CN107629997A - 体外泡沫细胞形成模型及其在动脉粥样硬化研究中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了体外泡沫细胞形成模型及其在动脉粥样硬化研究中的应用。本发明提供的泡沫细胞形成模型的构建方法包括：在可机械拉伸的细胞培养装置中从下至上依次培养平滑肌细胞、内皮细胞和单核细胞，得到多细胞共培养体系；利用低密度脂蛋白处理多细胞共培养体系，通过可机械拉伸的细胞培养装置对其施加拉伸作用诱导泡沫细胞的形成，进而得到动脉粥样硬化发生早期泡沫细胞形成模型。本发明可以减少动物模型的消耗，节约经费，为抗动脉粥样硬化新药筛选提供了一个经济、高效的体外筛选模型，具有制备方法简单，实验操作方便，用时短，性能稳定的优点。

Description

体外泡沫细胞形成模型及其在动脉粥样硬化研究中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术与医药研究领域中，体外泡沫细胞形成模型及其在动脉粥样硬化研究中的应用。

背景技术

动脉粥样硬化造成的血管堵塞会导致各种心血管疾病，包括心肌梗死、中风、脑出血以及猝死等。世界卫生组织的统计报告表明全球因心血管疾病导致的死亡率排名居首，而且这种趋势在不断加剧。随着动脉粥样硬化发生几率不断升高和年轻化，由此导致的心血管疾病为家庭和社会带来了沉重的负担，成为全球普遍关注的大众健康问题。动脉粥样硬化是一种慢性发展的疾病，其特征在于大的动脉血管中脂质沉积、炎性细胞浸润和纤维组织增生。动脉粥样硬化一般进行缓慢，具有很强的隐秘性，早期常常没有症状。当前，动脉粥样硬化的研究模型主要是采取动物实验，包括小鼠、大鼠、兔子和猪等。构建这些动物模型的常用方法有：单纯高脂喂养、混合喂养、炎症免疫、内皮损伤、血液流变学改变以及基因工程等方法。其中，单纯高脂喂养法构建动脉粥样硬化模型依靠血液中脂质浓度升高，脂质沉积在受损内皮细胞部位是动脉粥样硬化早期发生的关键因素。混合喂养法是除了给动物喂养高脂食物外还增加维生素D3和蛋氨酸等。另外，内皮损伤法和炎症免疫造模法等也可以有效地构建动脉粥样硬化的模型。但是，以上这些方法所需时间长，而且在动物水平上构建动脉粥样硬化模型，个体之间差异性较大，形成的机制和过程较为复杂。

在动脉粥样硬化形成早期，血液中的单核细胞粘附在损伤的内皮细胞表面,然后穿透内皮层，在内膜下分化为巨噬细胞，在炎症反应环境下巨噬细胞产生的大量自由基使渗入血管内皮下的低密度脂蛋白胆固醇发生氧化修饰，形成氧化型低密度脂蛋白胆固醇，由巨噬细胞清道夫受体吞噬大量氧化型低密度脂蛋白胆固醇，导致巨噬细胞内脂质累积，形成含有许多脂滴的泡沫细胞。随着大量脂质堆积，泡沫细胞死亡破裂，溢出内容物继而引起周围细胞的免疫反应，破坏血管壁的稳定性和完整性，引起血管平滑肌细胞和内皮细胞迁移，将堆积的泡沫细胞包裹形成脂质条纹和斑块，最终使得血管内径变窄影响供血。因此，采用人类源细胞构建泡沫细胞形成模型，对研究动脉粥样硬化早期发生机制和筛选有效治疗药物具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备动脉粥样硬化发生早期的泡沫细胞形成模型。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种多细胞共培养模型的构建方法，所述方法包括：在细胞培养装置中从下至上依次培养血管平滑肌细胞、血管内皮细胞和单核细胞，得到三种细胞共培养体系，该三种细胞共培养体系为泡沫细胞形成模型。

所述细胞培养装置可为可机械拉伸的细胞培养装置；

所述细胞培养芯片装置包括三部分，由上往下依次叠加在一起的下述结构组成：细胞培养层、PDMS薄膜和液体流量控制层；

所述液体流量控制层上设有至少1条微通道；所述微通道上设有至少1个圆形腔室，所述腔室的高度与所述微通道的高度相等；

所述细胞培养层上设有与所述腔室数量相等的细胞培养池，所述细胞培养池的底部为所述PDMS薄膜(也即中层PDMS薄膜)，所述细胞培养池与所述腔室的形状和大小相同；

在沿所述液体流量控制层至所述细胞培养层的方向上，所述细胞培养池与所述腔室的位置相对应；

所述微通道的入口和出口均依次穿过所述PDMS薄膜和所述细胞培养层与外界相连通。

其中，各细胞的培养均在所述细胞培养层的细胞培养池中进行。

所述三种细胞共培养体系可用于制备泡沫细胞，即为泡沫细胞形成模型。

所述三种细胞共培养体系中由三种细胞形成的细胞层组成，从下至上依次为血管平滑肌细胞细胞层、血管内皮细胞细胞层和单核细胞细胞层。

上述方法中的细胞培养装置具体可见专利号ZL201310043685.3中的可机械拉伸的微流控芯片细胞培养装置。专利号ZL201310043685.3中的可机械拉伸的微流控芯片细胞培养装置均可用于制备所述泡沫细胞形成模型。

上述方法中的细胞培养装置，所述液体流量控制层的材质可为PDMS，所述微通道的入口和出口端连接微注射泵，利用微注射泵控制液体流量的大小、频率和时间。当向所述微通道里灌注液体时，所述中层PDMS薄膜受到液压向上的作用，发生凸起的形变，这样，就达到了为粘附在PDMS薄膜上的细胞施加机械拉伸应力的目的。

所述细胞培养层的材质可为PDMS，制作时，所述细胞培养层可通过模塑法先制作出PDMS模版，再按照模版打孔得到；所述细胞培养层规划了细胞生长区域，也提供了细胞生长空间。

上述方法中的细胞培养装置，所述细胞培养池可为开放圆柱体形，所述开放圆柱体形的设计，一方面简化有关参数的计算，另一方面便于细胞培养液和其它试液的加入和更换。

上述方法中的细胞培养装置，所述细胞培养池的直径可为0.4～0.6cm；

所述腔室的直径与所述细胞培养池的直径一致，在制作过程中，在将所述细胞培养层与所述液体流量控制层进行密封时，避免所述细胞培养池与所述腔室位置的偏差，影响所述细胞培养装置的制作精度。

上述方法中的细胞培养装置，所述微通道设有若干个所述腔室，相邻所述腔室之间的距离可为0.5～1.0cm。

上述方法中的细胞培养装置，所述微通道的高度可为45～100μm，宽度可为200～500μm。

上述方法中的细胞培养装置，所述中层PDMS薄膜的厚度可为80～100μm，可以根据匀胶旋涂仪的转速和时间进行控制。

上述方法中的细胞培养装置，所述细胞培养层和所述液体流量控制层的厚度均可为0.3～0.5cm。

上述方法中的细胞培养装置，所述液体流量控制层可设有若干条所述微通道，所述微通道之间可单独联通，也可串联连通或并联连通。

上述方法中，所述细胞培养装置上可包被有细胞粘附载体。

所述细胞粘附载体可为纤维黏连蛋白。纤维黏连蛋白使用的浓度可为20μg/ml，包被所述细胞培养装置的时间可为12～24h。

上述方法中，所述从下至上依次培养血管平滑肌细胞、血管内皮细胞和人源单核细胞可包括：

A1)在所述细胞培养装置中培养所述血管平滑肌细胞，得到接种有平滑肌细胞的细胞培养装置；

A2)在所述接种有平滑肌细胞的细胞培养装置中培养所述血管内皮细胞，得到平滑肌细胞-内皮细胞共培养体系；

A3)在所述平滑肌细胞-内皮细胞共培养体系中培养所述单核细胞，得到所述三种细胞共培养体系。

所述血管平滑肌细胞的接种密度可为2.0×10⁵个/ml。培养所述血管平滑肌细胞的时间可为24小时。

所述血管内皮细胞的接种密度可为3.0×10⁵个/ml。培养所述平滑肌细胞的时间可为24小时。

所述人源单核细胞的接种密度可为1.0×10⁴个/ml。

上述方法中，各细胞接种数量尽可能多以形成紧密连接的细胞层和利于形成连接完整的膜状结构为目标。

上述方法中，培养所述血管平滑肌细胞的体系与培养所述血管内皮细胞的体系中均可含有所述刺激细胞分泌基质胶的物质。所述刺激细胞分泌基质胶的物质具体可为抗坏血酸(维生素C)。抗坏血酸在相应体系中的浓度为30～70μg/ml，如50μg/ml。

本发明提供了含有泡沫细胞的细胞培养体系的制备方法，所述方法包括：向所述三种细胞共培养体系中添加一定量的低密度脂蛋白得到泡沫细胞诱导体系，培养所述泡沫细胞诱导体系，得到含有泡沫细胞的细胞培养体系。

上述方法中，所述泡沫细胞诱导体系中低密度脂蛋白的浓度可为5～200μg/mL，进一步可为5～50μg/mL。更进一步，所述泡沫细胞诱导体系中低密度脂蛋白的浓度可为5～25μg/mL。

所述培养所述泡沫细胞诱导体系可包括利用所述可机械拉伸的细胞培养装置对所述培养所述泡沫细胞诱导体系施加拉伸作用使细胞发生形态变化。所述细胞发生形态变化可为细胞从正常状态的形状变化至其他任何可变化的形态。

所述细胞培养装置应用原理基于以下假设：当所述腔室内的液体将中层所述PDMS薄膜顶起的时候，由于液压是均匀分布的，可以近似认为形成一个球面。这样，流量与应变之间的关系，就可以根据所形成球缺的体积计算公式，形成球冠面积(施压状态)、基底膜的平面面积(无压状态)和其它已知量之间的几何关系，推导得出如下公式1、公式2和公式3，而且在一定的范围内，可以将膜的应变视为与膜的厚度，以及PDMS本身的杨氏模量无关。

所述流量与应变(ε)间的关系，对单个腔室而言：

ε＝(S-S₀)/S₀ (公式1)

其中V₀为进入球缺部位液体的体积，S₀为原始状态时的基底膜平面面积，S为拉伸状态时形成球冠的弯曲面积。ε为膜的应变，r为细胞培养层细胞培养池的半径(由打孔器决定，为已知)。对于含有多个培养孔的通道，孔池的数目为n，对应的流量V满足：

V＝n·V₀ (公式3)

经过以上简单的数学推导，可得到中层的细胞培养室基底膜应变与下层液体流量控制参数之间的关系，因此可以通过微注射泵精确控制进、出微流控芯片液体的体积、频率和时间，对应获得作用膜上拉伸应变的不同强度、频率和作用时间。

上述方法中，所述使细胞发生形变具体可使形成的细胞层发生形变，可通过控制进出所述液体流量控制层内液体的体积、频率和时间实现。所述多细胞共培养形成生物膜发生形变可体现在膜拉伸应变上。所述拉伸应变范围可控制在0～20％之间，具体可为5％或15％。

利用所述泡沫细胞形成模型的构建方法构建的泡沫细胞形成模型，也属于本发明的保护范围。

利用含有泡沫细胞的细胞培养体系的制备方法制备的含有泡沫细胞的细胞培养体系，也属于本发明的保护范围。

所述泡沫细胞形成模型或所述含有泡沫细胞的细胞培养体系在筛选治疗和/或预防动脉粥样硬化药物中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述泡沫细胞形成模型或所述含有泡沫细胞的细胞培养体系在考察其他因素(物理与化学因素)与动脉粥样硬化之间中的关系，也属于本发明的保护范围。

所述泡沫细胞形成模型或所述含有泡沫细胞的细胞培养体系在深入研究动脉粥样硬化发生机制中，发现的重要调控因子及其在新药研究中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明中，所述平滑肌细胞可为人源血管平滑肌细胞。所述平滑肌细胞具体可为ATCC的人主动脉血管平滑肌细胞T/G HA-VSMC或者其它人源血管平滑肌细胞。

所述内皮细胞可为人源血管内皮细胞。所述内皮细胞具体可为中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心的PUMC-HUVEC-T1细胞，或者其它人源血管内皮细胞。

所述单核细胞可为人源单核细胞。所述单核细胞具体可为中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心的人源单核细胞THP-1。

所述抗坏血酸具体可为一般性药用级产品，如北京欣经科生物技术有限公司产品。低密度脂蛋白LDL具体可为上海翊圣生物科技有限公司产品。所述纤维黏连蛋白具体可为Gibco公司的fibronectin。

本发明发明人通过体外多细胞共培养体系的培养方法，利用具备可提供拉伸作用力的细胞培养装置模拟体外动脉粥样硬化早期形成过程，制备出可诱导泡沫细胞形成的泡沫细胞形成模型和含有泡沫细胞的细胞培养体系，可以减少动物模型的消耗，节约科研经费，为抗动脉粥样硬化新药筛选提供一个有效体外筛选模型。另外，本发明还具有如下优点：

(1)本发明中的圆形细胞生长区域，经过简单的数学推导，可得到中层的细胞培养室基底膜应变与下层液体流量控制参数之间的关系，通过恒流微注射泵准确控制进、出微流控芯片下层的液体流量、进出频率和作用时间。操作过程简单、方便。

(2)本发明中的泡沫细胞形成模型和含有泡沫细胞的细胞培养体系的制备耗时短，48h可构建成功，其后48小时可形成动脉粥样硬化早期标志性事件即泡沫细胞形成。

(3)本发明中泡沫细胞形成模型和含有泡沫细胞的细胞培养体系形成系统稳定，可重复性好，便于不同处理(药物等)组之间结果的比较。

(4)本发明中泡沫细胞形成模型和含有泡沫细胞的细胞培养体系经济、有效，减少动物实验验证药物对动脉粥样硬化的作用。

(5)本发明中泡沫细胞形成模型和含有泡沫细胞的细胞培养体系形成结果可以通过油红染色在较短时间内确定，操作方便。

附图说明

图1-本发明所采用的细胞培养装置的分解图；图中各标记如下：1-细胞培养层、2-PDMS薄膜、3-液体流量控制层、4-细胞培养池、5-液体进出微通道、6-液体腔室。

图2-血管平滑肌细胞-内皮细胞共培养模型激光共聚焦显微鉴定结果。红色荧光表示平滑肌细胞中的SM-α-肌动蛋白；绿色荧光表示内皮细胞膜上的VE钙粘蛋白；蓝色荧光表示细胞核内物质。

图3-共培养系统所使用的各个细胞系、平滑肌细胞-内皮细胞-单核细胞共培养体系所形成的“膜”状结构以及共培养体系的横截面示意图。其中A是血管平滑肌细胞(T/GHA-VSMC)，B是血管内皮细胞(PUMC-HUVEC-T1)，C是单核细胞(THP-1)，D为平滑肌细胞-内皮细胞-单核细胞共培养体系实物图，E为三种细胞的共培养体系横切面示意图。

图4-在不同强度拉伸作用力和不同浓度的低密度脂蛋白处理条件下三种细胞的共培养体系中泡沫细胞形成情况。

图5-大气可吸入颗粒物(PM_2.5)对25μg/ml LDL处理条件下泡沫细胞形成的影响。

图6-验证抗动脉粥样硬化药物(阿托伐他汀钙)对15％拉伸强度和25μg/ml LDL处理条件下泡沫细胞形成的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置五次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的血管平滑肌细胞是为美国ATCC的人主动脉血管平滑肌细胞T/GHA-VSMC；内皮细胞为中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心的血管内皮细胞PUMC-HUVEC-T1细胞；单核细胞THP-1为中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心产品；抗坏血酸(维生素C)为北京欣经科生物技术有限公司产品；低密度脂蛋白LDL为上海翊圣生物科技有限公司产品。

下述实施例中培养细胞所使用的培养基均为向高糖DMEM(Gibco,USA)添加如下量的物质得到的培养基：10％胎牛血清(Gibco，USA)，penicillin(100IU/mL，GibcoUSA),streptomycin(100μg/mL,Gibco,USA),insulin(40IU/mL,Aladdin,China),heparin(40IU/mL,Aladdin,China)和1％NEAA(Gibco,USA)。细胞培养条件为细胞恒温培养箱5％CO₂，37℃。

实施例1、在不同拉伸强度和不同浓度的低密度脂蛋白条件下，诱导泡沫细胞形成

本发明所使用的芯片装置是发明人自主开发设计的芯片装置(即专利号ZL201310043685.3中的可机械拉伸的微流控芯片细胞培养装置，以下简称细胞培养装置)制备泡沫细胞。首先将细胞培养装置清洗干净并烘干后，使用高压灭菌锅进行灭菌，再次烘干后，立即转移到超净工作台，备用。第二、接种细胞前将细胞培养装置安放在无菌的细胞培养皿(直径10厘米)中，并使用纤维黏连蛋白对细胞培养装置中的细胞生长孔室的底膜进行包被，增加血管平滑肌细胞贴壁能力，待细胞贴壁后加入含有50μg/ml抗坏血酸的培养基，可以刺激平滑肌细胞分泌较多的细胞外基质，为接下来接种内皮细胞提供较好条件，平滑肌细胞与内皮细胞两层形成紧密连接的“膜状结构”。第三、更换为含有悬浮的单核细胞THP-1的培养基，构建含有三种细胞的共培养体系。对构建成功的共培养模型，施加不同强度的拉伸和不同浓度的低密度脂蛋白条件分别处理，继续培养48h后，观察泡沫细胞的形成。通过对细胞进行油红染色以确定泡沫细胞，使用倒置显微镜明场视野对样品进行拍照，最后通过Photoshop软件的颜色区分功能，对照片中的红色部分进行定量分析。

泡沫细胞的具体制备方法如下：

(1)制作共培养系统的载体，即细胞培养装置(图1)，具体的制备过程如下(专利号：ZL201310043685.3)：

a.根据具体实验要求，利用计算机辅助设计软件(CAD)设计和绘制微流控芯片通道的结构，用高精度打印设备制作光掩膜。

b.制备硅片模版

取直径为100mm，厚度为0.5mm的硅片，用Piranha溶液(98％浓硫酸：30％双氧水＝3：1)浸泡30分钟，取出用大量去离子水清洗，烘干。在洁净的硅片上涂布光阻材料(photoresist)SU-82035，形成约50μm厚的膜层。然后将带有芯片设计的版式(通道为透光部分)的光掩膜(黑白胶片)紧贴在涂有光阻材料的硅片上，经高强度紫外光照处理；经过65℃和90℃两步烘烤后，将曝光后的硅片用丙二醇甲醚醋酸酯(propylene glycol methylether acetate)浸泡15分钟，除去未曝光部分的光阻材料，形成凸起的模板，再用异丙醇冲冼，用氮气流吹干，置于150℃条件下热焙坚膜30分钟，自然冷却后作为微流控芯片的阳模备用。

c.芯片上层的制作

取一定量的PDMS单体(SYLGARD 184SILICONE ELASTOMER BASE)和固化剂(SYLGARD 184SILICONE ELASTOMER CURING AGENT)按10：1的质量比混合均匀、脱气，将其倾注于上述制备的含有通道的硅片模版上，65℃加热固化30分钟，冷却后从模版上剥下含有孔印迹的PDMS胶片，用打孔器在PDMS胶片对应位置分别打孔，形成直径为0.5cm的孔。

d.芯片中层的制作

取一定量的PDMS单体(SYLGARD 184SILICONE ELASTOMER BASE)和固化说明书1000022010.26剂(SYLGARD 184SILICONE ELASTOMER CURING AGENT)按10：1的质量比混合均匀、脱气，用匀胶旋涂仪将其均匀涂布在洁净的硅片上，置于65℃烘箱中加热，固化10分钟。

e.二次固化法制备芯片上中层

所述上层和中层按照上述方法和固化时间制备完毕后，将打好孔的上层PDMS贴到中间层PDMS薄膜上，排除气泡，并放入65℃烘箱中继续烤2小时，这时形成了具有弹性PDMS膜的中上层结合体，然后用针形打孔器打出液体出入口。

f.芯片下层的制作

取一定量的PDMS单体(SYLGARD 184SILICONE ELASTOMER BASE)和固化剂(SYLGARD 184SILICONE ELASTOMER CURING AGENT)按10：1的质量比混合均匀、除气，将其倾注于上述制备的具有微通道和腔室的硅片模版上，65℃加热2小时以上固化，冷却后从模版上剥下含有通道的PDMS胶片，与芯片中上层一同置于等离子清洗器中处理30秒，然后，迅速取出将两片PDMS对压，形成密封的PDMS微流控芯片细胞培养装置。

g.微流控芯片装置与微注射泵控制系统的连接

先将制作完成的微流控芯片，放置于培养皿中，通过金属管接头和硅胶管连接到微注射泵控制系统即可使用。

其中，细胞培养装置由依次叠加在一起的细胞培养层、PDMS薄膜和液体流量控制层组成；液体流量控制层上设有至少1条微通道；微通道上设有至少1个腔室，腔室的高度与微通道的高度相等；细胞培养层上设有与腔室数量相等的细胞培养池，细胞培养池的底部为PDMS薄膜，细胞培养池与腔室的大小和形状相同；在沿液体流量控制层至细胞培养层的方向上，细胞培养池与腔室的位置相应；微通道的入口和出口均依次穿过PDMS薄膜和细胞培养层与外界相连通。

(2)细胞培养装置的灭菌

将细胞培养装置通过无水乙醇超声，超纯水超声以后，放置于烘箱，65℃，烘至干燥，使用新的锡箔纸将芯片包装起来，放到高压灭菌锅中，121℃，灭菌30分钟，随后放置烘箱中，65℃，烘至干燥，转移至超净工作台中，备用。

(3)细胞培养装置的包被

将灭菌后的细胞培养装置转移至无菌细胞培养皿中，并使用纤维黏连蛋白对芯片进行包被。纤维黏连蛋白fibronectin为gibco公司产品(规格为1mg)。将1mg的纤维黏连蛋白溶于10ml的PBS溶液中，使用0.22μm的无菌滤膜过滤，得到100μg/ml的纤维黏连蛋白母液，使用时，将纤维黏连蛋白母液利用PBS稀释5倍，得到20μg/ml的纤维黏连蛋白PBS溶液。向细胞培养装置的每个培养池中加入50μl的20μg/ml的纤维黏连蛋白PBS溶液，细胞培养箱中包被过夜，所得包被好的细胞培养装置备用。

(4)下层平滑肌细胞的接种

将在培养皿内生长良好的血管平滑肌细胞用PBS清洗，加入胰酶消化收集、离心、再使用新鲜的培养基重悬以后，对细胞进行计数，对细胞进行稀释至2.0×10⁵个/ml，然后加入抗坏血酸，得到混合液1，混合液1中抗坏血酸的浓度为50μg/ml，将混和液1接种到步骤(3)的包被好的细胞培养装置培养池中，每个培养池中加入50μl混和液1，放到细胞培养箱中，培养24小时，弃培养基，得到接种有平滑肌细胞的细胞培养装置，此时的细胞培养装置中的每个培养池底部均形成了平滑肌细胞层。

(5)上层内皮细胞的接种

将生长良好的内皮细胞用PBS清洗，加入胰酶消化、离心，并使用新鲜的培养基重悬以后，对细胞进行计数，对细胞进行稀释至3.0×10⁵个/ml，然后加入抗坏血酸，得到混合液2，混合液2中抗坏血酸的浓度为50μg/ml，将混合液2接种到步骤(4)的具有平滑肌细胞的细胞培养装置上，每个培养池中加入50μl混合液2，放到细胞培养箱中，继续培养24小时，弃培养基，得到平滑肌细胞-内皮细胞共培养体系。

平滑肌细胞-内皮细胞共培养体系的鉴定结果如图2所示。利用SM-α-肌动蛋白抗体(anti-SM-α-肌动蛋白)鉴定平滑肌细胞细胞，SM-α-肌动蛋白抗体只能识别平滑肌细胞中的肌动蛋白；利用VE-Cadherin(VE钙粘蛋白)抗体(anti-VE钙粘蛋白)鉴定内皮细胞，VE-Cadherin抗体只识别内皮细胞的膜蛋白，从而这两个抗体作为两种细胞的特异性标记物，指示这两种细胞层的位置，使用激光共聚焦显微镜做Z轴扫描，结果表明细胞培养装置中的每个培养池的下层细胞为平滑肌细胞，上层细胞为内皮细胞，从而鉴定共培养体系形成。

(6)单核细胞THP-1的引入

将悬浮的单核细胞THP-1收集至离心管中，离心，PBS重悬、清洗，再离心，用新鲜培养基重悬以后，对细胞进行计数，稀释至1.0×10⁴个/ml，得到THP-1悬浮液，向步骤(5)得到的平滑肌细胞-内皮细胞共培养体系的每孔中加入50μl THP-1悬浮液，放到细胞培养箱中，继续培养24小时，弃培养基，得到三种细胞平滑肌细胞-内皮细胞-单核细胞共培养体系，图3是该共培养体系中各层细胞显微形态图和横切面结构示意图。

(7)低密度脂蛋白LDL浓度与拉伸强度对泡沫细胞形成的影响

步骤(6)得到的平滑肌细胞-内皮细胞-单核细胞共培养体系，加入含有不同浓度LDL的培养基后进行培养，可以得到不同浓度LDL条件下的泡沫细胞形成结果。实验中LDL的浓度分别设置为0、5和25μg/mL。

(8)不同拉伸强度对泡沫细胞形成的影响

在步骤(7)加入不同量的LDL的平滑肌细胞-内皮细胞-单核细胞共培养体系的基础上，通过微注射泵精确控制进出细胞培养装置腔室中液体(PBS缓冲液)的流量、频率和时间使PDMS薄膜有不同程度的拉伸进而诱导泡沫细胞的形成，对应获得小孔底膜的不同拉伸应变的强度、频率和作用时间。在细胞培养装置腔室中液体增加时，PDMS薄膜被拉伸并向培养池方向弯曲。在泡沫细胞诱导的过程中设置了0％、5％和15％三个不同程度的膜拉伸应变，PDMS薄膜伸缩频率(即拉伸频率)均为1/28，均连续作用48小时，完成泡沫细胞形成实验。

流量与应变(ε)间的关系，对单个腔室而言：

ε＝(S-S₀)/S₀ (公式1)

其中V₀为进入球缺部位液体的体积，S₀为原始状态时的基底膜平面面积，S为拉伸状态时形成球冠的弯曲面积。ε为膜的应变，r为细胞培养层细胞培养池的半径(由打孔器决定，为已知)。对于含有多个培养孔的通道，孔池的数目为n，对应的流量V满足：

V＝n·V₀ (公式3)

(9)泡沫细胞的鉴定

对实验结束的三种细胞的共培养体系，使用PBS溶液清洗，通过多聚甲醛固定15分钟，PBS溶液清洗，油红染色1小时，60％异丙醇固定3分钟，PBS溶液清洗，苏木精溶液染色3分钟，加水返蓝，PBS溶液清洗，扣片，密封，然后使用倒置显微镜，在明场下观察并拍照。实验结果如图4所示。

将拍摄的照片，通过图片处理软件Photoshop中的颜色区分功能，对脂滴的红色面积所占的像素点进行统计，进而得到定量信息。

通过使用不同的拉伸强度和不同浓度的低密度脂蛋白LDL对三种细胞的共培养体系进行处理后，使用油红染色对共培养体系中生成的泡沫细胞进行显示，油红染色会使脂滴显示为红色，有脂滴聚集的细胞确定为泡沫细胞，通过观察油红的多少，来指示泡沫细胞形成的程度变化。

实验结果表明泡沫细胞形成程度跟拉伸强度以及低密度脂蛋白LDL的浓度密切相关。其中LDL的浓度起主要作用，LDL的浓度越高，泡沫细胞的数目越多。与此同时，拉伸对泡沫细胞的生成起促进作用，拉伸的形变越大，泡沫细胞数目也越多。但在没有低密度脂蛋白存在的情况下，即使最强程度的拉伸也没有形成泡沫细胞。所以，在泡沫细胞形成的过程中，低密度脂蛋白的浓度起关键作用，而增加拉伸强度明显促进泡沫细胞形成，二者具有协同作用。

实施例2、大气可吸入颗粒物(PM_2.5)对动脉粥样硬化前期泡沫细胞形成的影响

流行病学调查显示，PM_2.5与心血管疾病的发病率和死亡率相关。对人群中的研究发现，生活在交通要道＜100m的人群颈动脉内-中膜的厚度年均增加5.4μm，PM_2.5每增加23μg/m³，颈动脉内-中膜的厚度增加为对照组的2倍，这显示人群长期暴露于PM_2.5与动脉粥样硬化的关系密切。

本实施例以PM2.5为例，说明本发明提供的泡沫细胞形成体外模型，用于考察PM_2.5对动脉粥样硬化前期泡沫细胞形成的影响。

首先，采集北京市冬季的PM_2.5。将收集在滤纸上的PM_2.5称重，溶于超纯水中，配成5mg/ml的溶液，并进行灭菌，121℃，灭菌30分钟，备用。

按照实施例1的步骤(1)-(6)的方法构建共培养体系，在构建成功的共培养系统的培养基中引入PM_2.5和低密度脂蛋白LDL，PM_2.5设置3个不同PM_2.5浓度，分别为0μg/ml、10μg/ml和20μg/ml，LDL的梯度为25μg/ml，拉伸强度也设置了3个梯度，分别为0％、5％和15％，在这些条件的处理下，拉伸48小时(拉伸频率也均为1/28)后，将三种细胞的共培养体系进行油红染色，拍照，并使用Photoshop对图片中的脂滴进行定量分析。

结果如图5所示，结果表明：在25μg/ml低密度脂蛋白LDL存在的情况下，在同等强度的拉伸条件下，共培养体系中脂滴的数量是随着PM_2.5的浓度升高而增加的。在相同的PM2.5浓度处理下，脂滴的数量随着拉伸强度的增加而增加，说明PM2.5的浓度和拉伸强度都对泡沫细胞形成具有促进作用，随着PM2.5浓度升高和拉伸强度增加，泡沫细胞的数量增加更加显著。

实施例3、阿托伐他汀对多细胞共培养体系中泡沫细胞形成的影响

目前，在治疗动脉粥样硬化疾病中采用最多的药物是他汀类药物，其中，阿托伐他汀是最为常用。有关他汀类药物的降脂机理已经进行了大量的研究报道，临床上得到验证。随着研究的深入，人们发现他汀类药物除了具有降脂的作用外，还有改善内皮细胞、抗炎、抑制平滑肌细胞增殖、抗血栓形成和抗血小板等功能。动脉粥样硬化的前期标志是内皮细胞功能紊乱，而低密度脂蛋白浓度升高是诱发内皮细胞功能紊乱的一个重要因素，本发明的发明人通过在多细胞共培养体系中加入低密度脂蛋白(25μg/ml)，加剧内皮细胞功能紊乱。另外，阿托伐他汀(Atorvastatin)可以抑制平滑肌细胞的增殖。在上述共培养体系中，以阿托伐他汀钙为例验证阿托伐他汀对多细胞共培养体系中泡沫细胞形成的影响。

具体方法如下：

阿托伐他汀钙为北京普益华科技有限公司提供的Bide产品，将其使用无水乙醇溶解，配置成一定浓度的母液备用。

为了考察不同浓度的阿托伐他汀钙的作用，发明人采用了容易形成泡沫细胞的诱导条件，即25μg/ml低密度脂蛋白LDL和15％的拉伸形变同时作用，在进行诱导的同时，设置阴性对照组(不拉伸、不加低密度脂蛋白LDL、不加抗动脉粥样药物阿托伐他汀钙)，阳性对照组(15％拉伸形变、25μg/ml低密度脂蛋白LDL、不加抗动脉粥样硬化药物阿托伐他汀钙)，实验组(15％拉伸形变、25μg/ml低密度脂蛋白LDL、分别为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml阿托伐他汀钙)，LDL与阿托伐他汀钙均添加至多细胞培养体系的培养基中。在实施例1的三种细胞的共培养体系基础上，采用上述条件培养处理细胞48小时，然后进行油红染色，拍照并分析结果。

实验结果如图6所示：阴性对照组无泡沫细胞的形成，阳性对照组的泡沫细胞形成的数目最多，脂滴的面积也是最大的，而在实验组中，随着抗动脉粥样硬化药物阿托伐他汀钙的浓度升高，生成的泡沫细胞数目减少，脂滴的面积也减少，当阿托伐他汀钙的浓度达到50ng/ml的时候，形成的脂滴的面积和阴性对照组已无明显区别。结果表明：该泡沫细胞形成体外模型可以验证阿托伐他汀钙治疗动脉粥样硬化的的作用，证明实施例1的三种细胞的共培养体系诱导泡沫细胞形成的模型可有效用于抗动脉粥样硬化药物的筛选。

Claims (10)

1.泡沫细胞形成模型的构建方法，包括：在细胞培养装置中从下至上依次培养平滑肌细胞、内皮细胞和单核细胞，得到三种细胞共培养体系，该三种细胞共培养体系为泡沫细胞形成模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞培养装置为可机械拉伸的细胞培养装置；

所述细胞培养装置包括依次叠加在一起的细胞培养层、PDMS薄膜和液体流量控制层；

所述液体流量控制层上设有至少1条微通道；所述微通道上设有至少1个腔室，所述腔室的高度与所述微通道的高度相等；

所述细胞培养层上设有与所述腔室数量相等的细胞培养池，所述细胞培养池的底部为所述PDMS薄膜，所述细胞培养池与所述腔室的形状相同；

在沿所述液体流量控制层至所述细胞培养层的方向上，所述细胞培养池与所述腔室的位置相应；

所述微通道的入口和出口均依次穿过所述PDMS薄膜和所述细胞培养层与外界相连通。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述细胞培养装置上包被有细胞粘附载体。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述从下至上依次培养平滑肌细胞、内皮细胞和单核细胞包括：

A1)在所述细胞培养装置中培养所述平滑肌细胞，得到接种有平滑肌细胞的细胞培养装置；

A2)在所述接种有平滑肌细胞的细胞培养装置中培养所述内皮细胞，得到平滑肌细胞-内皮细胞共培养体系；

A3)在所述平滑肌细胞-内皮细胞共培养体系上培养所述单核细胞，得到所述三种细胞共培养体系。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：培养所述平滑肌细胞的体系与培养所述内皮细胞的体系中均含有所述刺激细胞分泌基质胶的物质。

6.含有泡沫细胞的细胞培养体系的制备方法，包括：向权利要求1-5中任一所述的三种细胞共培养体系中添加低密度脂蛋白得到泡沫细胞诱导体系，培养所述泡沫细胞诱导体系，得到含有泡沫细胞的细胞培养体系。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述泡沫细胞诱导体系中低密度脂蛋白的浓度为5-100μg/mL。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述培养所述泡沫细胞诱导体系包括通过所述可机械拉伸的细胞培养装置对所述培养所述泡沫细胞诱导体系施加拉伸作用使细胞发生形态变化。

9.下述M1)或M2)的产品：

M1)利用权利要求1-5中任一所述的方法制备的泡沫细胞形成模型；

M2)利用权利要求6-8中任一所述的方法制备的含有泡沫细胞的细胞培养体系。

10.权利要求9所述的产品在筛选治疗和/或预防动脉粥样硬化药物中的应用。