JP2006325532A - 細胞培養容器，細胞培養容器の製造方法、及び培養細胞 - Google Patents

Abstract

【課題】
簡便に簡単な構造で剥離時の細胞への損傷を防ぎ、栄養物の運搬，老廃物排出を促進するとともに、構造による培養効率の改善効果を高めることのできる細胞培養容器を提供する。
【解決手段】
培養容器に培養する細胞よりも小さい相当直径の複数の突起物を有する培養面と、培養面を囲む培養面側壁を形成し、培養面側壁と培養面の境界線上にある任意の位置と最近接の突起物の距離が培養する細胞の直径よりも小さいことを特徴とする細胞培養容器を提供する。細胞培養容器の突起物が培養細胞に与える効果をより効率よく細胞に与えることができる。
【選択図】図１

Description

本発明は細胞の剥離特性に優れた細胞培養容器と、その細胞培養容器の製造方法、及びその培養容器で培養した培養細胞に関する。

近年、医療目的に使われる細胞培養の技術が進歩し、実際に皮膚の移植などに用いられている。また、少量の細胞から皮膚などの組織にとどまらず角膜，歯，骨，臓器など複雑な器官へと自家移植や他家移植に向けた培養技術の進歩が見られる。

細胞の培養にはガラス製や樹脂製のペトリシャーレなどの容器が用いられる。例えば、以下のようなペトリシャーレが開示されている。所定の濃度のコラーゲン溶液を、培養容器に、ピペットで表面が一様になるよう分注して塗布した後、１５分〜７２時間乾燥する。あるいは、所定の濃度のコラーゲン溶液を、シリコーン膜等の伸縮性を有する培養基材上に塗布し、１５〜４２℃のインキュベーター内で２０〜１２０分間重合させた後、このシリコーン膜等の伸縮性を有する培養基材をＵＶ灯下で１５分〜７２時間放置し、コラーゲンが乾燥した後、リン酸緩衝液で再び湿らせ、その後、１０〜４０％伸展させて固定するなどの手法により細胞培養用シャーレを作成する方法がある（特許文献１参照）。

上記第一の方法によれば、細胞をその細胞と親和性のあるコラーゲンの上において培養することが出来るが、反面、細胞と培養容器の密着力が強い為に細胞の剥離が困難であった。この密着力に対して、機械的に細胞を剥がすと細胞に物理的な損傷を与え、トリプシンなどの酵素によって化学的な処理を行うと細胞表面の膜タンパク質が破壊されて移植後の細胞の組織への定着率が低下するという問題があった。

このような問題を解決する細胞培養容器をこれまでに発明者らは以下の特許文献に開示した。形状を制御できる有機ポリマー製の柱状微小突起群を備えた機能性基板の上で細胞を培養することによって培養液を細胞下部に配しやすく、また、細胞の剥離性を改善する方法を用いている（特許文献２参照）。

上記第２の方法は剥離の問題を培養容器表面で細胞が接する部位を小さくすることで表面の密着力を減少し、解決する手法である。しかし、本手法ではシート端部や、若しくは機能性基板を入れるシャーレの底面で機能性基板を配していない箇所にも細胞が吸着し、細胞の培養効率が低下するという課題があった。また、微小突起の上で培養された細胞が通常の培養容器で培養する際と異なる性状を示す場合には、そのような微小突起の上で培養された細胞と微小突起を持たない平滑部で培養された細胞が混合してしまうという課題があった。

特開２００２−１４２７５１号公報（実施例Ａ） 特開２００４−１７０９３５号公報（実施例５）

本発明の目的は簡便に簡単な構造で剥離時の細胞への損傷を防ぎ、栄養物の運搬，老廃物排出を促進するとともに、構造による培養効率の改善効果を高めることのできる細胞培養容器を提供することである。

上記課題を解決するために、本発明の第１は、培養容器に培養する細胞よりも小さい相当直径の複数の突起物を有する培養面と、培養面を囲む培養面側壁を形成し、培養面側壁の各部位とその近傍の培養面上の突起物との間隔が培養する細胞の直径よりも小さいことを特徴とする細胞培養容器を提供する。細胞培養容器の培養面端部付近で突起物が形成されていない部位を無くし、突起物が培養細胞に与える効果をより効率よく細胞に与えることができる。なお、相当直径という語を用いたのは、突起物の断面が必ずしも円形ではなく、楕円，多角形，非対称形などの場合があるためで、本発明ではこれらを全て包含するために相当直径を用いている。本発明で相当直径は、突起物の底面における断面の直径とする。

また、容器への付着力の強い細胞系によっては培養面側壁への吸着が無視できず、また、そのような側壁で培養された細胞が培養面に混合することを嫌う系がある。このような系に対しては培養面側壁に対しても培養面と同様の突起物を付与することが最善であるが、それが困難である場合には表面構造や材質によって培養面側壁を細胞非接着性とすることができる。また、微小な突起物を有する培養面と培養面側壁との間に培養面を囲む培養面よりも低い位置にある緩衝面を形成することで、培養面側壁に吸着した細胞が移動して突起物を有する培養面に移ることを防ぐことができる。この場合においても培養面の微小な突起物のうち、最も緩衝面から近い微小な突起物と培養面端部の間の距離を培養する細胞の直径よりも小さくすることによって培養面上で突起物が培養細胞に与える効果をより効率よく細胞に与えることができる。

細胞培養容器の培養面表面は培養液を行き渡らせるために親水性に処理することで培養液の流れを促進することができる。しかし、培養する細胞の種類によっては容器表面を疎水性に処理をすることや、容器表面を金属やタンパク質などで覆うことが必要となることがある。このため、本発明は細胞培養容器に形成された微小な突起物が細胞と接する先端部のみに細胞培養に必要な疎水化処理，金属によるコート，タンパク質によるコートなど細胞培養に必要な処理を施すことができる。

また、培養する細胞に配向性など、特定の形状を求める場合には培養する細胞の形状に応じて疎水処理などの特定の処理を細胞培養容器の底面に部分的に処理することがある。本発明は細胞培養容器表面の微小な突起物の先端部に対して施す疎水性，金属によるコート，タンパク質によるコートなど細胞培養に必要な処理を容器表面に選択的に施すことができる。

本発明を適用することにより、剥離時の細胞への損傷を防ぎ、栄養物の運搬，老廃物排出を促進するとともに、これらの突起物による培養効率の改善効果をより高められる効果が得られる。また、突起物が形成されていない部位で培養された細胞が突起物上の細胞に混合することを防ぐという効果を得ることもできた。

以下、図面を参照しながら本発明の細胞培養容器について詳細に説明する。

図１は本発明における細胞培養容器１００の第一の形態を示す鳥瞰図である。細胞、及びその培養液を入れる細胞培養容器１００の培養面１０２には培養する細胞よりも小さい相当直径の突起物１０１が形成されている。これらの突起物１０１の相当直径は１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０ｎｍ以上１mm以下であることが好ましく、また、細胞との接触面積を減らすために細胞の直径よりも十分に小さく、例えば細胞の直径の５分の１以下に設定される。突起物１０１の相互の間隔は細胞の直径よりも小さい値とする必要がある。換言すると、細胞の断面積よりも突起物の断面積が小さく、細胞の断面内に複数の突起が配置される形状とする。また、突起物１０１の下部に十分に培養液を浸透させる必要があるためこれらの突起物１０１の高さは十分に高く、例えば相当直径以上、より好ましくは相当直径の５倍以上であることが好まれる。しかし、構造強度的な観点からは１００倍以下が好まれる。培養面１０２は１つの細胞培養容器１００に対して１箇所とすることもできるが、図１に示すように培養面側壁１０３によって２箇所以上に分離することによって１つの細胞培養容器１００を用いて複数条件で細胞を培養することが可能となる。

図２（ａ）は、本発明における細胞培養容器１００の第一の形態のうち図１に示した
ＡＢ間の断面図を示す概念図である。図２（ｂ）は、図２（ａ）の特に培養面１０２と培養面側壁１０３との境界部を示す概念図である。突起物１０１は培養面側壁１０３近くにまで形成されており、突起物１０１は培養面１０２の実質的に全面を覆っている。培養面側壁１０３と培養面１０２の境界線上にある任意の位置と最近接の突起物１０１の距離Ｉは培養する細胞の相当直径以下となるように設計されている。突起物１０１を含む培養面
１０２，培養面側壁１０３は一体となっており、同一の材料から形成されている。培養面側壁１０３にも突起物１０１を形成すれば突起物１０１による効果をさらに効率よく得ることができるため最も好ましいが、加工が困難である場合には培養面１０２よりも細胞が吸着し難い別の表面構造を形成するか、若しくは細胞非接着性の表面処理を施すことが可能である。培養面側壁１０３の高さは培養面１０２表面から溢れることなく培養液を保持できる高さがあることが好ましい。この高さは培養面１０２の面積や形状，親水性や培養面１０２に配する培養液の量に応じて最適の値とすることができるが、培養面１０２からの培養面側壁１０３の高さｈを０.０５mm以上１００mm以下とすることが好ましい。また、この培養面側壁１０３は培養面１０２上の突起物１０１の高さよりも高くすることが好ましく、より好ましくは突起物１０１の高さの１０倍以上に設定する。この高さは培養面１０２の形状にも依存するが、高さの下限は適正な量の培養液を突起物１０１を有する培養面１０２上に保持できるかどうかで決まり、高さの上限は培養液や細胞への操作性によって決まる。また、培養面側壁１０３の培養面１０２に対する傾斜角度θは培養液の保持と培養面側壁１０３への細胞の付着を妨げるために４５度以上とすることが好ましい。また、必要に応じて多数の段を有する階段状の培養面側壁１０３を形成して培養面側壁103に表面構造を形成しやすくすることも可能である。

図３は本発明における細胞培養容器１００の第二の形態を示す鳥瞰図である。培養面
１０２上の突起物１０１の形状は第一の形態と同一であるが、培養面側壁１０３は培養面１０２よりも細胞付着性の低い材質から形成されており、培養面１０２へ接着されている。培養面側壁１０３と培養面１０２の間の接着は、突起物１０１を損ねることなく取り外し可能な構成とすることで、例えば培養後の観察操作を容易にすることもできる。

図４は、本発明における細胞培養容器１００の第二の形態のうち図１に示したＡＢ間の断面図を示す概念図である。第一の形態と同様に、突起物１０１は培養面側壁１０３近くにまで形成されており、突起物１０１は培養面１０２の実質的に全面を覆っている。培養面側壁１０３と培養面１０２の境界線上にある任意の位置と最近接の突起物１０１の距離Ｉは培養する細胞の相当直径以下となるように設計されている。

図５は本発明における細胞培養容器１００の第三の形態を示す鳥瞰図である。培養面
１０２上の突起物１０１の形状は第一，第二の形態と同一であるが、培養面１０２と培養面側壁１０３の間に培養面１０２を囲む培養面１０２よりも低い位置にある緩衝面１０４を形成している。培養面側壁１０３に細胞が吸着する場合でもこの緩衝面１０４を形成することで培養面１０２に培養面側壁１０３に吸着した細胞が移動することを防ぐことができる。

図６は、本発明における細胞培養容器１００の第三の形態のうち図１に示したＡＢ間の断面図を示す概念図である。突起物１０１は緩衝面１０４近傍にまで形成されており、突起物１０１は培養面１０２の実質的に全面を覆っている。培養面１０２の緩衝面１０４側の端部の各部位とその最近傍の突起物１０１との距離Ｉは培養する細胞の相当直径以下となるように設計されている。緩衝面１０４はその上に移動した細胞がさらに培養面１０２へと移るのを防ぐ深さがあれば良い。その深さは細胞種や培養条件にもよるが、培養面
１０２から０.０１mm 以上の高さがあり、培養面１０２を培養液で浸すことのできる構成とするために培養面側壁１０３の高さよりも小さい値となる。また、緩衝面の幅（培養面側壁から培養面端部までの距離）ｄは、細胞が培養面１０２へ移るのを防ぐために、培養する細胞の相当直径よりも大きくすることが好ましい。

本発明における細胞培養容器１００の材質は特に限定されないが、所望する加工精度，表面特性，光学特性，強度などに応じて選択される。具体的には、ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリビニルアルコール，ポリ塩化ビニリデン，ポリエチレンテレフタレート，ポリ塩化ビニール，ポリスチレン，ＡＢＳ樹脂，ＡＳ樹脂，アクリル樹脂，ポリアミド，ポリアセタール，ポリブチレンテレフタレート，ガラス強化ポリエチレンテレフタレート，ポリカーボネート，変性ポリフェニレンエーテル，ポリフェニレンスルフィド，ポリエーテルエーテルケトン，液晶性ポリマー，フッ素樹脂，ポリアレート，ポリスルホン，ポリエーテルスルホン，ポリアミドイミド，ポリエーテルイミド，熱可塑性ポリイミド等の熱可塑性樹脂や、フェノール樹脂，メラミン樹脂，ユリア樹脂，エポキシ樹脂，不飽和ポリエステル樹脂，アルキド樹脂，シリコーン樹脂，ジアリルフタレート樹脂，ポリアミドビスマレイミド，ポリビスアミドトリアゾール等、の熱硬化性樹脂、及びこれらを２種以上ブレンドした材料を用いることが可能である。また、この他にガラス類などの無機物も使用することが可能である。細胞培養容器１００の材質としては一般に細胞に対する親和性が要求されるため、培養する細胞に応じて親和性を確認して選択する必要がある。また、培養による評価を容易とするために細胞培養容器１００には観察に用いる波長の光に対して透明と見なせ、同波長における蛍光を実質的に発さない材質を用いることが好ましい。また、例えば、ポリ乳酸やポリカプロラクトンを始めとする脂肪族ポリエステルやポリ酸無水物，合成ポリペプチド等の合成系の他に、キトサンやセルロースなどの天然物系も含めた生分解性樹脂を用いることで、培養後に細胞培養容器１００を容易に生分解できる構成にすることもできる。

本発明における突起物１０１の材質は特に限定されないが、やはり所望する加工精度，表面特性，光学特性，強度などに応じて前述の樹脂組成物、若しくはガラス類など無機物よりなる。これらの突起群は培養面１０２と一体化されていることが好まれる。

本発明における細胞培養容器１００の第一の形態を形成する手法を図７に示す。図７はいわゆるナノインプリント法による細胞培養容器１００の形成を示している。容器原料
１０５を加熱して軟化し、その容器原料１０５に突起物１０１，培養面１０２、及び培養面側壁１０３を規定する形状が形成された金型１０６を押し付けることにより、金型106の形状を容器原料１０５に転写し、突起物１０１，培養面１０２、及び培養面側壁１０３を有する細胞培養容器１００を得ることができる。

本発明における細胞培養容器１００の第二の形態を形成する手法を図８に示す。図８はいわゆるナノインプリント法による細胞培養容器１００の形成を示している。容器原料
１０５を加熱して軟化し、その容器原料１０５に突起物１０１，培養面１０２を規定する形状が形成された金型１０６を押し付けることにより、金型１０６の形状を容器原料105に転写する。その後、別に形成した培養面側壁１０３を培養面１０２に接合することによって細胞培養容器１００を得ることができる。

本発明における細胞培養容器１００の第三の形態を形成する手法を図９に示す。図９はいわゆるナノインプリント法による細胞培養容器１００の形成を示している。容器原料
１０５を加熱して軟化し、その容器原料１０５に突起物１０１，培養面１０２，培養面側壁１０３、及び緩衝面１０４を規定する形状が形成された金型１０６を押し付けることにより、金型１０６の形状を容器原料１０５に転写し、突起物１０１，培養面１０２，培養面側壁１０３、及び緩衝面１０４を有する細胞培養容器１００を得ることができる。

また、これらの第一から第三の形態の形成方法において、容器原料１０５に金型１０６を押し付けた後、容器原料１０５から金型１０６を剥離する際に、金型１０６のうち、突起物１０１に相当する形状内に充填した容器原料１０５を延伸させることで、金型１０６上の形状よりもアスペクト比の高い形状を突起物１０１を形成できる高アスペクト比ナノプリント法を採用することも可能である。本手法によれば、高アスペクト比のパターンを簡便に形成することができる。

以上それぞれの細胞培養容器１００の形成で用いられる金型１０６は、細胞培養容器
１００上の突起物１０１に相当する形状、つまり相当直径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０ｎｍ以上１mm以下である形状を表面に形成することが求められる。このため、金型は金属，カーボンやシリコンなどの無機物、及び樹脂組成物の少なくとも１つを含み、その表面形状は光リソグラフィ法，電子線直接描画法，粒子線ビーム加工法，走査プローブ加工法などの微細加工法や微粒子の自己組織化、又はこれらの手法により形成されたマスタよりナノインプリント法，射出成型法，無電解めっき法などにより形状転写することにより形成される。また、突起物１０１の微小な形状に比較すると、培養面側壁１０３を規定する形状はマクロスケールの形状であり、このような形状を形成する際には機械加工や複数の金型を接合するなどの手法を併用すると精度良く金型１０６を形成することができる。また、マクロ形状を規定する手法に焦点深度の大きい光リソグラフィ法やレーザ加工法、若しくは微粒子の自己組織化法などを組み合わせることで培養面側壁103に微細加工を施し、細胞の非接着性を付与することができる。また、図７〜図９では突起物１０１を形成する手法として軟化した容器原料１０５に金型１０６を押し付けるいわゆるナノインプリント法を用いたが、これ以外の射出成型法を代表とする樹脂の成型法や、金型を用いずレーザ加工法などで直接加工することも可能であるのは明らかである。

本発明において、細胞培養容器は必要に応じて、過酸化水素やオゾンなどの酸化剤を含む溶媒への浸漬や紫外線照射，プラズマ処理などの気相処理などによる親水化処理や、溶液への浸漬などによるポリリジン，アルブミン，コラーゲン，フィブロネクチン，フィブリノーゲン，ビトロネクチン，ラミニン等のタンパクによるコート、若しくはめっき，気相蒸着法による金属コート，光や電子線，粒子線などによる１つ以上の表面改質が行われ、細胞培養に必要な表面処理が施される。また、シリコーンゴムや樹脂フィルム，金属薄膜などの弾性体からなるスタンプや部分的なディスペンス法を用いて加熱や樹脂ペースト，シリコーングリス，フッ素系コート剤などの疎水化剤やタンパクを含有する溶媒の部分塗布を行い、必要に応じて面内分布を付けて例えば突起物１０１の先端部や、培養面側壁１０３にのみ表面処理を施すことも可能である。

図３，図４，図８で用いた培養面側壁１０３は先に示した培養面１０２とは別に機械加工，成型加工などによって形成する。材質は先に示した細胞培養容器１００に用いる材質から選択される。ここで培養面１０２と同じ材質で培養面側壁１０３を形成すれば接合後の形状制度や接合強度に優れた構造を形成することができ、外観としては図１に示した構造となる。これらの培養面側壁１０３と培養面１０２の接合には精度に優れた加熱加圧や振動溶着，赤外線レーザ溶着などによる熱接合の他には接着剤を用いることができる。ただし、熱接合においては培養面１０２上の突起物１０１が許容範囲以上の変形を示さない条件を選択する必要があり、接着剤を用いる際には接合時に培養面１０２表面に接着剤が回りこまず、また、硬化後に細胞が表面に吸着せず、かつ、溶出物が細胞毒性を示さない条件を選択する必要がある。また、ＰＤＭＳ(Poly(dimethyl siloxane)) 樹脂に代表されるような、弾性を有して細胞培養容器１００との密着性の高い材質で培養面側壁１０３を形成すると、培養面側壁１０３を細胞培養容器１００上に密着するだけで十分な接着強度が得られる。また、このような構成で培養面側壁１０３を形成すると突起物１０１や、その上で培養した細胞を損ねることなく培養面側壁１０３を取り外し可能な構成とすることができ、例えば培養後の観察操作を容易にすることもできる。また、培養面側壁１０３と培養面１０２表面の突起物１０１の距離を小さくするためには、予め突起物１０１を形成する位置と培養面側壁１０３の形状や位置を高精度に合わせる必要がある。このため、図８（ｄ）に示すように突起物１０１を形成する範囲を培養面１０２よりも大きく取り、接合時に培養面側壁１０３によって培養面側壁１０３直下の突起物１０１のみを押しつぶす、若しくは突起物１０１を培養面側壁１０３の下部で覆うことによって、培養面１０２内に残った突起物１０１と培養面側壁１０３の距離を小さくとることができる。

本発明における細胞培養容器１００は２箇所以上の複数の培養面１０２を有することができるが、使用の際には細胞培養容器１００の培養面１０２を個別に切り離して別の培養箇所や別の培養時に用いることもできる。また、培養する際に妨げとなるような細胞培養容器１００の一部分を切断して除去することも可能であることは明らかである。このように切断する場合には予め細胞培養容器１００に切断の助けとなるような構造、例えば切り取り線や折り曲げて切断できるような切れ目，切り込み部を入れておくことで切断を容易に行うことができる。

本発明における細胞培養容器１００は製造後に実際に細胞を培養する箇所へと搬送する必要がある。この際に外界から塵埃やバクテリアなどの異物などが混入するのを防ぐ必要がある。このため、細胞培養容器１００全体を袋に入れて入口を熱シールなどで封止して密封する、若しくは培養面１０２及び培養面側壁１０３のうち、培養時に培養液に接する箇所のみを封止するようにカバーフィルムを貼り付けるなどの手法で培養面１０２を外界から隔離する梱包工程が必要となる。また、梱包後に培養面１０２に残留した微生物類を殺菌するために滅菌処理を施すことが望ましい。滅菌処理の代表的な手法としては高温蒸気を用いるオートクレーブ法があるが、細胞培養容器１００の材質や、突起物１０１の形状によっては高温蒸気によって変形や変質を引き起こす可能性がある。このため、細胞培養容器を構成する材料のガラス転移点よりも低い温度で施せるＵＶ照射やエチレンオキサイドガス滅菌，ガンマ線滅菌などの手法によって滅菌処理を施すことが好ましい。もちろん、耐熱性のある樹脂やガラス類を用いる場合にはオートクレーブ法を用いることは可能である。滅菌処理は梱包後に施すことが一般的であるが、滅菌処理法に応じて梱包の種類を蒸気透過型の梱包とする、それぞれの処理に対して反応して処理の有無を示すことのできるインジケータを取り付けるなどの梱包への配慮が必要となる。

図１０に本発明における細胞培養容器１００の使用法を示す。培養面１０２を培養液
１０７で満たし、突起物１０１の上に細胞１０８を配置する。この後、常法により細胞
１０８を培養する。本発明の細胞培養容器１００では、細胞１０８と培養面１０２との接触が突起物１０１によって点接触となるため、細胞１０８の剥離時に生じる損傷を防ぐことができる。また、突起物１０１の形状や突起物１０１の表面処理を、培養する細胞108によって変化させることにより、品質の良い培養細胞を剥離時の損傷なしに形成できる。また、本特許における細胞培養容器１００においては突起物１０１は培養面１０２の実質的に全面を覆っているため、図１１に示す端部に平面部の存在する細胞培養容器１００のように培養面１０２の平坦部に付着する細胞１０９が存在しない為に、突起物１０１による細胞培養への改善効果を効率的にすることができる。また、培養面１０２に細胞１０８が付着する平坦部の領域を実質的に無くし、場合によっては培養面側壁１０３に細胞108が吸着することを妨げ、吸着してもその部位で吸着した細胞１０８が培養面１０２に配されることを防ぐ構造を形成することによって、突起物１０１が細胞１０８に特異な影響を与える際に突起物１０１が形成されていない部位で培養された細胞１０８が混合することを防ぐという効果を得ることもできる。なお、細胞１０８とは、培養組織，器官に代表される組織化された培養細胞をも含む概念である。

本発明における細胞培養容器１００は図１０に示すように培養液１０７と細胞１０８を培養面１０２に配した状態で、定法によれば恒温恒湿下の培養庫内で培養し、必要に応じて培養液１０７の交換や細胞１０８の取り出し、試薬の追加，振とう操作，顕微鏡による観察、場合によっては冷凍機による冷凍操作などの単位操作間に、操作を行う装置の間を移動する必要がある。このような操作や移動の間に細胞培養容器１００が撓んで培養液
１０７や細胞１０８が偏ったり、培養面１０２から漏れたりすることを防ぐ必要があるため、細胞培養容器１００は容器全体としては十分な剛性を有することが好ましい。このため、例えば細胞培養容器１００の少なくとも周辺部や培養面１０２以外の領域の一部は厚み０.５mm 以上の剛性のある構造とすると良い。なお、培養面１０２を構成する部材における吸光や蛍光を軽減し、外部からの温度伝導を促進するために培養面１０２においては周辺部よりも薄く設定することができる。また、より軽量で剛性の高い構造とする為に、細胞培養容器１００の端部などで折り曲げて強度を補強する領域を形成したり、培養面側壁１０３の培養面１０２に対して反対側を中空とするような構造を取ったりすることで強度やハンドリング性に関連の無い部位を除去することもできる。また、細胞培養容器100が単体では十分な剛性を有さない場合には細胞培養容器１００に培養面１０２を形成した後に、別に形成した剛性を有する部材を細胞培養容器１００に取り付けることによって剛性を付与することもできる。

以下、実施例により本発明をさらに詳述する。

以下、本発明の一実施例を説明する。図１２は本実施例で作製した培養面１０２の走査型電子顕微鏡写真の模式図である。培養面１０２には複数の突起物１０１が形成されている。突起物１０１の材質はポリスチレンで分子量は２０００から３８４万であり、更に分子量の上限は６００万まで拡張することができる。

突起物１０１は底面が直径５００ｎｍで高さが１μｍの円柱形状である。高さと一辺の比は２となり、１より大きいことが分かる。突起物１０１の間隔は１μｍであり、通常の細胞の直径よりも小さい値となっている。また、突起物１０１の配列法は図１２に示すような２次元正方配列となっている。

また、突起物１０１は先端部の直径が４００ｎｍと底面部より小さくなっており、末広がり状であることが分かる。本実施例では、突起物１０１の形状は根本から先端にかけて細くなっていく形状であるが、例えば、細くなる部位のない柱状形状でも、根本から先端にかけて細くなり先端部に太い部分を有するきのこのような形状でも突起物１０１の機能を得ることができる。

また、突起物１０１は培養面下地１１０と同じポリスチレンでできており、両者は接続されて一体化していることが分かる。

また、突起物１０１の先端部が突起物１０１の底面部より細く末広がり状であるため、突起物１０１が培養面下地１１０から取れにくい効果を得られる。また、突起物１０１が培養面下地１１０の材料と同じであり、両者が一体化しているため基板から取れにくい効果をより強くすることができた。

なお、本実施例では、突起物１０１と培養面下地１１０の材料はポリスチレンを用いたが、培養する細胞種や、細胞培養容器１００の使用方法に応じて先に示した細胞培養容器１００の材質として示した材質の中から選択することができる。後に示す製造方法は材質に応じて条件を変化することで同様の工程を経て製造することができる。

図１は本実施例で作製した細胞培養容器１００の模式図である。細胞培養容器１００は全体が先に示した分子量のポリスチレン製であり、突起物１０１を有する培養面１０２と、培養面側壁１０３を有する。培養面１０２は一片１cmの正方形であり、培養面側壁103は概鉛直方向に立って培養面１０２を囲んでおり、その高さは０.７mm である。また、培養面１０２は細胞培養容器１００中央部に２ヶ所形成されており、互いの距離を５mm空けている。

上述の細胞培養容器１００は以下に述べる方法で作製した。図７は本実施例における細胞培養容器１００の製造工程である。本手法ではナノインプリント法によって細胞培養容器１００を形成した。先に示したポリスチレン製の容器原料１０５（２０mm×４０mm，厚み１mm）を１５０℃に加熱して軟化した。軟化した容器原料１０５に突起物１０１，培養面１０２、及び培養面側壁１０３を規定する形状が形成されたニッケル製の金型１０６をプレス圧力４ＭＰａで１８０ｓ間プレスした。その後、プレス圧力は解放せずに３５℃に冷却して金型１０６と容器原料１０５を取り出し、金型１０６を容器原料１０５から垂直に引き上げることで剥離し、突起物１０１，培養面１０２、及び培養面側壁１０３を有する細胞培養容器１００を得ることができた。

金型１０６の製造方法を図１３に示す。図１３(ａ)に示した第一の金型原盤部品１１１は突起物１０１，培養面１０２、及び培養面側壁１０３を規定する形状を有する結晶方位（１００）が１cm角の両面研磨シリコンウエハであり、第二の金型原盤部品１１２は培養面側壁１０３の最上部とその他の領域の形状を規定する２０mm×４０mmの平滑な陽極接合用ガラス板である。第一の金型原盤部品１１１には前記の細胞培養容器１００上の突起物１０１に相当する微細凹凸形状が光リソグラフィ法によって形成され、直径２００mmのシリコンウエハからダイシングによって所定のサイズに切り出して洗浄を施した。その後、図１２（ｂ）に示すように陽極接合法（４００℃，１ｋＶ）によって第一の金型原盤部品１１１，第二の金型原盤部品１１２を接合して金型原盤１１３を作成した。この時に第一の金型原盤部品１１１の高さによって培養面側壁１０３の高さが決まることになるが、この高さは第一の金型原盤部品１１１と第二の金型原盤部品１１２の間に所定のスペーサーを入れる等の手法で高さを変化させることができる。また、第二の金型原盤部品１１２に培養面側壁１０３の少なくとも一部の形状を規定する形状を予め形成しておけば高さの調整はより広い範囲で行うことができる。これらのスペーサーやそれぞれの金型原盤部品の材質，接合界面の平滑度や形状に応じて金型原盤部品の接合法も陽極接合法のほかに金属系もしくは無機系もしくは有機系の接着層を形成する手法，溶接法など所与の手法から選択することで加工精度を高めることができる。金型原盤１１３にはフッ素系の離型剤によって離型処理を施し、図１３（ｃ）に示すように２０mm×４０mm，厚さ２mmのポリスチレン製のレプリカ材料１１４に１５０℃，１０ＭＰａで加圧して２５℃に冷却後に金型原盤１１３を剥離することで金型レプリカ１１５を形成した。そして金型レプリカ１１５に無電解めっき法でニッケル薄膜を金型レプリカ１１５上に形成した後に電解めっき法でニッケル膜厚を３mmまで増やして金型１０６を形成した。その後、金型１０６の突起物１０１，培養面１０２、及び培養面側壁１０３を規定する部位を含む領域に所定のフッ素系の離型処理を施した。

金型１０６は以上に示しためっき法のほかに、レプリカ形成に用いたナノインプリント法やキャスト法を使って耐熱性や強度に優れた樹脂を用いた金型１０６を形成すると、めっき法よりも形成工程を簡略化することができるため好適である。また、少量試作品を形成するような場合では金型原盤１１３を直接に金型１０６として使用することも可能である。

本実施例では金型１０６に培養面１０２と培養面側壁１０３の間に培養面１０２を囲む培養面１０２よりも低い位置にある緩衝面１０４に相当する形状を付加することで、先に示した本発明における第三の形態で示した構成とすることが可能である。

本発明では材料として厚さ１mmのポリスチレン製の容器原料１０５を用いたが、厚さは要求される培養面１０２の面積、及び培養面側壁１０３の高さに応じて最適な厚みとする必要がある。例えば、本実施例における培養面１０２よりも大きい培養面１０２を有する細胞培養容器１００では、容器全体のハンドリング時の剛性を保つ為に細胞培養容器100の周辺部、若しくは培養面の厚みを０.５mm 以上とする必要がある。但し、細胞培養容器１００全体の占める省スペース性や操作性を考慮に入れ、容器原料１０５の厚みは上記の剛性との兼ね合いで最適値を選ぶ必要がある。また、培養面１０２を広く用いられているマイクロプレートと同様の、互いに分離された直径１６mmの円形（２４穴マイクロプレート相当），直径８mmの円形（９６穴マイクロプレート相当），４mmの円形（３８４穴マイクロプレート相当），２mmの円形（１５３６穴マイクロプレート相当）などとする時には培養面１０２の厚みや、培養面側壁１０３の厚みは０.５mm よりも小さい値とすることができる。しかし、これらのマイクロプレートでも容器全体としての剛性を保つ必要があるため、例えばマイクロプレートの縁や、複数の培養面１０２の間にある領域において少なくとも厚みを０.５mm 以上とする領域を有することが好ましい。このような剛性を付与する為に、細胞培養容器１００には培養面１０２を形成した後に、別途外枠や下打ち材などの補強材を取り付けることも可能である。特に細胞培養容器１００をマイクロプレート状の形状とする時にはそれぞれの培養面１０２における培養面側壁１０３の高さを１cm前後とすることが多いが、この高さは培養面１０２の面積に応じて変えることができる。特に上記の３８４穴プレートや１５３６穴プレート相当とするように培養面１０２の面積が小さい場合には必要な培養液量が１〜１００μｌ程度と少なくなるため、培養面側壁１０３の高さはより小さい値とすることができる。

培養面１０２の形状は、培養面１０２における培養液の澱みを防ぐ為に円形とすることが最も好ましいが、金型１０６上の第一の金型原盤部品１１１のダイシング工程を容易とするために本実施例では培養面１０２の形状を正方形とした。培養面１０２の形状としては培養方法と製造方法，細胞培養容器１００上の培養面１０２の配置に応じてこの他に楕円形状や多角形形状などとすることもでき、特に形状は限定されない。培養面１０２の大きさ，深さ、及び１つの細胞培養容器１００上における培養面１０２の数は培養する細胞系や培養の用途によって最適の数値とすることができる。例えば細胞培養容器１００を比較的大きい培養組織や同一条件の多数の培養細胞を得るための生産手段として用いる場合には培養面１０２を大きくすると良いが、試験的に多条件でアッセイとして培養する場合には培養面１０２は小さく、１つの細胞培養容器１００内にそれぞれ分離された多くの培養面１０２を有するマイクロプレートのような形状を有していると、培養に用いる試薬や細胞数を少量にすることができるため好ましい。また、培養の用途に応じて、分離された領域毎に培養面１０２の突起物１０１の表面処理，先端部の形状や直径，高さなどの形状や配置を変化させることで、同じ細胞種を同条件で培養した際の突起物１０１の形状，配置による培養細胞の状態変化を試験することや、異なる細胞種を培養する際に細胞種ごとに最適な突起物１０１のパターンとすることが可能である。また、それぞれの培養面102において突起物１０１の形状や配置を面内で変化させることによって、一つの培養面102のみを用いて培養細胞の状態変化を試験して、その培養細胞に最適な突起物１０１のパターンを探索するような用途に用いることも可能である。

以下、本発明の別の一実施例を説明する。図２は本実施例で作製した細胞培養容器100の模式図である。細胞培養容器１００は突起物１０１を含む培養面１０２が第一の実施例と同じ分子量のポリスチレン製であり、培養面側壁１０３は図１４に示す形状の高さ0.7
mmのＰＤＭＳ(Poly(dimethyl siloxane)、ダウ・コーニング社）から成る。培養面１０２は一片０.９０cm の正方形であり、培養面側壁１０３は概鉛直方向に立って培養面１０２を囲んでいる。また、培養面１０２は細胞培養容器１００中央部に２ヶ所形成されており、互いの距離を５mm空けている。なお、培養面１０２上に形成された突起物１０１は底面の直径が５００ｎｍ，高さ１μｍの円柱状であり、第一の実施例と全く同じ構成である。

上述の細胞培養容器１００は以下に述べる方法で作製した。図８は本実施例における細胞培養容器１００の製造工程である。先に示したポリスチレン製の容器原料１０５（２０mm×４０mm，厚み１mm）を１５０℃に加熱して軟化し、その容器原料１０５に突起物101，培養面１０２（一辺１cmの正方形）を規定する形状が形成されたニッケル製の金型106をプレス圧力４ＭＰａで１８０ｓ間プレスした。その後、圧力は解放せずに３５℃に冷却後に金型１０６と容器原料１０５を取り出し、金型１０６を容器原料１０５から垂直に引き上げることで剥離し、突起物１０１，培養面１０２を規定する。その後、別の金型からキャスト法で形成した図１４に示すＰＤＭＳ製の培養部側壁１０３を培養面１０２に密着させることで接合し、細胞培養容器１００を得ることができた。

金型１０６の製造方法は第一の実施例と同様であるが、培養面側壁１０３は後に接合して形成するために金型１０６にこの部位に相当する形状は形成する必要は無い。しかし、培養面側壁１０３の高さを補う目的で、培養面側壁１０３の下部に相当する形状を金型
１０６に形成することができる。また、培養面側壁１０３の形成にも金型を用い、その金型は鉄，ニッケルなどの金属から形成することが多いが、求められる加工精度や簡便性，可視性などの必要性に応じて有機樹脂やシリコンウエハ，ガラスなど無機物などから形成することも可能である。培養面側壁１０３を形成する金型の形成方法としてはその加工精度と金型の材質に応じて先に細胞培養容器１００の形成で用いる金型１０６の製造方法として示した手法の中から選択される。

本実施例における培養面側壁１０３の形成方法を図１５に示す。本実施例では厚さ２mmのニッケル板１１６に対して機械加工によって培養面側壁１０３に相当する一辺０.９０
cm，高さ１mmの凸形状を有する形状を加工した金型１１７を形成した。その後、金型表面にフッ素系の離型処理を施し、硬化前のＰＤＭＳを硬化剤と混合して金型１１７に高さ
０.７mm 分をキャストして１２０℃，１０分の熱処理を施してＰＤＭＳを硬化して金型から外し、培養面側壁１０３とした。このようにして形成したＰＤＭＳ製の培養面側壁103は細胞接着性が低いために細胞培養容器１００に好適である。また、ＰＤＭＳ製の培養面側壁１０３は培養面１０２との密着性が高いために、培養面１０２上の所定の位置に培養面側壁１０３を配して密着させることで培養に必要な密着性を得ることができる。また、培養面１０２の突起物１０１は先に示したように一辺１cm角の正方形の領域に形成されており、培養面側壁１０３は培養面１０２の端部０.０５cm を覆うように密着させることによって、培養面側壁１０３と突起物１０１の距離を突起物１０１の間隔である１μｍとすることができる。また、必要な細胞を培養した後に、培養液を取り除いて培養面側壁103を培養面１０２から引き離すことで容易に培養面側壁１０３を除くことができる。このため、観察時に障害となる培養面側壁１０３を取り外すことが可能であり、正立型の光学顕微鏡による高解像度観察や走査型電子顕微鏡による培養後の細胞の形状評価に好適である。

本実施例においても、第一の実施例と同様に培養面１０２の大きさ，深さ、及び１つの細胞培養容器１００上における培養面１０２の数は培養する細胞系や培養の用途によって最適の数値とすることができる。例えば細胞培養容器１００を多くの同一条件の培養細胞を得るための生産手段として用いる場合には培養面１０２を大きくすると好適であるが、試験的に多条件でアッセイとして培養する場合には培養面１０２は小さく、１つの細胞培養容器１００内に多くの培養面１０２を有するマイクロプレートのような形状を有していると、培養に用いる試薬や細胞数を少なく抑えることができ、好ましい。

以下、本発明の細胞培養容器１００に細胞培養に適した表面処理を施した例を説明する。実施例１の手法で突起物１０１を形成した細胞培養容器１００に対し、親水化処理として酸素プラズマ処理（１００Ｗ，３０ｓ）を施した。この細胞培養容器１００内部の突起物１０１の先端部に、５０μｇ／ｍＬのコラーゲンＩ溶液（Cultrex(登録商標) Bovine
CollagenＩ，溶媒：０.０２Ｍ 酢酸水溶液）を突起物１０１の高さよりも薄くコートさせた表面親水化ＰＤＭＳ製の平滑スタンプを密着させ、突起物１０１の先端部のみコラーゲンＩ溶液を付着させた。平滑スタンプを除いた後に室温にて１時間保持してＰＢＳ（リン酸緩衝液）で洗浄することで、突起物１０１の先端部のみにコラーゲンＩによる修飾を加え、細胞培養に適した表面処理を行った。

本実施例では突起物１０１の形成後にタンパクの一種であるコラーゲンによる修飾を行ったが、この手法に限らず、培養を行う細胞の種類、及び細胞培養容器１００、及び突起物１０１の材質に応じて酸素プラズマ処理（例えば１００Ｗ，３０ｓ），紫外線照射，過酸化水素水，オゾン水への浸漬などによる親水化処理，アミノ基，カルボキシル基，メチル基，ＣＦ₃ 基などに代表される官能基の導入，ポリリジン，アルブミン，コラーゲン，フィブロネクチン，フィブリノーゲン，ビトロネクチン，ラミニンなどのタンパク被覆など適宜異なる表面処理を施すこともできる。また、この表面処理を突起物１０１の一部にのみ施すことによって培養する細胞の形状を制御することができる。

以下、本発明の細胞培養容器１００を用いて細胞を培養し、細胞の剥離性が向上した例を示す。

図１６は実施例１の手法を用いて本実施例で作製した細胞培養容器１００の形状例である。図１７は細胞培養容器１００上に形成した突起物１０１の配列例を示している。本実施例では培養した細胞の剥離性と培養面１０２上の突起物１０１の形状の関係を調べるために、突起物１０１の直径Ｒを（ａ）１８０ｎｍ，（ｂ）２４０ｎｍ，（ｃ）５００ｎｍ，（ｄ）２μｍの４通りとした４つの培養面１０２を細胞培養容器１００に形成した。形成した突起物１０１の高さＨは４つの細胞培養容器１００において全て１μｍである。突起物１０１の配列は図１７に示すように２次元正方格子状であり、隣り合う突起物１０１の間隔Ｄは直径Ｒの２倍である。このような突起物１０１は培養面側壁１０３の近傍まで連続的に各培養面１０２上に形成されている。

剥離性の評価のために、それぞれの培養面１０２上でヒト間葉系幹細胞（CAMBREX社，
Cyro hMSC Ｎo.２０５１）を培地（ＣＡＭＢＲＥＸ社、ブレットキットＭＳＣＧＭ（間葉系幹細胞増殖用培地））中に播種し、３７℃・５％ＣＯ₂ 下のインキュータ内で５日間培養した。比較のために一般的に用いられる動物細胞培養用ディッシュ(Corning社) においても同様の条件でヒト間葉系幹細胞を培養した。

剥離性は、５日間培養後のそれぞれの培養面１０２上のヒト間葉系幹細胞を培地中に発生させた水流によって剥離することで評価した。水流は２５０μｌ用電動ピペット（EDP plus EP−２５０ ）に容量２００μｌのピペットチップを装着して、それぞれの培養面
１０２近傍から底面に対して７０度の角度で培養に用いている培地を吐出することによって発生させた。

顕微鏡観察下で、培地を１回吐出してそれぞれの培養面１０２上の細胞の剥がれを観察した結果を表１に示す。本発明で形成したいずれのそれぞれの培養面１０２においても、比較例として用いた動物細胞培養用ディッシュと比較してヒト間葉系幹細胞の剥離性が増すことが確認された。細胞培養容器１００からのヒト間葉系幹細胞の剥離性は突起物101の直径Ｒに依存し、直径が大きいＲ＝２μｍの時に剥離能は最も大きくなることが示された。このことから、接着性細胞であるヒト間葉系幹細胞の接着力は突起物１０１上では小さくなり、剥離性に優れることが示された。また、この効果はいずれの培養面１０２においても培養面１０２の全面に渡って観察され、突起物１０１の効果を受けずに培養面102に接着したヒト間葉系幹細胞が実質的に存在しないと見なすことができた。

本発明による細胞培養容器の一例の鳥瞰図を示す模式図。 本発明による細胞培養容器の一例の断面図を示す模式図。 本発明による細胞培養容器の別の一例の鳥瞰図を示す模式図。 本発明による細胞培養容器の別の一例の断面図を示す模式図。 本発明による細胞培養容器の第三の例の鳥瞰図を示す模式図。 本発明による細胞培養容器の第三の例の断面図を示す模式図。 本発明における細胞培養容器の製造工程を示す模式図。 本発明における別の細胞培養容器の製造工程を示す模式図。 本発明における第三の細胞培養容器の製造工程を示す模式図。 本発明における細胞培養容器の使用法を示す模式図。 培養面に突起物の無い領域のある細胞培養容器での細胞培養を示す模式図。 本発明における突起物の走査電子顕微鏡写真を示す模式図。 第１の実施例における金型の製造工程を示す模式図。 第２の実施例における培養面側壁の鳥瞰図を示す模式図。 第２の実施例における培養面側壁の製造工程を示す模式図。 第４の実施例における細胞培養容器の鳥瞰図を示す模式図。 第４の実施例における突起物の走査電子顕微鏡写真を示す模式図。

符号の説明

１００…細胞培養容器、１０１…突起物、１０２…培養面、１０３…培養面側壁、104…緩衝面、１０５…容器原料、１０６，１１７…金型、１０７…培養液、１０８…細胞、１０９…平坦部に付着した細胞、１１０…培養面下地、１１１…第一の金型原盤部品、
１１２…第二の金型原盤部品、１１３…金型原盤、１１４…レプリカ材料、１１５…金型レプリカ、１１６…ニッケル板。

Claims (27)

1. 培養する細胞よりも微小な相当直径の複数の突起物を有する培養面と、培養面を囲む培養面側壁の二つの部位を含む細胞培養容器であって、培養する細胞よりも微小な相当直径の突起物が培養面全体に形成されており、培養面側壁の培養面の境界線上にある任意の位置と最近接の突起物の距離が培養する細胞の直径よりも小さいことを特徴とする細胞培養容器。
2. 培養する細胞よりも微小な相当直径の複数の突起物を有する培養面と、培養面を囲む培養面側壁の二つの部位を含む細胞培養容器であって、さらに培養面側壁と培養面の間に培養面よりも低い位置にある緩衝面が形成されており、培養する細胞よりも微小な相当直径の突起物が培養面全体に形成されており、緩衝面側にある培養面端部の任意の位置と最近接の突起物の距離が培養する細胞の直径よりも小さいことを特徴とする細胞培養容器。
3. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、培養面が培養面側壁によって２つ以上に分離されていることを特徴とする細胞培養容器。
4. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、表面の突起物を含む培養面と培養面側壁が同一の材料から成り、一体であることを特徴とする細胞培養容器。
5. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、表面の突起物と培養面が同一の材料からなり、培養面側壁の少なくとも一部が培養面とは異なる材料から成ることを特徴とする細胞培養容器。
6. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、表面の突起物と培養面が同一の材料からなり、培養面側壁の少なくとも一部が培養面から取り外し可能であることを特徴とする細胞培養容器。
7. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、培養面側壁に培養する細胞よりも微小な相当直径の突起物が形成されていることを特徴とする細胞培養容器。
8. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、培養面側壁に表面構造の形成、若しくは細胞難接着性の表面修飾が成されることによって細胞が培養面に比較して培養面側壁に吸着し難いことを特徴とする細胞培養容器。
9. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、前記突起物の間隔が該細胞の直径よりも小さいことを特徴とする細胞培養容器。
10. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、表面の突起物の相当直径が１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、高さが１０ｎｍ以上１mm以下である突起物であることを特徴とする細胞培養容器。
11. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、培養面からの培養面側壁の高さが0.05mm以上１００mm以下であり、培養面に対する傾斜角度が４５度以上であることを特徴とする細胞培養容器。
12. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、細胞培養容器の厚みが０.５mm 以上である領域を含むことを特徴とする細胞培養容器。
13. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、細胞培養容器の全体、若しくはその一部に、親水処理，疎水化処理，金属層の形成、又は、有機物質の被覆のいずれか１つ以上の処理が施されていることを特徴とする細胞培養容器。
14. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、細胞培養容器内の特定の領域に選択的に親水処理，疎水化処理，金属層の形成、又は、有機物質の被覆のいずれかの１つ以上の処理が施されていることを特徴とする細胞培養容器。
15. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、細胞培養容器内の突起物を構成する個々の突起物に対して選択的に親水処理，疎水化処理，金属層の形成、又は有機物質の被覆のいずれか１つ以上の処理が施されていることを特徴とする細胞培養容器。
16. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器であって、細胞培養容器内の突起物を構成する突起群の先端部のみに親水処理，疎水化処理，金属層の形成、又は有機物質の被覆が施されていることを特徴とする細胞培養容器。
17. 培養する細胞よりも微小な相当直径の複数の突起物を有する培養面と、培養面を囲む培養面側壁の二つの部位を含む細胞培養容器の製造方法であって、
    培養面表面の複数の突起物を含む培養面と培養面側壁の形状に相当する形状を有する一つの金型を軟化した状態の容器原料に配し、突起物を含む培養面と培養面側壁の形状を容器原料に形成する工程と、
    金型を容器原料から外す工程と、
    を含むことを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
18. 培養する細胞よりも微小な相当直径の複数の突起物を有する培養面と、培養面を囲む培養面側壁の二つの部位を含む細胞培養容器の製造方法であって、
    培養面表面の複数の突起物を含む培養面に相当する形状を有する一つの金型を軟化した状態の容器原料に配し、突起物を含む培養面の形状を容器原料に形成する工程と、
    金型を容器原料から外す工程と、
    培養面側壁を容器原料に接合する工程と、
    を含むことを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
19. 請求項１７又は１８に記載の細胞培養容器の製造方法であって、金型が培養面を囲む培養面よりも低い位置にある緩衝面を規定する形状を有することを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
20. 請求項１７又は１８に記載の細胞培養容器の製造方法であって、さらに製造した細胞培養容器の一部を切断する工程が含まれていることを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
21. 請求項１７又は１８に記載の細胞培養容器の製造方法であって、さらに製造した細胞培養容器の培養面を外界から隔離する梱包工程が含まれていることを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
22. 請求項１７又は１８に記載の細胞培養容器の製造方法であって、さらに製造した細胞培養容器の培養面を、細胞培養容器を構成する材料のガラス転移点よりも低い温度において滅菌処理を施す工程が含まれていることを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
23. 請求項１又は２に記載の細胞培養容器で培養されたことを特徴とする培養細胞。
24. 細胞を培養するための細胞培養容器であって、培養する細胞よりも微小な相当直径の複数の突起物を有する培養面と、培養面を囲む培養面側壁の二つの部位を含み、該培養面は培養面側壁によって複数領域に分離されており、培養面からの培養面側壁の高さが0.05mm以上１００mm以下であり、細胞培養容器の少なくとも一部の厚みが０.５mm 以上であることを特徴とする細胞培養容器。
25. 細胞を培養するための細胞培養容器であって、培養する細胞よりも微小な相当直径の複数の突起物を有する培養面と、培養面を囲む培養面側壁と、培養面側壁と培養面の間に培養面よりも低い位置にある緩衝面を含み、該培養面は培養面側壁によって複数領域に分離されており、該緩衝面の幅が培養する細胞の直径よりも大きいことを特徴とする細胞培養容器。
26. 請求項２４又は２５に記載の細胞培養容器であって、培養面側壁の一部に細胞培養容器を切断するための切り込み部、又は、切り取り線が形成されていることを特徴とする細胞培養容器。
27. 請求項２４又は２５に記載の培養容器であって、培養面に形状された突起物の表面処理，高さ，先端部直径，相当直径，間隔あるいは配置の少なくとも一つの形状が分離された領域毎に異なることを特徴とする細胞培養容器。
    
    

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