WO2006123570A1

WO2006123570A1 - 細胞培養容器

Info

Publication number: WO2006123570A1
Application number: PCT/JP2006/309474
Authority: WO
Inventors: Go Tazaki; Taiji Nishi; Motohiro Fukuda; Yasuzo Kirita
Original assignee: Kuraray Co., Ltd.
Priority date: 2005-05-17
Filing date: 2006-05-11
Publication date: 2006-11-23
Also published as: EP1882736A1; TW200720432A; JPWO2006123570A1; KR101190039B1; CN201080483Y; US20090075366A1; KR20090024221A; EP1882736A4; TWI390039B

Abstract

　細胞培養に適した形状を有する細胞培養容器を提供することができ、さらに安価で観察が容易な細胞培養容器を提供する。本発明にかかる細胞培養容器１００は、蓋体１０と、容器本体２０と、板状基板３０を備えている。蓋体１０は、容器本体２０の開口部２１を覆う。容器本体２０は、細胞等の被培養物を収容する。板状基板３０は、容器本体２０の底部２３に形成された貫通孔２４を覆う。さらに、板状基板３０には、被培養物を培養するための微細凹凸パターンが形成されている。

Description

明細書

細胞培養容器

技術分野

[0001] 本発明は、薬物などの効果判定やその毒性を試験する場合に、培養細胞を用いて行うバイオアツセィ法、および治療を目的とした細胞の培養方法に用いられる細胞培養容器に関するものである。

背景技術

[0002] 組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、バイオテクノロジー関連分野では欠力せない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索および薬効の判定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられている。

単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くは細胞培養の方法により培養皿や試験管のなかで培養が行われている。この培養系のなかで種々の検査が行われる。

[0003] これらのアツセィは、通常均一な培養系を設定し、評価する薬物等の量、濃度などを変えてその効果をみるものである。そのため培養に用いる培養器も一定の均一に形成されたものが用いられる。この培養器は、培養皿というものが一般的に用いられる。培養皿として一般的に用いられているものには、シャーレ、または 6ゥエルプレート、 12ゥエル、 48ゥエル、 96ゥエルの各プレートがある（特許文献 1参照）。最近の微量化への流れから、更に小口径で多数の培養皿力なる 384ゥエルプレートも使用され始めている。

また、被培養物の所定部位の位置特定を可能とするためにグリッド座標が設けられた培養容器も提案されている (特許文献 2参照)。これらの培養皿や培養容器の底部は平坦な平板状である。

[0004] しカゝしながら、組織細胞の培養は、底部が平板状の細胞培養皿や培養容器で行うと、細胞が薄く伸びて方向性のない形態を取り、生体内で持っていた機能を示さなくなってしまう問題を有していた。細胞の活性を確認する方法として、老廃物の排出による PHの変化や、炭酸ガスの放出を電気化学センサ等で測定が可能である。生体組織の測定データと、培養皿で培養した細胞の測定データを比較することが試みられているが、生体組織のデータを再現する値が、培養皿では再現できていないのが現状である。理由として、 1個のゥヱルプレートは容器形状である力数ミクロン力数 10ミクロンのサイズである細胞にとっては、平板上での培養と変わらないことが考えられる。特に、培養が難しい、例えば肝細胞等の組織細胞の増殖では、生体内で持つていた機能をさせることが更に困難となる。

[0005] 係る問題を解決する方法として、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微細な容器ノターンを形成し、その微細な容器パターン内で細胞を培養させることが試みられている（特許文献 3参照)。細胞を微細容器パターン内で培養し、立体的に細胞を増殖させることで、生体内で持っていた機能を発現しょうとするものである。

[0006] し力しながら、この方法は、一部のバイオアツセィ法、または一部の治療を目的とした細胞培養にし力適用できないことが現状である。例えば、生体の心臓における心筋細胞は、脳からの電気シグナルの伝達によって、拍動している。生体の心筋細胞は、その拍動機能を行うために、方向性を持った配列で構成されている。したがって、ノィォテクノロジー分野のなかで、人工臓器の組織再生に関する研究では、生体組織と同様、伸展方向が制御された細胞培養が必要とされるのに対し、現状の培養皿上での培養は、立体的な培養が困難であることに加え、伸展方向が制御できないため、研究試験の目的においても適用できない問題を有している。

[0007] また、治療を目的とした心筋培養の一つに、心筋梗塞により壊死した心筋組織の一部に、培養された心筋組織を移植することで、救命するための研究が行われている。心臓は、脳力もの電気シグナルによって、心臓全体が大きく拍動している。心筋梗塞により、一部の心筋組織が壊死すると、心筋内での信号伝達が遮断されるため、心臓は細動といわれる小さな収縮を繰り返すことになる。この結果、心臓内への血液の滞留によって、血栓が生じ、脳組織に運ばれた場合は、脳梗塞といった 2次的な症例を引き起こすことになる。細動が長期に至れば、死に至る可能性もある。この治療においては、人工臓器そのものを完成することが目的でなぐ一部の組織の代替であるために、早期に実現することが望まれている。 [0008] し力しながら、現状の培養皿上での培養は、立体的な培養が困難であることにカロえ、伸展方向が制御できないため、この目的においても適用できない問題を有している

[0009] 特許文献 1 :特開平 11 169166号公報

特許文献 2：特開 2001— 17157号公報

特許文献 3：特開平 8— 322593号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0010] 上述のように、従来の細胞培養容器にお!ヽて細胞培養を行なうと、細胞が薄く伸びて生体内で有していた機能を示さなくなってしまうという問題がある。

本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、細胞培養に適した形状を有する細胞培養容器を提供することを第 1の目的とする。さらに、安価で観察が容易な細胞培養容器を提供することを第 2の目的とする。

課題を解決するための手段

[0011] かかる目的を達成するために、本発明にかかる細胞培養容器は、少なくとも被培養物を収容する容器本体と、前記容器本体の開口部を覆う蓋体と、前記容器本体の底部に形成された貫通孔を覆う板状基板とを備えた細胞培養容器であって、前記板状基板には、前記被培養物を培養するための微細凹凸パターンが形成されたものである。

[0012] 本発明にかかる他の観点による細胞培養容器は、被培養物を収容する容器本体と、前記容器本体の開口部を覆う蓋体を備えた細胞培養容器であって、前記容器本体の底部には、前記被培養物を培養するための微細凹凸パターンが形成されたものである。

[0013] ここで、前記板状基板の厚さは、前記容器本体の底部の厚さよりも薄いことが好ましぐ特に、前記板状基板の厚さは、 0. 03mm〜： Lmmであることが望ましい。

[0014] また、前記微細凹凸パターンにより形成され、被培養物が配置、培養される空間構造の幅力0. 01 μ m〜1000 μ m、長さ力 0. 01 μ m〜1000 μ m、高さ力0. Ol ^ m 〜： LOOO /z mであることが望ましい。そして、前記微細凹凸パターンにより複数の空間構造が形成され、該空間構造は少なくとも一つの隣接する他の空間構造と互いに連通することが好ましい。

[0015] また、前記微細凹凸パターンが設けられた領域に表面処理が行われていることが望ましぐ板状基板は、透明榭脂基板であることが望ましい。そして、板状基板の面積は、前記容器本体の底部の面積の 10%〜60%であるのが好適である。

[0016] さらに、前記容器本体の底部の貫通孔の含む領域に凹部を設け、前記板状基板を当該凹部に嵌入するようにするとよい。特に、板状基板は、嵌合部材により前記凹部に着脱可能に固定されることが望ましい。また、嵌合部材は、自己接着性榭脂よりなることが好ましい。さらに、前記嵌合部材の厚さは、前記凹部の凹み以上であることが望ましい。

[0017] ここで、前記底面部に設けられた貫通孔は円形又は四角形であることが望ましぐ前記板状基板の形状が円形又は四角形であることが望ましい。さらに、前記蓋体又は容器本体に灌流のための開口を設けるとよい。発明の効果

[0018] 本発明によれば、細胞培養に適した形状を有する細胞培養容器を提供することができ、さらに、安価で観察が容易な細胞培養容器を提供することができる。

図面の簡単な説明

[0019] [図 1]本発明にかかる細胞培養容器の一部断面図である。

[図 2]本発明にかかる細胞培養容器の蓋体の一部断面図である。

[図 3]本発明にかかる細胞培養容器の容器本体の一部断面図である。

[図 4]本発明にかかる細胞培養容器の一部拡大断面図である。

[図 5]本発明にかかる細胞培養容器の一部拡大断面図である。

[図 6A]本発明にかかる細胞培養容器の一部拡大断面図である。

[図 6B]本発明にかかる細胞培養容器の一部拡大断面図である。

[図 7]本発明にかかる細胞培養容器の一部拡大断面図である。

[図 8]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す上面図である。

[図 9]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す上面図である。

圆 10]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す上面図である。

圆 11A]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す上面図である。

圆 11B]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す断面図である。

圆 12A]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す上面図である。

圆 12B]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す一部拡大上面図である。

圆 12C]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す一部拡大断面図である。

圆 13]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。

圆 14]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。

圆 15]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。

圆 16]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。

圆 17]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。

圆 18]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。

圆 19]本発明にかかる細胞培養容器の板状基板に形成された微細凹凸パターン構造を示す斜視図である。

符号の説明 [0020] 10 蓋体

20 容器本体

30 板状基板

40 嵌合部材

100 細胞培養容器

発明を実施するための最良の形態

[0021] 組織細胞の培養を市販されてヽる細胞培養皿 (シャーレ、またはゥエルプレート）上で行うと、培養細胞は薄く伸びて方向性のない形態を取る。研究者は、細胞の活性を確認する方法として、老廃物の排出による PHの変化や、炭酸ガスの放出を電気化学センサ等によって、生体組織の測定データと、培養皿で培養した細胞の測定データとを比較することを試みているが、生体組織のデータを示す値が、培養皿では再現できていないのが現状である。したがって、市販されている細胞培養皿上での培養では、生体内では持っていた機能を培養細胞が示していないと判断されている。そこで、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微細な容器パターンを形成し、その微細な容器パターン内で細胞を培養し、立体的に細胞を増殖させることで、生体内で持っていた機能を発現せしめるための研究が開始されたところである。

[0022] し力しながら、微細な容器パターンを有する培養皿上で培養した細胞力もなる組織を、実際に治療に適用しようと考えた場合、培養細胞力もなる組織の構造が生体と同じ配列構造を示して!/、な!、ため、細胞の立体的な培養が可能になっても治療用途に適用するには大きな障害が存在しているのが現状である。例えば、心筋梗塞により一部の心筋組織が壊死した結果、心筋内での信号伝達が遮断され、心臓が細動を引き起こす症例に適用する場合、心筋細胞の伸展方向が制御された組織を移植するのでなければ、心筋の信号伝達を回復させ、正常な心臓の拍動を再生させることができない。

[0023] 本発明に係る細胞の培養方法によると、微細凹凸パターンを設けることにより、立体的な増殖が可能であることにカ卩え、培養細胞の伸展方向が制御でき、かつ個々の空間構造で培養した細胞が連結することにより、生体組織と同様な組織を、所望の面積、厚さで得ることが可能となる。すなわち、医師、医工学の研究者、患者の望む培養組織を実現できる。微細凹凸パターンは、例えば、側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を配置するための複数の空間構造を有し、さらに、側壁に開口部を設けることで、複数の空間構造が連通した連結構造を形成すること〖こより、実現可能である。

側壁を複数有することで、複数の空間構造を作製し、要求される用途に応じて空間構造のエリアサイズを設定する。

[0024] 細胞培養にお、て、擬似足場となる接着斑は、側壁面および Zある、は空間構造面に形成される。そして、細胞は空間構造内の中央で立体的に生育し、骨格構造を形成する。対向する側壁にも伸展した細胞は、開口部によって、それぞれの空間構造で培養された細胞どうしが結合し、伸展方向が制御された培養組織を製造することが可能となる。培養する細胞種に応じ、側壁、空間構造、開口部の寸法を設定することにより、多様な培養系において伸展方向の制御が可能になると推測される。開口部とは、側壁によって形成された空間構造どうしが、連結するための構造を開口部とする。例えば、側壁どうしの隙間、側壁の凹み構造、側壁の内部に形成されたトンネル構造等も開口部として細胞の接着斑どうしを結合するのに有効である。

[0025] 板状基板や細胞培養容器の底部に形成された側壁、および側壁によって形成される空間構造の寸法は、細胞を培養する目的において最適な範囲であることが必要である。側壁によって形成される空間構造が、大きすぎると、細胞は平板上での培養と同様、薄く伸びて立体的な構造を示さず、その伸展方向を制御することはできない。空間構造が小さすぎると、その空間構造に細胞が入ることができなくなる。したがって、空間構造の寸法は、培養する細胞種に応じて、単一、または複数個が収納できる範囲とすることが望ましい。

[0026] 本発明にかかる細胞培養容器の構造を図を用いて説明する。図 1は、蓋体を装着した状態の細胞培養容器を示す一部断面図である。本発明にカゝかる細胞培養容器 100は、蓋体 10、容器本体 20、板状基板 30を備えている。蓋体 10を装着した状態の細胞培養容器 100は、円柱状の形状を有し、その上面及び底面の直径は例えば 20mm〜80mmであり、高さは 5mm〜40mmである。

[0027] 蓋体 10は、図 2の一部断面図に示されるように、上面部 11と側壁部 12を有している。本例の上面部 11は、正円形状の平板からなる。側壁部 12は、上面部 11の縁部力略垂直に円筒状に突出して形成される。図 2において下側に開口を有するように、側壁部 12が形成されている。この例に力かる蓋体 10は、円筒状の形状を有しているが、四角筒状の形状を有していてもよい。側壁部 12により形成された開口には、後述する容器本体 20の側壁部 22が嵌入される。図 1に示されるように、この例にかかる蓋体 10の側壁部 12の高さは、容器本体 20の側壁部 22の高さよりも低いため、嵌合状態において、蓋体 10の側壁部 12の先端部は、容器本体 20の側壁部 22の中間付近に位置する。

[0028] 図 3に示されるように、容器本体 20は、側壁部 22と底部 23を備え、上方に開口した開口部 21が形成される。容器本体 20の開口部 21内に被培養物や培養液が収容される。開口部 21は、蓋体 10を装着することによって覆われ、密閉状態となる。本例の底部 23は、その中央部に貫通孔 24が形成され、リング状の平板力もなる。本例の貫通孔 24は、円形であるが、四角形等の多角形であってもよい。側壁部 22は、底部 23 の縁部力も略垂直に円筒状に突出して形成される。図 3において上側に開口部 21を形成するように、側壁部 22が形成されている。

[0029] 容器本体 20の側壁部 22には、灌流するための貫通孔（開口）を設けてもよい。灌流するための貫通孔は、入口及び出口ともに容器本体 20の側壁部 22に設けてもよいが、入口は蓋体 10の上面部 11に設けてもよ!、。

蓋体 10や容器本体 20は、例えばプラスチック素材やガラスよりなる。蓋体 10ゃ容器本体 20は、精度が要求されないため、板状基板 30よりも安価な素材を用いることが望ましい。

[0030] 板状基板 30は、容器本体 20とは別体で構成されてヽる。このため、蓋体 10や容器本体 20とは異なる材料により微細加工が必要な板状基板 30の材料を選択することができる。例えば、蓋体 10や容器本体 20に安価な素材を用い、微細加工が必要な板状基板 30に高価な素材を用いることによって細胞培養容器を全体として安価かつ精度よく製造することが可能となる。

[0031] 板状基板 30の一面には、微細な凹凸パターンが形成されている。この板状基板 30 の微細な凹凸パターンが形成された面上に被培養物が配置され、培養される。微細凹凸パターンは、被培養物を培養するために形成され、より詳細には、被培養物に対して接着、増殖、分化、伸展、配向等の制御を行うために形成されている。特に、板状基板 30は平板であるため、細胞培養容器の底部に微細凹凸パターンを形成する場合と比較して、微細凹凸パターンを容易に形成することができる。微細凹凸バターンの具体的な構造については後に詳述する。

[0032] 板状基板 30は、容器本体 20の底部 23に形成された貫通孔 24を覆うような大きさを有する。本例の板状基板 30は、当該貫通孔 24が円形であるため、当該貫通孔 24 よりも直径が大きい円形の平板よりなる。板状基板 30の形状は円形でなくとも、四角形などの多角形状であってもよい。板状基板 30の面積は、板状基板 30の破壊を防止するという観点から、底面部 23の面積の 20%〜60%程度がよぐより好ましくは、 40%〜60%程度がよい。 20%未満であると、被培養物を培養する面積が小さくなり、 60%を越えると板状基板の貼り合せが難しいためである。

[0033] ここで、図 4は図 1の P部分を拡大した断面図である。図 4に示されるように、容器本体 20の底部 23の貫通孔 24の近傍は、板状基板 30が嵌入される凹部 231が設けられている。即ち、底部 23の厚みは、貫通孔 24の近傍において他の部分よりも薄く形成されている。凹部 231は、円形に切り欠かれた形状を有している。凹部 231の直径 aは、例えば 10mm〜50mmであり、貫通孔 24の直径 bは 5〜40mmである。板状部材 30は、凹部 231に例えば接着剤により接着固定される。このように、底部 23に凹部 231を設けることによって、板状基板 30を容器本体 20に貼り合せるときの位置合わせが容易になり、これによつて被培養物の培養中に接着剤等の染み出しを防止できる。

[0034] 板状基板 30の厚さは、例えば、 0. 03mm〜： Lmmであり、より好ましくは、 0. lmm 〜0. 3mmである。 0. 03mm未満であると、微細凹凸パターンの加工が難しぐ lm mを越えると顕微鏡観察において充分な焦点距離が得られないためである。特に、被培養物を顕微鏡等を用いて高倍率により観察する場合には、倍率に応じた厚さを選択することが好ましい。特に、対物レンズが 100倍以上の高倍率により被培養物を観察する場合には、 0. 2mm以下の板厚であることが望ましい。

[0035] 図 5に示されるように、板状基板 30を嵌入するための凹部 232を内側に設けてもよい。この場合には、内側力も板状基板 30が凹部 232内に嵌入される。このとき、板状基板 30の厚さを凹部 232の凹み以上とすることで、灌流の際に培養液が滞留する影響を抑制できる。

[0036] さらに、図 6Aに示されるように、内側に設けられた凹部 232に嵌入された板状基板 30を押圧固定する嵌合部材 40を設けるようにしてもよい。嵌合部材 40は、図 7に示されるように、外側に設けられた凹部 233に板状基板 30を押圧固定する場合にも用いられる。

また、図 6Aに示すように、嵌合部材 40の内径を凹部 23における貫通孔の内径より小さくすることにより、嵌合部材 40の反対側から板状基板 30に押圧して板状基板 30 を取り外す場合、被培養物を培養してヽる微細パターン領域にダメージを与えることなく容易に板状基板 30を取り外すことが可能となる。

[0037] 本例の嵌合部材 40は、中央部に貫通孔が設けられたリング形状を有し、市販のシール材により形成可能である。嵌合部材 40は、例えば、自己粘着性を有するポリジメチルシロキサン等のシリコンゴム系榭脂よりなる。

[0038] このように、嵌合部材 40により板状基板 30を固定する構成を採用することによって、被培養物を培養後、板状基板 30のみを取り外し、移植等を行なうことができる。

[0039] 板状基板 30は、気泡を排除し、細胞を固定ィ匕するために、表面処理を施すことが好ましい。気泡を排除し、基板表面に培養液を接触させるためには、基板表面を親水化することが効果的である。基板表面を親水化するための表面処理の方法は、種々の方法が適用できる。例えば、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射などを用いる方法、親水性の高分子材料を水溶液に溶解させコートする方法、蒸着重合、プラズマ重合などがあげられる。また、コートした高分子材料の培養液中への耐溶解性を高める方法としては、基板表面の官能基にコート材料をグラフトさせる方法が知られている。

[0040] 細胞を固定ィ匕するには、基板表面の疎水化、不活性金属の成膜、をまたは細胞の付着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法が挙げられる。疎水化の方法として、例えば、スパッタリング、蒸着などによる疎水性金属の成膜、蒸着重合、プラズマによる高分子材料の成膜などがあげられる。不活性金属の成膜には、例えば、金を蒸着、またはスパッタリングする方法などがあげられる。また、表面処理の際、一部分を被覆しておき、任意の部分を改質することも可能である。

[0041] 板状基板 30に使用される材質は、表面処理の効率から、プラスチック素材が好適である。板状基板 30は、 2P榭脂により微細凹凸パターンを形成したガラス基板であつてもよい。また、細胞の成長過程を観察していく場合、例えば蛍光顕微鏡を用いて観察するときには透過光観察が可能な透明材料が好ましい。榭脂材料としては特に限定されないが、例えば、アクリル系榭脂、スチレン系榭脂、アクリル 'スチレン系共重合榭脂（MS榭脂）、ポリカーボネート系榭脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリダリコール酸などのエステル系榭脂、ポリビュルアルコールエチレン 'ビュルアルコール共重合榭脂などの酢酸ビニル系榭脂、スチレン系エラストマ一などの熱可塑性エラストマ一、塩ィ匕ビュル系榭脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン榭脂、ポリビニルブチラール系榭脂、ポリエチレン、シクロォレフイン等のォレフィン系榭脂等を挙げることができる。これら榭脂はさらに他モノマーが共重合したものであってもよい。

[0042] 細胞培養容器 100および板状基板 30をプラスチック素材により成形する場合には、成形方法は、金属構造体を型として、榭脂成形品を形成する方法が好適である。金属構造体は、細胞培養容器 100では、例えば、鋼材をボールエンドミルにより切削加工を実施することにより形成できる。板状基板 30では、例えば、 UV光を露光光源としたフォトリソグラフ法によりレジストパターン体を作製、その表面にスパッタリング法によりニッケルを堆積させた後、電気メツキを実施することにより形成できる。

[0043] 榭脂成形品の形成方法は特に限定されな!ヽが、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。蓋体 10·容器本体 20については射出成形により成形し、精度が要求される板状基板 30についてはプレス成形により成形することが望まヽ。所定の寸法を選択した金属構造体を型として射出成形で榭脂成形品を形成する場合、金属構造体の形状を高！ヽ転写率で榭脂成形品に再現することが可能である。転写率を確認する方法としては、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡 (SEM)、透過電子顕微鏡 (TEM)等を使用して行うことができる。 [0044] これらの榭脂は必要に応じて滑剤、光安定剤、熱安定剤、防曇剤、顔料、難燃剤、帯電防止剤、離型剤、ブロッキング防止剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤などの 1種または 2種以上を含有することができる。

[0045] 次に、図 8を用いて、板状基板 30に形成された微細凹凸パターンの構造例について説明する。図 8は、板状基板 30の上面図である。図に示されるように、複数の側壁 31が格子状に形成されている。側壁 31と隣接する側壁 31の間に開口部 32が設けられている。 4つの側壁 31に囲まれた領域が空間構造 33である。この例では、空間構造 33は全て同じ面積を有してる。

[0046] 細胞を培養するための空間構造 33において、側壁 31の壁部または空間構造 33の底部などに細胞の増殖を促進するためのさらに微細な凹凸パターンを有してもよい。この微細な凹凸パターンを有することで、細胞の固定ィ匕に必要な擬似足場と呼ばれる接着斑が形成しやすくなり、細胞の分化、増殖を促進することが可能となる。

[0047] 空間構造 33の幅は、好ましくは 0. 01 μ m〜1000 μ mであり、さらに好ましくは、 5 μ m〜500 μ mである。空間構造 33の長さは、好ましくは 0. 01 μ m〜1000 μ mであり、さらに好ましくは、 5 μ m〜500 μ mである。空間構造 33の高さは、好ましくは 0 . 01 μ m〜1000 μ mであり、さらに好ましくは、 5 μ m〜500 μ mである。佃 J壁 31の幅は、好ましくは 0. 01 μ m〜1000 μ mであり、さらに好ましくは、 1 μ m〜500 μ m である。側壁 31の長さは、好ましくは 0. 01 μ m〜1000 μ mであり、さらに好ましくは、 1 μ m〜500 μ mである。佃 J壁 31の高さは、好ましくは 0. 01 μ m〜1000 μ mであり、さら〖こ好ましくは、 1 μ m〜500 μ mである。

[0048] 本例における側壁 31の高さは 20 μ m、幅（13)は 10 μ m、長さ（11, 14)は 60 μ mである。隣接する側壁 31の端部間の距離 (12, 15)は 40 ;ζ ΐη、隣接する平行な側壁 31 の距離 (16, 17)は 100 /z mである。微細凹凸パターンのサイズは本例に限らず、被培養物の種類等に応じて適宜選択可能である。また、微細凹凸パターンは上記のものに限られず、図 9および図 10に示すような形状でもよい。さらに、図 11A〜18に示すような形状でもよいが、それらに限定されるものではない。

[0049] 図 11Aおよび図 11Bに示す形状では、凹凸パターンは 2段の階段状に形成されている。図 11Aは平面図、図 11Bは、図 11Aの A—A'断面図である。板状基板 30の培養面には、 2段の側壁 31が形成される。すなわち、格子状に形成された第 1の側壁 311の上に直方体状の第 2の側壁 312がマトリクス状に形成されている。この第 1 の側壁 311及び第 2の側壁 312によって形成される空間が空間構造 33となる。すなわち、隣接する第 1の側壁 311の間の空間及び第 2の側壁 312の間の空間が空間構造 33になる。第 1の側壁 311と隣接する第 1の側壁 311との間及び第 2の側壁 312と隣接する第 2の側壁 312との間の空間により、細胞を培養するための空間構造 33が形成される。第 1の側壁 311及び第 2の側壁 312は底面に対して略垂直に形成されている。従って、空間構造 33は 2段の凹凸を有する階段状となる。第 1の側壁 311は、図 11Aに示すように矩形状の空間構造 33の四辺を囲むよう格子状に配置されてヽる。第 2の側壁 312は、隣接する空間構造 33の間の第 1の側壁 311の上に島状に配置されている。第 2の側壁 312は、矩形状の空間構造 33の四辺のそれぞれに対して設けられている。

[0050] 図 12A〜図 12Cに示す形状では、図 11Aおよび図 11Bに示した空間構造 33に加え、その底面に凹み 34が形成されている。図 12Aは平面図、図 12Bは図 12Aに示された点線内の構成を拡大して示す平面図、図 12Cは、図 12Bの B— B'断面図である。隣接する第 1の側壁 311の間において、底面に凹み 34が設けられている。凹み 3 4は隣接する第 1の側壁 311の間において、複数設けられている。従って、第 1の側壁 311の近傍において、板状基板 30の断面形状は、 3段の階段状となる。凹み 34は空間構造 33の底面にマトリクス状に配置されている。

[0051] 図 13の斜視図に示す形状では、 2段の階段状の側壁 31がー列に並んで設けられている。側壁 31のそれぞれは奥行き方向に延在して設けられている。隣接する側壁 31の間の空間構造 33は培養液が流れる凹溝となる。隣接する空間構造 33は、側壁 31の外側で互いに連通している。ここで、隣接する側壁 31の間の空間構造 33が細胞を培養するための培地となる。図 13に示す形状にすることによって、飛躍的な培地の確保が可能となる。なお、板状基板 30の表面上において、複数の側壁 31が配列されている方向を幅方向とし、それと直交する方向を奥行き方向とする。ここで、第 1の側壁 311と第 1の側壁 311の上に設けられた第 2の側壁 312の奥行き方向の大きさは略一致している。 [0052] 図 14の斜視図に示す形状では、 2段の階段状の側壁 31がマトリクス状に配列されている。すなわち、図 14に示す例では、第 1の側壁 311の上に、第 1の側壁 311よりも小さい第 2の側壁 312が配置された構成を有している。この第 1の側壁 311及び第 2の側壁 312からなる側壁 31がマトリクス状に配列されている。隣接する空間構造 33 は、第 1の側壁 311の上側で互いに連通している。側壁 31と側壁 31との間の空間構造 33において、細胞が培養される。すなわち、空間構造 33が細胞の培地となる。図 14に示す形状にすることによって、飛躍的な培地の確保が可能となる。

[0053] 図 15の斜視図に示す形状では、第 1の側壁 311と第 1の側壁 311よりも高い第 2の側壁 312がそれぞれ異なる箇所に設けられている。すなわち、高さの異なる第 1の側壁 311と第 2の側壁 312とが別々に設けられている。具体的には、第 2の側壁 312が板状基板 30の両端にそれぞれ設けられ、その間に複数の第 1の側壁 311が設けられている。第 2の側壁 312は、板状基板 30の端縁に沿って設けられている。第 2の側壁 312は、中央に設けられた第 1の側壁 311よりも高くなつている。すなわち、第 2の側壁 312が第 1の側壁 311の側壁 16よりも高い橋梁となる。これにより、 PHの維持、細胞からの産出物質の拡散防止が可能となる。第 1の側壁 311は、第 2の側壁 312 が設けられている方向に沿って 1列に配列されている。そして、各々の第 1の側壁 31 1は、第 2の側壁 312が設けられている方向と直交する方向に設けられている。側壁のそれぞれは奥行き方向に延在して設けられて、る。隣接する側壁の間の空間構造 33は培養液が流れる凹溝となる。これにより、第 2の側壁 312と直交する方向に培養液が流れる。すなわち、板状基板 30の中央部を介して一端力も他端へ、培養液が流れる。これにより、産出物質の拡散防止が可能となる。また、隣接する空間構造 33は、第 1の側壁 311の上側で互いに連通している。これにより、培養液を循環させることができる。

[0054] 図 16の斜視図に示す形状では、図 15に示す例と同様に、第 1の側壁 311によって形成される空間構造 33が、板状基板 30の底面に複数の凹みとして設けられている。板状基板 30の両端には、それぞれ第 2の側壁 312が設けられている。すなわち、 2 つの第 2の側壁 312はそれぞれ板状基板 30の端辺に沿って設けられている。

[0055] 図 17の斜視図に示す形状では、複数の空間構造 33が 1枚の基板上に形成されている。空間構造 33は基板面上に縦、横に並んで配列されている。この空間構造 33 の間には、溝状の開口部 32が設けられている。ここで、板状基板 30の表面上において、図 17中の横方向を幅方向とし、それと直交する縦方向を奥行き方向とする。図 1 7に示す例では、幅方向に 4つ、奥行き方向に 3つの空間構造 33が形成された板状基板 30を示している。すなわち、板状基板 30には、 12個の空間構造 33がマトリクス状に形成されている。ここでは、幅方向に隣接する空間構造 33は、 1つの開口部 32 で連通されている。一方、奥行き方向に隣接する空間構造 33は、 2つの開口部 32で連通されている。すなわち、奥行き方向に隣接する空間構造 33の間の開口部 32には、第 1の側壁 31が設けられている。この第 1の側壁 31によって、奥行き方向に隣接する空間構造 33の間の開口部 32が、 2つに区分けされている。

[0056] 図 18の斜視図に示す形状では、 2枚の基板を貼り合わせることによって板状基板 3 0を形成している。すなわち、第 1の基板 301と第 2の基板 302とを貼り合わせることによって板状基板 30が形成される。ここで、第 1の基板 301に貫通孔を形成して空間構造 33としている。この場合、第 2の基板 302の接合面力空間構造 33の底面となる。第 2の基板 302の表面には、開口部 32を形成するための微細な溝が形成される。そして、貫通孔が形成された第 1の基板 301と開口部 32が形成された第 2の基板 302 とを密着させる。このとき、第 2の基板 302の開口部 32が形成されている面が接合面となって、貼り合わせられる。第 2の基板 302の開口部 32は、隣接する貫通孔を結ぶ位置に所定の形状で設けられている。また、貫通孔は、平面形状が円形になっている。開口部 32は貫通孔が設けられている位置まで延在される。これにより、隣接する空間構造 33が底面側連通する。

[0057] 図 19の斜視図に示す形状では、複数の空間構造 33が 1枚の基板上に形成されている。空間構造 33は基板面上に縦、横に並んで配列されている。この空間構造 33 の間には、溝状の開口部 32が設けられている。ここで、板状基板 30の表面上において、図 4中の横方向を幅方向とし、それと直交する方向を奥行き方向とする。本実施例では、幅方向に 4つ、奥行き方向に 4つの空間構造 33が形成された板状基板 30 を示している。すなわち、板状基板 30には、 16個の空間構造 33がマトリクス状に形成されている。本実施例では、斜め方向に隣接する空間構造 33も開口部 32によつて連通されている。すなわち、開口部 32は、幅方向及び奥行き方向だけでなぐその間の斜め方向にも設けられている。また、本実施例では、図 18に示す例と異なり、斜め方向の開口部 32同士が交差していない。すなわち、斜め方向の開口部 32は全て同じ方向に設けられている。よって、 1つの空間構造 33に対して、その周囲に設けられた最大 6個の空間構造 33が連通される。この 6個の空間構造 33を、正六角形となるよう酉己置してちょい。

[0058] 高さが 1 m以下の凹凸パターンを形成する方法としては、例えば、サンドブラスト処理があげられ、更に小さな凹凸パターンを形成する場合には、 Arプラズマによるェツチング処理等があげられる。

高さが 1 m以上の凹凸パターンを形成する方法としては、例えば、シリコン材料、ガラス材料へのドライエッチング、ウエットエッチング等が想定できる。榭脂材料への成形方法として、例えば、押し出し成形、射出成形、ホットエンボス成形、ナノインプリント成形、ブロー成形、カレンダー成形、キャスト成形、プレス成形等が採用可能である。

[0059] 複数個の凹または凸パターンを有し、さらに、凹パターンの上部または凸パターンの底部に連通する面を有する細胞培養容器を用いて、培養細胞の伸展方向を制御することが期待される。

複数個の凹パターンを有する板状基板等を用いて細胞培養を行うと、凹パターンにおいて、連通する上部のみに培養することが可能となる。凹パターンの底部の面積が広いと、底部にも培養した細胞が伸展することとなるため、凹パターン底部の縦、横寸法の両方、または、片方を 1 μ mから 500 μ mの範囲とすることが好ましい。凹パターン底部の縦寸法のみを 1 μ mから 500 mの範囲とし、横寸法は、例えば、神経細胞や血管内皮細胞の培養において、 lmm、 10mm, 50mmと設定することにより、目的に応じた培養細胞の長さを実現することが可能となる。

[0060] 複数個の凸パターンを有する板状基板等を用いて細胞培養を行うと、凸パターンにおいて、連通する底部のみに培養することが期待される。凸パターンの上部の面積が広いと、上部にも培養した細胞が伸展することとなるため、凸パターン上部の縦、横寸法の両方、または、片方を 1 μ mから 500 mの範囲とすることが好ましい。凸パターン上部の縦寸法のみを 1 μ m力ら 500 μ mの範囲とし、横寸法は、例えば、神経細胞や血管内皮細胞の培養において、 lmm、 10mm, 50mmと設定することにより、目的に応じた培養細胞の長さを実現することが可能となる。

[0061] 凹または凸パターンの深さ、または高さは、細胞が凹凸を認識するために必要であり、 1 m〜500 μ mの範囲とすることが好ましい。

[0062] 細胞培養における擬似足場となる接着斑は、連通する面または凹凸パターンの側壁面に形成され、細胞が伸展可能な連通する面に増殖することによって伸展方向が制御されうる。

上述の例では、微細凹凸パターンを容器本体とは別体の板状基板に形成したが、これに限らず、容器本体の底部に形成するようにしてもよい。微細凹凸パターンを有する板状基板 30を備えた細胞培養容器 100以外にも、容器本体 40と板状基板 30とが一体になり、その底部に微細凹凸パターンが加工されている細胞培養容器であつてもよい。容器本体と微細凹凸パターンを一体ィ匕できるため、該細胞培養容器の成形をする上で板状基板 30を貼り合わせる工程がなぐコンタミの混入を防ぐことができる。

さらに、微細凹凸パターンに近接して培養液や試薬等の液体を導入するための流路を設けるようにしてもよい。

産業上の利用可能性

[0063] 本発明は、例えば、組織から単離した細胞を培養し、試験、検査に用いるための細胞培養容器に利用される。

Claims

請求の範囲

[1] 少なくとも被培養物を収容する容器本体と、前記容器本体の開口部を覆う蓋体と、前記容器本体の底部に形成された貫通孔を覆う板状基板とを備えた細胞培養容器であって、

前記板状基板には、前記被培養物を培養するための微細凹凸パターンが形成されている細胞培養容器。

[2] 被培養物を収容する容器本体と、前記容器本体の開口部を覆う蓋体を備えた細胞培養容器であって、

前記容器本体の底部には、前記被培養物を培養するための微細凹凸パターンが形成されて!ゝる細胞培養容器。

[3] 前記板状基板の厚さは、前記容器本体の底部の厚さよりも薄いことを特徴とする請求項 1記載の細胞培養容器。

[4] 前記板状基板の厚さは、 0. 03mm〜： Lmmであることを特徴とする請求項 3記載の細胞培養容器。

[5] 前記微細凹凸パターンにより複数の空間構造が形成され、該空間構造の幅が 0. 0 1 μ m〜1000 μ m、長さが 0. 01 μ m〜1000 μ m、高さが 0. 01 μ m〜1000 μ m であることを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の細胞培養容器。

[6] 前記微細凹凸パターンにより複数の空間構造が形成され、該空間構造は少なくとも一つの隣接する他の空間構造と互いに連通することを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の細胞培養容器。

[7] 前記微細凹凸パターンが設けられた領域に表面処理が行われていることを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の細胞培養容器。

[8] 前記板状基板は、透明榭脂基板であることを特徴とする請求項 1記載の細胞培養谷器。

[9] 前記板状基板の面積は、前記容器本体の底部の面積 20%〜60%であることを特徴とする請求項 1記載の細胞培養容器。

[10] 前記容器本体の底部の貫通孔の含む領域に凹部を設け、

前記板状基板を当該凹部に嵌入することを特徴とする請求項 1記載の細胞培養容器。

[11] 前記板状基板は、嵌合部材により前記凹部に着脱可能に固定されることを特徴とする請求項 10記載の細胞培養容器。

[12] 前記嵌合部材は、自己接着性榭脂よりなることを特徴とする請求項 11記載の細胞培養容器。

[13] 前記嵌合部材の厚さは、前記凹部の凹み以上であることを特徴とする請求項 11記載の細胞培養容器。

[14] 前記底面部に設けられた貫通孔は円形又は四角形であることを特徴とする請求項

1記載の細胞培養容器。

[15] 前記板状基板の形状が円形又は四角形であることを特徴とする請求項 1記載の細胞培養容器。

[16] 前記蓋体又は容器本体に灌流のための開口を設けたことを特徴とする請求項 1又は 2記載の細胞培養容器。