JP5932206B2 - 細胞培養方法及びスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
11 マイクロ容器
12 マイクロ容器の側壁
13 スポット
14 スポットの側壁
実施の形態に係る細胞培養に用いる細胞培養部のマイクロ容器の構成について図1、2を用いて説明する。図1は、本実施の形態に係るマイクロ容器の構成を示す平面図であり、図2は図1のII−II断面図である。図1に示すように、細胞培養部10はマイクロ容器11、側壁12を備える。細胞培養部10の培養面には、複数の側壁12が網目状に形成されており、この側壁12に四方を囲われた空間がマイクロ容器11となる。
また、重層化する細胞が神経細胞又は心筋細胞である場合、遺伝子発現量、酵素活性活動電位などを測定してスクリーニングするのが好ましい。
重層化する細胞が血管内皮細胞である場合、血管新生を視認してスクリーニングするのが好ましい。
<胎児肝細胞の培養方法>
ヒト胎児肝細胞の凍結ストックをタイプIVコラーゲンコートディッシュ(BD製)上に播種し、10日間程度培養し、増殖させた。その後、0.03%タイプIVコラーゲン(新田ゼラチン製)コートした凹凸パターン基材上に、1個のマイクロ容器に5細胞入る割合(3.8×104細胞/cm2)で肝細胞を播種し、5%CO2、37℃で3週間培養した。使用した培養液の組成は、DMEM/F12培地に10% ウシ胎児血清、1μg/ml インシュリン、1×10−7M デキサメタゾン、10mM ニコチンアミド、2mM L−グルタミン、50μm β−メルカプトエタノール、5mM HEPES、59μg/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシンを添加したものであり、播種後1日目から、上記培養液に更に25ng/ml HGF、20ng/ml EGF、10ng/ml オンコスタチンMを添加して使用した。同組成の新鮮培地0.5mLを用い、数日毎に培地交換を行った。
肝臓の表的な薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)の遺伝子発現は、所定日数培養した細胞からRNAを回収し、cDNA合成後、リアルタイムPCRを行うことで評価した。
図1に示す凹凸パターン形状であって、a=100μm、b=10μm、c=50μmのパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ni電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上にパターン転写を行い、前記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を100nm形成させ、γ線滅菌を行い、凹凸パターン基材を得た。その凹凸基材上にIV型コラーゲンをコーティング後、ヒト胎児肝細胞を培養した。
市販(ベクトン・ディッキンソン製、ファルコン(登録商標))のγ線滅菌済み平面状24ウェル培養プレートを用い、IV型コラーゲンをコーティング後、ヒト胎児肝細胞を培養した。
Claims (8)
- 区画された微小空間内において、肝実質細胞へ分化する増殖能を有する未分化細胞を重層化した状態で培養し、分化細胞を得る細胞培養方法であって、
前記未分化細胞は肝幹細胞及び肝前駆細胞のうちの少なくとも1つであり、
前記区画された微小空間が、表面にマイクロ容器を有する細胞培養容器における当該マイクロ容器であり、
前記マイクロ容器の底面積が9×10 −4 mm 2 〜9×10 −2 mm 2 、側壁の高さが15μm〜300μmであり、
前記マイクロ容器の底面に孔が開いていないことを特徴とする、
細胞培養方法。 - 前記未分化細胞が胎児肝組織から得られる未分化細胞であることを特徴とする請求項1に記載の細胞培養方法。
- 前記未分化細胞がヒト細胞であることを特徴とする請求項1又は2に記載の細胞培養方法。
- 前記細胞培養容器は前記表面に複数の前記マイクロ容器を有することを特徴とする請求項1〜3いずれか1項に記載の細胞培養方法。
- 前記マイクロ容器の側壁の高さが15μm〜150μm、側壁の幅が3μm〜15μmであることを特徴とする請求項4に記載の細胞培養方法。
- 前記細胞培養容器における前記マイクロ容器が形成された領域が透明性を有することを特徴とする請求項4又は5に記載の細胞培養方法。
- 請求項1〜6いずれか1項に記載の培養方法で培養した細胞を複数配置し、化合物をスクリーニングするスクリーニング方法。
- 請求項4〜6いずれか1項に記載の培養方法で培養した細胞を複数配置し、化合物をスクリーニングするスクリーニング方法であって、
前記細胞培養容器が、複数の前記マイクロ容器からなる区画化されたスポットを複数有することを特徴とするスクリーニング方法。
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