JP2009183204A - 細胞培養方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】骨髄間質細胞から高率に神経様細胞へ分化させることができる細胞培養方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明に係る細胞培養方法は、表面に複数のマイクロ容器11を有し、隣接する前記マイクロ容器11同士が開口部13により連通した細胞培養容器において細胞を培養する細胞培養方法であって、前記細胞が単離された骨髄間質細胞であり、当該骨髄間質細胞の分化率が40%以上であることを特徴とするものである。
【選択図】図1
【解決手段】本発明に係る細胞培養方法は、表面に複数のマイクロ容器11を有し、隣接する前記マイクロ容器11同士が開口部13により連通した細胞培養容器において細胞を培養する細胞培養方法であって、前記細胞が単離された骨髄間質細胞であり、当該骨髄間質細胞の分化率が40%以上であることを特徴とするものである。
【選択図】図1
Description
本発明は、細胞培養方法に関する。
組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索及び薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。そのため、バイオテクノロジー分野で使用される細胞類は、極めて多様化してきている。
単離した細胞は、直ちに浮遊状態にて試験に用いられる場合もあるが、多くの場合、培養皿に接着させた状態で培養し、種々の試験、検査に用いられる。細胞培養に用いられる初代細胞、株化細胞には、生体内での試験いわゆるin vivo試験と同様の薬剤感受性、毒性反応などを示すことが要求される。すなわち、細胞培養容器上で生体内類似の細胞機能が必要とされる。
ところで、骨髄間質細胞は間葉系細胞を含み、神経細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞など様々な細胞に分化できる細胞である(非特許文献1、2)。このような分化能を有するため、胚性幹細胞や胎児幹細胞において懸念されている倫理問題や免疫抑制剤の副作用、増殖コントロール等の課題を考慮せずに、自家組織として採取することができる。また、ドナーの犠牲が少ない状況で臨床に使用できる。以上のような理由から、骨髄間質細胞の分化・増殖の研究が活発に進められている。
骨髄間質細胞から神経細胞に分化させるためには、例えば、以下の手段がある。まず脊髄や大腿骨から骨髄細胞を採取する。このとき、骨髄細胞には骨髄間質細胞以外に浮遊性の造血系細胞が含まれている。この造血系細胞は非接着性であることから、樹脂製の培養ディッシュ、培養ボトルで培養することで浮遊する。そのため、接着性である骨髄間質細胞と容易に分離することができる。
次に、分離された骨髄間質細胞を樹脂製の培養面が平面である培養ディッシュや培養ボトルに再度播種し、数時間から数日間培養する。その後、神経細胞に分化させるため、分化誘導剤を添加する。一般的に知られている分化誘導剤としては、レチノイン酸、塩基性繊維芽細胞増殖因子等を挙げることができる。このようにして神経細胞に分化させた場合、神経細胞への分化比率は約20%である。
そのため、培養前に培養ディッシュや培養ボトルの表面をラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン等のタンパク性細胞外マトリクスやポリ−L−リシンやポリオルニチンのような合成高分子でコーティングし、培養に供することで分化率を高めることができる。(非特許文献3)
梅澤明弘、2001年、分子細胞治療、第2巻、p.17−24 伊澤良兼、外1名、2003年、Molecular Medicine、Vol.40臨時増刊号「再生医学」、p.144−151 Kim BJ、外3名、NeuroReport、2002年 Vol.13、p.1185−1188
梅澤明弘、2001年、分子細胞治療、第2巻、p.17−24 伊澤良兼、外1名、2003年、Molecular Medicine、Vol.40臨時増刊号「再生医学」、p.144−151 Kim BJ、外3名、NeuroReport、2002年 Vol.13、p.1185−1188
しかしながら、骨髄間質細胞の分化方向の制御は容易でない。また、臨床応用や研究用途では、より高効率に目的とする細胞へ分化させることが望まれている。なぜなら、上記各種試験において神経細胞を使用する場合、目的とする細胞以外の細胞へ分化すると、その分離に極めて多大な時間を要するからである。
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、骨髄間質細胞から高率に神経様細胞へ分化させることができる細胞培養方法を提供することを目的とする。
本発明に係る細胞培養方法は、表面に複数のマイクロ容器を有し、隣接する前記マイクロ容器同士が開口部により連通した細胞培養容器において細胞を培養する細胞培養方法であって、前記細胞が単離された骨髄間質細胞であり、当該骨髄間質細胞の分化率が40%以上であることを特徴とするものである。前記骨髄間質細胞培養用の培地にレチノイン酸及び/又は塩基性繊維芽細胞増殖因子を含むのが好ましい。
前記マイクロ容器を構成する凸部の高さが0.1μm〜500μmであるのが好ましい。また、前記開口部の幅が1μm〜100μmであるのが好ましい。さらに、前記細胞培養容器が透明性を有する樹脂からなるのが好ましい。
本発明によれば、骨髄間質細胞から高率に神経様細胞へ分化させることができる細胞培養方法を提供することができる。
本発明者らは、鋭意研究した結果、培養面に凹凸パターンすなわち複数のマイクロ容器が形成され、かつ、隣接するマイクロ容器同士が連通した細胞培養容器において、単離された骨髄間質細胞を培養することにより、高率に神経様細胞に分化させることができることを見出した。分化率は40%以上であることが好ましい。以下、本発明の実施の形態について説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定されるわけではない。また、説明を明確にするため、以下の記載及び図面は、適宜、簡略化されている。
実施の形態
実施の形態にかかる細胞培養容器の構成について図1(a)、(b)及び(c)を用いて説明する。図1(a)は、実施の形態にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。図1(b)は、図1(a)のIB−IB断面図である。図1(c)は、図1(a)の凹凸パターンの形状、大きさならびに配列を示す平面図である。
実施の形態にかかる細胞培養容器の構成について図1(a)、(b)及び(c)を用いて説明する。図1(a)は、実施の形態にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。図1(b)は、図1(a)のIB−IB断面図である。図1(c)は、図1(a)の凹凸パターンの形状、大きさならびに配列を示す平面図である。
細胞培養容器の培養面には、図1(a)に示すように凹凸パターンからなる細胞培養領域10が形成されている。細胞培養領域10は図1(a)に示した10mm×10mmに限定されることはなく、領域の大きさは細胞培養に関する実験条件や実験方法で任意に設定してよい。細胞培養容器のプレート形状ならびに大きさは、図1(a)の直径25mmの円形に限定されることはなく、大きさも限定されることはない。
細胞培養容器の断面の厚みは50μm〜1000μmが好ましく、100μm〜500μmがより好ましい。50μmよりも薄いと強度が低過ぎ、細胞培養容器の取扱いが困難となり、また1000μmより厚いと倒立型光学顕微鏡による観察に支障をきたす。
図1(c)に示すように、細胞培養領域10はマイクロ容器11、凸部12、開口部13を備える。細胞培養領域10には、凸部12が網目状に形成されており、この凸部12に四方を囲われた空間がマイクロ容器11となる。また、各マイクロ容器11の四辺に形成された凸部12の各辺の中央部に、開口部13が形成されている。
細胞培養容器の凸部11の高さは、0.1μm〜500μmが好ましく、10〜100μmがより好ましい。0.1μmよりも低いと細胞が凹凸パターンを認識せず、また500μmよりも高いと製造技術上の難易度が増し、高コストとなる。
細胞培養容器の開口部13の幅は1μm〜100μmが好ましく、10μm〜50μmがより好ましい。1μmより狭いと製造技術上の難易度が増し、高コストとなり、100μmよりも広いと細胞が凹凸パターンを認識しなくなる。
本発明にかかる細胞培養容器を適用できる細胞は骨髄間質細胞であるが、その種は限定されるものでなく、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、ウサギ、ニワトリ、ヒト等が挙げられる。
細胞培養容器は光学顕微鏡観察を可能にするため、ガラスと同等もしくはこれに近い光透過率が必要であり、300nm〜800nmの紫外線を含む光の透過率が80%以上になる材料が好ましい。そのため、アクリレート系ポリマー、カーボネート系ポリマー、スチレン系ポリマー、環状オレフィン系ポリマー等の非晶性樹脂が好ましい。
樹脂製の細胞培養容器に培養液を注入すると、凹凸パターンにより形成される空間構造や間隙に気泡が付着し易くなり、細胞培養ならびに観察が困難となる。そのため、細胞培養容器表面を親水化処理することが好ましい。細胞培養容器表面を親水化する方法は種々の方法が適用できる。具体的には、真空蒸着、スパッタリングにより、細胞培養容器表面に金属、金属酸化物を成膜する方法、親水性高分子を細胞培養容器表面にコートする方法、低温プラズマ処理、コロナ放電処理等により細胞培養容器表面に官能基を導入し直接親水化する方法、等が挙げられる。
細胞培養容器を樹脂により成形する場合は金属構造体を金型として作製することが好ましい。金属構造体の作製は精密切削・研磨による方法、フォトリソグラフ法によりパターンを形成しこの上に金属を形成させる方法が挙げられる。
樹脂の成形は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、キャスト成形、等を挙げることができる。
次に本発明の実施様態を具体的な実施例で説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
骨髄間質細胞の調製は雌のウィスターラットの大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を採取した。これを10%のウシ胎児血清を含むαMEM培地(Gibco社)を入れたポリスチレン製の80cm2セルカルチャーフラスコ(Nunc Intermed社)に播種し、37℃、5%炭酸ガスを含む雰囲気下で12時間培養した。培養後、培養液中の浮遊細胞及び培地を除去し、PBSで2回洗浄した。
さらに、セルカルチャーフラスコの底面に付着した細胞を、10%のウシ胎児血清を含むαMEM培地中、37℃、5%炭酸ガスを含む雰囲気下でさらに3〜5日間培養した。コンフルエントに達した細胞を、0.25%トリプシンを含む1mMEDTA溶液にて回収した。これを3〜5倍に希釈して10%のウシ胎児血清を含むαMEM培地中、37℃、5%炭酸ガスを含む雰囲気下でさらに3〜5日間培養した。これら細胞の増殖の操作をさらに1回又は2回繰り返した後、神経様細胞分化用の骨髄間質細胞を得た。
細胞培養容器は熱をかけた金属構造体をメタアクリル樹脂フィルムに押し当て、図1(a)に示すように10mm四方の領域に凹凸パターンを成形し、25mmの円形状に切り出した。図1(b)に示すようにプレート厚みは凹凸パターンの高さも含め150μmとなるように調整した。図1(c)は凹凸パターンの詳細形状を示した。円形状に切り出したプレートの凹凸パターン成形側の表面に、SiO2をエレクトロンビーム蒸着装置で膜厚が約100nmになるように蒸着した。その後、ガンマ線で滅菌し、分化評価用プレートを得た。分化評価用プレートは35mmφのポリスチレン製ディッシュの底面に凹凸パターン成形表面が上になるように設置し、骨髄間質細胞の神経様細胞への分化評価用ディッシュとした。
神経様細胞への分化評価は分化評価用ディッシュに、10%のウシ胎児血清を含み、レチノイン酸と塩基性繊維芽細胞増殖因子の濃度がそれぞれ10μM、20ng/mlであるDMEM/F−12培地(Gibco社)を入れた。これに神経様細胞分化用の骨髄間質細胞を105個/ディッシュで播種し、37℃、5%炭酸ガスを含む雰囲気下で4日間培養した。
培養後、神経幹細胞の分子マーカーで中間径フィラメントであるネスチン又は神経細胞の分子マーカーである中間径フィラメント(以下、NF−Mと称す)の免疫染色をする。そのため、分化評価用ディッシュをPBSで穏やかに洗浄した。そして、細胞を固定化するため4%のフォルムアルデヒドを含むPBSを入れ、室温で20分間静置した。
その後、分化評価用ディッシュをPBSで洗浄し、10%のヒツジ血清と0.3%のTriton X−100を含むPBSのブロッキング溶液を入れ、12時間室温下でブロッキングした。
その後、ネスチンに対するマウス抗ネスチン抗体(ケミコンインターナショナル社)とNF−Mに対するウサギ抗NF−M抗体(ケミコンインターナショナル社)をそれぞれ200倍に希釈した10%のヒツジ血清を含むPBSの一次抗体溶液を入れ、12時間室温で静置した。
一次抗体と反応後、二次抗体であるAlexa Flour 555で標識したヤギ抗マウスIgG抗体(Molecular Probes社)及びAlexa Flour 488で標識されたニワトリ抗ウサギIgG抗体(Molecular Probes社)を1000倍希釈した10%のヒツジ血清を含むPBSの二次抗体溶液を入れ、1時間室温で静置した。
二次抗体と反応後、分化評価用ディッシュをPBSで洗浄し、細胞の核を染色する4',6−Diamidino−2−phenylindole dihydrochloride(以下DAPIと称す)(Molecular Probes社)の0.3μMのPBS溶液を入れ、5分間室温にて静置した。その後、分化評価用ディッシュをPBSで洗浄し、神経様細胞観察用ディッシュを得た。
神経様細胞観察用ディッシュは神経幹細胞由来のネスチン、神経細胞由来のNF−M、及び細胞の核を観察するため、共焦点レーザー顕微鏡(カールツァイス社製LSM510)を使用し、レーザー波長364nm、488nm、及び543nmにてそれぞれDAPI、Alexa Flour 488、Alexa Flour 555を励起し、蛍光観察を行った。観察結果の評価は任意の一視野内における総細胞数(青色に光る陽性細胞数)に対する神経幹細胞数(赤色に光る陽性細胞数)、神経細胞数(薄緑色に光る陽性細胞数)のそれぞれの比率を比較した。各実施例及び比較例におけるNF−M陽性細胞の比率を表1に示す。
[実施例1]
実施例1に係る細胞培養容器はアクリル樹脂からなる。図1に示すように、実施例1に係る細胞培養容器では、凸型パターンは縦100μm、横100μmの十字の形で、高さ50μmの凸部12が縦方向及び横方向に間隔20μmで配列されている。これにより、正方形状のマイクロ容器11が形成される。また、当該正方形の各辺の中央部が幅20μmの開口部13となり、各開口部13において隣接する2つのマイクロ容器11同士が連通している。骨髄間質細胞を培養した結果、薄緑色に蛍光を発する神経細胞が観察された。表1に示すように、実施例1のNF−M陽性細胞の比率は70%と高率であった。
実施例1に係る細胞培養容器はアクリル樹脂からなる。図1に示すように、実施例1に係る細胞培養容器では、凸型パターンは縦100μm、横100μmの十字の形で、高さ50μmの凸部12が縦方向及び横方向に間隔20μmで配列されている。これにより、正方形状のマイクロ容器11が形成される。また、当該正方形の各辺の中央部が幅20μmの開口部13となり、各開口部13において隣接する2つのマイクロ容器11同士が連通している。骨髄間質細胞を培養した結果、薄緑色に蛍光を発する神経細胞が観察された。表1に示すように、実施例1のNF−M陽性細胞の比率は70%と高率であった。
[実施例2]
実施例2に係る細胞培養容器もアクリル樹脂からなる。図2に示すように、実施例2に係る細胞培養容器では、縦80μm、横20μm、高さ50μmの凸部12が正方形状のマイクロ容器11の各辺を構成するように配置されている。そして、当該正方形の各頂点に、20μmの開口部13が形成され、各開口部13において隣接する4つのマイクロ容器11同士が連通している。表1に示すように、実施例2のNF−M陽性細胞の比率は50%と高率であった。
実施例2に係る細胞培養容器もアクリル樹脂からなる。図2に示すように、実施例2に係る細胞培養容器では、縦80μm、横20μm、高さ50μmの凸部12が正方形状のマイクロ容器11の各辺を構成するように配置されている。そして、当該正方形の各頂点に、20μmの開口部13が形成され、各開口部13において隣接する4つのマイクロ容器11同士が連通している。表1に示すように、実施例2のNF−M陽性細胞の比率は50%と高率であった。
[実施例3]
実施例3に係る細胞培養容器もアクリル樹脂からなる。図3に示すように、実施例3に係る細胞培養容器では、縦60μm、横20μm、高さ50μmの第1の凸部12aと対角線が60μmの正方形で高さ50μmの第2の凸部12bとが組み合わされてパターン配列させている。凸部の開口部13の最小値は22μmである。各開口部13において、隣接する4つのマイクロ容器11同士が連通している。表1に示すように、実施例3のNF−M陽性細胞の比率は40%と高率であった。
実施例3に係る細胞培養容器もアクリル樹脂からなる。図3に示すように、実施例3に係る細胞培養容器では、縦60μm、横20μm、高さ50μmの第1の凸部12aと対角線が60μmの正方形で高さ50μmの第2の凸部12bとが組み合わされてパターン配列させている。凸部の開口部13の最小値は22μmである。各開口部13において、隣接する4つのマイクロ容器11同士が連通している。表1に示すように、実施例3のNF−M陽性細胞の比率は40%と高率であった。
[比較例1]
凹凸パターンが形成されていない分化評価用プレートをアクリル樹脂にて作製した。比較例1のNF−M陽性細胞の比率は25%と低率であった。
凹凸パターンが形成されていない分化評価用プレートをアクリル樹脂にて作製した。比較例1のNF−M陽性細胞の比率は25%と低率であった。
[比較例2]
分化評価用マルチプレートとして使用している6ウェルマルチウェルプレート(Becton Dickinson社)のウェル内にて直接調製した神経様細胞分化用の骨髄間質細胞を播種し、培養した。比較例2のNF−M陽性細胞の比率は30%と低率であった。
分化評価用マルチプレートとして使用している6ウェルマルチウェルプレート(Becton Dickinson社)のウェル内にて直接調製した神経様細胞分化用の骨髄間質細胞を播種し、培養した。比較例2のNF−M陽性細胞の比率は30%と低率であった。
[比較例3]
比較例3に係る細胞培養容器もアクリル樹脂からなる。図4(a)に示すように、10mm四方の領域に凹凸パターンからなる細胞培養領域10を成形し、25mmの円形状に切り出した。図4(b)に示すようにプレート厚みは凹凸パターンも含め150μmとなるように調整した。図4(c)には細胞培養領域10の詳細形状を示した。凹凸パターンから構成されるマイクロ容器11は、縦100μm、横100μm、深さ50μmであって、幅20μmの壁で仕切られている。比較例3のNF−M陽性細胞の比率は25%と低率であった。
比較例3に係る細胞培養容器もアクリル樹脂からなる。図4(a)に示すように、10mm四方の領域に凹凸パターンからなる細胞培養領域10を成形し、25mmの円形状に切り出した。図4(b)に示すようにプレート厚みは凹凸パターンも含め150μmとなるように調整した。図4(c)には細胞培養領域10の詳細形状を示した。凹凸パターンから構成されるマイクロ容器11は、縦100μm、横100μm、深さ50μmであって、幅20μmの壁で仕切られている。比較例3のNF−M陽性細胞の比率は25%と低率であった。
10 細胞培養領域
11 マイクロ容器
12 凸部
12a 第1の凸部
12b 第2の凸部
13 開口部
11 マイクロ容器
12 凸部
12a 第1の凸部
12b 第2の凸部
13 開口部
Claims (5)
- 表面に複数のマイクロ容器を有し、隣接する前記マイクロ容器同士が開口部により連通した細胞培養容器において細胞を培養する細胞培養方法であって、
前記細胞が単離された骨髄間質細胞であり、当該骨髄間質細胞の分化率が40%以上であることを特徴とする細胞培養方法。 - 前記骨髄間質細胞培養用の培地にレチノイン酸及び/又は塩基性繊維芽細胞増殖因子を含むことを特徴とする請求項1に記載の細胞培養方法。
- 前記マイクロ容器を構成する凸部の高さが0.1μm〜500μmであることを特徴とする請求項1又は2に記載の細胞培養方法。
- 前記開口部の幅が1μm〜100μmであることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
- 前記細胞培養容器が透明性を有する樹脂からなることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
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