KR101512878B1

KR101512878B1 - 배양 기재, 배양 시트 및 세포 배양 방법

Info

Publication number: KR101512878B1
Application number: KR1020117030767A
Authority: KR
Inventors: 료오스께 다까하시; 아끼꼬 히사다; 히로시 소노다; 다꾸 사이또오
Original assignee: 가부시키가이샤 히타치세이사쿠쇼
Priority date: 2009-06-23
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2015-04-16
Also published as: EP2447354B1; KR101454580B1; US9394514B2; EP2447354A4; WO2010150521A1; EP2447354A1; KR20140069360A; KR20140069361A; CN102803466A; CN102803466B; KR20130133094A; KR20120024831A; US20120100612A1

Abstract

배양 기재 표면에 화학 물질을 도포하는 일 없이, 직경이 일치된 3차원 조직을 형성시키는 기술을 가능하게 하는 배양 시트를 제공한다. 배양 기재의 배양 시트 상에, 복수의 홀이 형성되고, 각각의 홀의 저면인 배양면에는, 세포의 접착성이나 유주성을 제어할 수 있는 나노 필러가 형성된다. 각 홀의 배양면은, 구획벽을 설치한 구조로 하고, 내부의 나노 필러를, 각 홀의 중심 부근에 형성함으로써, 파종된 세포의 상호 작용을 제한하고, 형성되는 세포의 3차원 구조의 크기를 균일하게 하는 것이 가능해진다.

Description

배양 기재, 배양 시트 및 세포 배양 방법{CULTURE SUBSTRATE, CULTURE SHEET, AND CELL CULTURE METHOD}

본 발명은, 배양 기재를 사용하여 동식물 세포를 배양하고, 세포의 구상 조직(3차원 조직), 및 단층 조직(2차원 평면 조직)을 형성하는 기술에 관한 것이다.

의약품 개발 프로세스에 있어서, 동물 실험 대신에, 세포를 이용한 인ㆍ비트로(in vitro) 분석이 요구되고 있다. 특히, 약제 후보 물질의 스크리닝, 독성ㆍ대사 시험에 응용하는 움직임이 활발해져 있다.

이와 같은 배경 하에, 종래의 동물 실험 대신에, 세포를 이용한 대체법의 어프로치는 왕성하게 시도되어 왔지만, 임상 반응을 예측하기 위해서는 한계가 있는 경우가 많다. 이것은, 이들의 배양법에서는, 세포가 실제의 생체 내의 구조를 모의한 구조를 취하고 있지 않기 때문이라고 생각되어 있다(비특허 문헌 1). 따라서, 보다 생체에 가까운 기능을 발휘하는 3차원 조직의 구축이 지금까지 시도되고 있고, 다양한 세포종으로 3차원 조직을 형성하는 데 성공하고 있다.

세포의 3차원 조직을 형성시키기 위한 기재로서, 매우 미세한 균일 돌기가 규칙적으로 배열된 시트 표면에 형성된 배양을 위한 시트(나노 필러 시트)가 개발되고 있지만, 형성된 3차원 조직은, 기재로부터의 박리성이 높고(특허 문헌 1), 배지 교환의 과정에 의해 상실된다고 하는 문제가 있다. 또한 형성된 3차원 조직의 직경을 제어할 수 없기 때문에, 크기가 균일하지 않고, 각각의 3차원 조직의 성능이 변동된다고 하는 문제점을 내포하고 있어, 실용적인 형성법으로서는 여전히 미숙하다.

따라서, 배양 기재에 미소한 캐비티 구조를 설치하여, 그 캐비티당에 하나의 3차원 조직을 형성시키는 기술(세포 조직체 마이크로 칩)이 지금까지 개발되고 있다(특허 문헌 2, 비특허 문헌 2). 본 기술에서는 캐비티 저면의 중앙 부근에 대해, 접착성을 갖는 물질을 소정 영역에 도포함으로써, 세포 접착 영역과 세포 비접착 영역을 규정하고, 캐비티 그 자체를 회전 구동 장치 등에 의해 회전시켜, 회전 배양을 실행함으로써 세포 접착 영역인 캐비티 저면의 중앙 부근에 배양 세포가 유지되는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명자들은, 직경이 일치된 스페로이드 형성을 목적으로 하고, 나노 필러 배양 시트의 검토를 진행하고 있다(비특허 문헌 3). 이 나노 필러 배양 시트는, 세포가 접착하는 기재 표면을 3차원적은 요철 구조로 함으로써, 형성되는 스페로이드의 직경을 제어하려고 하는 것이다.

일본 특허 출원 공개 제2005-312343호 공보 일본 특허 출원 공개 제2006-121991호 공보

"The Use of 3-D Cultures for High-Throughput Screening:The Multicellular Spheroid Model" Leoni A. Kunz-Schughart, James P. Freyer, Ferdinand Hofstaedter, and Reinhard Ebner J Biomol Screen, 9:273-285(2004) "Orderly arrangement of hepatocyte spheroids on a microfabricated chip." J Fukuda and K Nakazawa Tissue Eng, 11:1254-62(2005) "Formation of Hepatocyte Spheroids with Structural Polarity and Functional Bile Canaliculi Using Nanopillar Sheets." R Takahashi, H Sonoda, Y Tabata and A Hisada, Tissue Eng Part A, 1-45(Mar4, 2010)

이와 같은 특징을 갖는 세포 조직체 마이크로 칩이지만, 세포를 기재 표면의 특정 부분에 강제적으로 접착시키기 위해, 기재 표면에 화학적으로 합성된 물질을 도포하여 세포 접착 영역과 세포 비접착 영역을 규정해야만 하여, 이에 의해 몇 개의 과제를 들 수 있다.

우선, 도포된 이들의 화학 물질은 세포의 육성에 악영향을 미칠 가능성이 있을 뿐만 아니라, 이 조작은 매우 미소한 영역에 화학 물질을 도포 또는 접착할 필요가 있으므로 매우 번잡한 작업으로 되어, 제조 비용도 든다.

또한, 파종된 세포가 비접착 영역에 빠지는 경우, 배양시의 배지 교환시에 배지와 함께 파기되어 상실되는 것이 불가피하며, 효율적인 배양 방법이라고는 말하기 어렵다. 또한 접착 영역에 빠진 세포가 회전 배양에 의해 강제적으로 조직을 형성하게 되므로, 세포에 대한 스트레스가 가해져 활성의 저하를 초래하는 것이 염려되어 있다.

한편, 종래의 나노 필러 시트에 있어서도, 기재 면 상에서 세포 운동을 제어하는 것이 곤란하며, 형성되는 3차원 조직의 크기ㆍ직경을 제어할 수 있어도, 형성된 3차원 조직을 원하는 장소로 보유 지지시킬 수 없다.

본 발명의 목적은, 배양 기재의 표면에 화학 물질을 도포하는 일 없이, 직경이 일치된 3차원 조직을 형성하고, 또한 3차원 조직을 원하는 위치로 보유 지지시키는 것을 가능하게 하는, 배양 시트, 배양 기재 및 그것을 사용한 세포 배양 방법을 제공하는 데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 있어서는, 배양 영역을 갖고, 배양 영역 내에 복수의 돌기가 형성되고, 배양 영역의 주위에 배양 영역을 구획하는, 돌기보다도 높은 구획이 형성된 구성을 제공한다.

또한, 상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 있어서는, 세포를 배양하는 배양 기재로서, 복수의 배양 영역과, 배양 영역 각각에 형성된 복수의 돌기와, 배양 영역 각각을 구획하는, 돌기보다 높은 높이를 갖는 구획을 구비한 배양 시트와, 이 배양 시트를 보유 지지하는 배양 시트 보유 지지부를 구비한 배양 기재를 제공한다.

또한, 상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 있어서는, 배양 기재를 사용한 세포 배양 방법으로서, 그 내부에 복수의 돌기를 갖고, 그 주위에 돌기보다 높은 구획을 갖는 배양 영역을 복수 구비한 배양 시트를 사용하고, 이들 복수의 배양 영역에 배양 대상의 세포를 파종함으로써, 배양 영역 각각에서 세포의 3차원 조직을 형성시키는 세포 배양 방법을 제공한다.

게다가 또한, 상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 있어서는, 복수의 배양 영역과, 배양 영역에 형성되는 복수의 돌기와, 배양 영역 각각을 구획하는, 돌기보다 높이가 높은 구획을 구비하고, 각 배양 영역 내에 제1과 제2 영역을 갖고, 제1 영역에 있어서의 돌기의 폭, 직경 혹은 피치와, 제2 영역에 있어서의 돌기의 폭, 직경 혹은 피치가 상이하고, 형성되는 3차원 조직이 구획에 의해 한정된 영역 내의 목적의 위치로 보유 지지되는 세포의 배양 시트를 제공한다.

게다가 또한, 상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 있어서는, 세포를 배양하는 배양 기재이며, 배양 시트와, 배양 시트를 보유 지지하는 배양 시트 보유 지지부를 구비하고, 배양 시트는 돌기가 복수 형성된 제1 영역과, 상기 돌기가 형성되어 있지 않은 제2 영역을 포함하는 배양 영역을 갖고, 배양 영역을 구획하는, 돌기보다도 높은 높이의 구획이 형성되어 있는 배양 기재를 제공한다.

본 발명을 적용함으로써, 단일 소재만을 사용하고, 세포 본래의 기능인 세포 운동을 촉진시켜 활성을 유지한 상태에서 스트레스가 적은 환경 하에 의한 3차원 조직 형성을 실현할 수 있다.

또한, 구획이라고 하는 한정 영역을 동일 소재로 일체적으로 형성함으로써, 그 한정 영역 내에 파종된 세포가 모두 하나의 3차원 조직 형성에 관계되는 것으로 되고, 매우 효율적인 배양 방법일 뿐만 아니라, 각각의 한정 영역마다 형성된 복수의 3차원 조직의 크기가 균일하고, 균질이며, 세포 분석에 유효한 것이 기대된다.

또한, 3차원 조직이 구획이라고 하는 한정 영역 내의 목적의 위치로 보유 지지되는 것이 기대된다. 또한, 목적에 따라서 2차원 평면 조직을 형성시키는 것도 가능하다. 2차원 평면 조직에 대해서도 마찬가지의 효과가 기대된다.

도 1은 제1 실시예에 관계되는 배양 시트와 배양 시트 내의 홀 구조를 도시하는 도면이다.
도 2는 제1 실시예에 관계되는 나노 필러 구조를 도시하는 도면이다.
도 3은 제1 실시예에 관계되는 배양 시트를 부착한 챔버 슬라이드를 도시하는 도면이다.
도 4는 제2 실시예에 관계되는 플레이트 프레임의 구성을 도시하는 도면이다.
도 5는 제2 실시예에 관계되는 플레이트와 배양 시트의 초음파 용착 플로우를 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 제3 실시예에 관계되는 간세포 배양의 흐름도를 도시하는 도면이다.
도 7은 제3 실시예에 관계되는 간세포 배양 플로우에 의한 배양 시트에 의한 간세포 3차원 조직 사진을 나타내는 도면이다.
도 8은 제4 실시예에 관계되는 2단계, 다단계 나노 필러 배양 시트를 도시하는 도면이다.
도 9는 각 실시예의 나노 필러의 배열 패턴의 종류를 도시하는 도면이다.
도 10a는 도 9에 도시한 필러 직경이 다른 배양 시트를 사용한 경우의 세포 배양 결과(세포의 모습)를 도시하는 도면이다.
도 10b는 도 9에 도시한 필러 직경이 다른 배양 시트를 사용한 경우의 세포 배양 결과(형성 세포수)를 도시하는 도면이다.
도 11은 배양 시트의 실시예의 변형예인 경사 나노 필러 배양 시트를 도시하는 도면이다.
도 12는 배양 시트의 실시예의 변형예인 표면 장력 회피 패턴 배양 시트의 1웰을 도시하는 도면이다.
도 13a는 제1 실시예에 있어서의 배양 기재의 외관 사시도, 상면도, 상하측면도를 도시하는 도면이다.
도 13b는 제1 실시예에 있어서의 배양 기재의 부분 확대도이며, A-A, B-B 부분 확대도와, C-C, D-D 부분 확대도를 도시하는 도면이다.
도 13c는 제1 실시예에 있어서의 배양 기재의 부분 확대도 및 단면도이며, E-E, F-F 부분 확대도, G-G선 단면도를 도시하는 도면이다.
도 14a는 제2 실시예에 있어서의 배양 기재의 외관 사시도, 저면도를 도시하는 도면이다.
도 14b는 제2 실시예에 있어서의 배양 기재의 상면도, 상하측면도를 도시하는 도면이다.
도 14c는 제2 실시예에 있어서의 배양 기재의 부분 확대도, 부분 단면도이며, A-A, B-B 부분 확대도와, C-C, D-D 부분 확대도와, H-H 단면도를 도시하는 도면이다.
도 14d는 제2 실시예에 있어서의 배양 기재의 부분 확대도 및 단면도이며, E-E, F-F 부분 확대도, G-G선 단면도를 도시하는 도면이다.
도 15a는 제5, 제6 실시예에 관계되는 배양 시트와 배양 시트 내의 홀 구조를 도시하는 도면이다.
도 15b는 제5, 제6 실시예에 관계되는 배양 시트와 배양 시트 내의 홀 구조를 도시하는 도면이다.
도 15c는 제5, 제6 실시예에 관계되는 배양 시트와 배양 시트 내의 홀 구조를 도시하는 도면이다.
도 16은 제7 실시예에 관계되는 간세포 배양 플로우에 의한 배양 시트에 의한 간세포 3차원 조직 사진을 나타내는 도면이다.
도 17은 제7 실시예에 관계되는 간세포 배양 플로우에 의한 배양 시트에 의한 간세포 3차원 조직 사진을 나타내는 도면이다.
도 18은 제7 실시예에 관계되는 간세포 배양 플로우에 의한 배양 시트에 의한 간세포 3차원 조직의 중심과 홀 구조의 중심 사이의 거리를 도시하는 도면이다.

이하, 배양 시트를 사용하여 세포를 배양하고, 세포 덩어리인 3차원 조직, 혹은 2차원 평면 조직의 형성 방법을 실현하기 위한 최선의 형태에 대해서, 도면을 사용하여 상세하게 설명한다.

<제1 실시예>

제1 실시예에서는, 배양 시트를 배양 시트 보유 지지 부재인 챔버 슬라이드에 적용한 예를 나타낸다. 이후, 종래의 나노 필러 시트에 대해, 본 발명에 있어서의 배양 영역을 형성하는 구획 구조를 갖고, 당해 구획 구조의 내부에 돌기물이 복수 형성된 시트를 배양 시트라고 기재한다. 당해 배양 시트는 세포에 악영향이 없는 재질로 형성되고, 본 예에서는, 폴리스티렌으로 하고 있다. 단, 재질은 폴리스티렌으로 한정되지 않는 것은 물론이다.

도 1은 본 실시예에서 작성한 배양 시트(100)의 주사형 전자 현미경 사진의 모식도이다.

또한 동시에, 배양 시트 1매당 복수개 존재하는 구획 구조(102)에 의해 구성된 구멍(101)(이하, 홀)의 하나의 구조를 도시한다. 당해 홀(101)의 내부가 세포 조직 형성 단위에 의한 배양 영역을 구성한다.

홀(101)의 저면에 보유 지지되어 있는 복수의 돌기물(102)은, 복수의 미소 돌기물(103)(이하, 돌기, 필러, 나노 필러라고도 함)로 이루어진다. 또한, 이 홀(101)의 직경을 홀 직경(105)으로 한다. 당해 배양 시트(100)에 있어서, 상기의 구획벽(102)을 구비하는 홀(101)과, 당해 홀(101)의 내부에 형성되어 있는 복수의 돌기(103)는 동일 재료로 일체적으로 형성되어 있다. 또한, 이 홀(101)은, 둥근 형상으로 한정되는 것이 아니라, 사각 형상 등 다른 형상이어도 된다.

이와 같이 세포에 악영향이 없는 단일 재료로, 구획벽(102)을 구비한 홀(101)과 당해 홀(101)의 내부에 형성되어 있는 복수의 돌기(103)가 일체적으로 배양 시트(100)로 형성됨으로써, 배양 공정에 있어서 세포에 이물질이 접착하는 일 없이 세포를 성장시킬 수 있다. 또한 개개의 구획 내에 있어서 세포가 성장하기 때문에, 균일한 크기의 세포를 형성시키는 것이 가능해진다.

또한, 포위 배치된 구획벽(102)의 내부에 복수의 돌기를 설치하고 있으므로, 세포가 원래 유지하고 있는 능력인 세포 운동을 촉진시켜, 당해 운동에 의해 성장함으로써, 회전 배양 등에 의한 외란(스트레스)의 영향 없이, 세포 활성을 유지한 세포 배양이 가능해진다.

이들 홀(101)과 돌기 집합체(103)를 별도의 부재로서 배양 영역을 형성하려고 하면, 그들의 접착, 용착에 의한 접합이 필요해진다.

예를 들어 이들을 접착 접합한 경우에는, 배양 영역의 내부에 접착제 성분이 혼입되어, 생성 세포에 악영향을 미칠 가능성이 있다. 또한 용착 접합에서는, 홀(101)의 내경이 세포 형성 레벨의 극미소 영역 직경 때문에, 목적으로 하는 세포 영역을 형성하면서, 구획, 돌기에 손상을 주지 않고 용착하는 것은 매우 곤란하다. 당해 구획이나 돌기에 손상, 변형이 있으면, 세포 형성 과정에 있어서 세포에 불필요한 스트레스를 주거나, 세포 자신의 운동에 장해가 될 가능성이 있다.

따라서, 배양 영역을 형성하는 홀(101)을 구성하는 홀 저면(104), 구획벽(102) 및 돌기(103)와는 일체적으로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같이 일체적으로 형성됨으로써, 세포 배양에 필요한 성분 이외의 불필요 성분의 영향을 배제한 배양을 실행하는 것이 가능해져 적합하다.

다음에, 돌기(103)의 확대도를 도 2에 도시한다. 필러 직경이란 돌기물 선단부의 직경을 나타낸다(도 2의 부호 106). 필러 피치란, 돌기물 선단부의 중심으로부터, 인접하는 돌기물 선단부의 중심까지의 거리를 나타낸다(도 2의 부호 107). 필러 높이란, 나노 필러의 선단부로부터 저부까지의 높이를 나타낸다(도 2의 부호 108).

본 실시예에서는, 필러 직경, 필러 피치, 필러 높이는 각각 2.0㎛, 4.0㎛, 1.0㎛의 것을 사용하였지만, 후술하는 바와 같이, 이들 이외의 배양 시트이어도 상관없다. 본 실시예에서는 구획 구조의 높이는 70㎛이지만, 이 값에 한정되지 않고, 적절하게는 형성되는 세포가 구획을 타고 넘지 않을 정도의 높이이면 된다.

본 실시예에 있어서의 배양 시트(100)는 이하에 서술하는 방법으로 제작한다.

직경 200㎛, 깊이 70㎛의 원형의 구멍이 정사각 배치되고, 그 저면에 직경 2.0㎛, 깊이 1.0㎛의 미세 구멍이 4.0㎛ 피치로 형성된 금형을, 400㎛의 두께의 폴리스티렌 필름에 135℃, 압력 2㎫로 프레스하였다. 실온에 냉각 후에 프레스 장치로부터 취출하고, 금형을 폴리스티렌 필름으로부터 박리함으로써, 홀 직경이 200㎛의 홀을 복수 보유 지지하고, 그 저면에 복수의 돌기를 가진 배양 시트를 제작할 수 있다.

여기서 형재(型材)는 실리콘 웨이퍼이며, 배양 시트 제작시에 있어서의 폴리스티렌 필름과의 접착을 방지하기 위해, 불소계의 이형제에 의해 이형 처리를 미리 실시하고 있다. 본 실시예에서는 형재를 실리콘 웨이퍼로 하였지만, 그 밖에 금속 재료 등의 금형이어도 상관없다.

도 3에 도시하는 바와 같이, 이와 같이 단일 소재로 일체 성형에 의해 제작된 배양 시트(100)를, 본 예에서는 2㎝×2㎝로 컷트하여, 챔버 슬라이드(109)의 글래스 저면에 수술용 접착제(110)를 도포해서 접착시킴으로써, 배양 시트(100)가 부착된 챔버 슬라이드(109)를 제작하고 있다. 또한, 도 3에 있어서, 부호 109a는 각 배양 시트(100)를 구분하는 프레임을 나타낸다. 이 프레임(109a)은 예를 들어 플라스틱재 등으로 형성된다. 또한, 이 프레임(109a) 등의 프레임의 형상은, 사각 형상으로 한정되지 않고, 둥근 형상 등 다른 형상이어도 된다.

도 13a 내지 도 13c에 있어서, 본 제1 실시예의 배양 시트가 부착된 챔버 슬라이드의 전체 구성도 및 주요부 단면도로서 도시한다.

도 13a는 본 실시예에 있어서의 배양 기재의 외관 사시도, 상면도, 상하측면도이다. 좌우측면도는 사시도로부터 그 형태가 명백하기 때문에 도시를 생략한다.

도 13b는 부분 확대도이며, A-A, B-B 부분 확대도와, C-C, D-D 부분 확대도를 도시하는 것이다.

도 13c는 부분 확대도 및 단면도이며, E-E, F-F 부분 확대도, G-G선 단면도를 도시하는 것이다.

도 13a 내지 도 13c에 있어서 도시되는 당해 물품은, 사람이나 동물이나 식물 등의 세포를 배양하는 배양 기재(배양 용기)로, 배양 시트(100)와 배양 시트(100)를 보유 지지하는 보유 지지부(챔버 슬라이드)(109)로 구성되어 있고, 배양 시트(100)의 표면에는 복수의 구획부(102)가 형성되어 있고, 보유 지지부(109)에 형성된 통 형상의 구멍부(109a)의 내부 저면에 설치되어 있다.

또한 그 구획부의 내부에는 복수의 미세한 돌기부(103)를 갖는 배양 영역이 각각 형성되어 있다. 구획부(102) 내의 배양 영역을 형성하는 시트면에 첨가되도록, 배양할 목적 세포를 구멍부(109a) 내에 대하여 첨가하면, 복수의 미세한 돌기부(103)로 보유 지지되어 당해 목적 세포가 배양되게 된다.

<제2 실시예>

다음에, 제2 실시예를 도 4, 도 5에 따라 설명한다. 제2 실시예에서는 배양 시트 부착 멀티 웰 플레이트의 구성 및 그 제작예를 나타낸다. 도 4의 (a)는 멀티 웰 플레이트를 구성하는 프레임(111)의 저면도이다. 배양 시트 보유 지지 부재인 프레임(111)은, 가로 폭 약 125㎜, 세로 약 80㎜, 높이 약 20㎜ 중에 종렬로 4구멍, 횡렬로 6구멍의 합계 24구멍의 통 형상의 구멍부(111a)가 성형된 것이다. 소재는 폴리스티렌을 사용하고 있다.

프레임에 형성되는 구멍의 수는 , 통상 6구멍으로부터 1536구멍까지, 용도에 따라 구분지어 사용하기 때문에, 이 프레임도 구멍의 수는 24구멍으로 한정되지 않는다. 또한 프레임의 소재도 폴리스티렌으로 한정되는 것은 아니다.

당해 배양 기재의 제작에서는, 프레임(111)과 배양 시트(100)를 초음파 용착에 의해 접합시킨다.

프레임(111)에는 미리, 이하의 처리를 실시해 둔다. 우선 첫 번째는, 프레임(111)과 배양 시트(100)를 용착시킬 때에 부여하는 초음파의 진동으로 세포 배양 시트와 플레이트가 어긋나게 되는 것을 방지할 목적으로, 프레임(111)의 저면에 필름 고정용 돌기(112)를 가공한다. 두 번째는, 배양 시트를 초음파로 용착시키기 위해 리브 구조(113)를 설치해 둔다.

도 4의 (b), (c)는 도 4의 (a)의 B-B', A-A' 각각의 단면도를 도시한다. 또한, 양자를 포갰을 때의 동일한 위치에, 필름용 고정 돌기가 끼워지도록 배양 시트에 동일한 직경의 구멍(114)을 형성해 둔다. 계속해서 이 프레임과 배양 시트(100)를 초음파 용착에 의해 접착한다.

그 공정을 도 5에 도시한다. 우선 프레임의 필름 고정용 돌기와 배양 시트의 구멍을 맞춰서, 양자를 포갠다[도 5의 (a)]. 계속해서, 초음파 발진기로부터, 컨버터, 부스터, 나아가서는 혼을 통하여 배양 시트측으로부터 초음파를 발생시켜, 양자를 용착한다[도 5의 (b)]. 혼(horn)이란, 적절한 위치에 적절한 에너지의 초음파를 쏘여 용착시키는 장치이며, 리브 구조의 위치를 따라서 적절하게 초음파가 발생되도록 설계한 전용 장치를 제작하여 사용하였다. 부호 115는, 이와 같이 하여 제작된 플레이트의 상면도를 도시하고 있다.

본 실시예에서는 초음파 용착을 사용하여 프레임과 배양 시트를 접합하였지만 이 방법에 한정되지 않는 것은 물론이다. 초음파 용착에서는 세포에 영향을 주는 접착제와 같은 유기물의 개재 내지 플레이트화를 실현할 수 있기 때문에, 세포에 대한 악영향이 없고, 신약 개발 프로세스에 있어서의 독성ㆍ대사 시험뿐만 아니라, 재생 의료 대상의 조직체 형성에 있어서도 적용 가능한 유용한 배양 시트인 것은 물론이다.

또한, 제1 실시예에 있어서 예시한 도 3의 챔버 슬라이드 형상의 배양 기재에 있어서도, 프레임(109a)의 저부에 리브 구조를 복수개 설치하고, 당해 리브 구조에 의해 배양 시트(100)와의 용착을 행함으로써, 본 실시예와 마찬가지의 접합 방법에 의한 배양 기재를 작성할 수 있는 것은 물론이다.

이와 같이 하여 작성된 배양 기재에 있어서, 프레임(111)의 저면에 형성된 배양 시트(100)에는, 복수의 홀(101)이 형성되고, 당해 홀 저면(104)에 구성되어 있는 복수의 돌기물은, 복수의 미소 돌기물(103)(이하, 돌기, 필러, 나노 필러라고도 함)로 이루어진다. 또한, 이 홀(101)의 직경을 홀 직경(105)으로 한다. 당해 배양 시트(100)에 있어서, 상기의 구획벽(102)을 구비한 홀(101)과, 당해 홀(101)의 내부에 형성되어 있는 복수의 돌기(103)는 동일 재료로 일체적으로 형성되어 있다. 또한, 이 홀(101)은, 둥근 형상으로 한정되는 것이 아니라, 사각 형상 등 다른 형상이어도 된다.

이와 같이 세포에 악영향이 없는 단일 재료로, 구획벽(102)을 구비한 홀(101)과 당해 홀(101)의 내부에 형성되어 있는 복수의 돌기(103)가 일체적으로 배양 시트로 형성됨으로써, 배양 공정에 있어서 세포에 이물질이 접착하는 일 없이 세포를 성장시킬 수 있다.

또한 개개의 구획 내에 있어서 세포가 성장하기 때문에, 균일한 크기의 세포를 형성시키는 것이 가능해진다.

또한, 포위 배치된 구획의 내부에 복수의 돌기를 설치하고 있으므로, 세포가 원래 유지하고 있는 능력인 세포 운동을 촉진시켜, 당해 운동에 의해 성장함으로써, 회전 배양 등에 의한 외란(스트레스)의 영향 없이, 세포 활성을 유지한 세포 배양이 가능해진다.

이들 홀(101)과 돌기 집합체(103)를 별도의 부재로서 배양 영역을 형성하려고 하면, 그들의 접착, 용착에 의한 접합이 필요해진다. 예를 들어 접착으로 접합한 경우에는, 배양 영역의 내부에 접착제 성분이 혼입되어, 생성 세포에 악영향을 미칠 가능성이 있다.

또한, 용착하려고 하면, 홀(101) 내부의 직경이 세포 형성 레벨의 극미소 영역 때문에, 목적으로 하는 세포 영역을 형성하면서, 구획, 돌기에 손상을 주지 않고 용착하는 것은 매우 곤란하다. 당해 구획이나 돌기에 손상, 변형이 있으면, 세포 형성 과정에 있어서 세포에 불필요한 스트레스를 주거나, 세포 자신의 운동에 장해가 될 가능성이 있다.

따라서, 배양 영역을 형성하는 홀(101)과 돌기(103)는 일체적으로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같이 일체적으로 형성됨으로써, 세포 배양에 필요한 성분 이외의 불필요 성분의 영향을 배제한 배양을 행하는 것이 가능해져 적합하다.

여기서 도 14a 내지 도 14d에 있어서, 본 실시예의 배양 시트 부착 멀티 웰 플레이트의 전체 구성도 및 주요부 단면도를 도시한다.

도 14a는 본 실시예에 있어서의 배양 기재의 외관 사시도, 저면도를 도시하는 것이다.

도 14b는 배양 기재의 상면도, 상하측면도를 도시하는 것이다. 여기서, 좌 우측면도는 외관 사시도로부터 그 형태가 명백하기 때문에, 도시 생략한다.

도 14c는 부분 확대도, 부분 단면도이며, A-A, B-B 부분 확대도와, C-C, D-D 부분 확대도와, H-H 단면도를 도시하는 것이다.

도 14d는 부분 확대도 및 단면도이며, E-E, F-F 부분 확대도, G-G선 단면도를 도시하는 것이다.

도 14a 내지 도 14d에 있어서 도시되는 당해 물품은, 사람이나 동물이나 식물 등의 세포를 배양하는 배양 기재(배양 용기)로, 배양 시트(100)와 배양 시트(100)를 보유 지지하는 보유 지지부(프레임)(111)로 구성되어 있다.

배양 시트(100)의 표면에는 복수의 홀(101)이 형성되어 있고, 보유 지지부에 형성된 통 형상의 구멍부(111a)의 내부 저면에 설치되어 있다.

또한 그 구획부의 내부에는 복수의 미세한 돌기부(103)를 갖는 배양 영역이 각각 형성되어 있다. 홀(101) 내의 배양 영역을 형성하는 시트면에 첨가되도록, 배양할 목적 세포를 구멍부(111a) 내에 대하여 첨가하면, 복수의 미세한 돌기부(103)로 보유 지지되어 당해 목적 세포가 배양되게 된다.

또한, 본 예의 배양 기재는, 프레임(111)의 이면으로부터 배양 시트가 용착되는 예를 나타내고 있고, 보유 지지부인 프레임(111)과 배양 시트(100)는 접합부(1112)를 통하여 용착되어 있다.

당해 접합부(1112)는 구멍부(111a)의 외부에 형성되어 있고, 배양 영역에는 그 용착의 영향이 없다.

따라서, 본 예에서는 용착을 예시하였지만, 당해 접합 방법에 한정되지 않고, 다른 접합 방법에 의해서도 배양 영역 자체에 접합에 의한 영향을 미치는 일은 없기 때문에, 다른 접합 방법을 채용하는 것도 가능하다.

또한, 본 예의 기재는, 당해 프레임(111)이 사각 형상의 형태를 이루고 있고, 그 4개의 정점 내, 적어도 1점이 컷트되어 있다. 이 컷트면(1113)이 형성되어 있음으로써, 배양을 행하는 작업자가 기재 구멍부의 위치를 특정하기 쉬워진다고 하는 효과가 있다.

컷트면은 필수적이지 않아, 없어도 되는 것은 물론이다. 당해 배양 기재에는 또한, 미끄럼 방지부(1111)가 형성되어 있어, 작업 중에, 작업자가 돌연 당해 기재를 요동, 낙하 등을 방지할 수 있다.

<제3 실시예>

제3 실시예에서는 제1 실시예 및 제2 실시예에 의해 제작한 배양 기재를 이용한 세포의 조직 배양에의 적용예를 나타낸다. 신약 개발에 있어서, 생체 기능을 반영하는 3차원 조직의 구축은, 동물 실험 대신에 세포를 이용한 여러 가지의 평가에 대하여 수요가 있다.

또한, 인공 다능성 간세포(Induced pluripotent stem cells:iPS 세포)나 배성 간세포(Embryonic stem cells:ES 세포)를 배양하여 원하는 세포로 분화시키기 전에는, 3차원 조직을 형성해야만 하므로, 재생 의료 분야에 있어서도 3차원 조직을 간편하게 구축하는 기술이 기대되고 있다. 이와 같은 배경으로부터, 여기서는 특히 챔버 슬라이드를 사용한 3차원 조직을 형성시키는 예를 나타내지만, 멀티 웰 플레이트라도 세포 배양의 본질적인 부분은 특별히 변하는 부분은 없다. 본 실시예에서는 래트(rat)의 간세포를 사용한 예를 나타내지만, 상술한 바와 같이 여러 가지의 동식물의 세포종에 적용 가능하며, 특히 세포종은 한정되지 않는다.

간세포의 조제는, 인시투(in situ) 콜라게나아제 관류법에 따른다. 상세하게는 이하와 같다. Fisher 344계 수형 래트(7 내지 10주령)를, 펜토바르비탈 마취 하에 개복하고, 문맥에 카테터를 삽입하여 전관류액(preperfusion solution)(Ca²⁺와 Mg²⁺ 불포함, EGTA를 포함하는 행크스액)을 주입한다.

동시에 간장 하부의 하대 정맥을 절개하여 혈액을 방출시킨다. 다음에 흉강을 개방하여, 우심방에 들어가는 하대 정맥을 절개하고, 간장 하부의 하대 정맥을 관지에서 멈춰 관류를 행한다. 간장으로부터의 탈혈(脫血)이 충분히 이루어진 것을 확인한 후 관류를 멈춘다. 관류액을 콜라게나아제 용액으로 바꿔, 관류를 행한다.

본 실시예에서는 0.05％ 콜라게나아제를 포함하는 행크스액을 사용하여 관류를 행하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포간 조직이 콜라게나아제에 의해 소화된 것을 확인한 후, 관류를 멈춘다. 간장을 분리시켜, 차게 한 행크스액 중에서 가늘게 잘라, 피펫팅에 의해 세포까지 분산시킨다. 다음에 거즈 여과에 의해 소화되지 않은 조직을 제거한다. 세포 현탁액은, 50G, 1분의 원심 분리를 수회 반복하여 비실질 세포를 제거한다. 이어서 등장 퍼콜(percoll)액을 사용하여 500G, 5분의 원심 분리에 의해 손상이 있는 간세포를 제거한다. 얻어진 간세포의 생존율은 트리판블루 배제법으로 계측하여, 생존율 85％ 이상의 간세포를 배양에 사용한다. 여기서는, 생존율 85％ 이상의 간세포를 배양에 사용하지만, 반드시 당해 조건에 한정되는 것이 아닌 것은 물론이다. 또한, 간세포의 조제는 반드시 in situ 콜라게나아제 관류법에 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 하여 얻어진 간세포를 사용한 배양의 흐름도를 도 6에 도시한다.

도 6의 플로우에 있어서, 우선, 제1 실시예에 의해 제작한 챔버 슬라이드 타입의 배양 시트에, I형 콜라겐(116)을 도포한다. 약산성 용액에 용해하고 있는 I형 콜라겐을 소정의 농도까지 멸균수로 희석한 희석액의 1-1.5mL을 상술한 챔버 슬라이드에 첨가한다[도 6의 (a)]. 다음에, 첨가한 I형 콜라겐을 나노 필러 시트(100)에 완전히 흡착시키기 위해, 감압 조작을 실시한다[도 6의 (b)]. 감압 조작은, 감압용 용기(117)와 감압 펌프(118)를 사용하여, 0.04 기압 이하로 행한다. 감압 시간은 특별히 한정되는 것이 아니지만, 본 실시예에서는 10분간 행한다. 감압에 사용하는 장치 구성은 특별히 한정되는 것은 아니다. 여기서 희석액의 소정 농도의 범위는 100(ng/ml) 이상 10(μg/ml) 이하이다. 반드시 당해 범위에 한정되는 것이 아니지만, 당해는 구상의 3차원 조직이 형성되는 데 적합한 범위이다. 마지막으로, 잉여의 I형 콜라겐을 제외하고, PBS(-)(119)를 추가한다[도 6의 (c)]. 이 조작을 3회 행하고, 잉여의 I형 콜라겐을 세정한다.

상술한 바와 같이 in situ 콜라게나아제 관류법에 의해 조제한 간세포(120)를 배지(121)에 현탁하고, 동일하게 상술한 바와 같이 준비한 I형 콜라겐을 도포한 NP 시트에 파종한다[도 6의 (d)]. 배지는 특별히 한정되는 것이 아니지만, 혈청(FCS), 인슐린, 덱사메타손을 포함한 배지(이하, 배지 10％ FCS 포함함)를 포함하는 윌리암스 E 배지를 사용한다. 본 실시예에서는, 특히 10％ FCS, 8.6nM 인슐린, 255nM 덱사메타손을 포함한 윌리암스 E 배지를 사용한다. 파종 후, CO₂ 인큐베이터를 사용하여 5％ CO₂, 37℃의 조건 하에서 배양을 개시하고, 18시간 이상 경과한 후에, 최초의 배지 교환을 행하고, 이후 24시간마다 배지 교환을 행한다. 파종 후 18시간째 이후의 배양에 사용하는 배지는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 본 실시예에서는, 배지(10％ FCS 포함함)로부터 FCS를 제외한 배지[이하, 배지(FCS 포함하지 않음)]를 사용한다.

또한, 간세포의 파종 밀도는, 본 실시예에서는 1×10⁵cells/ml로 하였지만, 이 농도에 한정되지 않는다. 여기서, 배양에 사용하는 배양 시트(100)는, 필러 높이, 필러 직경, 필러 피치가 각각 1.0㎛, 2.0㎛, 4.0㎛의 것을 사용하였지만, 이 값에 한정되지 않는다.

또한, 배양 시트에 첨가하는 I형 콜라겐의 농도는, 본 실시예에서는 100(ng/ml)으로 하였지만 이 이외의 농도라도 상관없다. 세포의 조건에 따라서는 이 농도 이외의 농도라도 스페로이드가 형성되는 것도 있다. 합계 96시간 배양하고, 3차원 조직(122)이 형성된다[도 6의 (e)]. 홀 직경이 200㎛의 상술한 배양 시트를 사용하여 실제로 간세포를 배양한 결과의 사진을 도 7에 나타낸다.

도 7로부터 명백해진 바와 같이, 배양 시트 표면에 특별한 화학 물질의 도포없음으로, 또한 세포에 있어서 스트레스가 적은 정치 배양으로부터, 이와 같이 크기가 정렬된 구상의 3차원 조직이 형성되었다. 이것은, 원래 유지하고 있는 세포의 활성을 상실시키는 일이 없다고 생각되므로, 세포 분석 등에 유효한 배양 방법이다.

<제4 실시예>

도 8에 제4 실시예로서, 상술한 배양 시트(100)의 실시예의 변형예를 나타낸다. 우선, 배양 시트(123)는 세포의 유주성, 접착성의 차이를 초래하는 돌기물의 배열 패턴을 도 8의 (a)와 같이, 제1 배열 패턴(125a)의 주위를 제2 배열 패턴(125b)으로 둘러싸도록 2단계로 배치함으로써, 제1 배열 패턴(125a) 상(예를 들어 홀의 중심 근방)에 3차원 조직 혹은 2차원 평면 조직을 형성시키는 예를 나타낸다.

또한 반대로, 도 8의 (b)와 같이, 제2 배열 패턴(125b)의 주위를 제1 배열 패턴(125a)으로 둘러싸도록 2단계로 배치함으로써, 제2 배열 패턴(125b) 상(예를 들어 홀 주변부)에 3차원 조직 혹은 2차원 평면 조직을 형성시키는 예를 나타낸다. 또한, 부호 124는 앞선 실시예와 마찬가지로, 홀을 나타낸다. 점선은, 패턴의 경계를 나타내고 있다.

또한 홀(124) 내의 중앙부에 한정되지 않고, 도 8의 (c)의 배양 시트(126)와 같이 배치함으로써, 예를 들어 4군데의 제1 배열 패턴(127a)을 제2 배열 패턴(127b)으로 둘러쌈으로써, 제1 배열 패턴(127b) 상에 크기가 정렬된 조직을 형성시킬 수도 있다. 이와 같이, 필러 직경, 필러 피치, 배치 패턴의 조합은, 목적에 따라서 최적의 패턴을 배치하고, 배양하는 것이 가능해진다. 마찬가지로, 도 8의 (d)는, 배열 패턴을 다단계 패턴(129c, 129b, 129a)으로 한 배양 시트(128)를 도시한다.

계속해서, 도 9를 사용하여, 상술해 온 실시예에 있어서의 돌기물의 배열 패턴(이하, 필러 패턴)의 종류를 설명한다. 도 9에 도시하는 바와 같이, 11종의 배열 패턴을 예시하였다. 도 9로부터 명백해진 바와 같이, 필러 직경과 필러 피치가 각각 0.18 내지 20.0㎛, 0.36 내지 40.0㎛의 11종이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들의 필러 패턴 하에 배양한 간세포의 일례를 도 10a, 도 10b에 도시하였다.

또한, 필러 패턴이 없는 플랫 평면 하에 배양에서는, 배양 도중에 있어서의 배지 교환시에 다수의 세포가 배지와 함께 배출되게 되므로, 원하는 것으로 하는 배양 세포를 효과적으로 취득할 수는 없다. 이로 인해, 도 10a에서는 도시를 하지 않는다.

도 10a는 필러 직경에 대하여 2배의 피치의 배양 시트(100)를 사용하여 배양을 행하였을 때의 세포의 모습을 도시하는 도면이다. 이 결과, 필러 직경이 0.18㎛, 0.5㎛, 1.0㎛에 있어서는, 구상이 아닌 평탄한 조직이 기재 저면에 접착하고 있는 한편, 2.0㎛, 5.0㎛에서는 기재에 대하여 구상을 한 3차원 조직이 형성되어 있었다.

또한 2.0㎛, 5.0㎛의 기재에 있어서 형성된 구상 세포에 대해서 비교해 보면, 2.0㎛ 기재의 쪽이, 세포가 기재에 접착하고 있고, 안정된 상태인 것을 알 수 있었다. 즉, 세포 접착성에 관해서는, 필러 직경이 클수록, 저 접착성을 도시하고, 세포에 의한 이동이 촉진되어 있는 것을 알 수 있다.

도 10b에서는, 각 필러 직경에 있어서의 시트로 형성된 간세포의 3차원 조직(스페로이드:spheroid)의 수에 대해서, 그 형성되는 직경마다 정리한 결과를 도시하는 도면이다. 시트 면적은 4평방㎝(2㎝×2㎝)이다.

간세포의 3차원 조직에 있어서는, 창약 분야에 있어서의 동물 실험 대신에 약제 스크리닝, 독성ㆍ대사 시험을 목적으로 한 세포 분석에 있어서, 50-100 마이크로 미터 직경인 세포가 바람직하고, 본 예에 있어서는 필러 직경이 2.0㎛ 기재된 경우에 있어서 당해 사이즈의 세포 형성수가 가장 많이 적합한 것을 알 수 있다.

그러나, 상기의 검토 하에서는, 50-100 마이크로 미터 직경인 세포를 형성하기 위해 필러 직경이 2.0㎛인 경우가 바람직하다고 하였지만, 이것에 한정되는 것이 아니라, 본 검토에 있어서 사용한 모든 필러 직경에 있어서, 필러가 형성되어 있지 않은 편평한 상태에 비해, 형상이 안정된 세포가 수많이 형성되는 것을 알 수 있었다. 이와 같이, 필러 패턴의 차이에 의해, 자유자재로 세포, 혹은 세포로 형성되는 조직의 형태, 혹은 기재에의 접착성을 변화시킬 수 있다.

상술한 결과를 응용하여, 도 8의 제4 실시예에서 설명한 바와 같이, 필러 직경(필러 피치)이 작은 제1 배열 패턴의 주위를, 필러 직경(필러 피치)이 큰 제2 배열 패턴으로 둘러싸도록 2단계로 배치하거나, 혹은 다단계로 배치함으로써, 세포 접착성 및 세포 자신의 운동 특성을 이용하여, 홀 내의 목적의 위치에, 원하는 형상의 조직을 형성시키는 것이 가능하게 된다.

또한, 동일 사이즈의 필러 직경을 갖는 나노 필러의 높이를, 홀의 주변부로부터 중심부를 향해서 내려 감으로써, 경사지도록 단계적으로 높이에 차이를 두어, 중력에 의해 중심부에 집중하도록 세포의 운동을 촉진시켜, 조직을 형성시키는 것도 가능하다. 도 11의 (a)에 단계적으로 나노 필러의 높이에 차이를 형성한 변형예인 배양 시트(130)를 도시하였다. 이때, 통상의 U자형의 배양 용기와 달리, 필러가 존재함으로써, 세포가 중앙에 유지되는 효과가 있다. 또한, 도 11의 (b)의 배양 시트(131)와 같이, 경사 중이라도 필러 직경에 차이를 두어, 상술한 효과를 촉진시키는 것도 가능해진다.

도 11의 변형예에서는, 경사가 매끄러워지도록 단계적으로 높이를 변화시키고 있지만, 계단 형상으로 순차 높이로 변화를 갖게 하는 구성으로 해도 된다.

또한, 복수의 홀이 집합하여 배양면을 형성하지만(챔버 슬라이드의 경우에는 사각 형상, 플레이트의 경우에는 둥근 형상), 배양할 때에는 표면 장력의 영향에 의해, 배양면 중앙부와 주변부에서는 3차원 조직의 생성 방법에 차이가 발생한다. 즉, 배양면 중앙부에서는 3차원 조직이 형성되어 있음에도 불구하고, 주변부에서는 표면 장력에 의해 당해 부분의 배지량이 증가하여, 산소 공급량이 저하되거나, 혹은 높은 수압이 걸린다고 하는 이유에 의해, 3차원 조직이 형성되지 않는 사태가 발생할 가능성이 있다. 이 현상을 회피하기 위해, 도 12의 (a), (b)에 도시하는 바와 같은 배양면의 중앙부에만 홀 구조를 보유 지지한 배양 시트(132, 133)를 제작하도록 해도 된다.

이와 같이 배양 시트를 형성함으로써, 배양 효율이 높고, 또한 제조 부하가 적은 배양 기재를 달성할 수 있다.

<제5 실시예>

도 15a, 도 15b, 도 15c에 제5 실시예의 배양 시트를 도시하였다. 제5 실시예는, 도 8의 제4 실시예에서 나타낸 다양한 변형예 중, 제1 배열 패턴(125a)이 플랫 구조로, 홀의 중심부에만 돌기가 배열되어 있는 패턴의 배양 시트를 사용하는 경우에 대응하고 있다. 즉, 본 실시예에서는, 배양 영역 각각이, 제1 영역과, 그것을 둘러싸는 제2 영역으로 이루어지고, 제1 영역에만 돌기를 배열하고, 제2 영역에는 돌기를 형성하지 않는 구조의 배양 시트로 함으로써, 직경이 일치된 3차원 조직인 스페로이드가 제1 영역에 대응하는, 배양 영역의 중심부에 보유 지지됨으로써, 원하는 위치로 보유 지지시킬 수 있다.

여기서는 배양 영역 내의 중심 근방에 돌기를 배열한 예를 나타내지만, 반드시 중심을 포함할 필요는 없고, 배양 영역 내의 원하는 것으로 하는 영역에 돌기를 배열시키면 되는 것은 물론이다. 또한, 대략 마름모꼴 형상의 돌기 영역을 형성하는 예를 나타내지만, 원형, 사각형, 다각 형상이어도 되는 것은 물론이다.

도 15a에 도시하는 바와 같이, 배양 시트(150)를 배양 시트 보유 지지 부재인 챔버 슬라이드에 적용하였다. 본 실시예에서는, 배양 시트 상의 구획 구조인 구획벽(152)에 의해 구획된 각 홀(151) 내에, 필러 높이, 필러 직경, 필러 피치가 각각 1.0㎛, 2.0㎛, 4.0㎛이고, 돌기부 집합체(153)의 직경이 80㎛, 및 20㎛의 배양 시트(150)를 사용하였다.

도 15a는 본 실시예에서 작성한 배양 시트(150)의 주사형 전자 현미경 사진의 모식도이며, 또한 동시에, 배양 시트 1매당에 복수개 존재하는 구획 구조(152)에 의해 구성된 홀(151)의 하나의 구조를 도시한다. 당해 홀(101)의 내부가 세포 조직 형성 단위에 의한 배양 영역을 구성하는 것은, 상술한 실시예와 마찬가지이다. 홀(151)의 저면에 보유 지지되어 있는 복수의 돌기물(153)은, 복수의 미소 돌기물로 이루어진다. 또한, 이 홀(151)의 직경을 홀 직경(155)으로 한다. 당해 배양 시트(150)에 있어서, 상기의 구획벽(152)을 구비하는 홀(151)과, 당해 홀(151)의 내부에 형성되어 있는 복수의 돌기(153)는 동일 재료로 일체적으로 형성되어 있다. 또한, 이 홀(151)은, 둥근 형상으로 한정되는 것이 아니라, 사각 형상 등 다른 형상이어도 되는 것은 상술한 실시예와 마찬가지이다.

도 15b, 및 도 15c의 각각의 도면에 있어서, 부호 156과 부호 158은 홀을, 부호 157, 부호 159는 돌기물 집합체를 나타내고 있다. 또한, 당해 배양 시트(150)는 세포에 악영향이 없는 재질로 형성되고, 본 예에서는, 폴리스티렌으로 하고 있다. 단, 재질은 폴리스티렌으로 한정되지 않는 것은 물론이다.

이와 같이 세포에 악영향이 없는 단일 재료로, 구획벽(152)을 구비한 홀(151)과 당해 홀(151)의 내부에 형성되어 있는 복수의 돌기(153)가 일체적으로 배양 시트(150)로 형성됨으로써, 배양 공정에 있어서 세포에 이물질이 접착하는 일 없이 세포를 성장시킬 수 있다. 또한 개개의 구획 내에 있어서 세포가 성장하기 때문에, 균일한 크기의 세포를 형성시키는 것이 가능해진다.

또한, 포위 배치된 구획벽(152)의 내부에 복수의 돌기를 설치하고 있으므로, 세포가 원래 유지하고 있는 능력인 세포 운동을 촉진시켜, 당해 운동에 의해 성장함으로써, 회전 배양 등에 의한 스트레스 등의 외란의 영향 없이, 세포 활성을 유지한 세포 배양이 가능해진다.

이들 홀(151)과 돌기 집합체(153)를 별도의 부재로서 배양 영역을 형성하려고 하면, 그들의 접착, 용착에 의한 접합이 필요해진다. 예를 들어 이들을 접착 접합한 경우에는, 배양 영역의 내부에 접착제 성분이 혼입되어, 생성 세포에 악영향을 미칠 가능성이 있다. 또한 용착 접합에서는, 홀(151)의 내경이 세포 형성 레벨의 극미소 영역 직경 때문에, 목적으로 하는 세포 영역을 형성하면서, 구획, 돌기에 손상을 주지 않고 용착하는 것은 매우 곤란하다. 당해 구획이나 돌기에 손상, 변형이 있으면, 세포 형성 과정에 있어서 세포에 불필요한 스트레스를 주거나, 세포 자신의 운동에 장해가 될 가능성이 있다.

따라서, 본 실시예에 있어서도, 배양 영역을 형성하는 홀(151)을 구성하는 홀 저면(154), 구획벽(152) 및 돌기(153)는 일체적으로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같이 일체적으로 형성됨으로써, 세포 배양에 필요한 성분 이외의 불필요 성분의 영향을 배제한 배양을 실행하는 것이 가능해져 적합하다.

또한, 본 실시예에 있어서의 돌기(153)의 확대도는, 도 2를 사용하여 설명한 제1 실시예의 돌기와 같은 구조를 갖기 때문에, 여기서는 설명을 생략한다. 본 실시예에서는 구획 구조인 구획벽(152)의 높이는, 예를 들어 70㎛이지만, 이 값에 한정되지 않고, 적절하게는 형성되는 세포가 구획을 타고 넘지 않을 정도의 높이이면 된다. 또한, 본 실시예에 있어서의 배양 시트(150)는 제1 실시예와 마찬가지의 방법으로 제작되므로, 여기서는 제작법의 상세한 설명은 생략한다.

또한, 본 실시예에 있어서도, 도 3에 도시하는 바와 같은, 배양 시트(150)가 부착된 챔버 슬라이드(109)를 제작할 수 있고, 도 13a, 도 13b, 도 13c와 마찬가지의 전체 구성 및 주요부 단면을 갖는 챔버 슬라이드 얻을 수 있는 것은 물론이고, 여기서는 설명을 생략한다.

<제6 실시예>

다음에, 제6 실시예를 도 4, 도 5를 사용하여 설명한다. 제6 실시예에서는 제5 실시예에서 설명한 배양 시트(150)를 사용한, 배양 시트(150) 부착의 멀티 웰 플레이트의 구성 및 그 제작예를 나타내는 실시예이다. 멀티 웰 플레이트의 구성과 그 제작예는, 도 4, 도 5에서 상세하게 설명하였지만, 본 실시예에서는, 제2 실시예에서 사용한 배양 시트(100) 대신에, 배양 시트(150)를 사용하는 점 이외에는, 기본적으로 제2 실시예와 마찬가지이다.

도 4의 (a)는 멀티 웰 플레이트를 구성하는 프레임(111)의 저면도이다. 배양 시트 보유 지지 부재인 프레임(111)은, 가로 폭 약 125㎜, 세로 약 80㎜, 높이 약 20㎜ 중에 종렬로 4구멍, 횡렬로 6구멍의 합계 24구멍의 통 형상의 구멍부(111a)가 성형된 것이다. 소재는 폴리스티렌을 사용하고 있다.

프레임에 형성되는 구멍의 수는, 통상 6구멍으로부터 1536구멍까지, 용도에 의해 구분지어 사용하기 때문에, 이 프레임도 구멍의 수는 24구멍으로 한정되지 않는다. 또한 프레임의 소재도 폴리스티렌으로 한정되는 것은 아니다.

당해 배양 기재의 제작에서는, 프레임(111)과, 도 15a의 배양 시트(150)를 초음파 용착에 의해 접합시킨다. 이하의 처리와 구성 등은 제2 실시예와 마찬가지이다.

이와 같이 하여 작성된 배양 기재에 있어서, 프레임(111)의 저면에 형성된 배양 시트(100) 대신에, 도 15a에서 설명한 배양 시트(150)에는, 복수의 홀(151)이 형성되고, 당해 홀 저면(154)으로 구성되어 있는 복수의 돌기물은, 복수의 미소 돌기물(153)로 이루어진다. 또한, 이 홀(151)의 직경을 홀 직경(155)으로 한다. 당해 배양 시트(150)에 있어서, 상기의 구획벽(152)을 구비한 홀(151)과, 당해 홀(151)의 내부에 형성되어 있는 복수의 돌기(153)는 동일 재료로 일체적으로 형성되어 있다. 또한, 이 홀(151)은, 둥근 형상으로 한정되는 것이 아니라, 사각 형상 등 다른 형상이어도 된다.

이와 같이 세포에 악영향이 없는 단일 재료로, 구획벽(152)을 구비한 홀(151)과 당해 홀(151)의 내부에 형성되어 있는 복수의 돌기(153)가 일체적으로 배양 시트로 형성됨으로써, 배양 공정에 있어서 세포에 이물질이 접착하는 일 없이 세포를 성장시킬 수 있다. 또한 개개의 구획 내에 있어서 세포가 성장하기 때문에, 균일한 크기의 세포를 형성시키는 것이 가능해진다. 또한, 포위 배치된 구획의 내부에 복수의 돌기를 형성하고 있으므로, 세포가 원래 유지하고 있는 능력인 세포 운동을 촉진시켜, 당해 운동에 의해 성장함으로써, 회전 배양 등에 의한 외란(스트레스)의 영향 없이, 세포 활성을 유지한 세포 배양이 가능해진다.

상술한 바와 같이, 본 실시예에 있어서도, 배양 영역을 형성하는 홀(151)과 복수의 돌기(153)는 일체적으로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같이 일체적으로 형성됨으로써, 세포 배양에 필요한 성분 이외의 불필요 성분의 영향을 배제한 배양을 실행하는 것이 가능해져 적합하다.

본 실시예의 배양 시트 부착 멀티 웰 플레이트의 전체 구성도 및 주요부 단면도도, 제2 실시예와 마찬가지로, 도 14a, 도 14b, 도 14c, 도 14d에 도시하는 바와 같이 되므로, 여기서는 설명을 생략한다.

<제7 실시예>

계속해서, 제7 실시예로서, 제5 실시예 및 제6 실시예에 의해 제작한 배양 기재를 이용한 세포의 조직 배양에의 적용예를 설명한다. 앞서, 제3 실시예로서, 제1 실시예 및 제2 실시예에 의해 제작한 배양 기재를 이용한 세포의 조직 배양에의 적용예를 나타냈지만, 본 실시예와 제3 실시예의 차이점은, 배양 시트(100) 대신에 배양 시트(150)를 사용한 배양 기재를 사용하는 점에 있다. 그 이외의 점은, 설명이 공통되므로 여기서는 설명을 생략하는 것으로 한다.

또한, 이와 같이 하여 얻어진 배양 기재를 사용한 배양의 흐름도도, 배양 시트(150)를 사용하는 점 이외에는, 도 6에 도시하는 배양 플로우와 완전히 동일한 것은 물론이다.

도 16, 도 17, 도 18을 사용하여, 본 실시예의 배양 기재를 사용한 배양의 결과에 대해서 설명한다. 본 실시예에 있어서의, 홀(151)의 중심부에 필러 폭 2.0㎛의 나노 필러가 직경 80㎛의 원 형상으로 배열된 배양 시트(150)에서는, 도 16에 도시하는 바와 같이, 직경이 일치된 스페로이드(160)가 홀(156)의 중심부에 보유 지지되어 있다. 또한, 도 17에 도시하는 바와 같이, 홀(158)의 중심부에, 동일한 사이즈의 나노 필러가 직경 20㎛의 원 형상으로 배열된 배양 시트(150)에서는, 스페로이드가 중심부에 보유 지지되지 않았다.

이상의 결과로부터 명백해진 바와 같이, 배양 시트 표면에 특별한 화학 물질의 도포 없이, 또한 세포에 있어서 스트레스가 적은 정치 배양으로부터, 이와 같이 크기가 정렬된 구상의 3차원 조직이 형성되었다. 이것은, 원래 유지하고 있는 세포의 활성을 상실시키는 일이 없다고 생각되므로, 세포 분석 등에 유효한 배양 방법이다.

도 18에, 홀(151) 내 전체면 나노 필러, 필러 에어리어 80㎛, 필러 에어리어 20㎛의 3종류의 시트를 사용하여, 홀(151)의 중심과 스페로이드의 중심 사이의 거리를 측정한 결과를 나타낸다. 도 18에 있어서, 횡축은, 스페로이드의 폭(㎛), 종축은 스페로이드의 중심간 거리(㎛)를 나타낸다. 도 18가 도시하는 바와 같이, 다른 2종류에 비해, 필러 에어리어 80㎛의 시트로 명백하게 스페로이드가 홀의 중심부에 보유 지지되어 있는 것을 알 수 있다. 이와 같이, 홀 직경과 중심부의 나노 필러 에어리어를 적절하게 하면, 크기가 정렬된 스페로이드가 홀의 중심부에 보유 지지되는 것이 명확해졌다.

본 발명은, 배양 기재를 사용하여 동식물 세포를 배양하고, 세포의 구상 조직(3차원 조직), 및 단층 조직(2차원 평면 조직)을 형성하는 기술로서 매우 유용하다.

100, 123, 126, 128, 130, 131, 132, 133, 150 : 배양 시트
101, 124, 151, 156, 158 : 홀
102, 152 : 구획벽
103, 153, 157, 159 : 돌기물/돌기물 집합체
104, 154 : 홀 저면
105, 155 : 홀 직경
106 : 필러 직경
107 : 필러 피치
108 : 필러 높이
109 : 챔버 슬라이드
110 : 수술용 접착제
111 : 프레임
111a : 프레임에 형성된 구멍부
112 : 필름 고정용 돌기
113 : 리브 구조
114 : 배양 시트 구멍
115 : 세포 배양 플레이트
116 : I형 콜라겐 용액
117 : 감압용 용기
118 : 감압용 펌프
119 : 세정용 생리 식염수(PBS(-))
120 : 배지
121 : 간세포
122 : 간세포 스페로이드
125a, 125b, 127a, 127b, 129a, 129b, 129c : 돌기물 배열 패턴
1111 : 미끄럼 방지부
1112 : 접합부
1113 : 컷트면

Claims

세포를 배양하는 배양 기재이며,
배양 시트와, 상기 배양 시트를 보유 지지하는 배양 시트 보유 지지부를 구비하고,
상기 배양 시트는 배양 영역을 갖고, 상기 배양 영역 내에 복수의 돌기가 형성되고,
상기 돌기보다도 높고, 또한 상기 배양 시트 보유 지지부에 의해 형성된 측벽보다도 낮은 구획이 상기 배양 영역 내에 형성되고,
복수의 3차원 조직의 각각을 보유 지지하는 복수의 홀 구조가 상기 구획에 의해 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제1항에 있어서,
상기 측벽에 의해, 상기 배양 시트를 둘러싸는 프레임이 형성되는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제2항에 있어서,
상기 프레임은, 상기 배양 시트 보유 지지부에 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제3항에 있어서,
상기 시트 보유 지지부는, 상기 배양 시트에 접합 되는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제4항에 있어서,
상기 시트 보유 지지부와 상기 배양 시트는, 초음파 용착에 의해 접합 되는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제2항에 있어서,
상기 프레임은 사각 형상 혹은 둥근 형상인 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
세포를 배양하는 배양 기재이며,
배양 시트와,
상기 배양 시트를 보유 지지하는 배양 시트 보유 지지부를 구비하고,
상기 배양 시트는 배양 영역을 갖고, 상기 배양 영역 내에 복수의 돌기가 형성되고,
상기 배양 시트 보유 지지부에 상기 배양 영역을 둘러싸는 프레임이 형성되고,
상기 돌기보다도 높고, 또한 상기 프레임보다도 낮은 구획이 상기 배양 영역 내에 형성되고, 복수의 3차원 조직의 각각을 보유 지지하는 복수의 홀 구조가 상기 구획에 의해 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제7항에 있어서,
상기 배양 시트 보유 지지부는, 상기 배양 시트에 접합 되는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제8항에 있어서,
상기 배양 시트 보유 지지부와 상기 배양 시트는, 초음파 용착에 의해 접합 되는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제1항에 있어서,
상기 배양 시트는, 상기 배양 영역을 복수로 갖는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제1항에 있어서,
상기 배양 영역 내에 제1 영역과 제2 영역을 갖고, 상기 제1 영역에 있어서의 상기 돌기의 폭/직경과, 상기 제2 영역에 있어서의 상기 돌기의 폭/직경이 다른 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제1항에 있어서,
상기 돌기는 상이한 복수 종류의 폭/직경을 갖는 패턴으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제1항에 있어서,
상기 배양 영역 내에 제1 영역과 제2 영역을 갖고, 상기 제1 영역에 있어서의 상기 돌기의 피치와, 상기 제2 영역에 있어서의 상기 돌기의 피치가 다른 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제1항에 있어서,
복수의 상기 돌기는 상이한 복수 종류의 피치를 갖는 패턴으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제1항에 있어서,
상기 배양 영역 내의 복수의 돌기에 있어서, 당해 영역 내의 제1 영역에 있어서의 돌기의 높이와, 제2 영역에 있어서의 돌기의 높이가 다른 것을 특징으로 하는, 배양기재.
제1항에 있어서,
상기 돌기는 상이한 복수 종류의 높이를 갖는 패턴으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 배양기재
배양 기재를 사용한 세포 배양 방법이며,
상기 배양 기재는,
배양 시트와,
상기 배양 시트를 보유 지지하는 배양 시트 보유 지지부를 구비하고,
상기 배양 시트는 복수의 배양 영역을 갖고, 상기 배양 영역 내에 복수의 돌기가 형성되고,
상기 돌기보다도 높고, 또한 상기 배양 시트 보유 지지부에 의해 형성된 측벽보다도 낮은 구획이 상기 배양 영역 내에 형성되고, 복수의 상기 배양 영역 각각에 복수의 3차원 조직의 각각을 보유 지지하는 복수의 홀 구조가 상기 구획에 의해 형성되어 있고, 복수의 상기 배양 영역 각각에 배양 대상의 세포를 파종함으로써, 상기 배양 영역 각각에서 상기 세포의 3차원 조직을 형성하는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 방법.
제17항에 있어서,
상기 세포는 배성 간세포(幹細胞), iPS 세포, 및 간세포(肝細胞)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 방법.
제17항에 있어서,
상기 배양 기재는, 상기 측벽에 의해 상기 배양 시트를 둘러싸는 프레임을 형성하는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양 시트에 있어서의 상기 구획 및 복수의 상기 돌기는, 동일 소재로 일체적으로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제7항에 있어서,
상기 배양 시트에 있어서의 상기 구획 및 복수의 상기 돌기는, 동일 소재로 일체적으로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 배양 기재.
제17항에 있어서,
상기 배양 시트에 있어서 상기 구획 및 복수의 상기 돌기는, 동일 소재로 일체적으로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 방법.
세포를 배양하는 배양 시트이며,
배양 영역을 갖고, 상기 배양 영역 내에, 복수의 돌기가 형성되고,
상기 돌기보다도 높고, 또한 상기 배양 시트를 보유 지지하는 배양 시트 보유 지지부에 형성된 상기 배양 영역을 둘러싸는 프레임보다도 낮은 구획이 상기 배양 영역 내에 형성되고, 복수의 3차원 조직의 각각을 보유 지지하는 복수의 홀 구조가 상기 구획에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는, 배양 시트.
제23항에 있어서,
상기 구획 및 복수의 상기 돌기는, 동일 소재로 일체적으로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 배양 시트.