部について独立した操作を行うことができる。また、前記第一結合部及び前記第二結合部は、一方が凸形状に形成され、他方が凹形状に形成されて、互いに嵌合可能となっていることとしてもよい。こうすれば、基部材と枠部材との位置決めを簡便且つ確実に行うことができる。また、前記基部材と、前記基部材に取り付けられた前記枠部材と、を一体的に保持し、前記基部材及び前記枠部材のそれぞれの外周の少なくとも一部に当接して前記基部材及び前記枠部材の相対的な位置を固定する当接部を有する保持部材をさらに備えたこととしてもよい。こうすれば、基部材と枠部材との位置決めを簡便且つ確実に行うことができる。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る細胞培養器具用枠部材は、細胞を保持可能な複数の第一のウェルを含むウェル群が形成された基部材に着脱可能に構成され、前記ウェル群に対応する貫通穴が形成され、前記基部材に取り付けられることによって、前記貫通穴の内壁が前記ウェル群の周囲に立設されて、溶液を保持可能な第二のウェルを形成することを特徴とする。本発明によれば、細胞を保持可能な複数のウェルを備えながら操作性に優れた細胞培養器具を構成するための枠部材を提供することができる。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る細胞培養方法は、上述したいずれかの細胞培養器具を用いることを特徴とする。本発明によれば、細胞を保持可能な複数のウェルを備えながら操作性に優れた細胞培養器具を提供することができる。

また、上述の細胞培養方法は、基部材と、当該基部材に着脱可能な枠部材と、を備えた上述の細胞培養器具を用い、前記枠部材を前記基部材に取り付けた状態で、前記細胞培養器具のうち前記第二のウェルに細胞を含む溶液を注入することによって、前記第二のウェルに対応する一つの前記ウェル群に前記細胞を播種する工程と、前記基部材から前記枠部材を取り外して、前記ウェル群で前記細胞を培養する工程と、を含むこととしてもよい。こうすれば、ウェル群への細胞の播種を効率よく確実に行うことができる。

また、上述の細胞培養方法は、基部材と、当該基部材に着脱可能な枠部材と、を備えた上述の細胞培養器具を用い、前記ウェル群で細胞を培養する工程と、前記基部材に前記枠部材を取り付けた状態で、前記細胞培養器具のうち前記第二のウェルに所定の溶液を注入することによって、前記第二のウェルに対応する一つの前記ウェル群の細胞に前記所定の溶液を接触させる工程と、を含むこととしてもよい。こうすれば、ウェル群内の細胞に対する処理を効率よく確実に行うことができる。

また、上述の細胞培養方法は、前記基部材に複数の前記ウェル群が互いに離間して形成され、前記枠部材には、その各々が前記複数のウェル群のうち一つに対応する前記貫通穴が複数形成されている上述の細胞培養器具を用い、前記複数のウェル群で細胞を培養する工程と、前記基部材に前記枠部材を取り付けた状態で、前記細胞培養器具のうち前記複数の第二のウェルに互いに異なる溶液を注入することによって、前記複数の第二のウェルに対応する前記複数のウェル群の細胞に、互いに異なる前記溶液を接触させる工程と、を含むこととしてもよい。こうすれば、複数のウェル群の各々で培養されている細胞に対して、互いに異なる溶液による処理を効率よく確実に行うことができる。

本発明の一実施形態に係る細胞培養器具の一例について分離状態を示す斜視図である。 図１に示すＩＩ−ＩＩ線を通る面で切断した分離状態の器具１の断面図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具の一例について装着状態を示す斜視図である。 図３に示すＩＶ−ＩＶ線で切断した装着状態の器具１の断面図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具の一例について他の側面を説明するための断面図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具の他の例について分離状態を示す斜視図である。 図６に示すＶＩＩ−ＶＩＩ線を通る面で切断した分離状態の器具１の断面図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具の他の例について装着状態を示す斜視図である。 図８に示すＩＸ−ＩＸ線で切断した装着状態の器具１の断面図である。 本発明の一実施形態に係る結合部を有する細胞培養器具の一例について分離状態を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係る結合部を有する細胞培養器具の他の一例について分離状態を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係る結合部を有する細胞培養器具の他の一例について装着状態を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係る結合部を有する細胞培養器具のさらに他の一例について分離状態を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係る結合部を有する細胞培養器具のさらに他の一例について分離状態を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係る保持部材を有する細胞培養器具の一例について分離状態を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係る保持部材を有する細胞培養器具の一例について装着状態を示す斜視図である。 図１６に示すＸＶＩＩ−ＸＶＩＩ線で切断した装着状態の細胞培養器具の断面図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養方法に含まれる主な工程を示すフロー図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具の培養状態の一例を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具の培養状態の他の一例を示す斜視図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具の他の例についての斜視図である。 図２１に示すＸＸＩＩ−ＸＸＩＩ線で切断した器具１の断面図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具で形成された細胞組織体の一例を示す顕微鏡写真である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具で形成された細胞組織体の他の例を示す顕微鏡写真である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具で形成された胚様体の一例を示す顕微鏡写真である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具で形成されたニューロスフェアの一例を示す顕微鏡写真である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具で形成された胚様体の粒径分布の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具で形成されたニューロスフェアの粒径分布の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具で形成された肝細胞スフェロイドの一例を示す顕微鏡写真である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具で形成された胚様体の他の例を示す顕微鏡写真である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具で形成された肝細胞スフェロイドの粒径分布の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具で形成された胚様体の粒径分布の他の例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具の分離状態の外観の一例を示す写真である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具の装着状態の外観の一例を示す写真である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具の装着状態の外観の他の例を示す写真である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具で形成された細胞組織体のさらに他の例を示す顕微鏡写真である。 本発明の一実施形態に係る細胞培養器具で形成された細胞組織体の直径について評価した結果の一例を示す説明図である。

以下に、本発明の一実施形態に係る細胞培養器具及びこれを用いた細胞培養方法について図面を参照しながら説明する。まず、本実施形態に係る細胞培養器具（以下、「器具１」という）について説明する。

図１〜図４は、器具１の一例についての説明図である。図１〜図４に示すように、器具１は、基部材２と、当該基部材２とは別体に形成され当該基部材２に着脱可能な枠部材３と、を備えている。図１は、基部材２から枠部材３が取り外された状態（以下、「分離状態」という）の器具１の斜視図である。図２は、図１に示すＩＩ−ＩＩ線を通る面で切断した分離状態の器具１の断面図である。図３は、基部材２に枠部材３が取り付けられた状態（以下、「装着状態」という）の器具１の斜視図である。図４は、図３に示すＩＶ−ＩＶ線を通る面で切断した装着状態の器具１の断面図である。

図１〜図４に示すように、基部材２には、一つのウェル群（以下、「マイクロウェル群２０」という）が形成されている。すなわち、本実施形態において、基部材２は、厚さが一定の平板形状に形成された第一基板部１０を有している。そして、第一基板部１０の上方側の平坦な表面（以下、「上面１１」という）の一部にマイクロウェル群２０が形成されている。

マイクロウェル群２０は、細胞を保持可能な複数の第一のウェル（以下、「マイクロウェル２１」という）を含んで構成されている。各マイクロウェル２１は、基部材２の上面１１に開口する有底の穴として形成されている。すなわち、各マイクロウェル２１は、円形の平坦な底面２２と、当該底面２２の周囲に立設する所定高さの円筒内壁として形成された内壁２３と、を有している。複数のマイクロウェル２１は、第一基板部１０の上面１１の所定範囲内に、所定の間隔で規則的に配置されている。

基部材２は、目的に応じて選択される任意の材料を用いて形成することができる。すなわち、基部材２を構成する材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート（ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等）、ポリビニル等の合成樹脂、ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）等のシリコン系樹脂、ＥＰＤＭ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｄｉｅｎｅ Ｍｏｎｏｍｅｒ）等の合成ゴム、天然ゴム、ガラス、セラミック、ステンレス鋼等の金属材料、からなる群より選択される１つの材料を単独で用い、又は２以上の材料を組み合わせて用いることができる。

また、基部材２を構成する材料、特に、マイクロウェル群２０が形成されている部分を構成する材料としては、例えば、当該マイクロウェル群２０内で培養された細胞を顕微鏡等の光学的な手段により観察する場合の利便性の点から、上述した材料のうち、透光性の材料を好ましく用いることができる。すなわち、本実施形態において、第一基板部１０は、例えば、透光性の合成樹脂やガラスを用いて形成することができる。

具体的に、例えば、第一基板部１０を透光性の合成樹脂から成形し、当該第一基板部１０の上面１１の一部に、当該第一基板部１０の厚さより小さい所定深さの複数の有底孔を複数のマイクロウェル２１として形成することができる。また、例えば、透光性の合成樹脂から成形された第一の平板の一部に複数の貫通孔を形成し、当該第一の平板の当該貫通孔が開口する表面の一つに、ガラスから成形された第二の平板を接着することにより、当該第一の平板と当該第二の平板とから構成される第一基板部１０を形成することができる。この場合、第一の平板の各貫通孔の内壁が各マイクロウェル２１の内壁２３となり、各貫通孔を塞ぐ第二の平板の表面の一部が各マイクロウェル２１の底面２２となる。なお、この場合、第一の平板及び第二の平板としては、同一の材料から成形されたものを用いることもできる。

マイクロウェル２１の形成には、目的に応じて選択される任意の加工方法を用いることができる。すなわち、例えば、マシニングセンタ等を用いた穿孔加工、レーザー等を用いた光微細加工、エッチング加工、エンボス加工等により、予め成形された第一基板部１０の一部にマイクロウェル２１を形成することができる。また、例えば、射出成形、プレス成形、ステレオリソグラフィー等により、第一基板部１０の成形と同時に、当該第一基板部１０の一部にマイクロウェル２１を形成することができる。

マイクロウェル２１は、目的に応じた任意のサイズで形成することができる。マイクロウェル２１を比較的小さな所定範囲のサイズで形成することにより、例えば、数ｃｍ角の基部材２に微小なマイクロウェル２１を多数形成することができる。この場合、数の限られた希少な細胞を多数のマイクロウェル２１で培養することができる。また、適切なサイズの細胞組織体（細胞が三次元的に集合し互いに結合することで形成される細胞塊）を各マイクロウェル２１で形成することが可能となる。

すなわち、各マイクロウェル２１のうち、基部材２の表面（本実施形態においては、第一基板部１０の上面１１）に開口する部分（以下、「開口部２４」という）の面積は、例えば、１００〜１×１０^６μｍ^２の範囲とすることができ、好ましくは７×１０^３〜５×１０^５μｍ^２の範囲とすることができる。具体的に、例えば、図１〜図４に示すように、マイクロウェル２１の開口部２４が円形である場合には、その直径は１０〜１０００μｍの範囲とすることができ、好ましくは１００〜８００μｍの範囲とすることができる。

また、各マイクロウェル２１の底面２２の面積は、例えば、１００〜１×１０^６μｍ^２の範囲とすることができ、好ましくは７×１０^３〜５×１０^５μｍ^２の範囲とすることができる。具体的に、例えば、図１〜図４に示すように、マイクロウェル２１の底面２２が円形である場合には、その直径は１０〜１０００μｍの範囲とすることができ、好ましくは１００〜８００μｍの範囲とすることができる。

開口部２４又は底面２２の面積が上記範囲内である場合には、１つの基部材２に多数のマイクロウェル２１を形成することができる。このため、稀少な細胞であっても互いに離隔された多数のマイクロウェル２１の各々で培養することができる。また、この場合、多数のマイクロウェル２１の各々で、所定範囲の均一なサイズの細胞組織体（例えば、球状のスフェロイド）を１つずつ形成することができる。すなわち、細胞組織体が所定のサイズより大きくなると、当該細胞組織体の内部に含まれる細胞に対して、周囲の培養液から酸素や栄養が十分に供給されなくなる。この点、各マイクロウェルの開口部２４及び底面２２の面積が上記範囲の上限値又はそれより小さい場合には、内部の細胞を良好な状態に維持できる適切なサイズの細胞組織体を大量且つ確実に形成することができる。これに対し、開口部２４又は底面２２の面積が上記範囲の上限値より大きい場合には、各マイクロウェル２１で形成される細胞組織体のサイズが大きくなりすぎることがある。また、この場合、１つのマイクロウェル２１内に複数個の細胞組織体が形成されてしまうことがある。一方、開口部２４又は底面２２の面積が上記範囲の下限値より小さい場合には、各マイクロウェル２１内に細胞を確実に保持させることが容易でない。また、この場合、増殖した細胞によりマイクロウェル２１が塞がれることがある。また、隣接するマイクロウェル２１間を繋ぐように細胞が増殖してしまうこともある。

各マイクロウェル２１の深さ（本実施形態においては、図２及び図４に示す内壁２３の高さ）は、例えば、２．５〜２０００μｍの範囲とすることが好ましい。マイクロウェル２１の深さが上記範囲の上限値より大きい場合には、当該マイクロウェル２１の底面２２に保持された細胞や細胞組織体に対して、当該マイクロウェル２１外の培養液から酸素や栄養素を十分に供給できないことがある。一方、マイクロウェル２１の深さが上記範囲の下限値より小さい場合には、当該マイクロウェル２１内に保持された細胞又は細胞組織体が、培養の操作中に当該マイクロウェル２１外に脱離してしまうことがある。

また、各マイクロウェル２１の開口部２４又は底面２２の代表長さ（開口部２４及び底面２２が円形又は多角形に形成されている場合には、それぞれ当該円の直径又は当該多角形の対角線長さ）に対する、当該マイクロウェル２１の深さの比率（以下、「アスペクト比」という）は、０．５〜２．０の範囲とすることが好ましい。具体的に、例えば、開口部２４及び底面２２が直径５μｍの円形である場合には、マイクロウェル２１の深さを２．５μｍ〜１０μｍとすることが好ましい。また、例えば、開口部２４及び底面２２が直径１０００μｍの円形である場合には、マイクロウェル２１の深さを５００μｍ〜２０００μｍとすることが好ましい。アスペクト比が上記範囲の上限値より大きい場合には、各マイクロウェル２１の底面２２に保持された細胞又は形成された細胞組織体に対して、当該マイクロウェル２１外の培養液から酸素や栄養素を十分に供給できないことがある。一方、アスペクト比が上記範囲の下限値より小さい場合には、マイクロウェル２１内に保持された細胞又は細胞組織体が、培養の操作中に当該マイクロウェル２１外に脱離してしまうことがある。

なお、各マイクロウェル２１の開口部２４の面積、底面２２の面積、深さがそれぞれの上記範囲の上限値又はそれより小さい場合には、各マイクロウェル２１に保持できる溶液が微量となる。このため、例えば、基部材２の全体を気相中に曝した状態で、各マイクロウェル２１に対して溶液の注入や回収等の操作を行うと、操作中に当該各マイクロウェル２１内の溶液が蒸発して、当該溶液の組成や当該溶液中の細胞に不都合が生じる場合がある。したがって、この場合、基部材２のうち、少なくともマイクロウェル群２０が形成されている表面部分（本実施形態においては、第一基板部１０の上面１１のうちマイクロウェル群２０が形成されている部分）の全体を溶液中に浸漬した状態で操作を行うことが好ましい。

マイクロウェル２１の底面２２の全体又は一部は、基板部１０を構成する材料の選択や、当該底面２２に対する表面修飾処理によって、細胞接着性又は細胞非接着性とすることができる。また、マイクロウェル２１の底面２２で細胞を培養する場合には、内壁２３は、細胞非接着性とすることが好ましい。ここで、細胞接着性の表面とは、例えば、培養に用いる溶液中において、細胞が当該表面上に沈降した場合に、当該細胞が、その形状を球形から変化させて、比較的扁平な形状で接着することができる表面である。一方、細胞非接着性の表面とは、例えば、培養に用いる溶液中において、細胞が当該表面上に沈降した場合に、当該細胞が、その形状を球状からほとんど変化させず、極めて弱く接着する表面である。この場合、細胞非接着性表面上の細胞は、当該表面に全く接着できず球形のまま溶液中で浮遊状態を維持し、又は培養液の流れ等によって当該表面から容易に脱離する。

マイクロウェル２１の底面２２及び内壁２３は、例えば、第一基板部１０を構成する材料の表面そのものとすることができ、又は当該第一基板部１０を構成する材料表面に細胞接着性物質又は細胞非接着性物質が物理的又は化学的に固定された表面として形成することができる。

細胞接着性物質としては、用いる細胞の細胞膜に存在するたんぱく質等の細胞表面分子（例えば、インテグリンや糖鎖受容体等）のうち特定のものに対して結合し得る物質であれば特に限られず用いることができる。すなわち、例えば、生体から取得されたタンパク質（コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等）や、細胞接着性を示す特定のアミノ酸配列（アルギニン・グリシン・アスパラギン酸（いわゆるＲＧＤ）配列等）や、特定の糖鎖配列（ガラクトース側鎖等）を有する合成された細胞接着性物質を、細胞の種類に応じて適宜選択して用いることができる。

細胞非接着性物質としては、用いる細胞の細胞膜に存在するたんぱく質や糖鎖等の細胞表面分子に対して結合しない物質であれば特に限られず用いることができる。すなわち、例えば、生体から取得されたタンパク質（アルブミン等）や、溶液中で極めて高い親水性を示す高分子（ポリエチレングリコール及びその誘導体等）や、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ｐｏｌｙ―ＨＥＭＡ（ポリヒドロキシエチルメタクリレート）、ＳＰＣ（セグメント化ポリウレタン）等の化合物を、細胞の種類に応じて適宜選択して用いることができる。

これら細胞接着性物質又は細胞非接着性物質は、例えば、これらを含む水溶液をマイクロウェル２１の底面２２及び内壁２３上で乾燥させることにより、又は当該水溶液中において、当該物質が有する官能基と当該底面２２及び内壁２３に結合している官能基との間で化学反応（例えば、カルボキシル基やアミノ基等の間の縮合反応等）を起こさせて共有結合を形成させることにより、又は当該水溶液中において、当該物質が有するチオール基と当該底面２２及び内壁２３に予め形成された金属（プラチナ、金等）薄膜とを結合させることにより、当該底面２２及び内壁２３上に固定化することができる。

マイクロウェル２１の底面２２の全体を細胞非接着性とした場合には、当該マイクロウェル２１内で、当該底面２２に接着していない細胞組織体を形成することができる。また、例えば、マイクロウェル２１の底面２２の中央部分に細胞接着性の第一領域を形成し、当該第一領域を囲む周辺部分を細胞非接着性の第二領域とすることにより、当該マイクロウェル２１内で、当該底面２２のうち第一領域に接着した細胞組織体を形成することができる。このようなマイクロウェル２１内における細胞組織体の形成は、マイクロウェル２１の開口部２４又は底面２２の面積が上述した範囲内である場合に、特に簡便かつ確実に達成することができる。なお、このように各マイクロウェル２１内で細胞組織体を形成する場合には、内壁２３を細胞非接着性とすることが好ましい。また、当然ながら、マイクロウェル２１の底面２２の全体を細胞接着性とすることにより、当該底面２２の全体に細胞を二次元的に接着させて培養することができる。

枠部材３には、図１〜図４に示すように、基部材２に形成された一つのマイクロウェル群２０に対応する貫通穴として一つの窓部４０が形成されている。すなわち、本実施形態において、枠部材３は、厚さが一定の平板形状に形成された第二基板部３０を有しており、当該第二基板部３０を貫通する矩形の穴が窓部４０として形成されている。この窓部４０は、第二基板部３０のうち、基部材２のマイクロウェル群２０に対応する位置に、当該マイクロウェル群２０の全体を収容可能な開口面積で形成されている。

また、枠部材３は、基部材２に着脱可能に構成されている。すなわち、この枠部材３は、基部材２のマイクロウェル群２０が窓部４０内に配置されるように、当該基部材２に取り付け可能に構成され、且つ、取り付け後に再び当該基部材２から取り外し可能に構成されている。さらに、この枠部材３は、基部材２への取り付け及び基部材２からの取り外しを複数回、繰り返し行うことができるように構成されている。

そして、図３及び図４に示すように、枠部材３が基部材２に取り付けられた装着状態の器具１において、当該枠部材３は、当該基部材２のマイクロウェル群２０の周囲に立設される。より具体的には、装着状態において、窓部４０の内壁４１は、対応する一つのマイクロウェル群２０の周囲に立設される。この結果、器具１においては、窓部４０に対応する、溶液を保持可能な第二のウェル（以下、「マクロウェル５０」という）が形成される。

すなわち、マクロウェル５０は、一つのマイクロウェル群２０が形成された底面５１と、窓部４０の内壁４１と、を有する有底の穴として形成される。このマクロウェル５０の底面５１は、基材部２のうち、一つのマイクロウェル群２０が形成されている表面部分（本実施形態においては、第一基板部１０の上面１１のうち、マイクロウェル群２０が形成されている部分）である。そして、例えば、装着状態の器具１を気相中に載置した状態でマクロウェル５０内に溶液を注入した場合には、当該マクロウェル５０は、当該溶液を当該マクロウェル５０外に漏洩させることなく、底面５１と内壁４１とに囲まれたその内部に保持することができる。

マクロウェル５０の底面５１の面積は、例えば、１〜２５００ｍｍ^２の範囲とすることができ、好ましくは１０〜１０００ｍｍ^２の範囲とすることができる。また、マクロウェル５０の深さ（すなわち、底面５１を囲む窓部４０の内壁４１の高さ）は、例えば、５０μｍ以上とすることができ、好ましくは５００μｍ以上とすることができ、より好ましくは１０００μｍ以上とすることができる。底面５１の面積及びマクロウェル５０の高さがそれぞれ上記範囲内である場合には、マクロウェル５０内に溶液を安定して保持することができる。

枠部材３は、目的に応じて選択される任意の材料を用いて形成することができる。すなわち、枠部材３を構成する材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート（ＰＭＭＡ等）、ポリビニル等の合成樹脂、ＰＤＭＳ等のシリコン系樹脂、ＥＰＤＭ等の合成ゴム、天然ゴム、ガラス、セラミック、ステンレス鋼等の金属材料、からなる群より選択される１つの材料を単独で用い、又は２以上の材料を組み合わせて用いることができる。

また、枠部材３のうち、少なくとも窓部４０の周囲の表面部分を、基部材２のうち、マイクロウェル群２０の周囲の表面部分と密着可能な材料で形成した場合には、当該枠部材３を当該基部材２に取り付けるための特別な部分を器具１に形成することなく、当該枠部材３を当該基部材２に取り付け可能に構成することができる。また、この場合、さらに、器具１の装着状態において溶液を保持可能なマクロウェル５０を簡単且つ確実に形成することもできる。このような密着性の高い材料は、基部材２を構成する材料との組み合わせにより適宜選択することができる。すなわち、例えば、上述の枠部材３の形成に用いられる材料のうち、ＰＤＭＳ等のシリコン系樹脂、合成ゴム、天然ゴム等の伸縮性のある樹脂（エラストマー樹脂）を好ましく用いることができる。

具体的に、例えば、第一基板部１０を透光性の合成樹脂により形成する一方で、第二基板部３０の全体、又は第二基板部３０の下方側の平坦な表面（以下、「下面３１」という）のうち窓部４０を囲む部分をシリコン系樹脂で形成することができる。この場合、枠部材３を基部材２に取り付ける際に、窓部４０内にマイクロウェル群２０が収容されるよう、当該枠部材３と基部材２とを位置合わせするとともに、当該枠部材３の下面３１と当該基部材２の上面１１とを圧接することにより、当該窓部４０の内壁４１を、当該マイクロウェル群２０の周囲の上面１１に密着して立設させることができる。

窓部４０は、目的に応じて選択される任意の加工方法を用いて形成することができる。すなわち、例えば、マシニングセンタ等を用いた穿孔加工、レーザー等を用いた光微細加工、エッチング加工、エンボス加工等により、予め成形された第二基板部３０の一部に窓部４０を形成することができる。また、例えば、射出成形、プレス成形、ステレオリソグラフィー等により、第二基板部３０の成形と同時に、当該第二基板部３０の一部に窓部４０を形成することができる。

図５には、器具１の他の側面を説明するため、図４に示したものと同一の器具１の断面を示す。図５に示すように、マイクロウェル群２０は、その辺縁を構成する、枠部材３に最も近い位置に形成されたマイクロウェル（以下、「辺縁ウェル２１ｉ」という）と、その中央部分を構成する、当該枠部材３から比較的遠い位置に形成されたマイクロウェル（以下、「中央ウェル２１ｉｉ」という）と、を含んでいる。

上述のように、マイクロウェル群２０において、互いに結合を形成可能な細胞を培養することにより、これら辺縁ウェル２１ｉ及び中央ウェル２１ｉｉの各々に、当該細胞が三次元的に集合した細胞組織体を１つずつ形成することができる。

この場合、辺縁ウェル２１ｉと中央ウェル２１ｉｉとが同一の形状及びサイズで形成されているにもかかわらず、当該辺縁ウェル２１ｉで形成された細胞組織体（以下、「辺縁組織体」という）のサイズと、当該中央ウェル２１ｉｉで形成された細胞組織体（以下、「中央組織体」という）のサイズと、が異なってしまうことがある。すなわち、例えば、辺縁組織体のサイズは、中央組織体に比べて大きくなる傾向がある。

この点、本発明の発明者は、鋭意検討を重ねた結果、辺縁ウェル２１ｉと枠部３との距離Ｄ（図５に示す例においては、辺縁ウェル２１ｉの枠部材３側の端部と、当該枠部材３の内壁４１と、の距離Ｄ）を所定の微小な閾値以下とすることにより、辺縁組織体のサイズを中央組織体のサイズに限りなく近づけることができることを独自に見出した。

すなわち、この距離Ｄは、５．０ｍｍ以下とすることが好ましく、２．０ｍｍ以下とすることがより好ましく、１．０ｍｍ以下とすることが特に好ましい。距離Ｄを上記の範囲とすることにより、中央組織体のサイズに対する辺縁組織体のサイズの比を、例えば、１．２５以下とすることができ、さらに１．２０以下とすることもできる。

距離Ｄを低減すると、辺縁ウェル２１ｉと枠部材３とが近接するため、当該辺縁ウェル２１ｉにおける細胞培養を行う上での操作や観察の難易度が高くなる。しかしながら、枠部材３は、基部材２に対して着脱可能となっている。このため、例えば、必要に応じて、枠部材３を基部材２から取り外し、この分離状態で操作や観察を行うことができる。

したがって、着脱可能な基部材２と枠部材３とを備えた器具１を用い、当該器具１における上記距離Ｄを微小な上記範囲内に低減することにより、辺縁ウェル２１ｉ及び中央ウェル２１ｉｉの各々において、極めて均一なサイズの細胞組織体を１つずつ形成し、培養することが可能となる。

また、基部材２には複数のマイクロウェル群２０を互いに離間して形成することもできる。この場合、枠部材３には、その各々が複数のマイクロウェル群２０のうち一つに対応する窓部４０を少なくとも一つの形成することができる。図６〜図９は、この場合の器具１の一例についての説明図である。図６は、分離状態の器具１の斜視図である。図７は、図６に示すＶＩＩ−ＶＩＩ線を通る面で切断した分離状態の器具１の断面図である。図８は、装着状態の器具１の斜視図である。図９は、図８に示すＩＸ−ＩＸ線を通る面で切断した装着状態の器具１の断面図である。なお、以下の例に係る器具１については、上述の図１〜図４に示した例と同様の部分には同様の符号を付し、重複する点については詳細な説明を省略する。

図６〜図９に示すように、基部材２には、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄが互いに離間して形成されている。各マイクロウェル群２０ａ〜２０ｄは、細胞を保持可能な複数のマイクロウェル２１を含んで構成されている。

一方、枠部材３には、その各々が基部材２の４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち一つに対応する４つの窓部４０ａ〜４０ｄが形成されている。すなわち、４つの窓部４０ａ〜４０ｄの各々は、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち互いに異なる一つに対応する位置に形成されている。この結果、枠部材３は、４つの窓部４０ａ〜４０ｄの間を仕切る十字状に形成された仕切部３２を有している。

そして、図８及び図９に示すように、装着状態の器具１においては、各窓部４０ａ〜４０ｄ（図６及び図７参照）の内壁４１ａ〜４１ｄが、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち対応する一つの周囲にそれぞれ立設される。この結果、器具１には、枠部材３の仕切部３２によって仕切られた４つのマクロウェル５０ａ〜５０ｄが形成される。各マクロウェル５０ａ〜５０ｄの底面５１ａ〜５１ｄには、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち対応する一つがそれぞれ形成される。

そして、枠部材３の下面３１のうち少なくとも４つの窓部４０ａ〜４０ｄの各々の周辺部分と、基部材２の上面１１のうち少なくとも４つのマイクロウェル群２０の各々の周辺部分と、は互いに密着している。この結果、４つのマクロウェル５０ａ〜５０ｄは、互いに独立に溶液を保持できるように形成されている。

また、基部材２と枠部材３とには、対応する位置に互いに結合可能な第一結合部と第二結合部とをそれぞれ形成することができる。図１０は、図６〜図９に示す例に係る器具１に第一結合部及び第二結合部を形成した場合の一例について、その分離状態を示す斜視図である。

図１０に示す器具１においては、第一基板部１０の上面１１のうち、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄの全体を囲む外周部分の一部に、当該上面１１に所定高さで突出する凸形状の４つの第一結合部（以下、「嵌合突起６０」という）が形成されている。一方、第二基板部３０の下面３１のうち、４つの窓部４０ａ〜４０ｄの全体を囲む外周部分の一部であって、第一基板部１０の４つの嵌合突起６０に対応する位置には、所定深さの凹形状の４つの有底穴（以下、「嵌合穴６１」という）が形成されている。

これら嵌合突起６０と嵌合穴６１とは、対応する形状で形成され、嵌合可能となっている。そして、対応する基部材２の嵌合突起６０と枠部材３の嵌合穴６１とをそれぞれ嵌合させることにより、当該基部材２に当該枠部材３を取り付けて、図８及び図９に示すような装着状態の器具１を構成することができる。この場合、基部材２と枠部材３とを、予め定められた位置関係で、簡便且つ確実に結合させることができる。

また、基部材２に複数のマイクロウェル群２０が互いに離間して形成されている場合には、当該基部材２の当該複数のマイクロウェル群２０の各々の周囲に、枠部材３の一部と結合可能な結合部を形成することもできる。図１１及び図１２は、この場合の器具１の一例について、その分離状態及び装着状態をそれぞれ示す斜視図である。

図１１及び図１２に示す器具１においては、第一基板部１０の上面１１のうち、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄの各々の外周部分に嵌合突起６０が４つずつ形成されている。一方、枠部材３には、基部材２の４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち一つに対応する一つの窓部４０のみが形成されている。そして、この枠部材３の下面３１のうち窓部４０の周囲部分には、基部材２の各マイクロウェル群２０ａ〜２０ｄの周囲に形成された４つの嵌合突起６０に対応する位置に、当該４つの嵌合突起６０と嵌合可能な形状で４つの嵌合穴６１が形成されている。

そして、図１２に示すように、装着状態の器具１においては、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち、一つのマイクロウェル群２０ｂの周囲にのみ、一つの窓部４０の内壁４１が立設される。この結果、基部材２上に一つのマクロウェル５０が形成される。このマクロウェル５０の底面５１には一つのマイクロウェル群２０ｂが形成される。

なお、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄの各々の外周には、同一の配置で４つの嵌合突起６０がそれぞれ形成されているため、枠部材３は、当該４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのいずれにも対応して構成されている。すなわち、枠部材３を、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち、任意の一つの周囲に取り付けることにより、当該４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうちいずれか一つが底面５１に形成された一つのマクロウェル５０を形成することができる。

また、例えば、上述の図１０に示すような、４つの窓部４０が形成された枠部材３において、当該４つの窓部４０の各々の周囲に、図１１及び図１２に示す嵌合突起６０に対応する嵌合穴６１を４つずつ形成することもできる。そして、対応する基部材２の嵌合突起６０と枠部材３の嵌合穴６１とをそれぞれ嵌合させることにより、当該基部材２に当該枠部材３を取り付けて、図８及び図９に示すような装着状態の器具１を構成することができる。この場合、基部材２と枠部材３とを、予め定められた位置関係で、簡便且つより確実に結合させることができる。

また、図１１及び図１２には、枠部材３に、１つの貫通穴４０が形成されている例を示したが、枠部材３には、複数のマイクロウェル群２０のうち一部に対応する２以上の貫通穴４０を形成することもできる。すなわち、例えば、枠部材３には、図１１及び図１２に示すような４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち、２つのマイクロウェル群２０ａ，２０ｂの各々に対応する２つの貫通穴４０を形成することもできる。この場合、装着状態の器具１においては、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄの一部である、２つのマイクロウェル群２０ａ，２０ｂの各々の周囲にのみ窓部４０の内壁４１を立設させて、２つのマクロウェル５０を形成することができる。

図１３は、第一結合部及び第二結合部を備えた器具１の他の例について、その分離状態を示す斜視図である。図１３に示す器具１においては、第一基板部１０の上面に、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄの全体を囲む所定深さの堀状に第一結合部（以下、「堀部６２」という）が形成されている。一方、第二基板部３０の下面３１には、第一基板部１０の堀部６２に対応して、４つの窓部４０ａ〜４０ｄの全体を囲む所定高さの堤防状の第二結合部（以下、「堤防部６３」という）が形成されている。これら堀部６２と堤防部６３とは、対応する形状で形成され、嵌合可能となっている。

そして、基部材２の堀部６２と枠部材３の堤防部６３とを嵌合させることにより、当該基部材２に当該枠部材３を取り付けて、図８及び図９に示すような装着状態の器具１を構成することができる。この場合、基部材２と枠部材３とを、予め定められた位置関係で、簡便且つ確実に結合させることができる。

また、基部材２に複数のマイクロウェル群２０を互いに離間して形成している場合には、当該基部材２の当該複数のマイクロウェル群２０の各々の周囲に、枠部材３の一部と結合可能な結合部を形成することもできる。図１４は、この場合の器具１の一例について、その分離状態を示す斜視図である。

図１４に示す器具１においては、第一基板部１０の上面１１のうち、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄの各々の外周を囲む堀部６２が形成されている。一方、枠部材３は、基部材２の４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち一つに対応する一つの窓部４０が形成されている。そして、この枠部材３は、基部材２の４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち一つの周囲に形成された堀部６２の一部に嵌合可能な形状で形成されている。そして、装着状態の器具１においては、図１２に示した例と同様に、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち一つの周囲にのみ、枠部材３の一つの窓部４０の内壁４１が立設されて、一つのマクロウェル５０が形成される。

なお、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄの各々の外周には、同一の配置で堀部６２がそれぞれ形成されているため、枠部材３は、当該４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのいずれにも対応して構成されている。すなわち、枠部材３を、４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち、任意の一つの周囲に取り付けることにより、当該４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうちいずれか一つが底面５１に形成された一つのマクロウェル５０を形成することができる。

また、例えば、基部材２において、図１４に示すような堀部６２が形成される場合には、上述の図１３に示すような、４つの窓部４０が形成された枠部材３を用いることもできる。この場合、枠部材３の堤防部６３（図１３参照）は、図１４に示す基部材２の堀部６２に対応して、当該枠部材３の４つの窓部４０の各々の周囲に突出して形成された格子状とすることもできる。そして、これら基部材２の堀部６２と枠部材３の堤防部６３とを嵌合させることにより、当該基部材２に当該枠部材３を取り付けて、図８及び図９に示すような装着状態の器具１を構成することができる。この場合、基部材２と枠部材３とを、予め定められた位置関係で、簡便且つより確実に結合させることができる。

また、器具１は、基部材２と、当該基部材２に取り付けられた枠部材３と、を一体的に保持する保持部材をさらに備えることもできる。この場合、保持部材は、基部材２及び枠部材３のそれぞれの外周の少なくとも一部に当接して当該基部材２及び当該枠部材３の相対的な位置を固定する当接部を有する。図１５〜図１７は、この場合の一例に係る器具１ついての説明図である。図１５及び図１６は、この例に係る器具１について、その分離状態及び装着状態をそれぞれ示す斜視図である。図１７は、図１６に示すＸＶＩＩ−ＸＶＩＩ線を通る面で切断した装着状態の器具１の断面図である。

図１５〜図１７に示すように、この器具１は、基部材２と、枠部材３と、保持部材４と、を備えている。保持部材４は、厚さが一定の平板形状に形成された第三基板部７０を有している。この第三基板部７０の上方側の平坦な表面には、基部材２及び枠部材３を収容するための矩形の有底穴（以下、「収容部７１」という）が形成されている。この収容部７１は、矩形の平坦な底面７２と、当該底面７２の周囲に立設する所定高さの内壁７３と、を有している。

そして、図１６及び図１７に示す装着状態の器具１において、基部材２は、収容部７１の底面７２上に載置される。さらに、枠部材３は、基部材２に取り付けられた状態で収容部７１に収容される。すなわち、基部材２と枠部材３とは積層された状態で、保持部材４の収容部７１に嵌め入れられている。このため、基部材２の外周２２と、当該基部材２に取り付けられた枠部材３の外周３３と、は収容部７１の内壁７３に当接している。この結果、器具１においては、基部材２と枠部材３とを、予め定められた位置関係で、簡便且つ確実に保持することができる。

また、図１５〜図１７に示すように、この例に係る枠部材３の一部には、上方に突出した凸形状の取手部３０ａが形成されている。このため、操作者は、例えば、ピンセットにより取手部３０ａをつまむことによって、枠部材３の基部材２への取り付けや取り外しを簡単に行うことができる。この取手部３０ａは、枠部材３の成形時に一体的に形成することができ、また、予め形成された枠部材３に新たに形成することもできる。また、このような凸形状の取手部３０は、上述の又は後述の例に係る枠部材３も含め、本発明に係る任意の枠部材３に任意の形状で形成することができる。

次に、本実施形態に係る細胞培養方法（以下、「本方法」という）について説明する。本方法においては、器具１のマイクロウェル群２０で細胞を培養する。ここで、細胞としては、由来とする動物種や臓器・組織の種類等を問わず、目的に応じた任意のものを用いることができる。具体的に、この細胞としては、例えば、ヒト又はヒト以外の動物（サル、ブタ、イヌ、ラット、マウス等）の任意の臓器又は組織（肝臓、膵臓、腎臓、神経、皮膚等）に由来する初代細胞（幹細胞やＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を含む）、樹立されている株化細胞、又はこれらに遺伝子操作等を施した細胞を用いることができる。また、細胞としては、一種類の細胞を単独で用いることもできるし、二種類以上の細胞を任意の比率で混在させて用いることもできる。また、細胞組織体を形成する場合には、細胞同士の間で互いに結合を形成できる細胞を好ましく用いることができる。

また、細胞の培養に用いる溶液としては、用いる細胞の生存状態や機能等を維持することができるよう、必要な塩類や栄養成分等を適切な濃度で含む任意の水溶液を用いることができる。具体的に、この溶液としては、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）等の基礎培地に抗生物質等を添加した培養液や、いわゆる生理食塩水等を用いることができる。

図１８は、本方法に含まれる主な工程を示すフロー図である。図１８に示すように、本方法は、器具１のマイクロウェル群２０に細胞を播種する播種工程Ｓ１００と、当該マイクロウェル群２０で細胞を培養する培養工程Ｓ２００と、当該ウェル群２０で培養された細胞に対して所定の処理を施す処理工程Ｓ３００と、を含む。

播種工程Ｓ１００においては、例えば、図３及び図４に示すような枠部材３を基部材２に取り付けた装着状態で、器具１のうちマクロウェル５０に細胞を含む溶液を注入することによって、当該マクロウェル５０に対応する一つのマイクロウェル群２０に細胞を播種することができる。具体的に、この場合、例えば、まず、装着状態の器具１を、クリーンベンチ等の無菌的な培養操作空間内において気相（空気）中に載置する。そして、操作者は、ピペットを用いて、細胞を分散した培養液を、器具１のマクロウェル５０内に注ぎ入れる。この結果、マクロウェル５０の底面５１に形成された複数のマイクロウェル２１の各々に細胞を播種することができる。このような播種工程Ｓ１００においては、播種に必要な細胞や溶液の量を、マクロウェル５０の容積に対応する量に低減することができ、且つ各マイクロウェル２１に細胞を確実に播種することができる。

また、例えば、図８及び図９に示すように、器具１に複数のマクロウェル５０ａ〜５０ｄが形成される場合には、当該複数のマクロウェル５０ａ〜５０ｄの各々に、互いに異なる条件で細胞を播種することもできる。すなわち、例えば、マクロウェル５０ａ〜５０ｄごとに、互いに異なる種類の細胞を播種することができ、互いに異なる密度で細胞を播種することができ、又は互いに異なる培養液を用いて細胞を播種することができる。

培養工程Ｓ２００においては、例えば、播種工程Ｓ１００で装着状態の器具１に細胞が播種された場合には、基部材２から枠部材３を取り外して、分離状態の器具１のマイクロウェル群２０で当該細胞を培養することができる。すなわち、例えば、枠部材３が取り外された基部材２のみ（分離状態の器具１）を、所定の培養容器（例えば、細胞培養に汎用されている数ｃｍ径のプラスチックディッシュ）内に載置し、その全体を培養液中に浸漬した状態で細胞を培養する。

また、培養工程Ｓ２００においては、基部材２から枠部材３を取外すことなく、装着状態の器具１で細胞の培養を行うこともできる。この場合もまた、器具１は、所定の培養容器内に載置される。そして、その全体が培養液中に浸漬された器具１のマイクロウェル群２０で細胞が培養される。

図１９は、分離状態の器具１（枠部材３が取り外された基部材２）の全体を培養液Ｍ中に浸漬して培養を行う場合の一例を示す説明図である。また、図２０は、装着状態の器具１の全体を培養液Ｍ中に浸漬して培養を行う場合の一例を示す説明図である。

図１９及び図２０に示すように、器具１を用いた細胞の培養においては、当該器具１の全体を収容可能な培養容器５を用いることができる。この培養容器５は、器具１を収容可能な培養部５ａを有している。そして、この培養部５ａ内の底面５ｂに器具１を載置するとともに、当該培養部５ａに培養液Ｍを満たす。この結果、器具１は、培養液Ｍ中に沈降した状態で培養容器５の底面５ｂ上に保持される。この培養容器５に収容された器具１の各マイクロウェル２１内で細胞を培養することができる。なお、この培養容器５としては、例えば、細胞培養に汎用されているプラスチックディッシュを用いることができる。

また、装着状態の器具１においては、例えば、顕微鏡等の光学的な手段により各マイクロウェル２１に保持されている細胞を観察する場合に、枠部材３によって光が散乱して、観察に不都合が生じることがある。このため、培養工程Ｓ２００においては、例えば、マイクロウェル２１内の細胞を顕微鏡で観察する場合に、枠部材３を基部材２から取外して器具１を分離状態とすることが好ましい。そして、観察後には、再び枠部材３を基部材２に取り付けて、細胞の培養を継続することもできる。このように、器具１においては、枠部材３が基部材２に取り付け可能であり、且つ当該基部材２から取り外し可能に構成されているため、装着状態と分離状態とを必要に応じて任意のタイミングで任意の回数だけ切り替えることができる。

処理工程Ｓ３００においては、例えば、細胞が培養された装着状態の器具１のうち、マクロウェル５０に所定の溶液を注入することによって、当該マクロウェル５０に対応する一つのマイクロウェル群２０の細胞に当該所定の溶液を接触させることができる。具体的に、この場合、例えば、まず、マイクロウェル群２０で細胞が培養された装着状態の器具１を、クリーンベンチ等の無菌的な培養操作空間内において気相（空気）中に載置する。そして、操作者は、ピペットを用いて、マイクロウェル５０内の培養液を回収して除去した後、所定の溶液を、当該マクロウェル５０内に新たに注ぎ入れる。この結果、マクロウェル５０の底面５１に形成された複数のマイクロウェル２１の各々に保持された細胞に、当該溶液を接触させることができる。このような処理工程Ｓ３００においては、処理に必要な溶液の量を、マクロウェル５０の容積に対応する量に低減することができ、且つ各マイクロウェル２１の細胞に対する当該溶液の接触を確実に行うことができる。

また、例えば、図８及び図９に示すように、器具１に複数のマクロウェル５０ａ〜５０ｄが形成される場合には、装着状態の器具１のうち、当該複数のマクロウェル５０ａ〜５０ｄの各々に、互いに異なる溶液を注入することができる。この場合、複数のマクロウェル５０ａ〜５０ｄに対応する複数のマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄの細胞に、互いに異なる溶液を接触させることができる。すなわち、マクロウェル５０ａ〜５０ｄごとに、互いに異なる溶液を細胞に接触させることができる。具体的に、例えば、４つのマクロウェル５０ａ〜５０ｄの各々に、４種類の試薬のうち互いに異なる１種類の試薬を含む溶液をそれぞれ注入することにより、当該マクロウェル５０ａ〜５０ｄごとに、互いに異なる種類の試薬を細胞に接触させることができる。

このように、複数のマイクロウェル群２０が形成された基部材２と複数の窓部４０が形成された枠部材３とを備えた器具１を用いることによって、例えば、培養可能な細胞の数が非常に少ない場合や、細胞に対する処理に使用する溶液の量又は当該溶液に溶解させる試薬の量が非常に少ない場合であっても、当該細胞の培養操作を、多様な条件で、簡便且つ確実に行うことができる。

また、例えば、培養工程Ｓ２００において、各マイクロウェル２１内で細胞組織体を形成した場合には、処理工程Ｓ３００において、当該細胞組織体に対して所定の処理を施すことができる。すなわち、各マイクロウェル２１の底面２２の全体を細胞非接着性に形成し、当該各マイクロウェル２１内で細胞組織体を形成した場合には、複数のマイクロウェル２１内において当該細胞組織体は浮遊状態で保持されている。このため、処理工程Ｓ３００においては、複数のマイクロウェル２１から複数の細胞組織体をまとめて簡単且つ確実に回収することができる。

さらに、この場合、図８及び図９に示すように、器具１の複数のマクロウェル５０ａ〜５０ｄの各々で細胞組織体を形成した場合には、装着状態の器具１において、当該複数のマクロウェル５０ａ〜５０ｄの一部、例えば、一つのマクロウェル５０ａのみから選択的に、細胞組織体を回収することもできる。

また、例えば、各マイクロウェル２１の底面２２の中央部分に細胞接着性の第一領域を形成し、当該第一領域を囲む周辺部分を細胞非接着性の第二領域として形成した場合には、当該マイクロウェル２１内で、当該底面２２のうち第一領域に接着した細胞組織体を形成することができる。この場合、処理工程Ｓ３００においては、各底面２２に接着した状態の各細胞組織体に、所定の溶液を接触させる等、所定の処理を施すことができる。

さらに、この場合、図８及び図９に示すように、器具１の複数のマクロウェル５０ａ〜５０ｄの各々で細胞組織体を形成した場合には、装着状態の器具１において、当該複数のマクロウェル５０ａ〜５０ｄごとに、底面２２に接着した細胞組織体に対して互いに異なる溶液を接触させることもできる。

図２１及び図２２は、器具１の他の例についての説明図である。図２１は、器具１の斜視図であり、図２２は、図２１に示すＸＸＩＩ−ＸＸＩＩ線を通る面で切断した器具１の断面図である。

図２１及び図２２に示す例に係る器具１は、上述の例における基部材２に相当する基部８０ａ〜８０ｄと、上述の例における枠部材３に相当する枠部８１ａ〜８１ｄと、を備えている。これら基部８０ａ〜８０ｄと枠部８１ａ〜８１ｄとは一体的に形成され、互いに着脱不可能となっている。そして、対応する基部８０ａ〜８０ｄと枠部８１ａ〜８１ｄとによって、溶液を保持可能なマクロウェル５０ａ〜５０ｄが形成されている。

より具体的に、基部８０ａ〜８０ｄは、図６〜図９に示す例におけるマクロウェル５０ａ〜５０ｄの底部５１ａ〜５１ｄに相当し、枠部８１ａ〜８１ｄは、当該図６〜図９に示す例における窓部４０ａ〜４０ｄの内壁４１ａ〜４１ｄに相当する。各基部８０ａ〜８０ｄには、一つずつマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄが形成され、各枠部８１ａ〜８１ｄは、当該各マイクロウェル群２０ａ〜２０ｄの周囲に立設されている。また、この器具１は、４つのマクロウェル５０ａ〜５０ｄの間を仕切る十字状に形成された仕切部８２を有している。

そして、一体的に形成された基部８０及び枠部８１を有する器具１においても、マクロウェル５０が形成されていることによって、上述の例と同様に、微小なマイクロウェル２１を干上がらせることなく、マイクロウェル群２０ごとに所望の細胞培養操作を簡便且つ確実に行うことができる。また、複数のマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄについて、互いに異なる処理を行うこともできる。

基部８０ａ〜８０ｄと枠部８１ａ〜８１ｄとが一体的な器具１を構成する材料としては、上述の基部材２や枠部材３に用いられるものと同様の材料を用いることができる。すなわち、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート（ＰＭＭＡ等）、ポリビニル等の合成樹脂、ＰＤＭＳ等のシリコン系樹脂、ＥＰＤＭ等の合成ゴム、天然ゴム、ガラス、セラミック、ステンレス鋼等の金属材料、からなる群より選択される１つの材料を単独で用い、又は２以上の材料を組み合わせて用いることができる。

また、器具１を構成する材料、特に、マイクロウェル群２０が形成されている部分を構成する材料としては、例えば、当該マイクロウェル群２０内で培養された細胞を顕微鏡等の光学的な手段により観察する場合の利便性の点から、上述した材料のうち、透光性の材料を好ましく用いることができる。すなわち、本実施形態において、器具１は、例えば、その全体又は一部が透光性の合成樹脂やガラスを用いて形成することができる。

また、マイクロウェル２１の形成には、目的に応じて選択される任意の加工方法を用いることができる。すなわち、例えば、マシニングセンタ等を用いた穿孔加工、レーザー等を用いた光微細加工、エッチング加工、エンボス加工等により、予め成形された器具１の基部８０ａ〜８０ｄの一部にマイクロウェル２１を形成することができる。この場合、例えば、ポリスチレン等の透光性の樹脂から成形された市販のプラスチックディッシュの底面に上記のような加工方法を用いてマイクロウェル２１を形成することにより、器具１を製造することもできる。また、例えば、射出成形、プレス成形、ステレオリソグラフィー等により、基部８０ａ〜８０ｄと枠部８１ａ〜８１ｄとが一体的な器具１の成形と同時に、当該基部８０ａ〜８０ｄの一部にマイクロウェル２１を形成することができる。

以上説明したように、本発明に係る器具１は、特に、稀少な細胞と稀少な試薬を用いた簡便且つ確実な細胞培養操作を可能とする。したがって、器具１は、培養細胞を利用した創薬、再生医療、基礎研究等の様々な産業利用において極めて有用なツールとして期待できる。

次に、器具１を用いた本方法の具体的な実施例について説明する。

［実施例１］
図１〜図４に示すような器具１を用い、播種工程Ｓ１００において、装着状態の器具１に細胞を播種した場合と、分離状態の器具１に細胞を播種した場合と、についてマイクロウェル群２０に細胞を保持できる効率を比較した。すなわち、ＰＭＭＡ製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ４００μｍ）の表面のうち、１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲内に、マシニングセンタ（卓上型ＮＣ微細加工機、株式会社ピーエムティー製）を用いた穿孔加工処理により、直径３００μｍ、深さ２００μｍの円形のマイクロウェル２１を１０２０個形成した。この複数のマイクロ２１ウェルは、互いにその開口部２４及び底面２２の円の中心間距離が３３０μｍとなるように規則的に配置した。次に、スパッタリング装置（Ｅ―１０３０、日立株式会社製）を用いたスパッタリング処理を施すことにより、その表面にプラチナ（Ｐｔ）の薄膜（厚さ６ｎｍ）を形成した。

このようにして、図１〜図４に示すような基部材２を作製した。すなわち、この基部材２の上面１１のうち１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲内には、開口部２４及び底面２２が直径３００μｍの円形であり、深さが２００μｍであるマイクロウェル２１を１０２０個含む一つのマイクロウェル群２０が形成された。

さらに、細胞非接着性物質である分子量３００００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有する細胞非接着性の合成高分子（化学式：ＣＨ_３（ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＳＨ、日油株式会社製）を５ｍＭの濃度で含むエタノール溶液を、各マイクロウェル２１内に注入し、窒素雰囲気下において当該細胞非接着性高分子が有するチオール基と当該各マイクロウェル２１の底面２２のプラチナ表面との間に化学結合を形成させることにより、当該底面２２に当該細胞非接着性高分子を固定化した。その後、第一基板部１０の全体をエタノール溶液によって十分に洗浄して余剰の細胞非接着性高分子を除去するとともに、当該第一基板部１０をエタノールに約１０分間浸漬し、さらに当該第一基板１０に紫外線照射を約３０分間照射することにより滅菌処理を行った。このようにして形成された各マイクロウェル２１の底面２２は、その全体が細胞非接着性となった。

一方、ＰＤＭＳ製の平板（２０ｍｍ×２０ｍｍ、厚さ２．２ｍｍ）に、第一基板部１０のマイクロウェル群２０を収容可能な矩形の貫通穴（１０ｍｍ×１０ｍｍ）として窓部４０を形成することにより、図１〜図４に示すような枠部材３０を作製した。すなわち、まず、直径９０ｍｍのプラスチックディッシュ内に、ＰＤＭＳのプレポリマーと硬化剤とを１０：１の体積比率で混ぜ合せたＰＤＭＳ溶液（Ｓｙｌｇａｒｄ１８４、Ｄａｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を１３ｍＬ流し込み、室温で２日間放置することにより硬化させた。次に、硬化したＰＤＭＳ円板をディッシュから取り外し、メスを使って上記形状のＰＤＭＳ製枠部材３を切り出した。この枠部材３は、その全体がＰＤＭＳで形成されたため、当該枠部材３の下面３１を基部材２の上面１１に押し付けることによって構成した装着状態の器具１においては、当該下面３１と当該上面１１とを容易且つ確実に密着させることができた。その結果、図３及び図４に示すような、溶液を保持可能な一つのマクロウェル５０が形成された器具１を構成することができた。

そして、第一の条件においては、図２０に示すように、直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ（培養容器５）内に装着状態の器具１を載置し、当該器具１のうち、マクロウェル５０（１０ｍｍ×１０ｍｍ×２．２ｍｍ）内に、培養液（１０％のウシ胎児血清を添加したＷｉｌｌｉａｍｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ培地）にＨｅｐＧ２細胞（理化学研究所・バイオリソースセンター）を４×１０^５個／ｍＬの密度で分散させた細胞分散液を０．２５ｍＬ入れた。すなわち、１×１０^５個のＨｅｐＧ２細胞を一つのマクロウェル５０に播種した。播種後、２時間が経過した後に、ピペット操作により、マクロウェル５０内のマイクロウェル群２０に保持されている細胞を回収し、当該回収した細胞に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を定量した。このＤＮＡの定量は、ＤＡＰＩ（４’６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を用いた方法により行った。このＤＮＡの定量結果から、播種に用いた細胞の総数に対する、実際にマイクロウェル２１内に保持された細胞の数の割合を細胞固定化率（％）として算出した。

一方、第二の条件においては、図１９に示すように、直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ（培養容器５）内に分離状態の器具１（すなわち、基部材２のみ）を載置し、当該プラスチックディッシュ内に、上述の培養液にＨｅｐＧ２細胞を４×１０^５個／ｍＬの密度で分散させた細胞分散液を２ｍＬ入れた。すなわち、８×１０^５個のＨｅｐＧ２細胞をプラスチックディッシュ内に播種した。なお、このとき、基部材２の全体は培養容器５内において培養液に浸漬された。そして、上記の第一の条件と同様に、播種から２時間後に、マイクロウェル群２０に保持された細胞を回収して、ＤＮＡの定量を行い、細胞固定化率（％）を算出した。

その結果、上記第二の条件で得られた細胞固定化率は約１５％であったのに対して、上記第一の条件で得られた細胞固定化率は約１００％であった。すなわち、基部材２に枠部材３を取り付けた装着状態で細胞の播種を行うことによって、マイクロウェル群２０への細胞の保持を簡便且つ確実に行うことができることが確認された。

［実施例２］
上述の実施例１と同様に作製された器具１を用い、播種工程Ｓ１００において、装着状態の器具１に細胞を播種した場合と、分離状態の器具１に細胞を播種した場合と、について複数のマイクロウェル２１の各々に保持される細胞の数のばらつきを比較した。

すなわち、第一の条件においては、図２０に示すように、直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ内に装着状態の器具１を載置し、当該器具１のうち、マクロウェル５０（１０ｍｍ×１０ｍｍ×２．２ｍｍ）内に、培養液（１０％のウシ胎児血清を添加したＷｉｌｌｉａｍｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ培地）にＨｅｐＧ２細胞を４×１０^５個／ｍＬの密度で分散させた細胞分散液を０．２５ｍＬ入れた。播種後、２時間が経過した後に、器具１の中央付近に形成された６０個のマイクロウェル２１の各々の底面２２に沈降した細胞の数を位相差顕微鏡下で計数した。

一方、第二の条件においては、図１９に示すように、直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ内に分離状態の器具１（すなわち、基部材２のみ）を載置し、当該プラスチックディッシュ内に、上述の培養液にＨｅｐＧ２細胞を４×１０^５個／ｍＬの密度で分散させた細胞分散液を２ｍＬ入れた。そして、播種から２時間後に、上記の第一の条件と同様の位置に形成された６０個のマイクロウェル２１の各々の底面２２に沈降した細胞の数を位相差顕微鏡下で計数した。

その結果、１つのマイクロウェル２１に保持された細胞の数は、第一の条件では６８．２±１３．４（算術平均±標準偏差）個であり、第二の条件では６６．９±１６．９（算術平均±標準偏差）個であった。すなわち、基部材２に枠部材３を取り付けた装着状態で細胞の播種を行うことによって、各マイクロウェル２１に保持される細胞の数のばらつきを低減できる傾向が確認された。

［実施例３］
上述の実施例１と同様に作製された器具１を用いて、各マイクロウェル２１内で細胞組織体を形成した。そして、培養工程Ｓ２００において、装着状態の器具１に保持された当該細胞組織体を顕微鏡観察した場合と、分離状態の器具１に保持された細胞組織体を顕微鏡観察した場合と、について観察の明瞭さを比較した。

すなわち、器具１の各マイクロウェル２１内に、ＨｅｐＧ２細胞を播種し、１０日間培養することにより、当該各マイクロウェル２１内に当該ＨｅｐＧ２細胞が三次元的に集合した球状の細胞組織体（ＨｅｐＧ２スフェロイド）を１つずつ形成させた。なお、培養液としては１０％のウシ胎児血清を添加したＷｉｌｌｉａｍｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ培地を用い、ＨｅｐＧ２細胞は、各マクロウェル５０に２×１０^５個のＨｅｐＧ２細胞を播種した。そして、装着状態又は分離状態の器具１の各マイクロウェル２１内において、培養１０日目のＨｅｐＧ２スフェロイドを位相差顕微鏡下で観察した。

図２３には、装着状態の器具１において、枠部材３に近接した、マイクロウェル群２０の端部分のマイクロウェル２１内で形成されたＨｅｐＧ２スフェロイドＴ１の位相差顕微鏡写真を示す。一方、図２４には、分離状態の器具１において、図２３と同様にマイクロウェル群２０の端部分のマイクロウェル２１内で形成されたＨｅｐＧ２スフェロイドＴ２の位相差顕微鏡写真を示す。図２３に示すように、装着状態の器具１においては、マイクロウェル群２０のうち枠部材３に近接したマイクロウェル２１内のＨｅｐＧ２スフェロイドＴ１の一部が明瞭に観察されなかった。これに対し、図２４に示すように、分離状態の器具１においては、マイクロウェル群２０の全域にわたって各マイクロウェル２１内のＨｅｐＧ２スフェロイドＴ２は明瞭に観察することができた。すなわち、器具１の各マイクロウェル２１内の細胞又は細胞組織体を顕微鏡下で観察する場合には、枠部材３を基部材２から取り外した分離状態とすることが好ましいことが確認された。

［実施例４］
上述の実施例１と同様の方法により、各マイクロウェル２１の底面２２が細胞非接着性である２種類の器具１（以下、「第一の器具１」、「第二の器具１」という）を作製した。第一の器具１においては、上面１１のうち１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲内に、開口部２４及び底面２２が直径３００μｍの円形であり、深さが２００μｍであり、中心間距離が４４０μｍで規則的に配置された５７２個のマイクロウェル２１を含む一つのマイクロウェル群２０を形成した。また、第二の器具１においては、上面１１のうち１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲内に、開口部２４及び底面２２が直径４００μｍの円形であり、深さが２６０μｍであり、中心間距離が４４０μｍで規則的に配置された５７２個のマイクロウェル２１を含む一つのマイクロウェル群２０を形成した。そして、第一の器具１の各マイクロウェル２１内及び第二の器具１の各マイクロウェル２１内で細胞組織体を形成した。

すなわち、図２０に示すように、直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ（培養容器５）内に装着状態の第一の器具１を載置した。次いで、第一の器具１のうち、マクロウェル５０内にマウスＥＳ細胞（大日本住友製薬）を分散した細胞分散液を注入することにより、当該マウスＥＳ細胞を各マイクロウェル２１内に播種した。そして、この培養容器５内に培養液をさらに２．０ｍＬ加えて、装着状態の第一の器具１の全体を当該培養液中に浸漬させた状態で５日間培養を行った。その結果、各マイクロウェル２１内にマウスＥＳ細胞が三次元的に集合した球状の細胞組織体（胚様体）を１つずつ形成させることができた。培養液としては、１５％ウシ胎児血清、１％ヌクレオシド、１％非必須アミノ酸、１％２−メルカプトエタノール、１％グルタミンを含むＤＭＥＭ培地を用い、第一の器具１の一つのマクロウェル５０に、１×１０^５個のマウスＥＳ細胞を播種した。一方、同様に、培養容器５内に載置した第二の器具１の各マイクロウェル２１内に、マウス神経幹細胞（大阪医療センターより提供）を播種した。そして、５日間培養することにより、各マイクロウェル２１内にマウス神経幹細胞が三次元的に集合した球状の細胞組織体（ニューロスフェア）を１つずつ形成させた。培養液としては、１％Ｎ−２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２０ｎｇ／ｍＬのＨｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＨｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂＦＧＦを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用い、第二の器具１の一つのマクロウェル５０に、１×１０^５個のマウス神経幹細胞を播種した。

また、対照群として、直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ（組織培養ディッシュ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）の底面全体に、上記第一の器具１及び第二の器具２の各マイクロウェル２１の底面２２に固定化したものと同様の細胞非接着性高分子を固定化し、当該培養ディッシュ内でマウスＥＳ細胞又はマウス神経幹細胞を５日間培養した。なお、マウスＥＳ細胞については、培養液として１５％ウシ胎児血清、１％ヌクレオシド、１％非必須アミノ酸、１％２−メルカプトエタノール、１％グルタミンを含むＤＭＥＭ培地を用い、培養ディッシュあたり４×１０^５個の細胞を播種し、マウス神経幹細胞については、培養液として１％Ｎ−２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２０ｎｇ／ｍＬのＨｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＨｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂＦＧＦを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用い、培養ディッシュあたり１×１０^５個の細胞を播種した。

そして、器具１の各マイクロウェル２１内又は対照の培養ディッシュ内で培養５日目に形成されていた細胞組織体を位相差顕微鏡下で観察するとともに、１００個の胚様体又はニューロスフェアについて、そのサイズの分布を測定した。

その結果、図２５に示すように、マウスＥＳ細胞を播種した器具１の各マイクロウェル２１内においては、球状の胚様体Ｔ３が１つずつ形成された。また、図２６に示すように、マウス神経幹細胞を播種した器具１の各マイクロウェル２１内においては、球状のニューロスフェアＴ４が１つずつ形成された。これら胚様体及びニューロスフェアは、各マイクロウェル２１内において、底面２２に接着することなく、浮遊状態で保持されていた。

図２７には、器具１の各マイクロウェル２１内又は対照の培養ディッシュ内で培養５日目に形成されていた胚様体の直径の分布を示す。図２８には、器具１の各マイクロウェル２１内又は対照の培養ディッシュ内で培養５日目に形成されていたニューロスフェアの直径の分布を示す。図２７及び図２８において、横軸は細胞組織体の直径（μｍ）を示し、縦軸は、各直径の細胞組織体の数（個）を示す。また、黒丸印は器具１のマイクロウェル群２０で形成された細胞組織体についての測定値を示し、白四角印は対照の培養ディッシュで形成された細胞組織体についての測定値を示す。図２７及び図２８に示すように、対照の培養ディッシュでは様々な直径の細胞組織体が形成されたのに対して、器具１のマイクロウェル群２０では、均一な直径の細胞組織体が形成されていた。すなわち、第一の器具１のマイクロウェル群２０でマウスＥＳ細胞を培養することにより、各マイクロウェル２１に、直径が１４０μｍ〜２４０μｍの範囲内である胚様体を１個ずつ、底面２２に接着しない状態で形成することができた。また、第二の器具１のマイクロウェル群２０でマウス神経幹細胞を培養することにより、各マイクロウェル２１に、直径が１２０μｍ〜２００μｍの範囲内であるニューロスフェアを１個ずつ、底面２２に接着しない状態で形成することができた。

［実施例５］
まず、ＰＭＭＡ製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ２００μｍ）の表面のうち、１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲内に、マシニングセンタ（卓上型ＮＣ微細加工機、株式会社ピーエムティー製）を用いた穿孔加工処理により、直径３００μｍの円形の貫通孔を６７２個形成した。この円形貫通孔は、互いにその中心間距離が４００μｍとなるように規則的に配置した。次に、この円形貫通孔が設けられたＰＭＭＡ平板の一方側の表面に、貫通孔を設けていない別体に形成されたＰＭＭＡ製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ２００μｍ）を熱圧着処理（１０６℃、２時間）によって貼り付けた。

このようにして、図１〜図４に示すような基部材２を作製した。すなわち、この基部材２の上面１１のうち１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲内に、開口部２４及び底面２２が直径３００μｍの円形であり、深さが２００μｍであり、中心間距離が４００μｍで規則的に配置された６７２個のマイクロウェル２１を含む一つのマイクロウェル群２０が形成された。そして、さらに、スパッタリング装置（Ｅ―１０３０、日立株式会社製）を用いたスパッタリング処理を施すことにより、各マイクロウェル２１の底面２２にプラチナ（Ｐｔ）の薄膜（厚さ６ｎｍ）を形成した。

一方、直径２００μｍ、長さ２００μｍ、中心間距離が４００μｍの複数の円筒状突起の各々の先端にさらに直径１００μｍ、長さ７０μｍの円筒状突起が形成されたＰＤＭＳ製のスタンプをモールド成形により作製した。そして、このスタンプを用いたマイクロコンタクトプリンティングにより、各マイクロウェル２１の底面２２に細胞接着性の第一領域を形成した。すなわち、細胞接着性のタンパク質であるコラーゲン（ＣｅｌｌｍａｔｒｉｘＴｙｐｅ Ｉ−Ｃ、新田ゼラチン社製）を含む水溶液に、スタンプの各円筒状突起の先端を浸した。そして、位相差顕微鏡下において観察しながら、各円筒状突起の位置を、上述のプラチナが蒸着された各マイクロウェル２１の底面２２の中央付近の位置に押し当てることにより、当該各円筒状突起の先端に塗布されていたコラーゲンを、当該底面２２の中央付近に塗布した。このようにして、直径３００μｍの各マイクロウェル２１の底面２２の中央付近に、細胞接着性である直径約１００μｍの第一領域を１つ形成した。

さらに、底面２２のうち、第一領域以外の部分を細胞非接着性とした。すなわち、細胞非接着性物質である分子量５０００又は分子量１００００のＰＥＧ鎖を有する細胞非接着性の合成高分子（化学式：ＣＨ_３（ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＳＨ、日油株式会社製）を５ｍＭの濃度で含むエタノール溶液を、第一領域を形成後の各マイクロウェル２１内に注入した。そして、窒素雰囲気下で所定時間放置することにより、細胞非接着性高分子を、各マイクロウェル２１の底面２２のうち、第一領域の周辺部分に固定化した。

このようにして形成した細胞接着性の第一領域と細胞非接着性の第二領域とからなる底面２２を有する各マイクロウェル２１内に、初代ラット肝細胞又はマウスＥＳ細胞（大日本住友製薬）を播種した。そして、５日間培養することにより、各マイクロウェル２１内に初代ラット肝細胞が三次元的に集合した球状の細胞組織体（肝細胞スフェロイド）又は球状の胚様体を１つずつ形成させた。なお、初代ラット肝細胞は、各マイクロウェル２１の第二領域に分子量５０００のＰＥＧ鎖を有する細胞非接着性高分子が固定化された器具１を用いて培養した。また、マウスＥＳ細胞は、各マイクロウェル２１の第二領域に分子量１００００のＰＥＧ鎖を有する細胞非接着性高分子が固定化された器具１を用いて培養した。また、初代ラット肝細胞については、培養液として６０ｍｇ／Ｌのプロリン、５０μｇ／ＬのＥＧＦ、１０ｍｇ／Ｌのインシュリン、７．５ｍｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、０．１μＭの硫酸銅・５水和物、３μｇ／Ｌのセレン酸、５０ｐＭの硫酸亜鉛・７水和物、５０μｇ／Ｌのリノール酸、５８．８ｍｇ／Ｌのペニシリン、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、１．０５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、１．１９ｇ／ＬのＨＥＰＥＳを加えたＤＭＥＭ無血清培地を用い、器具１に一つ形成されたマクロウェル５０に１.７×１０^５個／ｃｍ^２の密度で播種した。一方、マウスＥＳ細胞については、培養液として１５％ウシ胎児血清、１％ヌクレオシド、１％非必須アミノ酸、１％２−メルカプトエタノール、１％グルタミンを含むＤＭＥＭ培地を用い、器具１に一つ形成されたマクロウェル５０に１×１０^５個／ｃｍ^２の密度で播種した。

また、初代ラット肝細胞についての対照群として、肝細胞のスフェロイド形成に適しているとされる直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ（プライマリア、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）内で初代ラット肝細胞を５日間培養した。また、マウスＥＳ細胞についての対照群として、直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ（組織培養ディッシュ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）の底面全体に、マイクロウェル２１の底面２２に固定化したものと同様の細胞非接着性高分子を固定化し、当該培養ディッシュ内でマウスＥＳ細胞を５日間培養した。

そして、器具１の各マイクロウェル２１内又は対照の培養ディッシュ内で培養５日目に形成されていた細胞組織体を位相差顕微鏡下で観察するとともに、１００個の肝細胞スフェロイド又は胚様体について、そのサイズの分布を測定した。

その結果、図２９に示すように、初代ラット肝細胞を播種した器具１の各マイクロウェル２１内においては、球状の肝細胞スフェロイドＴ５が１つずつ形成された。また、図３０に示すように、マウスＥＳ細胞を播種した器具１の各マイクロウェル２１内においては、球状の胚様体Ｔ６が１つずつ形成された。これら肝細胞スフェロイド及び胚様体は、各マイクロウェル２１内において、底面２２のうち、第一領域に接着した状態で保持されていた。

図３１には、器具１の各マイクロウェル２１内又は対照の培養ディッシュ内で培養５日目に形成されていた肝細胞スフェロイドの直径の分布を示す。図３２には、器具１の各マイクロウェル２１内又は対照の培養ディッシュ内で培養５日目に形成されていた胚様体の直径の分布を示す。図３１及び図３２において、横軸は細胞組織体の直径（μｍ）を示し、縦軸は、各直径の細胞組織体の数（個）を示す。また、黒丸印は器具１のマイクロウェル群２０で形成された細胞組織体についての測定値を示し、白四角印は対照の培養ディッシュで形成された細胞組織体についての測定値を示す。図３１及び図３２に示すように、対照の培養ディッシュでは様々な直径の細胞組織体が形成されたのに対して、器具１のマイクロウェル群２０では、均一な直径の細胞組織体が形成されていた。すなわち、器具１のマイクロウェル群２０で初代ラット肝細胞を培養することにより、各マイクロウェル２１に、直径が１２０μｍ〜２００μｍの範囲内である肝細胞スフェロイドを１個ずつ、底面２２の中央付近に接着した状態で形成することができた。また、器具１のマイクロウェル群２０でマウスＥＳ細胞を培養することにより、各マイクロウェル２１に、直径が１２０μｍ〜２００μｍの範囲内である胚様体を１個ずつ、底面２２の中央付近に接着した状態で形成することができた。

［実施例６］
図６〜図９に示すような４つのマクロウェル５０ａ〜５０ｄが形成された器具１を作製し、当該４つのマクロウェル５０ａ〜５０ｄの各々に互いに独立に溶液を保持可能であることを確認した。すなわち、上述の実施例１の場合と同様の方法により、ＰＭＭＡ製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ７００μｍ）の表面のうち、互いに離間した４つの矩形の範囲（６ｍｍ×６ｍｍ）の各々に、直径３００μｍ、深さ２００μｍの円形のマイクロウェル２１を中心間距離３３０μｍにて３７８個形成することにより、図６〜図９に示すような４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄが形成された基部材２を作製した。

一方、ＰＤＭＳ製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ３ｍｍ）に、第一基板部１０の４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち互いに異なる一つを収容可能な矩形の貫通穴（７ｍｍ×７ｍｍ）を形成することにより、図６〜図９に示すような４つの窓部４０ａ〜４０ｄが形成された枠部材３０を作製した。

図３３には、このようにして作製した４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄが形成された基部材２と、４つの窓部４０ａ〜４０ｄが形成された枠部材３と、が分離された状態の器具１の写真を示す。また、図３４には、この基部材２に枠部材３が取り付けられて、４つのマクロウェル５０ａ〜５０ｄが形成された装着状態の器具１の写真を示す。そして、図３５には、この装着状態の器具１において、４つのマクロウェル５０ａ〜５０ｄの各々に、互いに異なる溶液を保持させた場合の写真を示す。すなわち、図３５に示す器具１において、第一のマクロウェル５０ａには、細胞が生存しているか死滅しているかを判断するために使用される、紺色のトリパンブルー溶液Ｓ１が保持されており、第二のマクロウェル５０ｂには、無色透明の緩衝液Ｓ２が保持されており、第三のマクロウェル５０ｃ及び第四のマクロウェル５０ｄには、ｐＨを判断するために赤色の色素であるフェノールレッドが添加されている赤色の培養培地Ｓ３が保持されている。図３５に示すように、器具１の４つのマクロウェル５０ａ〜５０ｄの各々には、互いに独立に溶液を保持することできることが確認された。

［実施例７］
上述の実施例１と同様に作製された器具１を用いて、図５に示す辺縁ウェル２１ｉと枠部材３との距離Ｄと、当該辺縁ウェル２１ｉ及び中央ウェル２１ｉｉで形成される細胞組織体のサイズと、の関係を検討した。

すなわち、ＰＭＭＡ製の平板（２４ｍｍ×２４ｍｍ、厚さ４００μｍ）から成形された基部材２と、ＰＤＭＳ製の平板（２０ｍｍ×２０ｍｍ、厚さ１．１ｍｍ）から成形された枠部材３と、を備え、上記距離Ｄが互いに異なる５種類の器具１を製造した。

具体的に、上面１１のうち、１０ｍｍ×１０ｍｍの矩形範囲内に、直径３００μｍ、深さ３００μｍの円形のマイクロウェル２１が９００個規則的に配置された基部材２を製造した。すなわち、この基部材２には、一定の間隔で直列的に配置された３０個のマイクロウェル２１からなる列が、当該一定の間隔で並列に３０列配置された。各マイクロウェル２１の底面２２は細胞非接着性とした。

一方、基部材２に取り付けられた場合に、距離Ｄが０μｍ、３００μｍ、６００μｍ、１０００μｍ又は２０００μｍのいずれかとなるように互いに異なるサイズの矩形の窓部４０が形成された５種類の枠部材３を製造した。これら５種類の枠部材３のいずれかと、基部材２と、を組み合わせることにより、１つのマクロウェル５０を有し、距離Ｄが互いに異なる５種類の器具１を製造した。

次いで、各器具１を直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ（組織培養ディッシュ、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）内に入れた。そして、各器具１のマクロウェル５０内に、培養液に分散させたＨｅｐＧ２細胞を２×１０^５個ずつ播種した。この培養液をマクロウェル５０内に２時間放置して細胞を培養することにより、当該細胞を当該マクロウェル５０の底面５１上に沈降させた。その後、プラスチックディッシュに２ｍＬの培養液を入れて、器具１の全体を培養液内に浸漬した。そして、培養液中に浸漬した器具１のマクロウェル５０内において細胞を１４日間培養した。また、枠部材３を取り付けない基部材２のみからなる、分離状態の器具１も準備した。そして、マイクロウェル群２０の面積あたりの細胞密度が上記装着状態の器具１と等しくなるようＨｅｐＧ２細胞を播種し、同様に培養した。その結果、各器具１の各マイクロウェル２１内にＨｅｐＧ２細胞が三次元的に集合した球状の細胞組織体（ＨｅｐＧ２スフェロイド）を１つずつ形成させることができた。

そして、各器具１について、マイクロウェル群２０の辺縁の列に含まれる辺縁ウェル２１ｉのうち５０個の各々に形成された辺縁組織体Ｔｉの直径と、辺縁から１１番目〜２０番目の列に含まれる中央ウェル２１ｉｉのうち５０個の各々に形成された中央組織体Ｔｉｉの直径と、を位相差顕微鏡を用いた観察によりそれぞれ測定した。さらに、中央組織体Ｔｉｉの直径の算術平均値に対する、辺縁組織体Ｔｉの直径の算術平均値の比率を「直径比」として算出した。

図３６は、６種類の器具１で形成された細胞組織体の位相差顕微鏡写真である。図３６（Ａ）は距離Ｄが０μｍである器具１、図３６（Ｂ）は距離Ｄが３００μｍである器具１、図３６（Ｃ）は距離Ｄが６００μｍである器具１、図３６（Ｄ）は距離Ｄが１０００μｍである器具１、図３６（Ｅ）は距離Ｄが２０００μｍである器具１、図３６（Ｆ）は枠部材３を有しない器具１についての写真をそれぞれ示す。図３６（Ｆ）の下方に示すスケールバーの長さは５００μｍを示している。

図３６に示すように、各器具１のマクロウェル５０の底面５１において、枠部材３に隣接する辺縁ウェル２１ｉ内には球状の辺縁組織体Ｔｉが１つずつ形成され、より内側の中央ウェル２１ｉｉ内には球状の中央組織体Ｔｉｉが１つずつ形成された。辺縁組織体Ｔｉ及び中央組織体Ｔｉｉはいずれも、辺縁ウェル２１ｉ及び中央ウェル２１ｉｉ内において、底面２２及び内壁２３に接着することなく培養液中に浮遊しつつ保持されていた。なお、この実施例７においては、器具１の全体が培養液中に十分に浸漬させるとともに、顕微鏡観察時の光の強さを適切に調整する等、操作条件を工夫することにより、図３６に示すように、鮮明な顕微鏡写真を得た。

図３７は、各器具１について算出された細胞組織体の直径比を示す。図３７において、横軸は各器具１の距離Ｄを示し、縦軸は各器具１における直径比を示す。なお、図３７の横軸の右端に示す「枠部材無」は、枠部材３が取り付けられていない基部材２を用いた場合の結果を示している。

図３７に示すように、距離Ｄを低減することによって、枠部材３が取り付けられていない場合（「枠部材無」）に比べて、直径比を低減することができた。すなわち、距離Ｄを２０００μｍ以下に低減することによって直径比を１．２０以下に低減することができた。また、距離Ｄを１０００μｍ以下に低減することによって直径比を１．１６以下に低減することができた。特に、距離Ｄを６００μｍ以下に低減した場合には、直径比を１．１５以下に低減することができた。

このように、器具１を用いた細胞組織体の形成においては、当該器具１の距離Ｄを特定の微小な範囲内にすることによって、辺縁組織体と中央組織体とのサイズのずれを効果的に低減して、極めて均一なサイズの多数の細胞組織体を簡便且つ確実に形成できることが確認された。

なお、本発明に係る器具１及びこれを用いた細胞培養方法は上述の例に限られない。例えば、基部材２のマイクロウェル２１は、目的に応じた任意の形状で形成することができる。すなわち、マイクロウェル２の開口部２４及び底面２２は、円形に限られず、例えば、多角形に形成することもできる。また、開口部２４と底面２２とは異なる形状に形成することもできる。また、開口部２４と底面２２とは異なる面積で形成することもできる。すなわち、例えば、マイクロウェル２１の内壁２３を傾斜するように形成して、開口部２４より底面２２の面積を小さく形成することもできる。また、マイクロウェル２１は、実質的に底面２２を有しない、傾斜した内壁２３のみを有するテーパ形状に形成することもできる。また、枠部材３の窓部４０もまた、円形や多角形等、目的に応じた任意の形状に形成することができる。

また、基部材２に複数のマイクロウェル群２０が形成される場合、枠部材３には１又は複数の任意の数の窓部４０を形成することができる。また、器具１を用いた培養の過程において、１つの基部材２と、複数の種類の枠部材３と、を組み合わせて使用することもできる。すなわち、例えば、所定数のマイクロウェル群２０が形成された基部材２と、互いに異なる数の窓部４０が形成された複数の枠部材３の各々と、を必要に応じて組み合わせて使用することができる。具体的に、例えば、図６〜図９に示すように、基部材２に４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄが形成されている場合、播種工程Ｓ１００においては、図６〜図９に示すような４つの窓部４０ａ〜４０ｄが形成された枠部材３を取り付けて、当該４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄの各々に細胞を播種する。そして、培養工程Ｓ２００においては、図１９に示すように枠部材３を取り外した分離状態の器具１で培養を継続する。さらに、処理工程Ｓ３００においては、図１１及び図１２に示すような、窓部４０が一つだけ形成された枠部材３を当該基部材２に取り付けて、当該４つのマイクロウェル群２０ａ〜２０ｄのうち、一つのマクロウェル５０に対応する一つのマクロウェル群２０ｂ内の細胞と、その他の３つのマクロウェル群２０ａ、２０ｃ、２０ｄ内の細胞と、に互いに異なる組成の溶液を接触させることもできる。

また、保持部材４は、図１５〜図１７に示すように、基部材２の外周２２及び枠部材３の外周３３の全体に当接する当接部を有するものに限られない。すなわち、保持部材４は、基部材２と枠部材３とを所定の位置関係で一体的に保持できるものであれば、これらの外周２２及び外周３３のそれぞれの一部に当接する当接部を有するものとすることができる。

Claims (13)

1. 細胞を保持可能な複数の第一のウェルを含むウェル群が形成された基部材と、
   前記ウェル群に対応する貫通穴が形成されるとともに、前記基部材に着脱可能に構成され、前記基部材に取り付けられた状態において、前記貫通穴の内壁が前記ウェル群の周囲に立設されて、溶液を保持可能な第二のウェルを形成する枠部材と、
   を備えた
   ことを特徴とする細胞培養器具。
2. 前記第一のウェルの開口部の面積は、１００〜１×１０^６μｍ^２の範囲である
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器具。
3. 前記基部材には、複数の前記ウェル群が互いに離間して形成され、
   前記枠部材には、その各々が前記複数のウェル群のうち一つに対応する前記貫通穴が少なくとも一つ形成されている
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養器具。
4. 前記枠部材には、その各々が前記複数のウェル群のうち一つに対応する前記貫通穴が複数形成され、
   前記枠部材が前記基部材に取り付けられた状態において、前記複数の貫通穴の各々の内壁が対応する一つの前記ウェル群の周囲に立設されて複数の前記第二のウェルが形成される
   ことを特徴とする請求項３に記載の細胞培養器具。
5. 前記基部材と前記枠部材とには、対応する位置に互いに結合可能な第一結合部と第二結合部とがそれぞれ形成されている
   ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の細胞培養器具。
6. 前記基部材には、複数の前記ウェル群が互いに離間して形成され、
   前記第一結合部は、前記複数のウェル群の各々の周囲に形成されている
   ことを特徴とする請求項５に記載の細胞培養器具。
7. 前記第一結合部及び前記第二結合部は、一方が凸形状に形成され、他方が凹形状に形成されて、互いに嵌合可能となっている
   ことを特徴とする請求項５又は６に記載の細胞培養器具。
8. 前記基部材と、前記基部材に取り付けられた前記枠部材と、を一体的に保持し、前記基部材及び前記枠部材のそれぞれの外周の少なくとも一部に当接して前記基部材及び前記枠部材の相対的な位置を固定する当接部を有する保持部材をさらに備えた
   ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の細胞培養器具。
9. 細胞を保持可能な複数の第一のウェルを含むウェル群が形成された基部材に着脱可能に構成され、
   前記ウェル群に対応する貫通穴が形成され、
   前記基部材に取り付けられることによって、前記貫通穴の内壁が前記ウェル群の周囲に立設されて、溶液を保持可能な第二のウェルを形成する
   ことを特徴とする細胞培養器具用枠部材。
10. 請求項１乃至８のいずれかに記載の細胞培養器具を用いる
    ことを特徴とする細胞培養方法。
11. 請求項１乃至８のいずれかに記載の細胞培養器具を用い、
    前記枠部材を前記基部材に取り付けた状態で、前記細胞培養器具のうち前記第二のウェルに細胞を含む溶液を注入することによって、前記第二のウェルに対応する一つの前記ウェル群に前記細胞を播種する工程と、
    前記基部材から前記枠部材を取り外して、前記ウェル群で前記細胞を培養する工程と、
    を含む
    ことを特徴とする請求項１０に記載の細胞培養方法。
12. 請求項１乃至８のいずれかに記載の細胞培養器具を用い、
    前記ウェル群で細胞を培養する工程と、
    前記基部材に前記枠部材を取り付けた状態で、前記細胞培養器具のうち前記第二のウェルに所定の溶液を注入することによって、前記第二のウェルに対応する一つの前記ウェル群の細胞に前記所定の溶液を接触させる工程と、
    を含む
    ことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細胞培養方法。
13. 請求項４に記載の細胞培養器具を用い、
    前記複数のウェル群で細胞を培養する工程と、
    前記基部材に前記枠部材を取り付けた状態で、前記細胞培養器具のうち前記複数の第二のウェルに互いに異なる溶液を注入することによって、前記複数の第二のウェルに対応する前記複数のウェル群の細胞に、互いに異なる前記溶液を接触させる工程と、
    を含む
    ことを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれかに記載の細胞培養方法。