KR102106805B1 - 세포 스페로이드 형성용 구조체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 스페로이드 형성방법 - Google Patents
세포 스페로이드 형성용 구조체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 스페로이드 형성방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102106805B1 KR102106805B1 KR1020180086267A KR20180086267A KR102106805B1 KR 102106805 B1 KR102106805 B1 KR 102106805B1 KR 1020180086267 A KR1020180086267 A KR 1020180086267A KR 20180086267 A KR20180086267 A KR 20180086267A KR 102106805 B1 KR102106805 B1 KR 102106805B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- spheroid
- solution
- cell
- cell spheroid
- forming
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 36
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 69
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 19
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 16
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 15
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 15
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 9
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 8
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000001259 photo etching Methods 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 111
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 14
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- MDLRQEHNDJOFQN-UHFFFAOYSA-N methoxy(dimethyl)silicon Chemical compound CO[Si](C)C MDLRQEHNDJOFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 2
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 210000002236 cellular spheroid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000010702 perfluoropolyether Substances 0.000 description 2
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 2
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- BGWLYQZDNFIFRX-UHFFFAOYSA-N 5-[3-[2-[3-(3,8-diamino-6-phenylphenanthridin-5-ium-5-yl)propylamino]ethylamino]propyl]-6-phenylphenanthridin-5-ium-3,8-diamine;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCNCCNCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 BGWLYQZDNFIFRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002120 photoresistant polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001843 polymethylhydrosiloxane Polymers 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/30—Synthetic polymers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
세포 스페로이드 형성용 구조체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 스페로이드 형성방법에 관한 것으로,
본 발명의 일 측면에서 제공하는 세포 스페로이드 형성용 구조체 제조방법은 복잡한 광식각공정과 특수한 장비 없이 제조가 가능하며, 이렇게 제조되는 세포 스페로이드 형성용 구조체는 홈(cavity)의 부피와 곡률이 조절됨에 따라 세포 스페로이드를 최적의 효율로 형성할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 세포 스페로이드 형성용 구조체 제조방법은 복잡한 광식각공정과 특수한 장비 없이 제조가 가능하며, 이렇게 제조되는 세포 스페로이드 형성용 구조체는 홈(cavity)의 부피와 곡률이 조절됨에 따라 세포 스페로이드를 최적의 효율로 형성할 수 있는 효과가 있다.
Description
세포 스페로이드 형성용 구조체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 스페로이드 형성방법에 관한 것이다.
일반적으로 세포를 2차원적으로 배양하여 약물 스크리닝이나 각종 연구에 사용하고 있으나, 이 경우, 3차원적으로 세포들이 상호작용을 하는 실제 생체 내의 조건과는 다른 환경이기 때문에, 세포가 가지고 있는 고유의 특성이나 세포의 조직 특이성을 잃어버리기 쉬워, 최근 세포를 3차원으로 배양하여 연구에 활용하는 것에 대한 필요성이 매우 중요하게 대두되고 있다.
한편, 3차원 세포 스페로이드는 세포들이 모여 3차원의 형태를 이루는 집합체를 이르는 것으로, 2차원 배양에 비해 생체와 유사한 조건에서 실험결과를 얻을 수 있어 실제 생체 내의 조건을 모사하는 세포 배양 모델로서 각광 받고 있다. 이에, 3차원 세포 스페로이드는 신약개발 또는 줄기세포를 이용한 분화 연구에 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. 이에, 세포 스페로이드를 빠르고 쉽게 형성할 수 있는 시스템이 요구되고 있다.
한편, 특허문헌 1(한국 공개특허 10-2017-0003177)은 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법을 개시하고 있다. 특허문헌 1은 마이크로 플레이트가 인체의 환경과 유사한 환경 및 구조에서 3차원 세포 또는 세포 집합체 배양을 가능하게 하고, 산소와 이산화탄소 등의 가스를 인체와 유사한 조건으로 공급하여, 이상적인 환경에서 3차원 세포 또는 세포 집합체를 배양하는 것이 가능함을 개시하고 있다.
하지만, 특허문헌 1에서 제공하는 마이크로 플레이트는 감광성 포토레지스트를 이용하는 매우 복잡한 광식각공정과 특수한 장비가 있어야만 제조가 가능한 단점이 있다.
이에, 특허문헌 1에서 요구하는 매우 복잡한 광식각공정과 특수한 장비 없이 세포 스페로이드 형성용 구조체를 제조하는 방법과, 이를 이용한 세포 스페로이드 형성방법이 요구되는 실정이다.
본 발명의 일 측면에서의 목적은 복잡한 광식각공정과 특수한 장비 없이도 쉽고 빠르게 세포 스페로이드 형성용 구조체의 제조가 가능한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은 홈(cavity), 또는 홀(hole)의 부피와 곡률이 조절됨에 따라 세포 스페로이드를 최적의 효율로 형성할 수 있는 세포 스페로이드 형성용 구조체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서의 목적은 홈(cavity)의 부피와 곡률이 조절됨에 따라 세포 스페로이드를 최적의 효율로 형성할 수 있는 세포 스페로이드 형성용 구조체를 사용하여, 세포 스페로이드를 형성하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면은 고분자 물질을 포함하는 제1 용액을 준비하는 단계;
상기 제1 용액에 제2 용액 방울을 투입하여, 상기 제1 용액에 투입된 제2 용액 방울이 상기 제1 용액의 수면에 접하여 배치되는 단계; 및
제1 용액 내 고분자 물질의 경화를 유도하는 단계; 를 포함하는, 세포 스페로이드(Spheroid) 형성용 구조체 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은 고분자 물질을 포함하는 기지체; 및 상기 기지체 표면에 형성된 홈(cavity)을 포함하고, 상기 홈은 구형 또는 타원형의 일부인 세포 스페로이드 형성용 구조체를 제공한다.
나아가, 본 발명의 또 다른 일 측면은 고분자 물질을 포함하는 기지체; 및 상기 기지체 표면에 형성된 홈(cavity)을 포함하고, 상기 홈은 구형 또는 타원형의 일부인 세포 스페로이드 형성용 구조체의 홈 표면에 세포 부착 방지제를 처리하는 단계; 및
상기 홈 표면에 세포를 파종(seeding)하는 단계; 를 포함하는, 세포 스페로이드 형성방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 세포 스페로이드 형성용 구조체 제조방법은 복잡한 광식각공정과 특수한 장비 없이 제조가 가능하며, 이렇게 제조되는 세포 스페로이드 형성용 구조체는 홈(cavity)의 부피와 곡률이 조절됨에 따라 세포 스페로이드를 최적의 효율로 형성할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 홈(cavity)의 형성 과정 및 방법을 도식화한 이미지와 에탄올 수용액 농도에 따라 형성되는 홈(cavity)의 형태를 상부와 측면에서 관찰한 이미지이며, 도 1b에서 기준자(scale bar)는 500 ㎛이다.
도 2는 본 발명의 일 측면에서 제공하는 세포 스페로이드(Spheroid) 형성용 구조체를 사용하여 세포 스페로이드를 형성하는 원리를 나타내는 이미지이다.
도 3은 세포 스페로이드 형성용 구조체의 홈(cavity) 표면에 사용하는 BSA의 농도에 따라, 스페로이드 형성 효율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 다양한 크기와 곡률의 홈 내부에 단일 스페로이드가 형성된 홈의 수를 측정하여 스페로이드 형성의 효율성을 평가한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 5는 5μL 부피 70% 농도 에탄올 방울로 형성되는 홈을 포함하는 구조체를 사용하여, 파종된 세포 수를 조절하고, 3일 동안 스페로이드 형성의 효율성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5a는 스페로이드 형성 효율을, 도 5b는 형성된 스페로이드의 직경을 나타낸다.
도 6은 홈(cavity) 내에서 형성된 단일 스페로이드를 관찰한 이미지이다. 도 6a는 5일 동안 스페로이드를 관찰한 이미지를, 도 6b는 생존/죽음 염색 분석(live/dead staining assay) 결과 이미지를, 도 6c는 다른 두 종류의 세포를 이용하여 다세포 스페로이드의 형성을 나타내는 이미지이다.
도 7은 홈(cavity) 내에서 형성된 단일 스페로이드를 공초점 현미경(confocal microscope)을 이용하여 단층 촬영한 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 측면에서 제공하는 세포 스페로이드(Spheroid) 형성용 구조체를 사용하여 세포 스페로이드를 형성하는 원리를 나타내는 이미지이다.
도 3은 세포 스페로이드 형성용 구조체의 홈(cavity) 표면에 사용하는 BSA의 농도에 따라, 스페로이드 형성 효율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 다양한 크기와 곡률의 홈 내부에 단일 스페로이드가 형성된 홈의 수를 측정하여 스페로이드 형성의 효율성을 평가한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 5는 5μL 부피 70% 농도 에탄올 방울로 형성되는 홈을 포함하는 구조체를 사용하여, 파종된 세포 수를 조절하고, 3일 동안 스페로이드 형성의 효율성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5a는 스페로이드 형성 효율을, 도 5b는 형성된 스페로이드의 직경을 나타낸다.
도 6은 홈(cavity) 내에서 형성된 단일 스페로이드를 관찰한 이미지이다. 도 6a는 5일 동안 스페로이드를 관찰한 이미지를, 도 6b는 생존/죽음 염색 분석(live/dead staining assay) 결과 이미지를, 도 6c는 다른 두 종류의 세포를 이용하여 다세포 스페로이드의 형성을 나타내는 이미지이다.
도 7은 홈(cavity) 내에서 형성된 단일 스페로이드를 공초점 현미경(confocal microscope)을 이용하여 단층 촬영한 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은,
고분자 물질을 포함하는 제1 용액을 준비하는 단계;
상기 제1 용액에 제2 용액 방울을 투입하여, 상기 제1 용액에 투입된 제2 용액 방울이 상기 제1 용액의 수면에 접하여 배치되는 단계; 및
제1 용액 내 고분자 물질의 경화를 유도하는 단계; 를 포함하는, 세포 스페로이드(Spheroid) 형성용 구조체 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 일 측면에서 제공되는 세포 스페로이드 형성용 구조체 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에서 제공되는 세포 스페로이드 형성용 구조체 제조방법에 있어서, 단계 1은 고분자 물질을 포함하는 제1 용액을 준비하는 단계이다.
여기서, 상기 고분자 물질은 성형성을 갖는 고분자 물질이라면 특별한 제한 없이 사용할 수 있으나,
구체예로서 폴리다이메틸실록산 (PDMS: Polydimethylsiloxane), 폴리우레탄 아크릴레이트 (PUA: Polyurethane acrylate), 퍼플루오르폴리에터 (PFPE: Perfluoropolyether), 폴리에스테르 아크릴레이트 (Polyester acrylate), (PCL: Polycaprolactone), 폴리락트산(PLA: Polylactic acid), 에틸셀룰로스 (EC: Ethylcellulose), 폴리스티렌 (PS: Polystyrene), 폴리테트라 플루오로에틸렌 (PTFE: Polytetrafluoroethylene), 폴리프로필렌-에폭시(PP-epoxy), 폴리 알콕시실란 오르가노겔(Poly(alkoxysilane) organogels) 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 제1 용액은 경화제를 더 포함할 수 있다.
상기 경화제는 상기 제1 용액을 경화시키는 역할을 하는 것으로, 디메틸 메틸하이드로젠 실록산(Dimethyl, methylhydrogen siloxane)일 수 있다. 하나의 예로 폴리다이메틸실록산과 경화제를 5:1 내지 20:1의 중량 비율로 혼합하여 제1 용액을 준비할 수 있다. 바람직한 중량 비율은 10:1이다.
본 발명의 일 측면에서 제공되는 세포 스페로이드 형성용 구조체 제조방법에 있어서, 단계 2는 상기 제1 용액에 제2 용액 방울을 투입하여, 상기 제1 용액에 투입된 제2 용액 방울이 상기 제1 용액의 수면에 접하여 배치되는 단계이다.
이때, 상기 제2 용액 방울의 부피는 5 내지 10 마이크로리터(μL)일 수 있다. 제2 용액 방울의 부피 범위가 특정됨에 따라, 추후 세포 스페로이드의 형성 효율이 대폭 증가될 수 있다.
또한, 상기 제2 용액 방울의 제2 용액은 물 또는 에탄올 수용액일 수 있다. 나아가, 상기 에탄올 수용액의 에탄올 농도는 최대 70%(v/v)까지일 수 있다. 몇 가지 에탄올 수용액의 에탄올 농도 범위를 예시하면, 1 내지 70%일 수 있고, 10 내지 70%일 수 있고, 20 내지 70%일 수 있고, 30 내지 70%일 수 있고, 40 내지 70%일 수 있고, 50 내지 70%일 수 있고, 60 내지 70%일 수 있다. 상기 에탄올 수용액의 에탄올 농도가 특정됨에 따라, 추후 세포 스페로이드의 형성 효율이 대폭 증가될 수 있다.
아울러, 상기 제1 용액의 밀도가 상기 제2 용액의 밀도보다 크거나 같을 수 있다. 이로써, 제1 용액에 투입된 제2 용액 방울이 상기 제1 용액에 투입된 상태에서 구형 또는 타원형을 유지하게 되고, 제2 용액 방울이 제1 용액의 수면에 접하도록 배치되어 제2 용액방울의 일부가 수면 밖으로 노출될 수 있다.
상기 제2 용액을 방울 형태로 투입하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 선형 모터로 제어되는 주사기에 의해 일정량이 투입되도록 조절될 수 있다. 또한, 스프레이 방식 또는 마이크로 피펫팅(pipetting)을 통해 제1 용액으로 다수의 제2 용액 방울이 투입될 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 제공되는 세포 스페로이드 형성용 구조체 제조방법에 있어서, 단계 3은 제1 용액 내 고분자 물질의 경화를 유도하는 단계이다.
이때, 상기 경화는 특별히 한정되는 것은 아니나, 몇 가지 구체 예를 들면 상온에서 24시간 동안 유지함으로써 경화할 수 있고, 50 내지 80℃의 온도에서 1 내지 3시간 동안 가열하여 경화할 수 있다. 또한, 제1 용액에 포함된 고분자의 종류에 따라 자외선, 가시광선 또는 전자빔을 조사하여 경화할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 제공되는 세포 스페로이드 형성용 구조체 제조방법은 복잡한 광식각공정과 특수한 장비 없이 쉽게 제조가 가능하며, 더 나아가 사용하는 제2 용액 방울의 부피와 농도를 조절함으로써, 추후 세포 스페로이드의 높은 형성 효율을 달성할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 다른 일 측면은,
고분자 물질을 포함하는 기지체; 및
상기 기지체 표면에 형성된 홈(cavity)을 포함하고,
상기 홈은 구형 또는 타원형의 일부인 세포 스페로이드 형성용 구조체를 제공한다. 이때, 상기 세포 스페로이드 형성용 구조체는 전술한 세포 스페로이드 형성용 구조체 제조방법으로 제조되는 구조체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은,
고분자 물질을 포함하는 기지체; 및 상기 기지체 표면에 형성된 홈(cavity)을 포함하고, 상기 홈은 구형 또는 타원형의 일부인 세포 스페로이드 형성용 구조체의 홈 표면에 세포 부착 방지제를 처리하는 단계; 및
상기 홈 표면에 세포를 파종(seeding)하는 단계; 를 포함하는, 세포 스페로이드 형성방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 또 다른 일 측면에서 제공하는 세포 스페로이드 형성방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서 제공하는 세포 스페로이드 형성방법에 있어서, 단계 1은 고분자 물질을 포함하는 기지체; 및 상기 기지체 표면에 형성된 홈(cavity)을 포함하고, 상기 홈은 구형 또는 타원형의 일부인 세포 스페로이드 형성용 구조체의 홈 표면에 세포 부착 방지제를 처리하는 단계이다.
이때, 상기 고분자 물질은 전술한 바와 동일하고, 상기 세포 부착 방지제는 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA), 아가로스(agarose), 또는 폴리-HEMA (poly(-2-hydroxyethyl methacrylate)) 용액을 사용할 수 있다.
세포 부착 방지제의 처리가 끝나면, 홈 표면에 세포를 파종하기 이전에 홈 표면을 세척하는 단계를 더 수행할 수 있으며, 이때 상기 홈 표면의 세척은 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서 제공하는 세포 스페로이드 형성방법에 있어서, 단계 2는 상기 홈 표면에 세포를 파종(seeding)하는 단계이다.
이때, 상기 홈 표면에 세포를 파종하는 단계에서, 홈 당 세포 수는 250 내지 2500개 범위로 파종하는 것이 바람직하다. 홈 당 파종하는 세포 수를 제어함으로써 스페로이드 형성 효율이 대폭 향상될 수 있다.
상기 세포 스페로이드 형성방법으로 제조되는 스페로이드의 평균 직경은 100 내지 500 ㎛이며, 세포배양, 생명과학, 진단의학 등에서 사용되는 스페로이드의 직경이 100~500 μm 임을 고려할 때, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 스페로이드 제조방법은 상용화 가능성이 높음을 알 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 세포 스페로이드 형성용 구조체 제조방법은 복잡한 광식각공정과 특수한 장비 없이 제조가 가능하며, 이렇게 제조되는 세포 스페로이드 형성용 구조체는 홈(cavity)의 부피와 곡률이 조절됨에 따라 세포 스페로이드를 최적의 효율로 형성할 수 있는 효과가 있으며, 이는 후술하는 실시예 및 실험예에 의해 직접적으로 뒷받침된다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
폴리다이메틸실록산 (Polydimethylsiloxane, PDMS) 엘라스토머(elastomer) 키트인 Sylgard 184를 Dow Corning (Midland, MI, USA)로부터 구매하여 준비하였다. 상기 Sylgard 184는 PDMS 모노머 100 중량부에 대하여 경화제(디메틸 메틸하이드로젠 실록산) 10 중량부를 포함하고 있다. 에탄올 (95.0%)은 Samchun Chemical Co. (Seoul, Korea)로부터 구매하여 준비하였다. DMEM(Dulbecco Modified Eagle's Minimal) 및 페니실린/스트렙토마이신 (PenStrep)은 Gibco-Life Technologies (Mulgrave, Australia)로부터 구매하여 준비하였다. 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)은 MP Biomedicals (Irvine, CA, USA)로부터 구매하여 준비하였다. 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA) 및 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)로부터 구매하여 준비하였다. LIVE/DEAD 세포 이미징 키트 (LIVE/DEAD Cell Imaging Kit, 488/570, Molecular Probes)는 Life Technologies Corp. (CA, USA)로부터 구매하여 준비하였다.
<
실시예
1> 세포
스페로이드
(Spheroid) 형성용 구조체 제조
본 발명의 일 측면에서 제공하는 세포 스페로이드(Spheroid) 형성용 구조체를 아래와 같이 제조하였다.
액상의 PDMS 및 경화제(디메틸 메틸하이드로젠 실록산)를 10:1 중량비로 혼합하고(Sylgard 184), 이 혼합 용액(제1 용액)을 1시간 동안 탈가스(degassed) 하였다. 0%(증류수), 30%, 50% 또는 70% 농도의 에탄올 수용액(제2 용액)을, 상기 탈가스를 완료한 혼합 용액의 상부표면에 방울 단위로 적하하였다. 에탄올 수용액의 적하는 마이크로피펫을 이용하여 적하하였다. 이때, 상기 제1 용액에 투입된 제2 용액 방울은 상기 제1 용액의 수면에 접하여 배치된다.
제2 용액 방울이 투입된 제1 용액을 65℃에서 2시간 동안 유지시켜, 상기 액상 PDMS의 경화를 유도하였다. 이 과정에서, 제2 용액 방울은 증발하여 제거되고, 제2 용액 방울이 제1 용액 내에서 점유하고 있던 부분은, PDMS의 경화가 유도됨에 따라 홈(cavity)이 형성된다. 이 홈은 에탄올 수용액의 농도, 밀도, 표면장력 등에 따라 구형의 일부일 수도 있고, 타원형의 일부일 수도 있다(도 1 참조).
도 1로부터, 에탄올은 물보다 표면장력이 작아 홈의 측면 형상이 구형보다는 타원형의 일부로 형성됨을 확인할 수 있다. 또한, 에탄올의 농도가 증가할수록, 홈의 곡률이 감소하고, 홈의 크기가 커짐을 확인할 수 있다.
즉, 사용하는 에탄올 방울의 크기나 에탄올의 농도를 조절함으로써, 세포 스페로이드(Spheroid) 형성용 구조체에 형성되는 홈의 곡률과 크기를 용이하게 제어할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 상기와 같이 제어된 곡률과 크기를 갖는 홈은, 세포의 빠른 자가응집(self-aggregation)과 견고한 구조의 세포 스페로이드 형성이 가능하도록 영향을 줄 것으로 기대된다.
<
실시예
2> 세포 배양
HEK293(Human embryonic kidney 293) 세포를 Korean Cell Line Bank (KCLB)로부터 구매하여 준비하였고, 권장되는 프로토콜에 따라 배양하였다. 37℃, 5% CO2 가습기(humidified incubator) 조건에서, 상기 세포를 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 필수 영양 배지에서 배양하였다. 상기 배지는 2일 간격으로 한번 교환하였다. 세포 수를 혈구 계산기(hemocytometer)로 계산하여, 파종 밀도(seeding density)를 결정하였다.
<
실시예
3> 세포
스페로이드
(Spheroid) 형성
실시예 1에서 제조한 세포 스페로이드(Spheroid) 형성용 구조체를 사용하여 세포 스페로이드를 아래와 같이 형성하였다.
먼저, 세포 스페로이드 형성용 구조체의 홈(cavity) 표면에 세포가 부착되는 것을 방지하기 위하여, 홈 표면을 3%의 BSA 용액으로 6시간 동안 처리하였다. BSA 처리가 끝나면, PBS로 홈 표면을 헹구었다(rinse). 이후, 상기 실시예 2에서 배양한 세포를 피펫팅(pipetting)을 통해 파종(seeding)하였다(도 2 참조).
<
실험예
1> 세포
스페로이드
(Spheroid) 형성 평가
명시야 이미지(Bright field images)는 Leica Application Suite X version 3.3 (Leica, Heerbrugg, Switzerland)을 사용하여 획득하였다. 홈에서 형성된 스페로이드는 Leica DMi8 도립현미경(inverted microscope)이 구성된 명시야 현미경을 사용하여 관찰하고 계수하였다.
<
실험예
2> 생존/죽음 세포 평가
생존/죽음 염색 분석(live/dead staining assay)을 사용하여 살아있는 세포를 감지하기 위하여, 실시예 3에서 형성한 스페로이드를 염색하였다.
구체적으로, 2μM 칼세인 (calcein)-AM 및 4μM 에티듐 호모다이머-1 (ethidium homodimer-1)을 함유하는 용액에, 실시예 3에서 형성한 스페로이드가 있는 배지를 첨가하였다.
20분 동안 배양한 후, Leica Application Suite X version 3.3 (Leica, Heerbrugg, Switzerland)가 구성된 형광 현미경(fluorescence microscope)을 사용하여 이미지화하였다.
<
실험예
3> 단일
스페로이드
형성을 위한 홈(cavity) 최적화
단일 스페로이드 형성을 유도하기 위하여, 세포 스페로이드 형성용 구조체의 홈(cavity) 표면을 접착 차단제(adhesion blocking agents)인 BSA 용액으로 6시간 동안 처리하였다. HEK 293 세포를 부드럽게 피펫팅하여 홈 내에 파종하였다.
우선, 상기 세포 스페로이드 형성용 구조체의 홈(cavity) 표면에 사용하는 BSA의 농도에 따라, 스페로이드 형성 효율을 분석하였다. 스페로이드 형성 효율은 2일 동안 단일 스페로이드가 형성된 홈의 수를 카운팅함으로써 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 세포 스페로이드 형성용 구조체의 홈(cavity) 표면에 사용하는 BSA의 농도에 따라, 스페로이드 형성 효율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3에 나타난 바와 같이, 3% BSA를 사용한 경우가, 1%, 5%, 10% BSA를 사용한 경우에 비해 스페로이드 형성 효율이 가장 우수하였다. 이로부터, 홈 표면에 세포 접착을 막기 위한 최적의 BSA 처리농도는 3%임을 확인하였다.
다음으로, 홈의 곡률(curvature)과 크기를 제어함에 따라 스페로이드 형성 효율의 변화를 평가하였다. 홈의 곡률과 크기는 실시예 1에서 전술한 바와 같이, 사용하는 에탄올 수용액의 농도를 0%, 30%, 50% 또는 70%로 변화시키며 제어하였다. 홈에 세포를 파종하고 2일 후, 다양한 크기와 곡률의 홈 내부에 형성된 스페로이드의 수를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 다양한 크기와 곡률의 홈 내부에 단일 스페로이드가 형성된 홈의 수를 측정하여 스페로이드 형성의 효율성을 평가한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 1μL 부피의 에탄올 방울을 사용하여 제조된 홈의 경우, 스페로이드의 형성이 용이하게 유도되기에 홈의 크기가 너무 작은 것으로 나타났다. 그 이유는, 홈의 크기가 너무 작음에 따라, 작은 개구부에 세포를 파종하기 어렵기 때문이다. 반면, 20μL 부피의 에탄올 방울을 사용하여 제조된 홈의 경우, 홈의 크기가 너무 큼에 따라 단일 홈에서 다수의 스페로이드가 형성되는 문제가 나타났다. 5 및 10 μL 부피의 에탄올 방울을 사용하여 제조된 홈의 경우, 각각의 홈마다 하나의 스페로이드가 용이하게 형성되는 것으로 나타났다. 10 μL 부피의 에탄올 방울을 사용하여 제조된 홈의 경우, 홈의 크기가 충분하여 곡률이 증가할 때 스페로이드의 형성 효율이 높은 것으로 나타났다.
결론적으로, 스페로이드 형성은 5μL 부피 70% 농도 에탄올 방울을 사용한 경우와, 10μL 부피 0% 농도 에탄올 방울을 사용한 경우가 가장 최적화된 조건임을 확인하였다. 그중에서도, 스페로이드 형성은 스페로이드 크기의 균일성 측면에서 5μL 부피 70% 농도 에탄올 방울을 사용한 경우가 가장 우수하였다.
후속 실험은, 취급의 용이성과 홈 내에 형성된 스페로이드 크기의 높은 균일성을 고려하여, 5μL 부피 70% 농도 에탄올 방울로 형성되는 홈을 포함하는 구조체를 사용하였다.
다음으로, 5μL 부피 70% 농도 에탄올 방울로 형성되는 홈을 포함하는 구조체를 사용하여, 파종된 세포 수를 조절하고, 3일 동안 스페로이드 형성의 효율성을 평가하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이,
홈 당 500 내지 2500 사이의 세포 수는, 스페로이드가 세포 파종 후 1일, 2일 차에 높은 효율로 형성될 수 있음을 알 수 있다. 홈 당 250개의 세포가 파종된 경우는 파종 후 3일 차에 스페로이드가 높은 효율로 형성될 수 있음을 알 수 있다. 반면, 홈에 5000개의 세포가 파종되면, 하나의 홈에 다중의 스페로이드가 형성되거나, 홈의 표면에 세포 응집체가 달라붙는 등의 문제가 발생하였다.
형성되는 스페로이드 직경 측면에서는, 약 100~500 μm 직경의 스페로이드가 500 내지 2500 사이의 세포 수에서 형성될 수 있음을 알 수 있다. 세포배양, 생명과학, 진단의학 등에서 사용되는 스페로이드의 직경이 100~500 μm 임을 고려할 때, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 스페로이드 제조방법은 상용화 가능성이 높음을 알 수 있다.
<
실험예
4>
스페로이드의
형성속도와 세포
생존능
평가
스페로이드의 장기 안정성을 평가하기 위해, 홈(cavity) 내의 스페로이드를 5일 동안 관찰하였다. 그 결과를 도 6a에 나타내었다. 도 6a에서 기준자(scale bar)는 100㎛이다. 둘째 날에 스페로이드는 파종 후 첫날보다 응축되었고, 이후 크기가 커짐을 알 수 있습니다.
다음으로, 본 발명의 일 측면에서 제공되는 세포 스페로이드 형성용 구조체의 홈(cavity)에서 형성된 스페로이드의 세포 생존능을 평가하였다. 그 결과를 도 6b에 나타내었다. 도 6b는 생존/죽음 세포 키트(Live/dead cell kit)로 염색된 스페로이드의 대표적인 광학 이미지와, 이에 대응하는 형광 이미지를 나타낸다. 도 6b에서 기준자(scale bar)는 50㎛이다. 녹색 형광으로 염색된 스페로이드는 높은 세포 생존능을 나타낸다.
3차원의 스페로이드를 구성하는 세포들의 전체적인 생존능 평가를 위하여 공초점 현미경(confocal microscope)을 이용하여 단층 촬영을 수행하였다. 도 7은 3 ㎛의 광학 단면으로 공초점 촬영한 이미지이다. 형성된 스페로이드의 지름이 약 100 ㎛일 때, 그 두께도 약 100 ㎛이기 때문에 스페로이드가 구형으로 형성된 것을 확인했다.
다음으로, 신장 종양 세포(kidney tumor cells)인 A498 세포를 사용하여도, HEK 293의 경우와 동일하게, 스페로이드의 형성이 가능한지 평가하였다. 보다 구체적으로, 생체 내의 미세 환경을 모방하기 위해, HEK 293 세포(정상 신장 세포)와, A498 세포(신장 종양 세포)를 혼합하고, 홈(cavity) 내에 파종하여 스페로이드 형성을 유도하였다. 그 결과를 도 6c에 나타내었다. 도 6c에서 기준자(scale bar)는 50㎛이다. 도 6c에 나타난 바와 같이, HEK 293 세포(정상 신장 세포)와, A498 세포(신장 종양 세포)가 혼합된 다세포 스페로이드가 성공적으로 형성될 수 있음을 알 수 있다.
Claims (13)
- 폴리다이메틸실록산 (PDMS: Polydimethylsiloxane)을 포함하는 제1 용액을 준비하는 단계;
상기 제1 용액에 제2 용액 방울을 투입하여, 상기 제1 용액에 투입된 제2 용액 방울이 상기 제1 용액의 수면에 접하여 배치되는 단계; 및
제1 용액 내 폴리다이메틸실록산의 경화를 유도하는 단계; 를 포함하는, 세포 스페로이드(Spheroid) 형성용 구조체 제조방법에 있어서,
상기 제2 용액 방울은,
5μL부피 70(v/v)%농도 에탄올 수용액 방울, 또는 10μL부피 물 방울인 것을 특징으로 하는 세포 스페로이드 형성용 구조체 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 제1 용액의 밀도가 상기 제2 용액의 밀도보다 크거나 같은 것을 특징으로 하는 세포 스페로이드 형성용 구조체 제조방법.
- 삭제
- 폴리다이메틸실록산 (PDMS: Polydimethylsiloxane)을 포함하는 기지체; 및 상기 기지체 표면에 형성된 홈(cavity)을 포함하고, 상기 홈은 구형 또는 타원형의 일부이며, 제1항의 제조방법으로 제조되는 세포 스페로이드 형성용 구조체의 홈 표면에 세포 부착 방지제를 처리하는 단계; 및
상기 홈 표면에 세포를 파종(seeding)하는 단계; 를 포함하는, 세포 스페로이드 형성방법에 있어서,
상기 홈 표면에 세포를 파종하는 단계에서,
홈 당 세포 수는 250 내지 2,500개 범위인 것을 특징으로 하는 세포 스페로이드 형성방법.
- 삭제
- 제7항에 있어서,
상기 세포 부착 방지제는 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA), 아가로스(agarose), 또는 폴리-HEMA(poly(-2-hydroxyethyl methacrylate)) 용액인 것을 특징으로 하는 세포 스페로이드 형성방법.
- 제7항에 있어서,
상기 홈 표면에 세포를 파종하기 이전에, 홈 표면을 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 스페로이드 형성방법.
- 제10항에 있어서,
상기 홈 표면의 세척은 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 수행하는 것을 특징으로 하는 세포 스페로이드 형성방법.
- 제7항에 있어서,
상기 홈 표면에 세포를 파종하는 단계에서,
홈 당 세포 수는 500 내지 2,500개인 것을 특징으로 하는 세포 스페로이드 형성방법.
- 제7항에 있어서,
상기 세포 스페로이드 형성방법으로 제조되는 스페로이드의 평균 직경은 100 내지 500 ㎛인 것을 특징으로 하는 세포 스페로이드 형성방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180086267A KR102106805B1 (ko) | 2018-07-24 | 2018-07-24 | 세포 스페로이드 형성용 구조체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 스페로이드 형성방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180086267A KR102106805B1 (ko) | 2018-07-24 | 2018-07-24 | 세포 스페로이드 형성용 구조체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 스페로이드 형성방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200011325A KR20200011325A (ko) | 2020-02-03 |
| KR102106805B1 true KR102106805B1 (ko) | 2020-05-06 |
Family
ID=69627204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180086267A Active KR102106805B1 (ko) | 2018-07-24 | 2018-07-24 | 세포 스페로이드 형성용 구조체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 스페로이드 형성방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102106805B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102546018B1 (ko) * | 2021-05-26 | 2023-06-20 | 중앙대학교 산학협력단 | 라만 분광법을 활용하여 세포 밀도에 따른 줄기세포 스페로이드의 분화 정도를 분석하는 방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008054621A (ja) * | 2006-09-01 | 2008-03-13 | Hokkaido Univ | 非スフェロイド化幹細胞の調製方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101416636B1 (ko) * | 2012-05-09 | 2014-07-10 | 경희대학교 산학협력단 | Ｐｄｍｓ 구조체, 이를 이용한 세포 배양기 및 그 제조방법 |
| KR101718920B1 (ko) | 2015-06-30 | 2017-03-23 | (주) 마이크로핏 | 다각형 마이크로 플레이트, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법 |
| KR101796765B1 (ko) * | 2015-10-02 | 2017-11-13 | 순천향대학교 산학협력단 | 스페로이드형 세포집합체를 함유하는 난소기능 개선용 약학조성물 및 이의 제조방법 |
-
2018
- 2018-07-24 KR KR1020180086267A patent/KR102106805B1/ko active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008054621A (ja) * | 2006-09-01 | 2008-03-13 | Hokkaido Univ | 非スフェロイド化幹細胞の調製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200011325A (ko) | 2020-02-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Białkowska et al. | Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures—examples of methods of preparation and the most important application | |
| Zhao et al. | A platform for generation of chamber-specific cardiac tissues and disease modeling | |
| Manini et al. | Role of microenvironment in glioma invasion: what we learned from in vitro models | |
| Unal et al. | Micro and nano-scale technologies for cell mechanics | |
| US10725021B2 (en) | Muscle chips and methods of use thereof | |
| JP5602718B2 (ja) | 三次元マイクロ流体プラットホームおよびその使用方法 | |
| Chen et al. | Naked liquid marbles: a robust three-dimensional low-volume cell-culturing system | |
| WO2006084242A9 (en) | Tissue sensor and uses thereof | |
| Lee et al. | Substrate curvature restricts spreading and induces differentiation of human mesenchymal stem cells | |
| Strobel et al. | Vascularized tissue organoids | |
| Tan et al. | Development and evaluation of microdevices for studying anisotropic biaxial cyclic stretch on cells | |
| Castellanos-Montiel et al. | An optimized workflow to generate and characterize iPSC-derived motor neuron (MN) spheroids | |
| Agrawal et al. | Devices and techniques used to obtain and analyze three‐dimensional cell cultures | |
| Bu et al. | In vitro characterization of dental pulp stem cells cultured in two microsphere-forming culture plates | |
| Millet et al. | Coupling microfluidic platforms, microfabrication, and tissue engineered scaffolds to investigate tumor cells mechanobiology | |
| Liu et al. | Integrated manufacturing of suspended and aligned nanofibrous scaffold for structural maturation and synchronous contraction of HiPSC-derived cardiomyocytes | |
| Steinberg et al. | Rapid clearing for high resolution 3D imaging of ex vivo pancreatic cancer spheroids | |
| Brady et al. | Role of SHH in patterning human pluripotent cells towards ventral forebrain fates | |
| Rosner et al. | Human embryo models and drug discovery | |
| KR102106805B1 (ko) | 세포 스페로이드 형성용 구조체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 스페로이드 형성방법 | |
| Roh et al. | Construction of a fibroblast-associated tumor spheroid model based on a collagen drop array chip | |
| Yan et al. | A rapid-patterning 3D vessel-on-chip for imaging and quantitatively analyzing cell–cell junction phenotypes | |
| Kim et al. | Genetically engineered phage induced selective H9c2 cardiomyocytes patterning in PDMS microgrooves | |
| Mattiassi et al. | The combined effects of topography and stiffness on neuronal differentiation and maturation using a hydrogel platform | |
| US20170370908A1 (en) | Brain in vitro models, devices, systems, and methods of use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20180724 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20191126 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20200423 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20200427 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20200427 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20240328 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20250317 Start annual number: 6 End annual number: 6 |