CN102337213B - 一种基于pdms的三维单细胞培养芯片及其可控制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于微细加工技术实现的三维单细胞培养芯片，属于生物微机电系统(Bio-MEMS)。本芯片包含阵列分布的腔体，各相邻腔体之间有微沟槽相连接，微沟槽深度与腔体高度一致，腔体底部包含纳米突起。本芯片利用细胞在空白PDMS表面及具有纳米微观形貌结构的PDMS表面黏附性的不同，结合表面拓扑图型，实现细胞图型化培养。该芯片无需任何化学和生物试剂即可用于细胞培养，克服了上述常用图型化方法稳定性差的缺陷，具有图型持久稳定、制备过程可控等特点，可满足批量生产的需要。同时，采用腔体之间具有微槽连接的图型化设计，可实现细胞间相互作用的研究。

Description

一种基于PDMS的三维单细胞培养芯片及其可控制备方法
所属领域
本发明涉及一种基于微细加工技术实现的三维单细胞培养芯片，属于生物微机电系统(Bio-MEMS)领域。
背景技术
微图型化单细胞培养芯片作为贴壁依赖型细胞研究及行为控制的实验性工具，在基础细胞生物学、生命科学、组织工程学以及药物筛选、基于细胞的生物传感器等领域具有广阔的应用前景。
用于实现细胞微图型化的典型代表是微接触印刷技术，是一类借助中间图型间接实现细胞图型化的方法，中间图型的稳定性直接关系到细胞图型构建的成败。由于存在蛋白质“失活”和蛋白质解吸附，以及自组装分子层不具备高度致密性等问题，细胞图型的稳定性成为该技术发展的瓶颈。Ahmi Choia等(Ahmi Choia，Jae Young Kimc，Jong Eun Leec.Et al.Effects ofPDMS curing ratio and 3D micro-pyramid structure on the formation of an invitro neural network.Current Applied Physics.2009，9，(4)：294-297.)直接在PDMS表面制备棱锥阵列，利用细胞的自重使细胞滑入沟槽中，并通过对PDMS表面进行氧等离子体处理，实现了海马神经元细胞的培养。虽然PDMS表面经氧等离子体处理后呈现出亲水性，但是，随着时间的推移将出现疏水性回复，如果不能在处理后立即进行细胞实验，将无法顺利实现细胞的黏附和增殖，即图型性质的稳定性差。
发明内容
本发明的目的是：为解决现有单细胞微图型化培养芯片存在的图型形状和图型性质稳定性差的不足，本发明提供一种稳定的三维单细胞培养芯片。
本发明的技术方案是：一种基于PDMS的三维单细胞培养芯片，包含阵列分布的腔体1，各相邻腔体1之间有微沟槽3相连接，微沟槽3深度与腔体1高度一致，腔体1底部包含纳米突起；腔体1最大内切圆直径
Figure BSA00000591404900011
满足：
Figure BSA00000591404900012
其中，
Figure BSA00000591404900013
是待培养细胞2的平均直径；腔体1高度h满足：0.5h0≤h≤2h0，其中，h0是待培养细胞2的高度平均值；相邻两个腔体1间的距离l，即腔体1中心线之间的距离满足：当应用于细胞接触性连接研究时，
Figure BSA00000591404900014
当应用于细胞非接触性连接研究时，
Figure BSA00000591404900015
其中，l0是待培养细胞2突触长度的平均值；所述微沟槽3呈90°均匀分布，微沟槽3宽度a满足：0.5μm≤a≤10μm。
所述基于PDMS的三维单细胞培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤：
步骤一：按质量或体积比为10∶1混合PDMS预聚体和交联剂，充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气，直至混合过程中产生的气泡完全排除；
步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置；所述硅模板包含立柱阵列，立柱最大外接圆直径
Figure BSA00000591404900021
满足：高度h满足：0.5h0≤h≤2h0，相邻两个立柱间的距离l满足：当应用于细胞接触性连接研究时，
Figure BSA00000591404900023
当应用于细胞非接触性连接研究时，
Figure BSA00000591404900024
立柱间有呈90°均匀分布的梁连接，梁宽度a满足：0.5μm≤a≤10μm，在立柱顶部有不规则纳米突起；
步骤三：将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化；
步骤四：将冷却后的PDMS轻轻剥下，就得到了所述基于PDMS的三维单细胞培养芯片。
本发明的有益效果是：本发明提出了一种基于PDMS材料的细胞图型化芯片结构及制备方法。利用细胞在空白PDMS表面和具有微纳复合结构的PDMS表面黏附性的差异，即空白PDMS表面不利于细胞黏附生长，而具有纳米结构的PDMS表面利于细胞生长的特性，在PDMS芯片上构建同时包含促进和抑制细胞黏附区域的图型化结构，实现细胞的定位生长；同时，采用腔体1之间具有微沟槽3连接的图型化设计，使PDMS芯片不仅可用于细胞培养，亦可用于细胞间相互作用的研究。
本发明提出的图型化细胞培养芯片，直接在PDMS表面构建图型化基底，利用PDMS表面微纳结构对细胞黏附的促进作用实现单细胞定位生长，芯片无需经过任何物理或化学修饰，即可用于细胞培养，因而具有图型性质和图型结构长期稳定、可靠的特点，克服了基于微接触印刷技术实现图型化时，图型稳定性差的缺陷；克服了目前PDMS表面需经过氧等离子体处理，且处理后须立即进行细胞实验的缺陷。该细胞培养微芯片将为贴壁依赖型细胞研究及行为控制、理解细胞功能等提供强有力的工具。
附图说明
图1为本发明提出的基于PDMS的三维单细胞培养芯片效果图
图2为本发明提出的基于PDMS的三维单细胞培养芯片结构示意图
图3为图2的局部放大图
图4为图2的A-A剖面图
图5本发明提出的硅模板结构示意图
图6为图5的A-A剖面图
图7为基于PDMS的三维单细胞培养芯片制备方法示意图
图8为硅模板制备方法示意图
图中：1.腔体，2.待培养细胞，3.微沟槽
具体实施方式：
实施例1：
本实施例中的芯片用于培养成骨细胞MC3T3-E1来进行细胞接触性连接研究。MC3T3-E1平均直径为20μm，平均高度h0为3μm，平均突触长度l0为20μm。
参阅图1～图3。本实施例中用于MC3T3-E1培养的三维单细胞培养芯片，包含阵列分布的圆形腔体1，各相邻腔体1之间有微沟槽3相连接，微沟槽3深度与腔体1高度h均为4μm；腔体1底部包含纳米突起；腔体1直径
Figure BSA00000591404900032
相邻两个腔体1间的距离l＝50μm；所述微沟槽3呈90°均匀分布，微沟槽3宽度a＝2μm。
本实施例中基于PDMS的三维单细胞培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤：
步骤一：按质量为10∶1混合PDMS预聚体和交联剂，并充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气30分钟，直至混合过程中产生的气泡完全排除；
步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置；所述硅模板包含圆柱阵列，圆柱直径
Figure BSA00000591404900033
高度h＝4μm，相邻两个立柱间的距离l＝50μm，立柱间有呈90°均匀分布的梁连接，梁宽度a＝2μm，在立柱顶部有不规则纳米突起；
所述硅模板包括微米图型结构制备和纳米结构制备两部分，其中，所述微米图型结构制备包括如下子步骤：
子步骤一：制作掩模版；
子步骤二：光刻；
子步骤三：电感耦合等离子体反应刻蚀，得到符合要求的硅微米结构；具体工艺参数为：SF6，气体流量180sccm/min，刻蚀时间14s；C4F6，气体流量85sccm/min，钝化时间7s；刻蚀/钝化循环的次数为12；刻蚀结束后，以O2作为工作气体，去除光刻胶；
所述纳米结构制备包括如下子步骤：
子步骤1：对硅片表面进行清洗，对硅片的清洗顺序是用丙酮震荡清洗10分钟，然后用乙醇震荡清洗10分钟，再用体积比为3∶1的98％的硫酸和30％的过氧化氢混合溶液清洗10分钟，最后用去离子水清洗，然后用氮气吹干；
子步骤2：将清洗过的硅片放入等体积比的4.6mol/L氢氟酸和0.01mol/L硝酸银混合溶液中，室温处理1分钟；
子步骤3：在30℃条件下，将硅片放入等体积比的2mol/L氢氟酸和0.1mol/L硝酸铁的混合溶液中，处理30分钟，得到硅微纳复合结构；
子步骤4：取出硅片，用去离子水多次漂清后用氮气吹干，得到所述硅模板；
步骤三：将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化，固化参数为：固化温度80℃，固化时间2h；
步骤四：将冷却后的PDMS轻轻剥下，就得到了所述基于PDMS的三维单细胞培养芯片。
实施例2：
本实施例中的芯片用于培养人乳腺上皮细胞HMEC来进行细胞非接触性连接研究。HMEC平均直径
Figure BSA00000591404900041
为45μm，平均高度h0为5μm，平均突触长度l0为10μm。
参阅图1～图3。本实施例中用于HMEC培养的三维单细胞培养芯片，包含阵列分布的圆形腔体1，各相邻腔体1之间有微沟槽3相连接，微沟槽3深度与腔体1高度h均为h＝7μm；腔体1底部包含纳米突起；腔体1直径
Figure BSA00000591404900042
相邻两个腔体1间的距离l＝80μm；所述微沟槽3呈90°均匀分布，微沟槽3宽度a＝5μm。
本实施例中基于PDMS的三维单细胞培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤：
步骤一：按质量为10∶1混合PDMS预聚体和交联剂，并充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气30分钟，直至混合过程中产生的气泡完全排除；
步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置；所述硅模板包含圆柱阵列，圆柱直径高度h＝7μm，相邻两个立柱间的距离l＝80μm，立柱间有呈90°均匀分布的梁连接，梁宽度a＝5μm，在立柱顶部有不规则纳米突起；
步骤三：将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化，固化参数为：固化温度90℃，固化时间2h；
步骤四：将冷却后的PDMS轻轻剥下，就得到了所述基于PDMS的三维单细胞培养芯片。

Claims (1)

1.一种基于PDMS的三维单细胞培养芯片，包含阵列分布的腔体(1)，各相邻腔体(1)之间有微沟槽(3)相连接，微沟槽(3)深度与腔体(1)高度一致，腔体(1)底部包含纳米突起；腔体(1)最大内切圆直径满足：其中，
Figure FSB00001015068500013
是待培养细胞(2)的平均直径；腔体(1)高度h满足：0.5h0≤h≤2h0，其中，h0是待培养细胞(2)的高度平均值；相邻两个腔体(1)间的距离l满足：当应用于细胞接触性连接研究时，
Figure FSB00001015068500014
当应用于细胞非接触性连接研究时，
Figure FSB00001015068500015
其中，l0是待培养细胞(2)突触长度的平均值；所述微沟槽(3)呈90°均匀分布，微沟槽(3)宽度a满足：0.5μm≤a≤10μm；
所述的基于PDMS的三维单细胞培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤：
步骤一：按质量或体积比为10∶1混合PDMS预聚体和交联剂，充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气，直至混合过程中产生的气泡完全排除；
步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置；所述硅模板包含立柱阵列，立柱最大外接圆直径满足：
Figure FSB00001015068500017
高度h满足：0.5h0≤h≤2h0，相邻两个立柱间的距离l满足：当应用于细胞接触性连接研究时，
Figure FSB00001015068500018
当应用于细胞非接触性连接研究时，
Figure FSB00001015068500019
立柱间有呈90°均匀分布的梁连接，梁宽度a满足：0.5μm≤a≤10μm，在立柱顶部有不规则纳米突起；
步骤三：将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化；
步骤四：将冷却后的PDMS剥下，得到所述基于PDMS的三维单细胞培养芯片。
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