CN108117987A - 高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化中的应用 - Google Patents

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王丽
陶婷婷
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Abstract

本发明提供一种高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化中的应用，该应用为在阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片上形成高通量的人诱导性多潜能干细胞的3D拟胚体结构并原位进行类心肌组织的诱导分化。该方法可以高通量形成大小均一的类心脏微组织，并可以原位动态观察类心脏微组织的生长、发育的全过程。该方法克服了传统拟胚体形成和3D心肌诱导分化分步实现的缺点，具有简化实验操作步骤，高通量、原位动态观察心肌发育的优势，无需特殊的仪器和试剂，可与其他技术集成化。主要用于人心脏发育学、疾病模型构建、心脏药物及毒物评估等领域。

Description

高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化中的应用
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及一种高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化中的应用。
背景技术
心脏是人体重要的脏器之一，先天性心脏病以及成人心脏病严重威胁人类健康和生命。利用人源性的心肌细胞和类心肌组织来研究心脏发育学、疾病机制、药物评价及毒性实验具有重要的科学意义。人诱导性多潜能干细胞和胚胎干细胞具有自我更新和多向分化的能力，利用3维拟胚体结构进行心肌组织的发育学研究及疾病模型构建具有重要的应用价值。传统方法是利用悬滴法、商品化的小坑结构先形成拟胚体，再将拟胚体转移到低粘附的培养皿中，进一步进行心肌细胞诱导分化。在转移过程中，拟胚体容易收到较大流体的剪切力刺激，干扰细胞的活性和分化的效果。传统的培养皿需要大量的培养基，费用较为昂贵，在换液过程中也会丢失部分拟胚体造成细胞浪费。此外由于心肌细胞的跳动特性，无法定位观察心肌组织的发育和药物反应。
制备高通量阵列微柱结构的芯片的材料为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，PDMS是目前微加工和微流控领域用的最多的材料，具有透明、透气、惰性好、疏水性、易成型、细胞相容性佳等优势。目前文献报道的利用芯片进行心肌诱导分化的方法都是基于聚合物凝胶材料的小坑法形成拟胚体，再将拟胚体转移到新的低黏附培养系统，步骤繁琐；转移过程中对干细胞会造成一定程度的损伤，细胞碎屑不容易清除等缺点。低粘附悬浮培养心肌微组织，不能实时定位观察同一个拟胚体来源的类心肌微组织的发育分化过程。
目前利用微流控芯片制备的微柱结构中，主要以微小尺度为主，用于研究表面拓扑结构对单细胞行为学的影响，尚无利用较大微柱形成微培养空间进行拟胚体形成和原位发育研究的应用。
因此，本发明主要针对上述人干细胞源3维类心肌组织分化的局限性，制备一种高通量微阵列芯片用于人诱导性多潜能干细胞的类心肌微组织分化，用于干细胞领域的应用研究。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是制备一种高通量微阵列芯片用于干细胞类心肌组织诱导分化。
一种高通量微阵列芯片的制备方法，具体步骤如下：
(1)利用软蚀刻技术制备高通量凹陷小坑的SU-8模板，对模板进行低黏附修饰，确保SU-8与PDMS聚合物容易剥离；
(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS与引发剂按照体积比10～14：1混合，浇注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加热固化1～2h，常温剥离SU-8模板，得到高通量的固定间距的阵列微柱结构PDMS芯片；
(3)在PDMS芯片周边用PDMS模块围起形成局限的开放培养池，放于80℃烘箱内加热40～60分钟，得到微阵列芯片。
SU-8模板低黏附修饰具体为：采用低粘附试剂硅烷化处理10-15分钟，80℃烘烤1～2小时，自然降温。
模板凹陷小坑的深度为500-1000微米，间距为30-100微米，微柱间距相同；其中微柱尺寸和微柱间距不限于该范围。
微柱尺寸为直径500-1000微米，高度为500～1000微米，间距为30-100微米，微柱间距相同。
所述模板低粘附处理试剂为三甲基氯硅烷或者氟硅烷等；
所述引发剂为：SYLGARD○R 184silicone elastomer curing agent.
所述PDMS模块形成的开放培养池，特征为根据芯片的形状，制备相应的中空结构，如环形，方形。将该结构用等离子处理或者PDMS胶水与芯片封接，目的限制细胞培养基溢出芯片结构；
所述高通量是指该芯片结构可以无限放大，或者区域化。
一种高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化中的应用，其特征在于：利用上述芯片高通量形成拟胚体并进行原位干细胞来源的类心肌组织诱导分化，具体步骤为：
(1)芯片无菌化：将上述微阵列芯片用氧等离子处理1～3分钟，加入去离子水；120～125℃高压灭菌20～30分钟；将芯片置于无菌的培养皿中4℃保存或降至室温后使用。
(2)芯片低粘附处理：利用低粘附试剂处理4～24小时，去除试剂用PBS清洗5～10次；
(3)拟胚体形成：取出芯片，加入mTeSR1培养基，不断用移液器吹打，去除小柱间的气泡，使微柱间隙充满培养基；将人诱导性多潜能干细胞(hiPSCs)用分散酶消化成单细胞，将密度在5×106-10×106个hiPSCs/cm2细胞接种到(2)所述的芯片中，加入1.5～2ml的mTeSR1培养基，并加入10～20μM的Y27632。静止培养24～48小时；根据细胞接种数量实现拟胚体大小的控制，(5-10)x106/cm2范围的细胞密度可以实现150-300微米直径的细胞球；
(3)类心肌组织诱导分化：拟胚体形成后，加入2ml诱导分化培养基1640/B27-insulin，添加终浓度在6～12μM的CHIR99021作用24～30小时；以加入CHIR99021作为诱导分化第1天，第2、3天分加入2ml诱导培养基1640/B27-insuline，第4、5天分别加入2ml诱导分化培养基1640/B27-insulin，添加终浓度6～12μM的IWP2；第7天以后加入2ml心肌细胞培养基1640/B27，每隔1天更换新鲜心肌细胞培养基；
所述1640/B27-insulin培养基的基础成分为RPMI1640，另外添加占总体积2％的B27-insulin,占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，终浓度10ug/ml抗支原体药物，终浓度10ug/ml Gentamicin,终浓度0.25ug/ml Amphotericin B；
所述心肌细胞培养基1640/B27基础成分RPMI1640，添加占总体积2％B27，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，终浓度10ug/ml抗支原体药物，终浓度10ug/mlGentamicin,终浓度0.25ug/ml Amphotericin B。
(4)不同形状类心肌微组织形成：通过增加细胞密度，形成不同形状、尺寸的三维类心肌微组织，原位观察微组织的生长、发育；
(5)所形成的类心肌微组织可以用于切片，组织染色；
一种高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化中的应用，应用对象不局限于人诱导性多潜能干细胞，同样适用于其他干细胞，包括人和动物的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)以及动物来源的诱导性多潜能干细胞；
所述低粘附处理试剂为0.1％～2％的F-127
所述Y27632的作用主要是减少细胞凋亡；
所述去除细胞碎屑方法主要是利用更换培养基前，轻轻的摆动芯片，在不影响细胞球的情况下，使得细胞碎片浮起，倾斜芯片至一侧，轻轻吸走培养基，轻轻在一侧加入培养基，缓慢放置水平，置于培养箱37°培养。
所述不同形状的心肌微组织，主要是利用细胞的密度以及微柱间距的调节，控制细胞间力的作用，达到平衡形成不同形状的微组织。
所述原位观察心肌微组织生长发育，通过标注微柱序列，定位每个拟胚体，通过显微镜观察每个定位的拟胚体的生长情况。
所述心肌组织染色指，芯片上的心肌微组织在显微镜下定位，利用移液器手动取出，进行免疫组织切片染色。
所述其他干细胞包括，人和动物的诱导性多潜能干细胞和胚胎干细胞。
本发明建立的一种高通量微阵列芯片在3D干细胞类心肌组织诱导分化中的应用，心肌细胞分化基于发育学原理，在特定的时间依次基于特定诱导分化因子。芯片微结构的限制作用，有利于原位观察单个心肌的发育，在换液过程中有效防止心肌微组织的丢失。
本发明的主要应用范围：多潜能干细胞来源的类心肌组织诱导分化、心肌的发育学研究、心脏疾病模型构建、药物和毒性评估等领域。
本发明的创造性在于：通过芯片的微结构，保证细胞碎屑有效清除的同时原位固定微组织，便于心肌微组织的发育学、行为学、药物反应的观察。
本发明的优点在于：高通量人干细胞来源的类心肌微组织，有利于原位观察拟胚体发育的动态过程，保证拟胚体之间的营养供给和信号传递，可以有效去除凋亡细胞和细胞碎片。该方法克服了传统拟拟胚体形成和悬浮培养心肌微组织诱导分化分步实现的缺点，有简化操作步骤，高通量、原位形成与分化的优势，无需特殊的仪器和试剂，可与其他技术集成化。
附图说明
图1是具体实施例1中高通量拟胚体形成的阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片的俯视图和剖面图；
图2是图2中4的放大图，用来描述微结构的具体尺寸；
其中1是微柱结构，2是微柱间距，3是芯片外围坝结构，4是有四个微柱结构围成的脑组织形成区域；5是微柱结构的直径，长度800微米，6是微柱间距，长度50微米；7是脑微组织形成区域；
图3是具体实施例2中人诱导性多潜能干细胞来源的高通量的类心肌微组织及标志物鉴定；
图4是不同形状的类心肌微组织；
图5是类心肌组织切片染色后标志物鉴定；其中，1是微柱，8是跳动的心肌组织。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
本发明所用试剂均为市购。
实施例1
阵列微柱结构PDMS聚合物芯片的制备
利用光刻蚀技术制作SU-8聚合物模板，将PDMS((10～14):1混合)倾倒于SU-8模板上，真空除泡后在80度烘箱内加热40～60分钟，冷却后，将固化的PDMS剥离模板。将无结构的PDMS块，蘸取玻璃片上的PDMS(20:1)，然后封接在有结构的PDMS芯片周围，将阵列微柱结构围起形成局限的开放培养池，放于80度烘箱内加热60分钟。芯片结构如图1所示，其中1是微柱结构，2是微柱间距，3是芯片外围坝结构，用来限定细胞和培养基，4是有四个微柱结构围成的心肌组织形成区域。芯片结构放大图2，5是微柱结构的直径，长度800微米，6是微柱间距，长度50微米；7是心肌微组织形成区域，与周围微柱间隔相同。
实施例2
高通量阵列微柱结构芯片用于人诱导性多潜能干细胞类心肌微组织形成
芯片制备过程如实施例1。拟胚体形成以及原位类心肌微组织形成步骤如下：
(1)芯片无菌化：将上述微阵列芯片用氧等离子处理1～3分钟，加入去离子水；120～125℃高压灭菌20～30分钟；将芯片置于无菌的培养皿中4℃保存或降至室温后使用。
(2)芯片低粘附处理：利用低粘附试剂PF-127处理4～24小时，去除试剂用PBS清洗5～10次；
(3)拟胚体形成：取出芯片，加入mTeSR1培养基，不断用移液器吹打，去除小柱间的气泡，使微柱间隙充满培养基；将人诱导性多潜能干细胞(hiPSCs)用分散酶消化成单细胞，将密度在5×106-10×106个hiPSCs/cm2细胞接种到(2)所述的芯片中，加入1.5～2ml的mTeSR1培养基，并加入10～20μM的Y27632。静止培养24～48小时；根据细胞接种数量实现拟胚体大小的控制，(5-10)x106/cm2范围的细胞密度可以实现150-300微米直径的细胞球；
(3)类心肌组织诱导分化：拟胚体形成后，加入2ml诱导分化培养基1640/B27-insulin，添加终浓度在6～12μM的CHIR99021作用24～30小时；以加入CHIR99021作为诱导分化第1天，第2、3天分加入2ml诱导培养基1640/B27-insuline，第4、5天分别加入2ml诱导分化培养基1640/B27-insulin，添加终浓度6～12μM的IWP2；第7天以后加入2ml心肌细胞培养基1640/B27，每隔1天更换新鲜心肌细胞培养基；
所述1640/B27-insulin培养基的基础成分为RPMI1640，另外添加占总体积2％的B27-insulin,占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，终浓度10ug/ml抗支原体药物，终浓度10ug/ml Gentamicin,终浓度0.25ug/ml Amphotericin B；
所述心肌细胞培养基1640/B27基础成分RPMI1640，添加占总体积2％B27，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，终浓度10ug/ml抗支原体药物，终浓度10ug/mlGentamicin,终浓度0.25ug/ml Amphotericin B。
图3所示为高通量的类心肌微组织，利用心肌细胞特定标志蛋白cTnT免疫荧光染色，阳性染色组织为跳动的心肌组织，统计跳动的心肌组织与总的拟胚体数量，考察在该芯片上心肌的诱导效率。诱导效率(％)＝跳动心肌组织/(跳动的心肌组织+未跳动的心肌组织)x100％。结果显示90％以上的拟胚体cTnT表达阳性，白色箭头为cTnT阳性表达的心肌组织。
(4)不同形状类心肌微组织形成：通过增加细胞密度，形成不同形状、尺寸的三维类心肌微组织，原位观察微组织的生长、发育；
如图4所示，通过调节干细胞密度，可以形成其他形状的心肌微组织。
(5)所形成的类心肌微组织可以用于切片，组织染色；如图5显示，1是微柱，8是跳动的心肌组织，可见有微小结构出芽生长；心肌组织进一步冰冻切片，免疫荧光染色检测心肌标志物cTnT，如图4D,E所示，80％以上细胞表达心肌特异蛋白。说明心肌微组织分化方法效率较高。

Claims (9)

1.一种高通量微阵列芯片的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)利用软蚀刻技术制备高通量凹陷小坑的SU-8模板，对模板进行低黏附修饰，确保SU-8与PDMS聚合物容易剥离；
(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS与引发剂按照体积比10～14：1混合，浇注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加热固化1～2h，常温剥离SU-8模板，得到高通量的固定间距的阵列微柱结构PDMS芯片；
(3)在PDMS芯片周边用PDMS模块围起形成局限的开放培养池，放于80℃烘箱内加热40～60分钟，得到微阵列芯片。
2.按照权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于：SU-8模板低黏附修饰具体为：采用硅烷化处理10-15分钟，80℃烘烤1～2小时，自然降温。
3.按照权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于：模板凹陷小坑的深度为500-1000微米，间距为30-100微米，微柱间距相同；其中微柱尺寸和微柱间距不限于该范围。
4.按照权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于：微柱尺寸为直径500-1000微米，高度为500-1000微米，间距为30-100微米，微柱间距相同。
5.按照权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于芯片形状为圆形或者方形。
6.一种高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化中的应用，其特征在于：利用上述芯片高通量形成拟胚体并进行原位干细胞来源的类心肌组织诱导分化，具体步骤为：
(1)芯片无菌化：将上述微阵列芯片用氧等离子处理1～3分钟，加入去离子水；120～125℃高压灭菌20～30分钟；将芯片置于无菌的培养皿中4℃保存或降至室温后使用。
(2)芯片低粘附处理：利用低粘附试剂处理4～24小时，去除试剂用PBS清洗5～10次；
(3)拟胚体形成：取出芯片，加入mTeSR1培养基，不断用移液器吹打，去除小柱间的气泡，使微柱间隙充满培养基；将人诱导性多潜能干细胞(hiPSCs)用分散酶消化成单细胞，将密度在5×106-10×106个hiPSCs/cm2细胞接种到(2)所述的芯片中，加入1.5～2ml的mTeSR1培养基，并加入10～20μM的Y27632。静止培养24～48小时；根据细胞接种数量实现拟胚体大小的控制，(5-10)x106/cm2范围的细胞密度可以实现150-300微米直径的细胞球；
(3)类心肌组织诱导分化：拟胚体形成后，加入2ml诱导分化培养基1640/B27-insulin，添加终浓度在6～12μM的CHIR99021作用24～30小时；以加入CHIR99021作为诱导分化第1天，第2、3天分加入2ml诱导培养基1640/B27-insuline，第4、5天分别加入2ml诱导分化培养基1640/B27-insulin，添加终浓度6～12μM的IWP2；第7天以后加入2ml心肌细胞培养基1640/B27，每隔1天更换新鲜心肌细胞培养基；
(4)不同形状类心肌微组织形成：通过增加细胞密度，形成不同形状、尺寸的三维类心肌微组织，原位观察微组织的生长、发育；
(5)所形成的类心肌微组织可以用于切片，组织染色。
7.按照权利要求6所述一种高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化的应用，其特征在于：所述诱导分化培养基1640/B27-insulin基础成分为RPMI1640，另外添加占总体积2％的B27-insulin,占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，终浓度10ug/ml抗支原体药物，终浓度10ug/ml Gentamicin,终浓度0.25ug/ml Amphotericin B。
8.按照权利要求6所述一种高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化的应用，其特征在于：所述心肌细胞培养基1640/B27基础成分RPMI1640，添加占总体积2％B27，占总体积1％penicillin-streptomycin(100×)，终浓度10ug/ml抗支原体药物，终浓度10ug/mlGentamicin,终浓度0.25ug/ml Amphotericin B。
9.按照权利要求6所述一种高通量微阵列芯片在干细胞类心肌组织诱导分化的应用，其特征在于：应用对象不局限于人诱导性多潜能干细胞，同样适用于其他干细胞，包括人和动物的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)以及动物来源的诱导性多潜能干细胞。
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