CN108148750B - 一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法 - Google Patents

一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108148750B
CN108148750B CN201611105481.8A CN201611105481A CN108148750B CN 108148750 B CN108148750 B CN 108148750B CN 201611105481 A CN201611105481 A CN 201611105481A CN 108148750 B CN108148750 B CN 108148750B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chip
porous filter
filter membrane
polydimethylsiloxane
microfluidic chip
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611105481.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108148750A (zh
Inventor
秦建华
尹方超
王丽
朱玉娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN201611105481.8A priority Critical patent/CN108148750B/zh
Publication of CN108148750A publication Critical patent/CN108148750A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108148750B publication Critical patent/CN108148750B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09J—ADHESIVES; NON-MECHANICAL ASPECTS OF ADHESIVE PROCESSES IN GENERAL; ADHESIVE PROCESSES NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE; USE OF MATERIALS AS ADHESIVES
    • C09J5/00—Adhesive processes in general; Adhesive processes not provided for elsewhere, e.g. relating to primers
    • C09J5/02—Adhesive processes in general; Adhesive processes not provided for elsewhere, e.g. relating to primers involving pretreatment of the surfaces to be joined

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法：取多孔滤膜在顶层芯片相应观察窗的位置处进行打孔；将多孔滤膜置于玻璃片上进行紫外活化后用硅烷化处理；多孔滤膜与顶层芯片一同进行不可逆的氧等离子封接后，置于烘箱中加热；聚二甲基硅氧烷粘合方法为：在玻璃片上甩聚二甲基硅氧烷薄膜，将底层芯片的上表面进行氧等离子的处理后，蘸取聚二甲基硅氧烷聚合物薄膜，与封接有顶层芯片的多孔滤膜对齐封接粘合，置于烘箱中加热，固化完全。本发明制得的微流控芯片同时具有细胞迁移和侵袭实验用小室和微流控芯片的功能，底层芯片可直接形成拟胚体，进行向心肌或脑的定向分化，可用于具有代谢依赖性药物的评价。

Description

一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法
技术领域
本发明涉及微流控芯片的结构设计和制备技术领域，特别提供了一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法。
背景技术
现有技术中，用于细胞迁移和侵袭实验的微流控芯片即Transwell的相关实验技术，传统方法是将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。但Transwell实验因为中间膜材料的性质限制，无法直接观察下层的现象，只能通过荧光进行观察，限制了它的应用。
微流控芯片实验室又称芯片实验室或微流控芯片，指的是把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测、细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代生物仿生和细胞研究的重要平台。但传统的Transwell实验无法直接观察下层的现象，只能通过荧光进行观察，限制了它的应用。
人们迫切希望获得一种技术效果优良的原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种技术效果优良的原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法。
本发明提供了一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法，所述多功能微流控芯片是用于细胞迁移和侵袭实验的TRANSWELL微流控芯片；其特征在于：该芯片由三层芯片组成，上层芯片为带有防塌陷小柱的细胞培养室，中间层为多孔滤膜，下层为带有微阵列小柱的细胞培养室；所述微流控芯片的顶层芯片的下表面和多孔滤膜为静电吸附，底层芯片的上表面和多孔滤膜为聚二甲基硅氧烷PDMS粘合，同时底层芯片的上表面和顶层芯片的下表面进行聚二甲基硅氧烷PDMS粘合；
所述原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法依次要求如下：
取多孔滤膜在顶层芯片相应观察窗的位置处进行打孔；
将多孔滤膜置于玻璃片上进行紫外活化0.5-3小时，然后，用硅烷化处理 10～60分钟；
多孔滤膜与顶层芯片一同进行不可逆的氧等离子封接后，置于70-90°烘箱中加热30分钟；
聚二甲基硅氧烷PDMS粘合方法为：使用单体与引发剂比例为(15～25):1 的聚二甲基硅氧烷PDMS聚合物，在玻璃片上甩10um-50um厚的薄膜，将底层芯片的上表面进行氧等离子的处理后，蘸取聚二甲基硅氧烷PDMS聚合物薄膜，与封接有顶层芯片的多孔滤膜对齐封接粘合，置于70～90°烘箱中加热，15-60 分钟固化完全；
之后将封接好的芯片从烘箱中拿出后，切成需要的尺寸备用。
所述原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述多功能微流控芯片的材料为能透光透气的聚二甲基硅氧烷PDMS 聚合物，聚二甲基硅氧烷PDMS单体与引发剂比例为(5～15):1；
其二，多孔滤膜材料为聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔径为0.01um-10um；
其三，顶层芯片培养室内设置有防塌陷小柱，防止顶层芯片塌陷影响液体的流通；
其四，底层芯片内有阵列排布的微柱，其中微柱的直径为200-800μm，微柱之间的距离为50-100μm，微柱的高度为200-900μm；微阵列小柱的高度要求低于底层通道的高度，以保证下层芯片中细胞具有充足的营养；
其五，顶层芯片与底层芯片为十字交叉，多孔滤膜切割成适当尺寸粘合于交叉部位，顶层芯片通道结构延长的部位可以观察顶层细胞，底层芯片通道延长的部位可以观察底层细胞。
本发明中制得的微流控芯片同时具有Transwell小室和微流控芯片的功能，通过视窗可以直接观察底层芯片，底层芯片可直接形成拟胚体，进行向心肌或脑的定向分化，可用于具有代谢依赖性药物的评价。
本发明有以下优点：
(1)可在不同的芯片层根据实验设计接种不同细胞。
(2)可同时观察顶层芯片和底层芯片的细胞培养状况。
(3)底层芯片可高通量的原位形成拟胚体，同时向心肌或脑等进行定向分化，用于进行药物评价。
附图说明
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1为原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法制得的顶层芯片结构示意图；
图2为原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法制得的底层芯片结构示意图；
图3为底层芯片电镜图；
图4为底层芯片拟胚体形成的明场观察图。
具体实施方式
图1中附图标记含义如下：1为液体入口，2为液体出口，3为防塌陷小柱， 4是培养基入口，5是培养基出口。
实施例1
一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法，所述多功能微流控芯片是用于细胞迁移和侵袭实验的TRANSWELL微流控芯片；该芯片由三层芯片组成，上层芯片为带有防塌陷小柱的细胞培养室，中间层为多孔滤膜，下层为带有微阵列小柱的细胞培养室；所述微流控芯片的顶层芯片的下表面和多孔滤膜为静电吸附，底层芯片的上表面和多孔滤膜为聚二甲基硅氧烷PDMS粘合，同时底层芯片的上表面和顶层芯片的下表面进行聚二甲基硅氧烷PDMS粘合；
所述原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法依次要求如下：
取多孔滤膜在顶层芯片相应观察窗的位置处进行打孔；
将多孔滤膜置于玻璃片上进行紫外活化0.5-3小时，然后，用硅烷化处理10～60分钟；
多孔滤膜与顶层芯片一同进行不可逆的氧等离子封接后，置于70-90°烘箱中加热30分钟；
聚二甲基硅氧烷PDMS粘合方法为：使用单体与引发剂比例为(15～25):1 的聚二甲基硅氧烷PDMS聚合物，在玻璃片上甩10um-50um厚的薄膜，将底层芯片的上表面进行氧等离子的处理后，蘸取聚二甲基硅氧烷PDMS聚合物薄膜，与封接有顶层芯片的多孔滤膜对齐封接粘合，置于70～90°烘箱中加热，15-60 分钟固化完全；
之后将封接好的芯片从烘箱中拿出后，切成需要的尺寸备用。
所述原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述多功能微流控芯片的材料为能透光透气的聚二甲基硅氧烷PDMS 聚合物，聚二甲基硅氧烷PDMS单体与引发剂比例为(5～15):1；
其二，多孔滤膜材料为聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔径为0.01um-10um；
其三，顶层芯片培养室内设置有防塌陷小柱，防止顶层芯片塌陷影响液体的流通；
其四，底层芯片内有阵列排布的微柱，其中微柱的直径为200-800μm，微柱之间的距离为50-100μm，微柱的高度为200-900μm；微阵列小柱的高度要求低于底层通道的高度，以保证下层芯片中细胞具有充足的营养；
其五，顶层芯片与底层芯片为十字交叉，多孔滤膜切割成适当尺寸粘合于交叉部位，顶层芯片通道结构延长的部位可以观察顶层细胞，底层芯片通道延长的部位可以观察底层细胞。
本实施例中制得的微流控芯片同时具有Transwell小室和微流控芯片的功能，通过视窗可以直接观察底层芯片，底层芯片可直接形成拟胚体，进行向心肌或脑的定向分化，可用于具有代谢依赖性药物的评价。
本实施例有以下优点：(1)可在不同的芯片层根据实验设计接种不同细胞。 (2)可同时观察顶层芯片和底层芯片的细胞培养状况。(3)底层芯片可高通量的原位形成拟胚体，同时向心肌或脑等进行定向分化，用于进行药物评价。
实施例2
微流控芯片制作
取多孔滤膜在顶层芯片相应观察窗的位置处进行打孔，将多孔滤膜(2)置于玻璃片上进行紫外活化1小时，然后，用硅烷化处理30分钟，多孔滤膜(2) 与顶层芯片一同进行不可逆的氧等离子封接后，置于80度烘箱中加热30分钟。使用单体与引发剂比例为20:1的PDMS聚合物，在玻璃片上甩10um-50um厚的薄膜，将底层芯片的上表面进行氧等离子的处理后，蘸取薄PDMS，与封接有顶层芯片的多孔滤膜对齐粘合，置于80度烘箱中加热，30分钟固化完全。将封接好的芯片从烘箱中拿出后，切成需要的尺寸。
实施例3
细胞接种和诱导
将芯片放在培养皿中，紫外灭菌2h，用移液枪将细胞培养基从芯片入口处加入，使培养基充满整个细胞培养室。放入真空泵中抽真空，除掉细胞培养室中的气泡。将六孔板中的Hips细胞用ReLeSR进行消化，细胞从壁上脱落后，终止消化，将培养瓶中的细胞悬液吸入离心管中进行离心，离心后，吸走上清液扔掉，加入新的培养基使细胞重悬，用移液枪吸取细胞悬液，从芯片下层液体入口处加入，从液体出口处吸走对应体积的培养基，在培养皿中加入培养基，减少芯片中培养基的挥发。将培养皿放在37℃的培养箱中保持静止24h，使细胞形成拟胚体，然后进行心肌细胞的定向分化，即第一天加入12微摩尔的 CHIR99021作用24小时，第4天加入12微摩尔IWP2作用2天，前6天使用 1640/B27减低胰岛素培养基，第七天开始使用1640/B27培养基。心肌细胞在第十天时开始跳动。
实施例4
心肌跳动一周后，开始接种上层细胞，将培养瓶中的HePG2细胞用胰酶进行消化，细胞从壁上脱落后，终止消化，将培养瓶中的细胞悬液吸入离心管中进行离心，离心后，吸走上清液扔掉，加入新的培养基使细胞重悬，用移液枪吸取细胞悬液，从顶层芯片液体入口1处加入细胞悬液，从液体出口2处吸走对应体积的培养基，进行置换，重复三次后，可认为底层顶层中已充满细胞悬液，放入培养箱中，使细胞贴壁生长。

Claims (2)

1.一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法，所述多功能微流控芯片是用于细胞迁移和侵袭实验的微流控芯片；其特征在于：该芯片由三层芯片组成，上层芯片为带有防塌陷小柱的细胞培养室，中间层为多孔滤膜，下层为带有微阵列小柱的细胞培养室；所述微流控芯片的顶层芯片的下表面和多孔滤膜为静电吸附，底层芯片的上表面和多孔滤膜为聚二甲基硅氧烷粘合，同时底层芯片的上表面和顶层芯片的下表面进行聚二甲基硅氧烷粘合；
所述原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法依次要求如下：
取多孔滤膜在顶层芯片相应观察窗的位置处进行打孔；
多孔滤膜通过静电吸附粘附在顶层芯片的下表面；
聚二甲基硅氧烷粘合方法为：使用单体与引发剂比例为(15～25):1的聚二甲基硅氧烷聚合物，在玻璃片上甩10μ m -50μ m 厚的薄膜，将底层芯片的上表面进行氧等离子的处理后，蘸取聚二甲基硅氧烷聚合物薄膜，与封接有顶层芯片的多孔滤膜对齐封接粘合，置于70～90℃ 烘箱中加热，15-60分钟固化完全。
2.按照权利要求1所述原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述多功能微流控芯片的材料为能透光透气的聚二甲基硅氧烷聚合物，聚二甲基硅氧烷单体与引发剂比例为(5～15)：1；
其二，多孔滤膜材料为聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔径为0.01μ m -10μ m ；
其三，顶层芯片培养室内设置有防塌陷小柱，防止顶层芯片塌陷影响液体的流通；
其四，底层芯片内有阵列排布的微柱，其中微柱的直径为200-800μm，微柱之间的距离为50-100μm，微柱的高度为200-900μm；微阵列小柱的高度要求低于底层通道的高度，以保证下层芯片中细胞具有充足的营养；
其五，顶层芯片与底层芯片为十字交叉，多孔滤膜切割成适当尺寸粘合于交叉部位，顶层芯片通道结构延长的部位可以观察顶层细胞，底层芯片通道延长的部位可以观察底层细胞。
CN201611105481.8A 2016-12-05 2016-12-05 一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法 Active CN108148750B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611105481.8A CN108148750B (zh) 2016-12-05 2016-12-05 一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611105481.8A CN108148750B (zh) 2016-12-05 2016-12-05 一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108148750A CN108148750A (zh) 2018-06-12
CN108148750B true CN108148750B (zh) 2021-10-15

Family

ID=62470051

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611105481.8A Active CN108148750B (zh) 2016-12-05 2016-12-05 一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108148750B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7128492B2 (ja) * 2018-10-29 2022-08-31 Nok株式会社 マイクロ流体チップおよびマイクロ流体デバイス

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011500018A (ja) * 2007-10-11 2011-01-06 エージェンシー フォー サイエンス， テクノロジー アンド リサーチ ケージ中で一時的リンカーを用いて細胞構造体を形成する方法
WO2009148507A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-10 Corning Incorporated Cell culture apparatus having variable topography
US20100190242A1 (en) * 2009-01-23 2010-07-29 Dr.Andrea Adamo System for division of a volume of liquid into drops and subsequent drop recollection
US20130096029A1 (en) * 2011-09-06 2013-04-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Multiplexed in vivo screening of biological samples
CN102337213B (zh) * 2011-10-13 2013-06-05 西北工业大学 一种基于pdms的三维单细胞培养芯片及其可控制备方法
CN102721820B (zh) * 2012-05-21 2013-11-13 浙江大学 一种制备具有集成化气动微阀的组装式高聚物微流控芯片的方法
US20140141503A1 (en) * 2012-11-20 2014-05-22 Corning Incorporated Cell culture substrate having uniform surface coating
CN102967890B (zh) * 2012-11-20 2015-03-11 中国科学院大连化学物理研究所 一种简易的pdms聚合物微透镜阵列的制备方法及应用
CN103146650B (zh) * 2013-02-23 2015-06-10 大连理工大学 基于微流控技术的两步构建三维神经干细胞模型的方法
CN103255057B (zh) * 2013-05-08 2014-12-17 重庆大学 一种细胞培养微流控芯片及其制备方法和应用
EP2896457B1 (en) * 2014-01-15 2017-08-23 IMEC vzw Microstructured micropillar arrays for controllable filling of a capillary pump
CN104388310B (zh) * 2014-10-31 2016-04-27 青岛大学附属医院 一种细胞联合培养芯片
WO2016148656A1 (en) * 2015-03-18 2016-09-22 National University Of Singapore Neurogenesis of dopaminergic neurons

Also Published As

Publication number Publication date
CN108148750A (zh) 2018-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107109341B (zh) 用于生成和培养3d细胞聚集体的方法和装置
Gao et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research
US20160161392A1 (en) Methods and apparatus for the manipulation of particle suspensions and testing thereof
US20080057561A1 (en) Cell culture treatment apparatus and cell culture treatment method
US10155923B2 (en) Microorganism culture device and method of operation thereof
US20210403853A1 (en) Methods for dynamic evolution and monitoring of characteristics in living cells using a microfluidic-enabled multi-well cell culture devices and systems
CN108499619A (zh) 一种膜整合式微流控过滤芯片及其制备方法和用途
EP3395939A1 (en) Cell sorting, culture, and growth vessel; and cell sorting, culture, and growth method
CN107904168B (zh) 一种研究细胞趋化的微流控芯片和方法
CN110431223A (zh) 用于微板实验室器具的灌注和环境控制的方法和设备
KR101201939B1 (ko) 마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법
CN108148750B (zh) 一种原位形成拟胚体的多功能微流控芯片的制备方法
CN103255057A (zh) 一种细胞培养微流控芯片及其制备方法和应用
CN107955775B (zh) 一种仿生多能生物界面体系的微流控芯片及其制备方法
CN102796659A (zh) 一种多孔单细胞观测板及其应用
WO2009097099A1 (en) Microfluidic device for cell culturing
TWI588256B (zh) 單細胞擷取與培養之裝置與方法
CN108148885B (zh) 一种基于微流控芯片的代谢依赖药物心肌毒性评价方法
CN113862151B (zh) 一种用于细胞共培养的微流控芯片装置及一种细胞共培养方法
Nishijima et al. Pneumatically actuated spheroid culturing Lab-on-a-Chip for combinatorial analysis of embryonic body
Sadeghi et al. A simple, bubble-free cell loading technique for culturing mammalian cells on lab-on-a-chip devices
Yasukawa et al. Combinatorial differentiation induction of embrionic bodies in" PASCL (Pneumatically Actuated Spheroids Culture Lab-on-chip)"
US20210260576A1 (en) Single Cell Isolation and Processing System With Reversible Well Shape
CN111526932A (zh) 分离回收系统以及分离回收方法
KR101401781B1 (ko) 세포 배양 및 응용연구를 위한 미세 관류 소자 및 그 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant