CN102803466B - 培养器材、培养片材及细胞培养方法 - Google Patents

培养器材、培养片材及细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供使不在培养器材表面上涂布化学物质、即可形成直径均一的三维组织的技术成为可能的培养片材。在培养器材的培养片材上形成多个孔，在作为各个孔的底面的培养面上形成可控制细胞的粘接性或迁移性的纳米柱状物。各孔的培养面是设有隔壁的结构，通过在各孔的中心附近形成内部的纳米柱状物，可以限制所接种的细胞的相互作用，使所形成的细胞的三维结构的大小均一。

Description

培养器材、培养片材及细胞培养方法
技术领域
本发明涉及使用培养器材来培养动植物细胞以形成细胞的球状组织(三维组织)和单层组织(二维平面组织)的技术。
背景技术
在药品开发过程中，作为动物实验的替代，需要利用了细胞的体外(invitro)分析。特别是用于候选药物的筛选、毒性代谢试验的动向变得活跃。
基于这种背景，尝试了许多代替现有动物实验的利用了细胞的代替法的研究，但在预测临床反应方面多是有限的。认为其原因在于，在这些培养方法中细胞并未采取模拟了实际的生物体内结构的结构(非专利文献1)。因而，目前尝试了构建发挥更接近生物体的功能的三维组织，在各种细胞种类中成功地形成了三维组织。
作为用于形成细胞三维组织的器材，开发了在规则排列的片材表面上形成有极微细的均一突起的用于培养的片材(纳米柱状物片材)，但所形成的三维组织从器材上的剥离性很高(专利文献1)，具有在培养基交换的过程中丢失的问题。另外，由于无法控制所形成的三维组织的直径，因而具有大小不均、各个三维组织的性能不均的问题，作为实用的形成方法仍然不成熟。
因此，目前开发出在培养器材上设置微小的空穴结构并在每个该空穴中形成一个三维组织的技术(细胞组织体微型芯片)(专利文献2、非专利文献2)。该技术的特征在于，相对于空穴底面的中央附近，将具有粘接性的物质涂布在规定区域内，由此规定细胞粘接区域和细胞非粘接区域，通过利用旋转驱动装置使空穴本身旋转来实施旋转培养，从而使培养细胞保持在作为细胞粘接区域的空穴底面的中央附近。
另外，本发明人等以形成直径均一的球状物为目的，进行了纳米柱状物培养片材的探讨(非专利文献3)。该纳米柱状物培养片材通过使细胞所粘接的器材表面形成3维的凹凸结构，可以控制所形成的球状物的直径。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2005-312343号公报
专利文献2：日本特开2006-121991号公报
非专利文献
非专利文献1：“The Use of 3-D Cultures for High-Throughput Screening：The Multicellular Spheroid Model”Leoni A.Kunz-Schughart，James P.Freyer，Ferdinand Hofstaedter，and Reinhard Ebner J Biomol Screen，9：273-285(2004)
非专利文献2：“Orderly arrangement of hepatocyte spheroids on amicrofabricated chip.”J Fukuda and K Nakazawa Tissue Eng，11：1254-62(2005)
非专利文献3：“Formation of Hepatocyte Spheroids with StructuralPolarity and Functional Bile Canaliculi Using Nanopillar Sheets.”R Takahashi，H Sonoda，Y Tabata and A Hisada，Tissue Eng Part A，1-45(Mar 4，2010)
发明内容
发明要解决的技术问题
虽然是具有这种优点的细胞组织体微型芯片，但由于使细胞强制性地粘接在器材表面的特定部分，因此必须在器材表面涂布化学合成的物质来规定细胞粘接区域和细胞非粘接区域，由此可举出数个技术问题。
首先，所涂布的这些化学物质不仅有可能对细胞的生长造成不良影响，而且由于该操作有必要将化学物质涂布或粘接在极微小的区域上，因而变成非常繁杂的操作，制造成本也增高。
另外，当所接种的细胞落入到非粘接区域时，在培养时的培养基交换时必然会与培养基一起被丢弃而丢失，很难说是一种高效的培养方法。而且，由于落入到粘接区域的细胞通过旋转培养强制地形成组织，因而会对细胞造成应激，有可能会导致活性的降低。
另一方面，在现有的纳米柱状物片材中，在器材面上难以控制细胞运动，即便能够控制所形成的三维组织的大小和直径，也无法将所形成的三维组织保持在目标位置上。
本发明的目的在于提供不需要在培养器材的表面上涂布化学物质即可形成直径均一的三维组织、而且能够使三维组织保持在目标位置上的培养片材、培养器材及使用其的细胞培养方法。
用于解决技术问题的手段
为了达成上述目的，本发明中提供下述构成：具有培养区域，在培养区域内形成有多个突起，并在培养区域的周围形成有将培养区域隔开且比突起高的隔壁。
另外，为了达成上述目的，本发明中，作为培养细胞的培养器材，提供具备培养片材和保持该培养片材的培养片材保持部的培养器材，所述培养片材具备多个培养区域、形成于各个培养区域上的多个突起和将各个培养区域隔开且比突起高的隔壁。
而且，为了达成上述目的，本发明中，作为使用了培养器材的细胞培养方法，提供通过使用具备多个培养区域的培养片材并在这些多个培养区域内接种培养对象的细胞、从而在各个培养区域内形成细胞的三维组织的细胞培养方法，其中所述培养区域在其内部具有多个突起，并在其周围具有比突起高的隔壁。
而且，为了达成上述目的，本发明中提供一种细胞的培养片材，其具备多个培养区域、形成于培养区域的多个突起和将各个培养区域隔开且比突起高度高的隔壁，各培养区域内具有第一区域和第二区域，第一区域中的突起的宽度、直径或间距与第二区域中的突起的宽度、直径或间距不同，所形成的三维组织被保持在通过隔壁限定的区域内的目标位置上。
进而，为了达成上述目的，本发明中提供一种培养器材，其是对细胞进行培养的培养器材，其具备培养片材和保持培养片材的培养片材保持部，培养片材具有包含形成有多个突起的第一区域和未形成该突起的第二区域的培养区域，并形成有将培养区域隔开且比突起高的高度的隔壁。
发明效果
通过使用本发明，仅使用单一原材料即可实现在促进作为细胞原本功能的细胞运动并维持活性的状态下在应激少的环境下形成三维组织。
另外，通过利用同一原材料一体地设置所谓隔壁的限定区域，接种于该限定区域内的细胞全部变得与一个三维组织形成有关，不仅是非常高效的培养方法，而且形成于每个各限定区域的多个三维组织的大小均一、均质，可期待对细胞分析有效。
进而，可期待将三维组织保持在所谓隔壁的限定区域内的目标位置上。而且，还可根据目的形成二维平面组织。对于二维平面组织，也可期待相同的效果。
附图说明
图1为表示第1实施例的培养片材和培养片材内的孔结构的图。
图2为表示第1实施例的纳米柱状物结构的图。
图3为表示第1实施例的粘贴有培养片材的腔室培养玻片的图。
图4为表示第2实施例的板框体的构成的图。
图5为用于说明第2实施例的板与培养片材的超声波焊接流程的图。
图6为表示第3实施例的肝细胞培养的流程图的图。
图7为表示第3实施例的按照肝细胞培养流程利用培养片材获得的肝细胞三维组织照片的图。
图8为表示第4实施例的二段式、多段式纳米柱状物培养片材的图。
图9为表示各实施例的纳米柱状物的排列图案的种类的图。
图10A为表示使用图9所示的柱状物直径不同的培养片材时的细胞培养结果(细胞样子)的图。
图10B为表示使用图9所示的柱状物直径不同的培养片材时的细胞培养结果(形成细胞数)的图。
图11为表示作为培养片材的实施例的变形例的倾斜纳米柱状物培养片材的图。
图12为表示作为培养片材的实施例的变形例的避免表面张力图案培养片材的1个孔的图。
图13A为表示第1实施例的培养器材的外观立体图、俯视图、上下侧视图的图。
图13B为第1实施例的培养器材的部分放大图，为表示A-A、B-B部分放大图和C-C、D-D部分放大图的图。
图13C为第1实施例的培养器材的部分放大图及端面图，为表示E-、，F-F部分放大图、G-G线端面图的图。
图14A为表示第2实施例的培养器材的外观立体图、仰视图的图。
图14B为表示第2实施例的培养器材的俯视图、上下侧视图的图。
图14C为第2实施例的培养器材的部分放大图、部分截面图，为表示A-A、B-B部分放大图和C-C、D-D部分放大图及H-H截面图的图。
图14D为第2实施例的培养器材的部分放大图及端面图，为表示E-E、F-F部分放大图，G-G线端面图的图。
图15A为表示第5、6实施例的培养片材和培养片材内的孔结构的图。
图15B为表示第5、6实施例的培养片材和培养片材内的孔结构的图。
图15C为表示第5、6实施例的培养片材和培养片材内的孔结构的图。
图16为表示第7实施例的按照肝细胞培养流程利用培养片材获得的肝细胞三维组织照片的图。
图17为表示第7实施例的按照肝细胞培养流程利用培养片材获得的肝细胞三维组织照片的图。
图18为表示第7实施例的按照肝细胞培养流程利用培养片材获得的肝细胞三维组织的中心与孔结构的中心间的距离的图。
具体实施方式
以下使用附图对使用培养片材培养细胞以实现作为细胞块的三维组织或二维平面组织的形成方法的最佳实施方式进行详细说明。
实施例1
实施例1中示出将培养片材适用于作为培养片材保持构件的腔室培养玻片的例子。以下，将相对于现有的纳米柱状物片材具有本发明的形成培养区域的隔壁结构、并在该隔壁结构的内部形成有多个突起物的片材记为培养片材。该培养片材用对细胞无不良影响的材质形成，本例中为聚苯乙烯。但材质当然并不限定于聚苯乙烯。
图1为本实施例中制作的培养片材100的扫描型电子显微镜照片的示意图。另外同时示出每1张培养片材中由多个存在的隔壁结构102所构成的孔101(以下称为孔)中的1个孔的结构。该孔101的内部构成细胞组织形成单元的培养区域。
保持于孔101底面上的多个突起物102由多个微小突起物103(以下也称作突起、柱状物、纳米柱状物)构成。另外，使该孔101的直径为孔径105。该培养片材100中，用同一材料一体地形成具备上述隔壁102的孔101和形成于该孔101内部的多个突起103。需要说明的是，该孔101并不限定于圆形形状，也可以是四边形形状等其他的形状。
通过如此用对细胞无不良影响的单一材料将具备隔壁102的孔101和形成于该孔101内部的多个突起103一体地形成为培养片材100，可以在培养工序中在异物不会粘接到细胞上的情况下使细胞成长。而且，由于细胞在各个隔壁内成长，因而可形成均一大小的细胞。
另外，由于在围起来配置的隔壁102的内部设有多个突起，因而会促进作为细胞原本保持的能力的细胞运动，并通过该运动而成长，从而没有旋转培养等所造成的干扰(应激)的影响，可进行维持了细胞活性的细胞培养。
如果想要将这些孔101和突起集合体103分体地形成培养区域，则需要通过它们的粘接、焊接来进行接合。
例如将它们粘接接合时，在培养区域的内部会混入粘接剂成分，有可能会对生成细胞造成不良影响。另外，在焊接接合时，由于孔101的内径是细胞形成水平的极微小区域的直径，因而很难在形成目标细胞区域的同时在不对隔壁、突起造成损伤的情况下进行焊接。当在该隔壁或突起中具有损伤、变形时，有可能在细胞形成过程中对细胞造成不必要的应激、或对细胞自身的运动造成障碍。
因此，优选将构成形成培养区域的孔101的孔底面104、隔壁102和突起103一体地形成。优选通过如此一体地形成，可以实施排除了对细胞培养为必要成分以外的不需要成分的影响的培养。
接着，将突起103的放大图示于图2。柱状物直径是指突起物顶端部的直径(该图2中的106)。柱状物间距是指从突起物顶端部的中心至相邻突起物顶端部的中心的距离(该图2中的107)。柱状物高度是指纳米柱状物的从顶端部至底部的高度(图2中的108)。
本实施例中，使用柱状物直径、柱状物间距、柱状物高度分别为2.0μm、4.0μm、1.0μm者，但如后所述，也可以是这些以外的培养片材。本实施例中，隔壁结构的高度为70μm，但并不限定于该值，优选所形成的细胞不会超过隔壁程度的高度即可。
本实施例的培养片材100通过下述方法制作。
将正方配置有直径为200μm、深度为70μm的圆形孔、以4.0μm的间距在其底面形成有直径为2.0μm、深度为1.0μm的微细孔的模具在135℃、2MPa压力下压制到400μm厚度的聚苯乙烯膜中。冷却至室温后，从压制装置中取出，将模具从聚苯乙烯膜上剥离，从而可以制作保持多个孔径为200μm的孔且在其底面具有多个突起的培养片材。
这里，模具材料为硅片，为了防止培养片材制作时与聚苯乙烯膜的粘接，预先利用氟系的脱模剂实施了脱模处理。本实施例中使模具材料为硅片，但也可以是其它金属材料等模具。
如图3所示，将如此用单一原材料通过一体成型制作的培养片材100在本例中剪切成2cm见方，在腔室培养玻片109的玻璃底面上涂布手术用粘接剂110使其粘接，从而制作了粘贴有培养片材100的腔室培养玻片109。需要说明的是，图3中，109a表示划分各培养片材100的框。该框109a例如用塑料材料等形成。此外，该框109a等框体的形状并不限定于四边形形状，还可以是圆形形状等其他的形状。
图13A～图13C中示出本实施例的粘贴有培养片材的腔室培养玻片的整体构成图及要部截面图。
图13A为本实施例的培养器材的外观立体图、俯视图、上下侧视图。左右侧视图由于由立体图可知其形态，因而省略图示。
图13B为部分放大图，表示A-A、B-B部分放大图和C-C、D-D部分放大图。
图13C为部分放大图及端面图，表示E-E、F-F部分放大图、G-G线端面图。
图13A～图13C中示出的该物品是对人或动物或植物等的细胞进行培养的培养器材(培养容器)，由培养片材100和保持培养片材100的保持部(腔室培养玻片)109构成，在培养片材100的表面上形成有多个隔壁部102，且设置在形成于保持部109的筒状孔穴部109a的内部底面上。
进而，形成各个在其隔壁部的内部具有多个微细的突起部103的培养区域。按照添加至形成隔壁部102内的培养区域的片材面的方式将所培养的目标细胞添加至孔穴部109a内时，变成保持于多个微细的突起部103来培养该目标细胞。
实施例2
接着，根据图4、图5说明第2实施例。实施例2中示出带有培养片材的多孔板的构成及其制作例。图4的(a)为构成多孔板的框体111的仰视图。作为培养片材保持构件的框体111成型为在横宽约为125mm、纵约为80mm、高约为20mm中纵列有4个孔穴、横列有6个孔穴的共计24个孔穴的筒状孔穴部111a。原材料使用聚苯乙烯。
形成在框体上的孔穴的数量通常从6个孔穴至1536个孔穴根据用途分别使用，因而该框体也并不限定于24个孔穴。另外，框体的原材料并不限定于聚苯乙烯。
在该培养器材的制作中，利用超声波焊接将框体111和培养片材100接合。
对框体111预先实施以下的处理。首先第一个是，为了防止由于使框体111和培养片材100焊接时施加的超声波振动而使细胞培养片材与板错位，在框体111的底面上加工膜固定用突起112。第二个是，为了用超声波将培养片材焊接，预先设置棱结构113。
图4的(b)、(c)分别表示图4(a)的B-B’、A-A’的截面图。另外，还可以在重叠两者时的相同位置上按照膜用固定突起嵌入的方式预先设置与培养片材相同直径的孔穴114。接着，利用超声波焊接将该框体与培养片材100粘接。
将其工序示于图5。首先，将框体的膜固定用突起和培养片材的孔穴对合，将两者重叠(图5的(a))。接着，由超声波振荡器通过变频器、升压器、进而焊头从培养片材侧产生超声波，将两者焊接(图5的(b))。焊头是指使适当能量的超声波接触于适当的位置将其焊接的装置，制作按照沿着棱结构的位置适当地产生超声波的方式设计的专用装置来使用。115表示如此制作的板的俯视图。
本实施例中，使用超声波焊接将框体和培养片材接合，但当然并不限定于该方法。由于利用超声波焊接可以在不存在对细胞造成影响的粘接剂等有机物的情况下实现板化，因而不会对细胞造成不良影响，当然可以说是不仅可适用于新药开发过程中的毒性代谢试验、而且也可适用于面向再生医疗的组织体形成的培养片材。
此外，对于实施例1中所示例的图3的腔室培养玻片形状的培养器材，当然也可以通过在框109a的底部设置多个棱结构、并利用该棱结构进行与培养片材10的焊接，由此利用与本实施例相同的接合方法制作培养器材。
对于如此制作的培养器材，在形成于框体111的底面上的培养片材100上形成多个孔101，构成于该孔底面104的多个突起物由多个微小突起物103(以下也称作突起、柱状物、纳米柱状物)构成。另外，使该孔101的直径为孔径105。在该培养片材100中，具备上述隔壁102的孔101和形成在该孔101内部的多个突起103用同一材料一体地形成。此外，该孔101并不限定于圆形形状，也可以是四边形形状等其他的形状。
通过如此用对细胞无不良影响的单一材料将具备隔壁102的孔101和形成在该孔101内部的多个突起103一体地形成为培养片材，由此可以在培养工序中在异物不会粘接在细胞上的情况下使细胞成长。
进而，由于细胞在各个隔壁内成长，因而可以形成均一大小的细胞。
另外，由于在围起来配置的隔壁的内部设置有多个突起，因而会促进作为细胞原本保持的能力的细胞运动，并通过该运动而成长，从而没有旋转培养等所导致的干扰(应激)的影响，可以进行维持了细胞活性的细胞培养。
如果想要将这些孔101和突起集合体103分体地形成培养区域，则需要通过它们的粘接、焊接来进行接合。例如将它们粘接接合时，在培养区域的内部会混入粘接剂成分，有可能会对生成细胞造成不良影响。
另外，在想要焊接时，由于孔101内部的直径是细胞形成水平的极微小区域，因而很难在形成目标细胞区域的同时在不对隔壁、突起造成损伤的情况下进行焊接。当在该隔壁或突起中具有损伤、变形时，有可能在细胞形成过程中对细胞造成不必要的应激、或对细胞自身的运动造成障碍。
因此，优选将形成培养区域的孔101和突起103一体地形成。优选通过如此一体地形成，可以进行排除了对细胞培养为必要成分以外的不需要成分的影响的培养。
这里，图14A～图14D表示本实施例的带有培养片材的多孔板的整体构成图及要部截面图。
图14A表示本实施例的培养器材的外观立体图、仰视图。
图14B表示培养器材的俯视图、上下侧视图。这里，左右侧视图由于由外观立体图可清楚其形态，因而图示省略。
图14C为部分放大图、部分截面图，表示A-A、B-B部分放大图、C-C、D-D部分放大图和H-H截面图。
图14D为部分放大图及端面图，表示E-E、F-F部分放大图、G-G线端面图。
图14A～图14D所示的该物品是培养人或动物或植物等的细胞的培养器材(培养容器)，由培养片材100和保持培养片材100的保持部(框体)111构成。
在培养片材100的表面上形成有多个孔101，设置在形成于保持部的筒状孔穴部111a的内部底面上。
进而，在其隔壁部的内部分别形成有具有多个微细突起部103的培养区域。按照添加于形成孔101内的培养区域的片材面的方式将所培养的目标细胞添加于孔穴部111a内时，变成保持于多个微细的突起部103来培养该目标细胞。
另外，本例的培养器材示出的是从框体111的里面焊接培养片材的例子，作为保持部的框体111和培养片材100通过接合部1112焊接在一起。
该接合部1112设置在孔穴部111a的外部，该焊接对培养区域没有影响。
因此，本例中示例了焊接，但并不限定于该接合方法，通过其他接合方法也不会对培养区域本身造成接合所导致的影响，因而也可采用其他的接合方法。
而且，本例的器材为该框体111形成四边形形状的形态、且其4个顶点内至少1点被剪切。通过形成该剪切面1113，具有进行培养的操作者变得易于确定器材孔穴部的位置的效果。
剪切面并不是必须的，当然也可以没有。在该培养器材上还形成有防滑部1111，可以防止在操作过程中操作者突然地摇动、掉落该器材等。
实施例3
实施例3中示出利用实施例1和2制作的培养器材的细胞组织培养中的适用例。在新药开发中，反映生物体机能的三维组织的构建对于利用代替动物试验的细胞的各种评价是需要的。
另外，由于在培养诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells：iPS细胞)或胚胎干细胞(Embryonic stem cells：ES细胞)使其分化成目标细胞之前必须形成三维组织，因而期待在再生医疗领域中简单构建三维组织的技术。由这种背景出发，这里特别示出使用腔室培养玻片形成三维组织的例子，但即便是多孔板，细胞培养的本质部分也并无特别改变。本实施例中示出使用大鼠肝细胞的例子，但如上所述可适用于各种动植物的细胞种类，细胞种类并无特别限定。
肝细胞的制备按照胶原酶原位灌流法进行。详细地说如下所述。在戊巴比妥麻醉下打开Fisher344系雄性大鼠(7～10周龄)的腹腔，在门静脉中插入导管，注入灌流液(不含Ca2+和Mg2+、含EGTA的Hanks液)。
同时，将肝脏下部的下腔静脉切开将血液放出。接着，打开胸腔，将进入右心房的下腔静脉切开，用套结止住肝脏下部的下腔静脉进行灌流。在确认了由肝脏的脱血充分后停止灌流。将灌流液换成胶原酶溶液进行灌流。
本实施例中，使用含0.05％胶原酶的Hanks液进行灌流，但并不限于此。在确认了细胞间组织被胶原酶消化后，停止灌流。切出肝脏，在冰镇后的Hanks液中切碎，通过移液分散成细胞。接着，通过纱布过滤将未消化的组织除去。将细胞悬浮液重复进行数次50G、1分钟的离心分离，将非实质细胞除去。接着，使用等渗Percoll液通过500G、5分钟的离心分离将有损伤的细胞除去。所得肝细胞的存活率通过锥虫蓝排除法测量，将存活率为85％以上的肝细胞用于培养。这里，虽然是将存活率为85％以上的肝细胞用于培养，但当然并不限定于该条件。另外，肝细胞的制备并不限定于胶原酶原位灌流法。
将使用了如此获得的肝细胞的培养流程图示于图6。
在图6的流程中，首先在实施例1中制作的腔室培养玻片型的培养片材上涂布I型胶原116。将稀释液的1-1.5mL添加至上述的腔室培养玻片上，该稀释液是将溶解于弱酸性溶液的I型胶原用灭菌水稀释至规定浓度而得到的(该图(a))。接着，为了使所添加的I型胶原完全地吸附在纳米柱状物片材100上，实施减压操作(该图(b))。减压操作使用减压用容器117和减压泵118在0.04个气压以下进行。减压时间并无特别限定，本实施例中进行10分钟。减压所使用的装置构成并无特别限定。这里，稀释液的规定浓度的范围为100(ng/ml)以上且10(μg/ml)以下。虽然并不限定于该范围，但该范围是形成球状的三维组织所优选的范围。最后，除去剩余的I型胶原，添加PBS(-)119(该图(c))。进行该操作3次，将剩余的I型胶原洗涤。
如上所述，将利用胶原酶原位灌流法制备的肝细胞120悬浮在培养基121中，接种在同样地如上准备的涂布有I型胶原的NP片材上(该图(d))。培养基并无特别限定，使用含有含血清(FCS)、胰岛素、地塞米松的培养基(以下称为培养基(含10％FCS))的Williams E培养基。本实施例中，特别使用含有10％FCS、8.6nM胰岛素、255nM地塞米松的Williams E培养基。接种后，使用CO2孵育箱在5％CO2、37℃的条件下开始培养，经过18小时以上后，进行最初的培养基交换，之后每24小时进行培养基交换。接种后第18小时以后的培养所使用的培养基并无特别限定，本实施例中使用从培养基(含10％FCS)中除去了FCS的培养基(以下称为培养基(不含FCS))。
另外，肝细胞的接种密度在本实施例中为1×105cells/ml，但并不限定于该浓度。这里，培养所使用的培养片材100使用柱状物高度、柱状物直径、柱状物间距分别为1.0μm、2.0μm、4.0μm者，但并不限定于该值。
另外，添加于培养片材的I型胶原的浓度在本实施例中为100(ng/ml)，但也可以是除此以外的其他浓度。根据细胞的条件，即便是除该浓度以外的浓度，也会形成球状物。共计培养96小时，形成三维组织122(该图(e))。将使用孔径为200μm的上述培养片材实际培养了肝细胞的结果的照片示于图7。
由图7可知，不在培养片材表面上涂布特别的化学物质，且利用对细胞的应激少的静置培养，如此形成了大小均匀的球状三维组织。考虑到这并未丧失原本保持的细胞的活性，因而是对细胞分析等有效的培养方法。
实施例4
图8中示出作为实施例4的上述培养片材100的实施例的变形例。对于培养片材123的引起细胞的迁移性、粘接性不同的突起物的排列图案，首先示出下述例子：如该图(a)所示，通过按照将第一排列图案125a的周围用第二排列图案125b包围起来的方式以二段式进行配置，在第一排列图案125a上(例如孔的中心附近)形成三维组织或二维平面组织。
然后示出下述例子：与该图(a)相反，如该图(b)所示，通过按照将第二排列图案125b的周围用第一排列图案125a包围起来的方式以二段式进行配置，在第二排列图案125b上(例如孔边缘部)形成三维组织或二维平面组织。需要说明的是，124与之前的实施例同样，表示孔。虚线表示图案的边界。
另外，并不限于孔124内的中央部，通过如该图(c)的培养片材126那样进行配置，例如通过将4个位置的第一排列图案127a用第二排列图案127b包围起来，也可在第一排列图案127b上形成大小均匀的组织。如此，柱状物直径、柱状物间距、配置图案的组合可根据目标配置最佳的图案来进行培养。同样地，该图的(d)示出使排列图案为多段式图案129c、129b、129a的培养片材128。
接着，使用图9说明上述实施例的突起物的排列图案(以下称为柱状物图案)的种类。如图9所示，示例了11种排列图案。由该图可知，是柱状物直径和柱状物间距分别为0.18～20.0μm、0.36～40.0μm的11种，但并不限定于此。将在这些柱状物图案下培养后的肝细胞的一例示于图10A、10B。
此外，在没有柱状物图案的平坦的平面下的培养中，由于在培养过程中的培养基交换时大量细胞与培养基一起被排出，因而无法有效地获得所希望的培养细胞。因而，图10A中并未图示出来。
图10A为表示使用相对于柱状物直径为2倍间距的培养片材100进行培养后的细胞的样子的图。结果，在柱状物直径为0.18μm、0.5μm、1.0μm时，并非球状的平坦组织粘接在器材底面上，而柱状物直径为2.0μm、5.0μm时，形成相对于器材呈球状的三维组织。
另外，对于柱状物直径为2.0μm、5.0μm的器材而言，尝试对所形成的球状细胞进行比较时可知，柱状物直径为2.0μm的器材中细胞粘接在器材上，是稳定的状态。即，关于细胞粘接性，柱状物直径越大，则显示越低的粘接性，可知促进了细胞的移动。
图10B是表示对于由各柱状物直径的片材所形成的肝细胞的3维组织(球状物：spheroid)的数量按每个所形成的直径进行总结的结果的图。片材面积为4平方cm(2cm×2cm)。
对于肝细胞的三维组织而言，在代替药物开发领域的动物试验的药剂筛选、以毒性代谢试验为目的的细胞分析中，优选50～100微米直径的细胞，本例中当柱状物直径为2.0μm的器材时，该尺寸的细胞形成数最多，从而优选。
但是，在上述探讨中，为了形成50～100微米直径的细胞，优选柱状物直径为2.0μm的情况，但并不限定于此，可知在本探讨中所使用的全部柱状物直径中，相比较于未形成柱状物的平坦的状态，会形成数量更多的形状稳定的细胞。这样，根据柱状物图案的不同，可以自由地改变细胞或由细胞形成的组织的形态或者对器材的粘接性。
应用上述结果，如图8的实施例4中所说明的那样，通过按照将柱状物直径(柱状物间距)小的第一排列图案的周围用柱状物直径(柱状物间距)大的第二排列图案包围起来的方式以二段式进行配置或者以多段式进行配置，可以利用细胞粘接性及细胞自身的运动特性在孔内的目标位置上形成目标形状的组织。
另外，通过使具有同一尺寸的柱状物直径的纳米柱状物的高度从孔的边缘部向中心部降低，倾斜地阶段式地设置高度上的差异，按照通过重力集中于中心部的方式促进细胞的运动，也可形成组织。图11的(a)示出了作为阶段式地设置纳米柱状物的高度上的差异的变形例的培养片材130。此时，与通常的U字型的培养容器不同，通过存在柱状物，具有将细胞保持在中央的效果。进而，如该图的(b)的培养片材131那样，即便倾斜，也设置柱状物直径上的不同，也可以促进上述效果。
在图11的变形例中是按照倾斜变得顺畅的方式阶段式地使高度变化，但也可以是以阶梯状依次使高度具有变化的构成。
另外，多个孔集合而形成培养面(在为腔室培养玻片时是四边形形状；在为板时是圆形形状)，在培养时由于表面张力的影响，在培养面中央部和边缘部产生三维组织形成方法上的不同。即，尽管在培养面中央部处形成了三维组织，但在边缘部处，由于表面张力，该部分的培养基量增加、氧供给量下降或者施加很高的水压等，因此有可能发生不形成三维组织的情况。为了避免该现象，还可制作图12的(a)、(b)所示的仅在培养面的中央部保持有孔结构的培养片材132、133。
通过如此地形成培养片材，可以实现培养效率高且制造负荷少的培养器材。
实施例5
图15A、图15B、图15C示出了第5实施例的培养片材。实施例5对应的是使用在图8的实施例4所示的各种变形例中第一排列图案125a为平坦结构、仅在孔的中心部排列有突起的图案的培养片材的情况。即，本实施例中，通过制成培养区域分别由第一区域和将其包围的第二区域构成、仅在第一区域排列突起、在第二区域不形成突起的结构的培养片材，将作为直径一致的三维组织的球状物保持在对应于第一区域的培养区域的中心部，从而可以将其保持在目标位置上。
这里示出了在培养区域内的中心附近排列有突起的例子，但当然并不必须包含中心，只要在培养区域内的所希望的区域上排列突起即可。另外，虽然示出了形成大致菱形形状的突起区域的例子，但当然也可以是圆形、四边形、多边形的形状。
如图15A所示，将培养片材150适用于作为培养片材保持构件的腔室培养玻片。本实施例中，使用在培养片材上的被作为隔壁结构的隔壁152隔开的各孔151内柱状物高度、柱状物直径、柱状物间距分别为1.0μm、2.0μm、4.0μm、突起部集合体153的直径为80μm和20μm的培养片材150。
图15A为本实施例中制作的培养片材150的扫描型电子显微镜照片的示意图，另外同时示出由每1张培养片材中多个存在的隔壁结构152构成的孔151的其中一个孔的结构。该孔101的内部构成细胞组织形成单元的培养区域，这与上述的实施例是同样的。保持在孔151的底面上的多个突起物153由多个微小突起物构成。另外，使该孔151的直径为孔径155。该培养片材150中，具备上述隔壁152的孔151和形成于该孔151内部的多个突起153由同一材料一体地形成。需要说明的是，该孔151并不限定于圆形形状，也可以是四边形形状等其他形状，这与上述的实施例是同样的。
图15B和图15C的各图中，156和158表示孔、157、159表示突起物集合体。此外，该培养片材150由对细胞无不良影响的材质形成，本例中为聚苯乙烯。但材质当然不限定于聚苯乙烯。
通过如此用对细胞无不良影响的单一材料将具备隔壁152的孔151和形成在该孔151内部的多个突起153一体地形成为培养片材150，可以在培养工序中异物不会粘接在细胞上的情况下使细胞成长。进而，由于细胞在各个隔壁中成长，因而可形成均一大小的细胞。
另外，由于在围起来配置的隔壁152的内部设有多个突起，因而会促进作为细胞原本保持的能力的细胞运动，通过该运动而成长，从而可以在没有旋转培养等所导致的应激等干扰的影响下，进行维持了细胞活性的细胞培养。
当想要将这些孔151和突起集合体153分体地形成培养区域时，则需要通过它们的粘接、焊接来进行接合。例如将它们粘接接合时，在培养区域的内部会混入粘接剂成分，有可能会对生成细胞造成不良影响。另外，在焊接接合时，由于孔151的内径是细胞形成水平的极微小区域直径，因而很难在形成目标细胞区域的同时在不对隔壁、突起造成损伤的情况下进行焊接。当在该隔壁或突起中具有损伤、变形时，有可能在细胞形成过程中对细胞造成不必要的应激、或对细胞自身的运动造成障碍。
因此，在本实施例中也优选将构成形成培养区域的孔151的孔底面154、隔壁152和突起153一体地形成。优选通过如此一体地形成，可以进行排除了对细胞培养为必要成分以外的不需要成分的影响的培养。
需要说明的是，本实施例的突起153的放大图由于与使用图2说明过的实施例1的突起具有相同结构，因而这里省略说明。本实施例中，作为隔壁结构的隔壁152的高度例如为70μm，但并不限定于该值，优选只要是所形成的细胞不会越过隔壁程度的高度即可。另外，本实施例的培养片材150由于用与实施例1相同的方法制作，因而这里省略制作方法的详细说明。
进而，本实施例中当然也可以制作图3所示的粘贴有培养片材150的腔室培养玻片109，可以获得具有与图13A、图13B、图13C相同的整体构成及要部截面的腔室培养玻片，这里省略说明。
实施例6
接着，使用图4、图5说明第6实施例。实施例6中为表示使用第5实施例说明过的培养片材150的带有培养片材150的多孔板的构成及其制作例的实施例。多孔板的构成及其制作例在图4、图5中详细地进行了说明，但本实施例中除了使用培养片材150代替实施例2中使用的培养片材100之外，基本上与实施例2是同样的。
图4的(a)为构成多孔板的框体111的仰视图。作为培养片材保持构件的框体111成型为在宽约为125mm、纵约为80mm、高度约为20mm中纵列有4个孔穴、横列有6个孔穴的共计24个孔穴的筒状孔穴部111a。原材料使用聚苯乙烯。
形成在框体上的孔穴的数量通常从6个孔～1536个孔根据用途分开使用，因而该框体的孔穴数也并不限定于24个孔。另外，框体的原材料也并不限定于聚苯乙烯。
在该培养器材的制作中，利用超声波焊接将框体111与图15A的培养片材150接合。以下的处理和构成等与实施例2是同样的。
如此制作的培养器材中，在代替形成在框体111底面上的培养片材100的图15A中说明过的培养片材150上形成多个孔151，在该孔底面154上构成的多个突起物由多个微小突起物153构成。另外，使该孔151的直径为孔径155。在该培养片材150中，具备上述隔壁152的孔151和形成在该孔151内部的多个突起153用同一材料一体地形成。此外，该孔151并不限定于圆形形状，也可以是四边形形状等其他的形状。
如此通过用对细胞无不良影响的单一材料将具备隔壁152的孔151和形成于该孔151内部的多个突起153一体地形成为培养片材，可以在培养工序中在异物不会粘接在细胞的情况下使细胞成长。而且，由于细胞在各个隔壁内成长，因而可形成均一大小的细胞。另外，由于在围起来配置的隔壁的内部设有多个突起，因而会促进作为细胞原本保持的能力的细胞运动，通过该运动而成长，从而没有旋转培养等所造成的干扰(应激)的影响，可以进行维持了细胞活性的细胞培养。
如上所述，本实施例中也优选将形成培养区域的孔151和多个突起153一体地形成。通过如此一体地形成，可以进行排除了对于细胞培养为必须成分以外的不要成分的影响的培养，从而是优选的。
本实施例的带有培养片材的多孔板的整体构成图及要部截面图也与实施例2相同，如图14A、图14B、图14C、图14D所示，因而这里省略说明。
实施例7
接着，作为第7实施例，说明利用了实施例5和6所制作的培养器材的细胞的组织培养中的适用例。首先，作为实施例3，示出了利用了实施例1和2所制作的培养器材的细胞的组织培养中的适用例，但本实施例与实施例3的不同点是利用使用培养片材150代替培养片材100的培养器材的方面。除此之外的说明是通用的，因而这里省略说明。
另外，当然使用了如此获得的培养器材的培养的流程图也是除了使用培养片材150这一点之外，与图6所示的培养流程完全相同。
使用图16、图17、图18，说明使用了本实施例的培养器材的培养结果。本实施例的在孔151的中心部以直径为80μm的圆形形状排列有柱状物宽为2.0μm的纳米柱状物的培养片材150中，如图16所示，将直径一致的球状物160保持在孔156的中心部。另外，如图17所示，在孔158的中心部以直径为20μm的圆形形状排列有相同尺寸的纳米柱状物的培养片材150中，球状物并未保持于中心部。
由以上结果可知，不在培养片材表面上涂布特别的化学物质，且利用对于细胞来说应激少的静置培养，形成了如此大小均匀的球状的三维组织。考虑到这并未丧失原本保持的细胞的活性，因而是对细胞分析等有效的培养方法。
图18表示使用孔151内整面为纳米柱状物、柱状物区域为80μm、柱状物区域为20μm这3种片材来测定孔151的中心与球状物中心之间的距离的结果。该图中，横轴表示球状物的宽度(μm)、纵轴表示球状物的中心间距离(μm)。如该图所示可知，与其他2种相比，在柱状物区域为80μm的片材中，球状物地保持在孔的中心部。如此可知，当使孔直径和中心部的纳米柱状物区域适当时，大小均匀的球状物被保持在孔的中心部。
产业上的可利用性
本发明作为使用培养器材对动植物细胞进行培养以形成细胞的球状组织(三维组织)和单层组织(二维平面组织)的技术是极为有用的。
符号说明
100、123、126、128、130、131、132、133、150  培养片材
101、124、151、156、158  孔
102、152  隔壁
103、153、157、159  突起物/突起物集合体
104、154  孔底面
105、155  孔径
106  柱状物直径
107  柱状物间距
108  柱状物高度
109  腔室培养玻片
110  手术用粘接剂
111  框体
111a 形成在框体上的孔穴部
112  膜固定用突起
113  棱结构
114  培养片材孔穴
115  细胞培养板
116  I型胶原溶液
117  减压用容器
118  减压用泵
119  洗涤用生理盐水(PBS(-))
120  培养基
121  肝细胞
122  肝细胞球状物
125a、125b、127a、127b、129a、129b、129c  突起物排列图案
1111  防滑部
1112  接合部
1113  剪切面。

Claims (18)

1.一种培养器材，其为对细胞进行培养的培养器材，其特征在于，具备培养片材和与所述培养片材接合并保持所述培养片材的培养片材保持部，所述培养片材具有培养区域，在所述培养区域内形成有多个突起，并通过隔壁形成有孔结构，所述隔壁比所述突起高且比由所述培养片材保持部形成的框低。
2.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，通过所述框将所述培养片材包围。
3.根据权利要求2所述的培养器材，其特征在于，所述框形成在所述培养片材保持部。
4.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，所述片材保持部与所述培养片材通过超声波焊接接合在一起。
5.根据权利要求2所述的培养器材，其特征在于，所述框为四边形形状或圆形形状。
6.一种培养器材，其为对细胞进行培养的培养器材，其特征在于，具备培养片材和与所述培养片材接合并保持所述培养片材的培养片材保持部，所述培养片材具有培养区域，在所述培养区域内形成有多个突起，在所述培养片材保持部形成包围所述培养区域的框，并通过隔壁形成有孔结构，所述隔壁比所述突起高且比所述框低。
7.根据权利要求6所述的培养器材，其特征在于，所述片材保持部与所述培养片材通过超声波焊接接合在一起。
8.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，所述培养片材具有多个所述培养区域。
9.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，在所述培养区域内具有第一区域和第二区域，所述第一区域中的所述突起的宽度/直径与所述第二区域中的所述突起的宽度/直径不同。
10.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，所述突起的宽度/直径是多段式的。
11.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，在所述培养区域内具有第一区域和第二区域，所述第一区域中的所述突起的间距与所述第二区域中的所述突起的间距不同。
12.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，多个所述突起的间距是多段式的。
13.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，在所述培养区域内的多个突起中，该区域内的第一区域中的突起的高度与第二区域中的突起的高度不同。
14.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，所述突起的高度以多段式构成。
15.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，所述培养片材中的所述隔壁及多个所述突起由同一原材料一体地形成。
16.根据权利要求6所述的培养器材，其特征在于，所述培养片材中的所述隔壁及多个所述突起由同一原材料一体地形成。
17.一种培养片材，其为对细胞进行培养的培养片材，其特征在于，具备培养区域，在所述培养区域内形成多个突起，并通过隔壁形成有孔结构，所述隔壁比所述突起高且比由保持所述培养片材的培养片材保持部形成的包围所述培养区域的框低。
18.根据权利要求17所述的培养片材，其特征在于，所述隔壁及多个所述突起由同一原材料一体地形成。
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