JP2006191809A - 伸展方向が制御された細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、薬物などの効果判定や、その毒性を試験する場合に、培養細胞を用いて行うバイオアッセイ法、および治療を目的とした細胞培養に関して、伸展方向が制御された細胞の培養方法ならびに細胞培養プレートを提供することを目的とする。
【解決手段】本発明における細胞培養プレートは、側壁１を複数個有し、それらの側壁１によって形成された培養細胞を配置するための空間構造３を複数有し、さらに側壁１に開口部２を設けることにより、複数の空間構造３が連通した構造を有しており、該細胞培養プレートを用いることで、伸展方向が制御された細胞の培養方法が提供される。
【選択図】図１

Description

本発明は、薬物などの効果判定や、その毒性を試験する場合に、培養細胞を用いて行うバイオアッセイ法、および治療を目的とした細胞の培養方法に関するものである。

組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索および薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。
単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くは細胞培養の方法により培養皿や試験管のなかで培養が行われている。この培養系のなかで種々の検査が行われる。

これらのアッセイは、通常均一な培養系を設定し、評価する薬物等の量、濃度などを変えてその効果を見るものである。そのため培養に用いる培養器も一定の均一に形成された物が用いられる。この培養器は、培養皿というものが一般的に用いられる。
培養皿として一般的に用いられているものには、シャーレ、または６ウェルプレート、１２ウェル、４８ウェル、９６ウェルの各プレートがある（特許文献１参照）。また、最近の微量化への流れから、更に小口径で多数の培養皿からなる３８４ウェルプレートも使用され始めている。

しかしながら、組織細胞の培養は、市販されている細胞培養皿で行うと、細胞が薄く伸びて方向性のない形態を取り、生体内で持っていた機能を示さなくなってしまう問題を有していた。
細胞の活性を確認する方法として、老廃物の排出によるＰＨの変化や、炭酸ガスの放出を電気化学センサ等で測定が可能である。生体組織の測定データと、培養皿で培養した細胞の測定データを比較することが試みられているが、生体組織のデータを再現する値が、培養皿では再現できていないのが現状である。理由として、１個のウェルプレートは容器形状であるが、数ミクロンから数１０ミクロンのサイズである細胞にとっては、平板上での培養と変わらないことが考えられる。特に、培養が難しい、例えば肝細胞等の組織細胞の増殖では、生体内で持っていた機能をさせることが更に困難となる。

係る問題を解決する方法として、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微細な容器パターンを形成し、その微細な容器パターン内で細胞を培養させることが試みられている（特許文献２参照）。細胞を微細容器パターン内で培養し、立体的に細胞を増殖させることで、生体内で持っていた機能を発現しようとするものである。

しかしながら、この方法は、一部のバイオアッセイ法、または一部の治療を目的とした細胞培養にしか適用できないことが現状である。例えば、生体の心臓における心筋細胞は、脳からの電気シグナルの伝達によって、拍動している。生体の心筋細胞は、その拍動機能を行うために、方向性を持った配列で構成されている。したがって、バイオテクノロジー分野のなかで、人工臓器の組織再生に関する研究では、生体組織と同様、伸展方向が制御された細胞培養が必要とされるのに対し、現状の培養皿上での培養は、立体的な培養が困難であることに加え、伸展方向が制御できないため、研究試験の目的においても適用できない問題を有している。

また、治療を目的とした心筋培養の一つに、心筋梗塞により壊死した心筋組織の一部に、培養された心筋組織を移植することで、救命するための研究が行われている。心臓は、脳からの電気シグナルによって、心臓全体が大きく拍動している。心筋梗塞により、一部の心筋組織が壊死すると、心筋内での信号伝達が遮断されるため、心臓は細動といわれる小さな収縮を繰り返すことになる。この結果、心臓内への血液の滞留によって、血栓が生じ、脳組織に運ばれた場合は、脳梗塞といった２次的な症例を引き起こすことになる。細動が長期に至れば、死に至る可能性もある。この治療においては、人工臓器そのものを完成することが目的でなく、一部の組織の代替であるために、早期に実現することが望まれている。

しかしながら、現状の培養皿上での培養は、立体的な培養が困難であることに加え、伸展方向が制御できないため、この目的においても適用できない問題を有している。

特開平１１−１６９１６６ 特開平８−３２２５９３

薬物などの効果判定や、その毒性を試験する場合に、培養細胞を用いて行うバイオアッセイ法、および治療を目的とした細胞培養において、市販されている細胞培養皿では、細胞が薄く伸びて方向性のない形態を取り、生体内で持っていた機能を示さなくなってしまう問題を有していた。また、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微細な容器パターンを形成し、その微細な容器パターン内で細胞を培養させる試みにおいても、伸展方向が制御できないため、治療を目的とした心筋細胞の培養に関する研究においても適用できない問題点があった。

本発明は、このような問題点を解決するためになされたもので、培養細胞の伸展方向が制御された細胞の培養方法および該細胞の培養方法に用いる細胞培養プレートを提供することを目的とする。

上記の課題を解決する本発明は、側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を配置するための複数の空間構造を有し、さらに、側壁に開口部を設けることにより、複数の空間構造が連結した連結構造を有する細胞培養プレートを用いて、細胞培養における擬似足場となる接着斑を側壁面に形成させ、空間構造内で培養された細胞は対向する側壁に伸展し、それぞれの空間構造で培養された細胞が開口部によって結合することにより、培養細胞の伸展方向が制御されることを特徴とする細胞の培養方法である。

また、前記細胞培養プレートにおける側壁が、高さが３μｍ〜１０００μｍ、厚さが３μｍ〜１０００μｍ、幅が３μｍ〜３０００μｍである細胞の培養方法である。また、前記細胞培養プレートが、培養液を灌流する流路を有しており、さらに、該流路の幅が１μｍ〜１０００μｍ、深さが１μｍ〜１０００μｍである細胞の培養方法である。

また、前記細胞培養プレートが、細胞の配置される空間構造内に、高さまたは深さが０．００１μｍ〜５０μｍの微細凹凸パターンを有する細胞の培養方法である。

また、別の本発明は、複数個の凹、または凸パターンを有し、それら凹、または凸パターンを設けることにより、凹パターンの上部、または凸パターンの底部に連通する面を有する細胞培養プレートを用いて、細胞培養における擬似足場となる接着斑を連通する面、または凹凸パターンの側壁面に形成させ、細胞は伸展可能な連通する面に増殖することで培養細胞の伸展方向が制御されることを特徴とする細胞の培養方法である。

一方、本発明は、側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を配置するための複数の空間構造を有し、さらに、側壁に開口部を設けることにより、複数の空間構造が連結した連結構造を有する細胞培養プレートおよび複数個の凹、または凸パターンを有し、それら凹、または凸パターンを設けることにより、凹パターンの上部、または凸パターンの底部に連通する面を有する細胞培養プレートである。

さらに、別の本発明の上記細胞培養プレートは細胞固定化のための表面処理が施されている。また、本発明の上記細胞培養プレートは樹脂成形品よりなり、さらに、別の本発明の上記細胞培養プレートは前記樹脂成形品が水溶性樹脂成形品である。

また、別の本発明は、上記細胞培養プレートを複数枚積層させた構造である細胞培養多層プレートである

本発明は、薬物などの効果判定や、その毒性を試験する場合に、培養細胞を用いて行うバイオアッセイ法、および治療を目的とした細胞培養において、培養細胞の伸展方向が制御される細胞の培養方法に関する。

例えば、本発明方法を、心筋梗塞により、一部の心筋組織が壊死した結果、心筋内での信号伝達が遮断され、心臓が細動を引き起こす症例に適用した場合、心筋細胞の伸展方向が制御された組織を移植することにより、心筋の信号伝達が回復し、正常な心臓の拍動を再現することが可能となる。
以下、本発明を詳細に説明する。

以下、本発明を詳細に説明する。

組織細胞の培養を市販されている細胞培養皿（シャーレ、またはウェルプレート）上で行うと、培養細胞は薄く伸びて方向性のない形態を取る。研究者は、細胞の活性を確認する方法として、老廃物の排出によるＰＨの変化や、炭酸ガスの放出を電気化学センサ等によって、生体組織の測定データと、培養皿で培養した細胞の測定データとを比較することを試みているが、生体組織のデータを示す値が、培養皿では再現できていないのが現状である。したがって、市販されている細胞培養皿上での培養では、生体内では持っていた機能を培養細胞が示していないと判断されている。そこで、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微細な容器パターンを形成し、その微細な容器パターン内で細胞を培養し、立体的に細胞を増殖させることで、生体内で持っていた機能を発現せしめるための研究が開始されたところである。

しかしながら、微細な容器パターンを有する培養皿上で培養した細胞からなる組織を、実際に治療に適用しようと考えた場合、培養細胞からなる組織の構造が生体と同じ配列構造を示していないため、細胞の立体的な培養が可能になっても治療用途に適用するには大きな障害が存在しているのが現状である。例えば、心筋梗塞により一部の心筋組織が壊死した結果、心筋内での信号伝達が遮断され、心臓が細動を引き起こす症例に適用する場合、心筋細胞の伸展方向が制御された組織を移植するのでなければ、心筋の信号伝達を回復させ、正常な心臓の拍動を再生させることができない。

本発明に係る細胞の培養方法によると、側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を配置するための複数の空間構造を有し、さらに、側壁に開口部を設けることで、複数の空間構造が連通した連結構造を有する細胞培養プレートを用いることにより、立体的な増殖が可能であることに加え、培養細胞の伸展方向が制御でき、かつ個々の空間構造で培養した細胞が連結することにより、生体組織と同様な組織を、所望の面積、厚さで得ることが可能となる。すなわち、医師、医工学の研究者、患者の望む培養組織を実現できる。
側壁を複数有することで、複数の空間構造を作製し、要求される用途に応じて空間構造のエリアサイズを設定する。要求される複数の空間構造の集合サイズは、縦・横０．５ｍｍ〜３０ｍｍ、少なくとも１ｍｍ〜２０ｃｍのサイズで、適用可能である。

細胞培養において、擬似足場となる接着斑は、側壁面に形成される。そして、細胞は空間構造内の中央で立体的に増殖し、骨格構造を形成する。対向する側壁にも伸展した細胞の接着斑は、開口部によって、それぞれの空間構造で培養された細胞の接着斑どうしが結合し、伸展方向が制御された培養組織を製造することが可能となる。
培養する細胞種に応じ、側壁、空間構造、開口部の寸法を設定することにより、多様な培養系において伸展方向の制御が可能になると推測される。開口部とは、側壁によって形成された空間構造どうしが、連結するための構造を開口部とする。例えば、側壁どうしの隙間、側壁の凹み構造、側壁の内部に形成されたトンネル構造等も開口部として細胞の接着斑どうしを結合するのに有効である。

細胞培養プレートにおける側壁、および側壁によって形成される空間構造の寸法は、細胞を培養する目的において最適な範囲であることが必要である。側壁によって形成される空間構造が、大きすぎると、細胞は平板上での培養と同様、薄く伸びて立体的な構造を示さず、その伸展方向を制御することはできない。空間構造が小さすぎると、その空間構造に細胞が入ることができなくなる。したがって、空間構造の寸法は、培養する細胞種に応じて、単一、または複数個が収納できる範囲とすることが望ましい。

好ましい側壁の高さは、３μｍ〜１０００μｍの範囲であることが好ましく、５μｍ〜５００μｍであることがより好ましい。厚さは、３μｍ〜１０００μｍの範囲であることが好ましく、５μｍ〜５００μｍであることがより好ましい。幅は、３μｍ〜３０００μｍであることが好ましく、５μｍ〜１０００μｍであることがより好ましい。

培養液を流すための流路について説明する。培養液を流すために設けられる流路の目的の一つは、常に新鮮な培養液を細胞に供給することによって、細胞が排出した老廃物による培養液の鮮度が低下し、ひいては細胞が生体内で持っていた機能を示さなくなることを防止するものである。

さらに、培養液を流すための流路によって、培養プレートにおいて、培養細胞の伸展方向を制御することが可能になると期待される。培養液は、その流れ方向において、流速、培養液がながれる空間などを設定することで培養細胞にずり応力を発生し、このずり応力によって培養細胞の伸展方向を制御することが可能となると考えられる。

また、培養液を流すための流路は、培養した細胞の産生物を回収したり他系列の培地に供給したりするために、役割を果たすことも可能である。流路または流路の末端に取り付けられた微小な流体コネクタによって、その産生物を回収して創薬開発に利用したり、他の培養プレートに供給することでより生体組織に近いモデルを実現したりすることも可能となる。流路の形状は、培養液を供給可能であればどのような形状も可能である。例えば、細胞培養プレートの複数の空間構造を有する面と、基板を密着させた際、その空間構造を有する面の全体と基板との隙間を流路とし、培養液を流してもよい。

流路の幅、または深さを微細化すれば高密度な細胞培養プレートを得ることが可能となるが、培養液の十分な供給量を確保できることを考慮し適宜選択することが望ましい。流路の幅、または深さは、培養液を供給可能とし、効率のよい集積化された細胞培養プレートを実現する観点から、実質的に１μｍから１０００μｍが好ましく、３μｍから５００μｍが更に好ましい。前記流路は複数の空間構造からなる複数の集合ブロック相互の間に設けることができる。

細胞を培養するための空間構造において、側壁の壁部または空間構造の底部などの空間構造内に細胞の増殖を促進するための微細な凹凸パターンを有してもよい。前記微細な凹凸パターンを有することで、細胞の固定化に必要な擬似足場と呼ばれる接着斑が形成しやすくなり、細胞の分化、増殖を促進することが可能となる。前記微細な凹凸パターンの高さまたは深さは、０．００１μｍから５０μｍの範囲が好ましく、０．００５μｍから２５μｍが更に好ましい。また、前記微細な凹凸パターンの縦または横の寸法は、０．００１μｍから５０μｍの範囲が好ましく、０．００５μｍから２５μｍが更に好ましい。

高さが１μｍ以下の凹凸パターンを形成する方法としては、例えば、サンドブラスト処理があげられ、更に小さな凹凸パターンを形成する場合には、Ａｒプラズマによるエッチング処理等があげられる。

高さが１μｍ以上の凹凸パターンを形成する方法としては、例えば、シリコン材料、ガラス材料へのドライエッチング、ウェットエッチング等が想定できる。樹脂材料への成形方法として、例えば、押し出し成形、射出成形、ホットエンボス成形、ナノインプリント成形、ブロー成形、カレンダー成形、キャスト成形、プレス成形等が採用可能である。

複数個の凹または凸パターンを有し、さらに、凹パターンの上部または凸パターンの底部に連通する面を有する細胞培養プレートを用いて、培養細胞の伸展方向を制御することが期待される。

複数個の凹パターンを有する細胞培養プレートを用いて細胞培養を行うと、凹パターンにおいて、連通する上部のみに培養することが可能となる。凹パターンの底部の面積が広いと、底部にも培養した細胞が伸展することとなるため、凹パターン底部の縦、横寸法の両方、または、片方を１μｍから５００μｍの範囲とすることが好ましい。凹パターン底部の縦寸法のみを１μｍから５００μｍの範囲とし、横寸法は、例えば、神経細胞や血管内皮細胞の培養において、１ｍｍ、１０ｍｍ、５０ｍｍと設定することにより、目的に応じた培養細胞の長さを実現することが可能となる。

複数個の凸パターンを有する細胞培養プレートを用いて細胞培養を行うと、凸パターンにおいて、連通する底部のみに培養することが期待される。凸パターンの上部の面積が広いと、上部にも培養した細胞が伸展することとなるため、凸パターン上部の縦、横寸法の両方、または、片方を１μｍから５００μｍの範囲とすることが好ましい。凸パターン上部の縦寸法のみを１μｍから５００μｍの範囲とし、横寸法は、例えば、神経細胞や血管内皮細胞の培養において、１ｍｍ、１０ｍｍ、５０ｍｍと設定することにより、目的に応じた培養細胞の長さを実現することが可能となる。

凹または凸パターンの深さ、または高さは、細胞が凹凸を認識するために必要であり、１μｍ〜５００μｍの範囲とすることが好ましい。
細胞培養における擬似足場となる接着斑は、連通する面または凹凸パターンの側壁面に形成され、細胞が伸展可能な連通する面に増殖することによって伸展方向が制御されうる。

微細加工を施した細胞培養プレートは、気泡を排除し、細胞を固定化するために、表面処理を施すことが好ましい。気泡を排除し、基板表面に培養液を接触させるためには、基板表面を親水化することが効果的である。基板表面を親水化するための表面処理の方法は、種々の方法が適用できる。例えば、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射などを用いる方法、親水性の高分子材料を水溶液に溶解させコートする方法、蒸着重合、プラズマ重合などがあげられる。また、コートした高分子材料の培養液中への耐溶解性を高める方法としては、基板表面の官能基にコート材料をグラフトさせる方法が知られている。

細胞を固定化するには、基板表面の疎水化、不活性金属の成膜、をまたは細胞の付着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法が挙げられる。疎水化の方法として、例えば、スパッタリング、蒸着などによる疎水性金属の成膜、蒸着重合、プラズマによる高分子材料の成膜などがあげられる。不活性金属の成膜には、例えば、金を蒸着、またはスパッタリングする方法などがあげられる。また、表面処理の際、一部分を被覆しておき、任意の部分を改質することも可能である。

培養プレートに使用される材質は、表面処理の効率から、プラスチック素材が好適である。また、細胞の成長過程を観察していく場合、例えば蛍光顕微鏡を用いて観察するときには透過光観察が可能な透明材料が好ましい。樹脂材料としては特に限定されないが、例えば、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂（ＭＳ樹脂）、ポリカーボネート系樹脂、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、スチレン系エラストマーなどの熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン樹脂、酢酸ビニル系樹脂（商品名：エクセバール）、ポリビニルブチラール系樹脂等を挙げることができる。

成形方法は、金属構造体を型として、樹脂成形品を形成する方法が好適である。樹脂成形品の形成方法は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。所定の寸法を選択した金属構造体を型として射出成形で樹脂成形品を形成する場合、金属構造体の形状を高い転写率で樹脂成形品に再現することが可能である。転写率を確認する方法としては、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）等を使用して行うことができる。

これらの樹脂は必要に応じて滑剤、光安定剤、熱安定剤、防曇剤、顔料、難燃剤、帯電防止剤、離型剤、ブロッキング防止剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤などの１種または２種以上を含有することができる。

細胞培養後、培養された細胞組織を細胞培養プレートから剥離して単独で得ることにより、培養細胞の展開用途を飛躍的に拡大することが可能となる。培養した細胞が基板に固定化されていると、展開用途としては毒性などの判定を行うアッセイなど、研究試験目的に限られることとなる。メディカル用途、なかでも治療目的に展開するには、細胞培養プレートを、例えば人工透析モジュールなどの代替に用いるまでが限界となり、心筋の壊死した組織を移植によって回復させるなどの治療目的には展開することはできない。また、培養した組織を剥離する際、細胞を傷つけてしまっては、移植に用いることはできなくなる。

培養された細胞を傷つけることなく剥離するには、細胞培養プレートを水溶性樹脂成形品とすることで可能となる。水溶性樹脂で細胞培養プレートを製造した後、例えば、表面に細胞の付着を促すタンパク質であるコラーゲンなど塗布する。細胞は、コラーゲンのコートにより、接着性を満足し、増殖を行う。細胞を培養した後、そのまま培養液中に基板を浸すことで、培養細胞のみを取り出すことが可能となる。例えば、細胞培養後、組織を素早く回収するには、培養液温度を高めることで、水溶性樹脂の溶解性を高め、スピーディーに培養組織を回収することが可能となる。水溶性樹脂としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン系樹脂、酢酸ビニル系樹脂（商品名：エクセバール）、ポリビニルブチラール系樹脂等あげることができる。

複数の細胞培養プレートを積層させることで、複数の細胞培養を同時に行うことができ、バイオアッセイに好適な培養プレートを効率よく提供することが可能となる。
複数の細胞培養プレートを積層させることで、例えば、人工透析モジュールの代替機能を発現することが可能となる。複数の細胞培養プレートを積層させ細胞培養多層プレートとすることで、透析機能を高め、実際の生体組織を使用することで、老廃物の除去効率が高まり、患者の延命が可能になることが期待されている。

肝臓細胞を対象とした場合も、複数のプレートの層別にクッパー細胞、表皮細胞などの培養を集積して行うことにより、人工肝臓モジュールとして用いた治療や、アルブミンなどの産生物を利用した創薬利用が期待される。

また、培養プレートをメディカル用途、なかでも治療目的に展開した場合、複数の細胞培養プレートを積層させることで、例えば、心筋梗塞によって一部の組織が壊死し、正常な拍動が得られず細動を起こすなどの疾患に対しても適用が期待される。細胞培養プレートの材料に、水溶性樹脂を用いた場合、複数の細胞培養プレートを積層した培養した後、基板を培養液中に溶解させることで、移植が可能な重層化した心筋細胞シートを得ることが可能となる。

本発明にしたがって、培養細胞の伸展方向の制御法、および形状について図を参照しながら以下に説明する。実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

＜細胞培養プレートＡの製造＞
金属構造体を型として、樹脂成形品を成形した。金属構造体は、ＵＶ光を露光光源としたフォトリソグラフ法によりレジストパターン体を作製、その表面にスパッタリング法によりニッケルを５００Å堆積させた後、電気メッキを実施し、厚さ０．５ｍｍのニッケル製金属構造体を得た。
次に、ニッケル製金属構造体を成形金型のキャビティに固定し、射出成形により図１に示す樹脂製細胞培養プレートＡを製造した。射出成形に用いた材料は、（株）クラレ製アクリル（パラペット Ｇ−ＨＳ）を使用した。
細胞培養プレートＡの外形は、直径１００ｍｍ、厚さ１ｍｍの基板であり、中央部の縦４０ｍｍ×横４０ｍｍのエリアに、複数の側壁１によって形成された複数の空間構造３を有する構造とした。側壁１の厚さは１０μｍ、高さ１５μｍ、幅６０μｍとし、４個の側壁１によって、縦１００μｍ×横１００μｍ、高さ１５μｍの空間構造３が１個形成される。複数の空間構造３を連通するための開口部２は、一直線に並ぶ側壁どうしの隙間であり、側壁１の間隔を４０μｍとした。
本成形品は平板形状であるが、使用用途に応じて、例えば、例えばシャーレの底部に、複数の側壁によって形成された複数の空間構造３を有するプレートを張り合わせるなどし、研究効率を高めるように工夫してもよい。

＜細胞培養プレートＢの製造＞
樹脂製細胞培養プレートＡを製造する方法と同様の製造方法にて、図２に示す樹脂製細胞培養プレートＢを製造した。
細胞培養プレートＢの外形は、直径１００ｍｍ、厚さ１ｍｍの基板であり、中央部の縦４０ｍｍ×横４０ｍｍのエリアに、複数の側壁１によって形成された複数の空間構造３を有する構造とした。側壁１の厚さは１０〜２０μｍ、高さ３０μｍ、幅２５０μｍとし、側壁１によって、縦１００μｍ×横１００μｍ、高さ３０μｍの空間構造が１個形成される。複数の空間構造３を連通するための開口部２は、側壁１の間隔を４０μｍとして得られた。
本成形品は平板形状であるが、使用用途に応じて、例えば、例えばシャーレの底部に、複数の側壁１によって形成された複数の空間構造２を有するプレートを張り合わせるなどし、研究効率を高めるように工夫してもよい。

＜細胞培養プレートＣの製造＞
樹脂製細胞培養プレートＡを製造する方法と同様の製造方法にて、図４に示す樹脂製細胞培養プレートＣを製造した。
細胞培養プレートＢの外形は、縦８０ｍｍ×横１４０ｍｍ、厚さ１ｍｍの基板であり、中央部の縦４０ｍｍ×横４０ｍｍのエリアに、複数の側壁によって形成された複数の空間構造を有し、その両側に培養液を灌流するための直径２ｍｍの貫通孔４を２個有する構造とした。側壁１の厚さは１０μｍ、高さ１５μｍ、幅６０μｍとし、４個の側壁によって、縦１００μｍ×横１００μｍ、高さ１５μｍの空間構造３が１個形成される。複数の空間構造を連通するための開口部２は、一直線に並ぶ側壁どうしの隙間で、側壁１の間隔を４０μｍとした。
樹脂製細胞培養プレートＣは、細胞培養試験では、培養液に浸すともにアクリル製プレートを重ね合わせ、貫通孔４により培養液を循環させた環境下で培養試験を行う。培養液が流れる流路５は、複数の空間構造の上面全体であり、アクリル製プレートとの隙間は、０．５ｍｍとした。

＜細胞培養プレートＤの製造＞
樹脂製細胞培養プレートＡを製造する方法と同様の製造方法にて、図５に示す樹脂製細胞培養プレートＤを製造した。
細胞培養プレートＤの外形は、縦７０ｍｍ×横１４０ｍｍ、厚さ１ｍｍの基板であり、中央部の縦４０ｍｍ×横４０ｍｍのエリアに、複数の側壁１によって形成された複数の空間構造３を有し、その両側に培養液を灌流するための直径２ｍｍの貫通孔４を２個有する構造とした。側壁１の厚さは１０μｍ、高さ１５μｍ、幅６０μｍとし、４個の側壁１によって、縦１００μｍ×横１００μｍ、高さ２５μｍの空間構造３が１個形成される。複数の空間構造３を連通するための開口部２は、一直線に並ぶ側壁１どうしの隙間で、側壁の間隔を４０μｍとした。
樹脂製細胞培養プレートＤは、細胞培養試験では、培養液に浸すともにアクリル製プレートを重ね合わせ、貫通孔４により培養液を循環させた環境下で培養試験を行う。培養液が流れる幅２ｍｍ、長さ４０ｍｍ流路５は、複数の空間構造３が設けられたエリアの間に等間隔で５本有する構造とした。アクリル製プレートと、複数の空間構造３の上部は密着している。

＜細胞培養プレートＥの製造＞
樹脂製細胞培養プレートＡを製造する方法と同様の製造方法にて、図６に示す樹脂製細胞培養プレートＥを製造した。
細胞培養プレートＥの外形は、直径１００ｍｍ、厚さ１ｍｍの基板であり、中央部の縦４０ｍｍ×横４０ｍｍのエリアに、複数の凹パターン６を有する構造とした。凹パターン６の幅は２０μｍ、深さ３０μｍ、長さ１８０μｍとし、縦方向８０μｍ、横方向２０μｍの間隔にて、連続する構造とした。
＜細胞培養プレートの調整＞
（細胞培養プレートＡ〜Ｅ）
細胞培養プレートＡ〜Ｅを用い、紫外線による滅菌処理を行った。次に細胞の付着を促すコラーゲンを塗布して細胞を培養するためのプレートを作製した後、シャーレ内に固定した。

（比較用培養プレート１、２）
スライドガラス１、２を用い、紫外線による滅菌処理を行った。次に細胞の付着を促すコラーゲンを塗布して細胞を培養するためのプレートを作製した後、シャーレ内に固定化した。

＜培養プレート上の細胞培養環境＞
（細胞培養プレートＡ〜Ｄおよび比較用プレートＡ）
ラットの心筋細胞を、細胞培養プレートＡ〜Ｄの空間構造が設けられたエリア、および比較用プレート１上に配置し、培養液に浸した。細胞培養プレートＣ〜Ｄは、培養液に浸すともにアクリル製プレートを重ね合わせ、貫通孔４により培養液を循環させた。
（細胞培養プレートＥ、および比較用プレートＢ：）
ラットの骨髄およびニワトリ胚心臓から分離培養したラット骨髄間質細胞およびニワトリ胚線繊芽細胞を、細胞培養プレートＥの凹パターンエリア並びに比較用培養プレート２上に配置し、培養液に浸した。

＜培養プレート上の細胞培養比較＞
（細胞培養プレートＡ〜Ｄおよび比較用培養プレート１）
前記の環境下で４日間の細胞培養試験を行った。細胞培養プレートＣ〜Ｄを用いた試験では常に新鮮な培養液を細胞に供給可能であるため培養液の交換は行わなかったが、細胞培養プレートＡ〜Ｂおよび比較用培養プレート１を用いた試験では、試験開始３日目に培養液の交換を行った。

細胞培養プレートＡ〜Ｄでは、複数の側壁１によって形成された複数の空間構造３のなかで、心筋細胞が立体的に培養されていることが確認された。心筋細胞の擬似足場となる接着斑は側壁１に形成され、空間構造３のなかで立体的に培養された。そして、空間構造３内で培養された心筋細胞は、対向する側壁１にも接着斑である擬似足場を形成した。そして、それぞれの空間構造３で立体的に培養された心筋細胞は、開口部２によって連結しており、その結果、伸展方法が制御された心筋細胞シートを得ることに成功した。こうして得られた伸展方法が制御された心筋細胞シートは、連結単位で同期した拍動を行うとともに、その拍動ストロークは、伸展制御することにより生体組織を再現していることが確認された。

こうして得られる伸展方向が制御された心筋細胞シートを積層させることで、将来、心臓の正常な機能を回復させる治療を目的とした生体移植に適用して、治療効果を挙げることが期待される。

また、細胞培養プレートＣ〜Ｄを用いた試験では、培養液を交換することなく、上記の結果を得ることができた。新鮮な培養液を常に供給しているため、細胞から排出される老廃物によって、ＰＨが変化するなどし、培養細胞の活性が低下する懸念がないため、肝細胞の培養など、細胞の成長が難しいとされる場合にも、これら本発明の細胞培養プレートを適用できることが期待される。また、培養の自動化も可能となるなどの利点を有する。
細胞培養プレートＡを用いてラットの心筋細胞を培養した結果を図３の写真に示す。

一方、比較用培養プレート１による培養では、培養細胞が薄く伸びて立体的な構造を示さなかった。細胞の伸展は、方向性のない形態をとり、プレートで個別の心筋がそれぞれ単独で拍動している様子が観察された。この結果は、培養細胞が立体構造を示していないため、細胞生体内で持っていた機能を発現していないこと示すものであるのに加え、心筋細胞の伸展方向が方向性のない形態をとっているため、アッセイ試験の判定に用いることが困難であることを予測させるものである。

（細胞培養プレートＥおよび比較用培養プレート２）
細胞培養プレートＥによる試験では、ラット骨髄間質細胞およびニワトリ胚線繊芽細胞を伸展方向が制御された形態で培養することに成功した。ラット骨髄間質細胞およびニワトリ胚線維芽細胞は、凹パターン６の側壁、または凹パターン６の上部に擬似足場となる接着斑を形成させた後、凹パターン６の内部に伸展することなく、連通する面７である凹部の上部に選択的に伸展することを確認した。すなわち、連通する面７に沿った方向へ培養細胞の伸展方向が制御されている。
一方、比較用培養プレート２による試験では、細胞は薄くのびて、スライドガラス一面に広がる形態となり、伸展方向を制御することはできなかった。
また、スライドガラス上では、培養面に隙間を有することができなかったが、細胞培養プレートＥでは、凹パターン６によって培養面の隙間を制御した形で培養することが可能である。この技術により、培養細胞を複合させ、例えば、血管内皮細胞を共培養することで、生体組織をより正しく再現した細胞培養が可能になることが期待される。

細胞培養プレートの実施の形態の一例を示す図である。 細胞培養プレートの実施の形態の一例を示す図である。 図１に示す細胞培養プレートを用いて培養された細胞の写真である。 細胞培養プレートの実施の形態の一例を示す図である。 細胞培養プレートの実施の形態の一例を示す図である。 細胞培養プレートの実施の形態の一例を示す図である。

符号の説明

１：側壁、２：開口部、３：空間構造、４：貫通孔、５：流路
６：凹パターン、７：連通する面

Claims (12)

1. 側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を配置するための複数の空間構造を有し、さらに、側壁に開口部を設けることにより、複数の空間構造が連通した連結構造を有する細胞培養プレートを用いて、細胞培養における擬似足場となる接着斑を側壁面に形成させ、空間構造内で培養された細胞は対向する側壁に伸展し、それぞれの空間構造で培養された細胞が開口部によって結合することにより、培養細胞の伸展方向が制御されることを特徴とする細胞の培養方法。
2. 前記細胞培養プレートにおける側壁が、高さが３μｍ〜１０００μｍ、厚さが３μｍ〜１０００μｍ、幅が３μｍ〜３０００μｍであることを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
3. 前記細胞培養プレートが、培養液を灌流する流路を有する請求項１または２記載の細胞の培養方法。
4. 前記流路の幅が１μｍ〜１０００μｍ、深さが１μｍ〜１０００μｍである請求項３に記載の細胞の培養方法。
5. 前記細胞培養プレートにおいて、細胞が配置される空間構造内に、高さまたは深さが０．００１μｍ〜５０μｍの微細凹凸パターンを有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
6. 複数個の凹または凸パターンを有し、それら凹パターンの上部または凸パターンの底部に連通する面を有する細胞培養プレートを用いて、細胞培養における擬似足場となる接着斑を連通する面または凹凸パターンの側壁面に形成させ、該細胞を伸展可能な連通する面に増殖せしめることで培養細胞の伸展方向が制御されることを特徴とする細胞の培養方法。
7. 側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を配置するための複数の空間構造を有し、さらに、側壁に開口部を設けることにより、複数の空間構造が連通した連結構造を有することを特徴とする細胞培養プレート。
8. 複数個の凹、または凸パターンを有し、それら凹、または凸パターンを設けることにより、凹パターンの上部、または凸パターンの底部に連通する面を有することを特徴とする細胞培養プレート。
9. 前記細胞培養プレートに細胞固定化のための表面処理が施されていること特徴とする請求項７または８に記載の細胞培養プレート。
10. 樹脂成形品よりなることを特徴とする請求項７から９のいずれか１項に記載の細胞培養プレート。
11. 樹脂成形品が水溶性樹脂成形品である請求項１０に記載の細胞培養プレート。
12. 請求項７〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養プレートを複数枚積層させた構造である細胞培養多層プレート。