JP3942183B2 - 培養容器 - Google Patents

Description

本発明は、実験や研究のために細胞や組織片などを被培養物として培養する際に好適に用いることができる培養容器に関する。

種々の目的から実験室等で広く使用されている実験研究用の培養容器としては、フラスコやペトリ皿のほか、マルチウェルプレートやローラーボトルなど、各種タイプのものがあり、その容器本体内に寒天や所要の液体を入れ、これらを培地として細胞や組織片や細菌などを含む各種の被培養物の培養ができるようになっている。

しかも、上記培養容器は、合成樹脂材により形成されているのが一般的であり、特に、透明な合成樹脂材であるポリスチレンは、安価であるばかりでなく、生体の細胞や組織片などの付着を容易化させる表面処理作業も円滑に行え、さらには顕微鏡観察に適する平面性の確保も容易であることから頻用されている。

一方、培養容器内の細胞や組織片などは、より高倍率のもとで顕微鏡観察する必要が生じたり、蛍光観察するに際しより高感度のもとで顕微鏡観察する必要が生じたりする場合がある。しかし、合成樹脂材からなる上記培養容器を用いてかかる要請に応えようとしても、平面性を確保しつつ、培養面（底部）の肉厚が１ｍｍ以下となるように樹脂成型することが技術的に難しいことから、肉厚が比較的厚くなって顕微鏡の焦点深度がとれなくなるばかりでなく、バッググラウンドとして材質に由来する蛍光（自己蛍光）が出て、所望する高倍率・高感度のもとで顕微鏡観察ができなくなってしまう不都合があった。

ところで、上記不都合を解消する技術としては、合成樹脂材と比較して平面性を確保しながらより薄い肉厚に成型できるほか、透過性が高く、低蛍光でもあるガラス材を用いる手法がある。具体的には、例えばスライドガラスやカバーガラス、カバースリップと称される板状ガラスを用い、該板状ガラスの表面上で細胞や組織片などを培養する手法である。

一方、容器本体の側壁部と、該容器本体の開口部に覆設される蓋部とを合成樹脂材で形成し、容器本体の底部のみがスライドガラスにより形成されているチャンバースライドと称される培養容器もある。

さらに、上記したポリスチレン製の培養容器、特にペトリ皿の底部に１個の透孔を設け、該透孔を下面側から塞いだ状態で接着したカバーガラスを配置してなるガラスベースディッシュやガラスボトムカルチャーディッシュと称されているガラス底面タイプの培養容器も市販されている。そして、このようなガラス底面タイプの培養容器を用いることにより、合成樹脂材からなる培養容器にみられ「所望する高倍率・高感度が得られない」という従来手法の不具合を解消することはできる。

また、培養容器内で培養した細胞や組織片などを顕微鏡で観察する際には、例えばマイクロインジェクションで特定の細胞に遺伝子や薬物を微量注入した後の形態変化を時間をおいて観察したり、細胞の走化性を観察したり、同一容器内で細胞の母集団を個別の亜集団に分けて観察するなど、個々の細胞の位置や一群としての細胞集団などの位置を特定した上で、繰り返して観察する必要のある場合がある。

このような繰返し観察の要請に対しては、位置の特定ができるようにし文字数字式座標を表示した合成樹脂製の培養容器（フラスコ）も既に提案されており（例えば、特許文献１参照）、該培養容器（フラスコ）を用いることにより培養状態のもとでの観察対象物の特定位置に対する顕微鏡による繰返し観察ができるようになっている。
特許第２６８３７３２号公報

しかし、文字数字式座標を表示した上記培養容器を用いる場合には、材質が合成樹脂材であるが故に焦点深度がとれず高倍率で観察できないほか、自己蛍光の問題も依然として残されており、さらには、成型技術上の問題もあって個々の細胞の位置を特定できる程度に微細化された文字数字式座標を表示できない不都合もあった。

一方、円形カバーガラスのなかには、グリッドと称されている微細化された座標が刻入されたものもすでに市販されている。これは、該円形カバーガラスの素材がガラスであるが故に、合成樹脂材の場合における既述の欠点を解消できるばかりではなく、レーザーやエッチングなどの精緻な加工技術を適用して微細なグリッドを容易に形成できることに由来する。

しかし、該円形カバーガラスは、あくまでも液体培地を入れた合成樹脂製の培養容器内に別体として浸しながらその表面で細胞などを培養するために用いられるものである。したがって、該円形カバーガラス上の細胞などを顕微鏡で観察する際には、合成樹脂製の培養容器内の液体培地中に浸した状態のもとで一応の観察はできるものの、合成樹脂材という材質に由来する既述の欠点は依然として解消できていない。また、より高倍率、高感度で観察する必要がある場合には、円形カバーガラスを培養容器内から取り出し、スライドガラス上に定置させた上で顕微鏡による観察を行う必要があるので、作業的に煩雑であるばかりでなく、液体培地から外へ取り出すことにより、生きたままの培養状態で顕微鏡観察ができなくなってしまうという問題もあった。

本発明は従来技術にみられた上記課題に鑑み、細胞や組織片などを被培養物として培養する際、該被培養物の所定部位を容易に位置特定できるばかりでなく、生きたままの培養状態を高倍率・高感度のもとで顕微鏡観察ができるようにした培養容器を提供することにその目的がある。

本発明は上記目的を達成すべくなされたものであり、その構成上の特徴は、細胞や組織片などからなる被培養物の収容を自在に形成された容器本体と、該容器本体への施蓋を自在に形成された蓋体とからなる培養容器において、前記容器本体は、１枚の透明なガラス板に個々の区画部として確保される板状ガラス部を前記被培養物を付着させるための底部とし、これらの各底部上に囲繞隔壁を各別に立設して仕切られた複数個の隔室を有して形成され、個々の前記隔室が位置する前記板状ガラス部の表裏いずれかの面には、付着された前記被培養物の所定の位置の特定を可能にすべく形成された複数本の緯線と経線とからなるグリッド座標をレーザーまたはエッチングによって設けたことにある。

この場合、前記板状ガラス部は、その肉厚が薄すぎると壊れやすく、厚過ぎると顕微鏡観察において焦点深度がとれないことから、０．０４〜１．５０ｍｍの肉厚とするのが好ましく、また、該板状ガラス部の表面には、細胞や組織片などを培養する際の付着性を高めるために、細胞外基質もしくはポリカチオン類を塗布しておくのが望ましい。

本発明によれば、容器本体の板状ガラス部に付着させて培養している細胞や組織片などの被培養物を、より高倍率、高感度のもとで顕微鏡観察する必要が生じた場合であっても、顕微鏡の焦点深度をとることができ、さらには透過率が高く、かつ、低蛍光な特性をも得ることができるので、十分に対応させることができる。

また、板状ガラス部には、複数本の緯線と経線とからなるグリッド座標が設けられているので、培養中の細胞や組織片などの被培養物に対し繰返し観察の必要が生じても、個々の細胞の位置や一群としての細胞集団などの位置を特定した上で、その都度、正確に顕微鏡観察をすることができ、実験・研究精度の向上に大きく寄与させることができる。しかも、細胞や組織片などの被培養物は、煩雑な準備作業を要することなく、生きたままの培養状態のもとで顕微鏡観察ができる。

さらに、板状ガラス部に細胞外基質やポリカチオン類が塗布されている場合には、培養面への細胞や組織片などの被培養物の付着性を高めることができる。

図１は、本発明に係る培養容器の一例を開蓋状態のもとで示す平面図であり、図２は、図１におけるＡ−Ａ線矢視方向での縦断面図である。

これら両図によれば、培養容器１１は、その底部２５に細胞や組織片などからなる適宜の被培養物（図示せず）を付着させるための透明な板状ガラス部２７を有してなる容器本体２２と、該容器本体２２への施蓋を自在に形成された図示しない蓋体とで構成されている。

このうち、容器本体２２は、１枚の透明なガラス板２８からなる底部２５上にポリスチレンなどの合成樹脂材からなる囲繞隔壁２４を立設して仕切られた複数個の隔室２３を有して形成されている。

この場合、板状ガラス部２７は、少なくとも各隔室２４の別に底部２５側に位置しているガラス板２８の個々の区画部２９により形成されることになる。なお、図中の符号３０は、隣り合う囲繞隔壁２４，２４相互間に介在させた補強リブを示す。

また、板状ガラス部２７の表面には、付着された細胞などの被培養物の所定部位の位置の特定を可能にすべく、レーザーやエッチングで刻入するなど、適宜の手法により形成された複数本の微細な緯線１９ａと経線１９ｂとからなるグリッド座標１９が設けられている。なお、グリッド座標１９は、必要により板状ガラス部２７の裏面に形成することもできる。

図３と図４とは、板状ガラス部２７の表面に設けられているグリッド座標１９を拡大してパターン別に例示したものである。このうち、図３は、例えば一群の細胞集団である母集団を個別の亜集団に分けて観察する際に好適な緯線１９ａと経線１９ｂと刻入してなるグリッド座標１９のパターン例を示す。また、図４は、例えば個々の細胞の位置や細胞群の位置を特定しようとする際に好適な緯線１９ａと経線１９ｂと刻入してなるグリッド座標１９のパターン例を示す。なお、上記したグリッド座標１９のパターン例は、あくまでも代表例であり、被培養物の所定部位の位置の特定ができるものであれば、上記パターン例以外にも研究目的等との関係で定まる各種の配置様式のものを所望に応じ適宜採用することができる。

なお、本発明における透明な板状ガラス部２７は、薄すぎると壊れやすく加工上問題があり、厚過ぎると、顕微鏡観察において焦点深度がとれず、ガラスの利点がなくなってしまうため、肉厚が０．０４〜１．５０ｍｍのものを採用するのが望ましい。また、より高倍率、高感度での顕微鏡観察を可能とする観点からは、より透過率が高く、かつ、より低蛍光な特性を示す板状ガラス部を用いるのが望ましい。

さらに、細胞や組織片などの被培養物を培養する際、培養面への被培養物の付着性を高める観点からは、例えばコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン等の細胞外基質や、例えばポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリオルチニン等のポリカチオン類を板状ガラス部の表面に事前に塗布しておくのが好ましい。

次に、本発明に係る培養容器１１の作用を図１と図２とに示した例に基づき説明すれば、開蓋状態にある容器本体２２の板状ガラス部２７の表面に細胞や組織片などの被培養物を付着した後、図示しない蓋体を施蓋して適宜の培養環境のもとにおくことにより、被培養物を培養することができる。

しかも、培養容器１１内の細胞や組織片などの被培養物をより高倍率のもとで顕微鏡観察する必要が生じたり、蛍光観察するに際しより高感度のもとで顕微鏡観察する必要が生じた場合であっても、板状ガラス部２７自体の肉厚が０．０４〜１．５０ｍｍであれば顕微鏡の焦点深度がとれるばかりでなく、透過率が高く、かつ、低蛍光な特性を得ることができるので、十分に対応させることができる。

また、板状ガラス部２７の表面もしくは裏面には、複数本の緯線１９ａと経線１９ｂとからなるグリッド座標１９が設けられているので、例えばマイクロインジェクションで特定の細胞に遺伝子や薬物を微量注入した後の形態変化を時間をおいて観察したり、細胞の走化性を観察したり、同一容器内で細胞の母集団を個別の亜集団に分けて観察するというような繰返し観察の必要が生じても、個々の細胞の位置や一群としての細胞集団などの位置を特定した上で、その都度、正確に顕微鏡観察をすることができる。しかも、細胞や組織片などの被培養物は、培地から外へ取り出すなどというような煩雑な準備作業を要することなく、生きたままの培養状態のもとで顕微鏡観察ができる。なお、グリッド座標１９が板状ガラス部２７の裏面に設けられている場合には、例えば顕微鏡写真撮影を行う際などに、事前にグリッド座標１９の位置を確認した後、グリッド座標１９が見えない状態で撮影できることになる。

さらに、本発明によれば、同一の培養容器１１内の複数箇所の隔室２３内にて細胞や組織片などの被培養物を培養できるほか、容器本体２２におけるガラス板２８の個々の区画部２９からなる各板状ガラス部２７を底部２５とし、各底部２５を被培養物を付着させるための独立領域として利用することができるので、同じ環境のもとで高倍率、高感な顕微鏡観察を繰り返して行うことができる。

本発明の一例につき容器本体の側のみを示す平面図。 図１におけるＡ−Ａ線矢視方向での縦断面図。 グリッド座標の一例を拡大して示す平面図。 グリッド座標の他例を拡大して示す平面図。

符号の説明

１１ 培養容器
１９ グリッド座標
１９ａ 緯線
１９ｂ 経線
２２ 容器本体
２３ 隔室
２４ 囲繞隔壁
２５ 底部
２７ 板状ガラス部
２８ ガラス板
２９ 区画部
３０ 補強リブ

Claims (3)

1. 細胞や組織片などからなる被培養物の収容を自在に形成された容器本体と、該容器本体への施蓋を自在に形成された蓋体とからなる培養容器において、
   前記容器本体は、１枚の透明なガラス板に個々の区画部として確保される板状ガラス部を前記被培養物を付着させるための底部とし、これらの各底部上に囲繞隔壁を各別に立設して仕切られた複数個の隔室を有して形成され、
   個々の前記隔室が位置する前記板状ガラス部の表裏いずれかの面には、付着された前記被培養物の所定の位置の特定を可能にすべく形成された複数本の緯線と経線とからなるグリッド座標をレーザーまたはエッチングによって設けたことを特徴とする培養容器。
2. 前記板状ガラス部は、その肉厚が０．０４〜１．５０ｍｍであることを特徴とする請求項１に記載の培養容器。
3. 前記板状ガラス部の表面には、細胞外基質もしくはポリカチオン類が塗布されていることを特徴とする請求項１または２に記載の培養容器。

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