CN108893440A - 一种基于单层纳米纤维基片共培养技术构建生物屏障的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障及其方法以及一种微流控芯片，本发明提供的基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障的生物相容性好，膜孔径均匀，该模型能够形成稳定性高、重复性高、生理功能接近于体内的生物屏障模型，并可以与微流控装置相匹配。

Description

一种基于单层纳米纤维基片共培养技术构建生物屏障的方法
技术领域
本发明属于组织工程生物材料技术领域，具体涉及一种生物屏障及其制备方法以及一种微流控芯片。
背景技术
生物屏障以精确的调节能力和强有力的防御机能，保持着人体与外环境之间的动态平衡，防止了病菌入侵，减少了机械刺激，促进了营养吸收与废物排泄，使人体得以安康无恙。然而，在药物治疗方面，生物屏障的存在限制了大多数药物在组织系统中的应用，从而导致了许多疾病仍然无法得到有效的控制。因此，在体外构建一种可以有效模拟体内生物屏障的模型用于药物输送过程等的研究是目前研究的热点。
人体内的生物屏障通常是多个细胞共同作用的结果。因此，为构建生物屏障模型，开发合适的用于细胞共培养的生物支架是研究的重点。最早的细胞共培养模型是由玻片把两种细胞分开放在同一个培养皿中实现共培养。由玻片把两种细胞分开放在同一个培养皿中实现共培养的培养方式提出了间接共培养的概念，但玻片无法进行细胞分泌物的渗透，故而无法建立两种细胞之间的相互作用，降低了共培养模型的质量。随着材料科学的发展，更多膜采料的选择为共培养模型带来了曙光。
Transwell小室是众多共培养模型中应用最广的。Transwell技术最关键的部分就是上下小室间有一张有通透性的膜，由于此膜的而存在，Transwell技术可用于多种生物方面的研究，例如生物屏障的建立、细胞趋化、细胞迁移和细胞侵袭等。Transwell技术目前应用广泛，但仍然存有缺陷，根据不同的实验要求选择合适的膜材料增加了实验的复杂性，而且Transwell装置中采用的多孔膜多为合成高分子材料例如聚碳酸酯膜，这种膜结构生物相容性差，而且多孔膜中孔的分布也不均匀。此外，Transwell装置本身不能为细胞生长提供动态微环境也不能与当前使用广泛的微流控装置相匹配，所以Transwell装置并不能满足当前对生物屏障模型研究的需要。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障及其方法以及一种微流控芯片，本发明提供的基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障的生物相容性好，膜孔径均匀，该模型能够形成稳定性高、重复性高、生理功能接近于体内的生物屏障模型，并可以与微流控装置相匹配。
本发明提供了一种基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障模型，包括一个或多个叠加的单层纳米纤维基片以及在所述单层纳米纤维基片两侧分别培养的不同种类的细胞；
所述单层纳米纤维基片包括：
具有若干个直通孔的基片支架，所述直通孔与所述单层纳米纤维基片的平面垂直；
用于固定所述基片支架并环绕于所述基片支架外围的固定环；
复合于所述基片支架的单层纳米纤维层，所述单层纳米纤维层由纺丝液通过静电纺丝制备而成，所述纺丝液包括明胶、卵磷脂、壳聚糖、胶原蛋白和海藻酸钠中的一种或多种。
优选的，所述基片支架的厚度为20～100μm，所述若干个直通孔为阵列排布，所述直通孔的孔径为200～1000μm，所述直通孔的横截面为三角形、四边形、五边形、六边形或圆形；
所述固定环的厚度为50～100μm；
所述单层纳米纤维层的孔径为5～30μm，厚度为300～500nm。
优选的，其特征在于，所述基片支架以及固定环为PEDGA材料。
优选的，所述生物屏障模型选自人体皮肤屏障模型、人体气血屏障模型或血脑屏障模型。
优选的，所述单层纳米纤维基片中，所述基片支架与单层纳米纤维层之间还包括一层金。
优选的，所述纺丝液中，明胶、卵磷脂、壳聚糖、胶原蛋白和海藻酸钠中的一种或多种的质量浓度为5wt％～20wt％，优选为10wt％。
本发明还提供了一种上述基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障模型的构建方法，包括以下步骤：
根据人体内生物屏障中细胞的分布，将细胞接种至一个或多个叠加的单层纳米纤维基片上，得到生物屏障模型。
优选的，所述生物屏障模型选自人体皮肤屏障模型、人体气血屏障模型或人体血脑屏障模型；
所述人体皮肤屏障模型的构建方法为：
A)将培养至对数期的成纤维细胞分别接种在两个单层纳米纤维基片的基片支架的一侧后，将所述两个单层纳米纤维基片叠加，进行所述成纤维细胞培养，叠加后的两个单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层分别在两侧；
B)将表皮细胞接种至第三个单层纳米纤维基片的基片支架的一侧进行培养；
C)将步骤B)的单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层与步骤A)中叠加后的两个单层纳米纤维基片的任意一侧的单层纳米纤维层贴合后叠加，使所述成纤维细胞与表皮细胞共培养，得到人体皮肤屏障模型；
所述人体气血屏障模型的构建方法为：
将血管内皮细胞接种至单层纳米纤维基片的基片支架的一侧进行培养后，再在单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层的一侧接种肺泡上皮细胞，使所述血管内皮细胞与肺泡上皮细胞共培养，得到人体气血屏障模型；
所述人体血脑屏障模型的构建方法为：
将血管内皮细胞与胶质细胞分别接种于两个单层纳米纤维基片的基片支架的一侧进行培养，将所述两个单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层贴合后叠加，使血管内皮细胞与胶质细胞共培养，得到血脑屏障模型。
优选的，所述单层纳米纤维基片的制备方法为：
a)利用PDMS模具制备具有若干个直通孔的基片支架；
b)利用PDMS模具制备固定环；
c)将所述基片支架与固定环粘结；
d)通过静电纺丝，在所述基片支架表面形成单层纳米纤维层，得到单层纳米纤维基片。
本发明还提供了一种微流控芯片，包括上述基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障模型。
与现有技术相比，本发明提供了一种基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障模型，包括一个或多个叠加的单层纳米纤维基片以及在所述单层纳米纤维基片两侧分别培养的不同种类的细胞；所述单层纳米纤维基片包括：具有若干个直通孔的基片支架，所述直通孔与所述单层纳米纤维基片的平面垂直；用于固定所述基片支架并环绕于所述基片支架外围的固定环；复合于所述基片支架的单层纳米纤维层，所述单层纳米纤维层由纺丝液通过静电纺丝制备而成，所述纺丝液包括明胶、卵磷脂、壳聚糖、胶原蛋白和海藻酸钠中的一种或多种。本发明采用单层纳米纤维基片培养技术构建生物屏障模型。该纳米纤维基片采用生物相容性好的材料作为原材料，并采用静电纺丝技术制备。本发明可实现细胞的离地三维培养，并将细胞与培养液的接触最大化，细胞与外界材料的接触最小化，使细胞在单层纳米纤维基片上具有充分的自由度，从而更好地模拟细胞在体内的微环境。此外，该培养基片由基片支架和固定环组成，为细胞生长分化提供支架，而且可允许细胞排泄物通过，建立细胞间的联系。更重要的是该基片可实现多个基片连扣在一起，使生物屏障模型的构建更加便利。因此，本发明为生物屏障的构建带来新的方向，也为药物的筛选提供有效的平台。本发明提供的基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障的生物相容性好，膜孔径均匀，该模型能够形成稳定性高、重复性高、生理功能接近于体内的生物屏障模型，并可以与微流控装置相匹配。
附图说明
图1为本发明制备的单层纳米纤维基片的示意图；
图2为不同倍数条件下聚集了纳米纤维的PEDGA基片的扫描电镜图；
图3为聚集了纳米纤维的PEDGA基片的纳米纤维层的孔径分布图(c)以及纳米纤维的直径分布图(d)；
图4为实施例1制备的单层纳米纤维基片光学照片；
图5为实施例1制备的单层纳米纤维基片交联前(a)与交联后(b)的扫描电镜图；
图6为人体皮肤屏障模型的截面结构示意图；
图7为人体皮肤屏障模型免疫荧光图；
图8为人体气血屏障模型截面的结构示意图；
图9为人体气血屏障模型免疫荧光图；
图10为肺泡上皮细胞和血管内皮细胞在基片上共培养一天后的三维荧光图；
图11为血脑屏障模型免疫荧光图；
图12为微流控芯片组装时按照生物屏障模型的照片；
图13为微流控芯片的照片；
图14为微流控芯片的照片；
图15为微流控芯片与外接泵相连后的照片；
图16为Trans-well生物屏障模型的结构示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障模型，包括一个或多个叠加的单层纳米纤维基片以及在所述单层纳米纤维基片两侧分别培养的不同种类的细胞；
所述单层纳米纤维基片包括：
具有若干个直通孔的基片支架，所述直通孔与所述单层纳米纤维基片的平面垂直；
用于固定所述基片支架并环绕于所述基片支架外围的固定环；
复合于所述基片支架的单层纳米纤维层，所述单层纳米纤维层由纺丝液通过静电纺丝制备而成，所述纺丝液包括明胶、卵磷脂、壳聚糖、胶原蛋白和海藻酸钠中的一种或多种。
本发明基于单层纳米纤维基片在体外构建一种模拟体内生物屏障的模型。
其中，所述单层纳米纤维基片包括：
具有若干个直通孔的基片支架，所述直通孔与所述单层纳米纤维基片的平面垂直；
用于固定所述基片支架并环绕于所述基片支架外围的固定环；
复合于所述基片支架的单层纳米纤维层，所述单层纳米纤维层由纺丝液通过静电纺丝制备而成，所述纺丝液包括明胶、卵磷脂、壳聚糖、胶原蛋白和海藻酸钠中的一种或多种。
在本发明中，所述单层纳米纤维基片包括具有若干个直通孔的基片支架，所述若干个直通孔的基片支架厚度为20～100μm，优选为40～60μm；所述若干个直通孔为阵列排布，所述直通孔的孔径为200～1000μm，优选为400～800μm，所述直通孔的横截面为三角形、四边形、五边形、六边形或圆形。
所述单层纳米纤维基片还包括用于固定所述基片支架并环绕于所述基片支架外围的固定环；
所述固定环的厚度为50～100μm，优选为60～90μm；外径5～15mm，内径5～15mm，外径大于内径；
本发明所述基片支架以及固定环为PEDGA材料。
所述单层纳米纤维基片还包括复合于所述基片支架的单层纳米纤维层，所述单层纳米纤维层由纺丝液通过静电纺丝制备而成，所述纺丝液包括明胶、卵磷脂、壳聚糖、胶原蛋白和海藻酸钠中的一种或多种。
所述纺丝液中明胶、卵磷脂、壳聚糖、胶原蛋白和海藻酸钠中的一种或多种的质量浓度为5wt％～20wt％，优选为10wt％～15wt％。
具体的，在本发明的一些具体实施方式中，所述纺丝液为：
将明胶溶解于溶液中，得到纺丝液。其中，所述溶液为体积比为(18～25):(10～18):(8～15)的乙酸、乙酸乙酯和蒸馏水的混合溶液。
在本发明的另一些实施方式中，所述纺丝液为：
卵磷脂-明胶-壳聚糖按质量比为(1～4):(12～18):(0.5～2)溶于65％～85％的乙酸。
为了提高静电纺丝的效果，即单层纳米纤维层与所述具有若干个直通孔的基片支架的粘附性，所述基片支架与单层纳米纤维层之间还包括一层金。
本发明提供的生物屏障模型还包括在所述单层纳米纤维基片两侧分别培养的不同种类的细胞。
根据所要构建的生物屏障模型，培养所需的特定细胞，待特定细胞培养至对数期后，按照人体内屏障中细胞的分布，将细胞合理接种至单层纳米纤维基片上。
在本发明的一些具体实施例中，所述生物屏障模型选自人体皮肤屏障模型、人体气血屏障模型或血脑屏障模型。
本发明还提供了一种上述基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障模型的构建方法，包括以下步骤：
根据人体内生物屏障中细胞的分布，将细胞接种至一个或多个叠加的单层纳米纤维基片上，得到生物屏障模型。
在本发明的一些具体实施例中，所述生物屏障模型选自人体皮肤屏障模型、人体气血屏障模型或血脑屏障模型。
本发明基于单层纳米纤维基片在体外构建一种模拟体内生物屏障的模型。
其中，所述单层纳米纤维基片的制备方法为：
a)利用PDMS基片支架模具制备具有若干个直通孔的基片支架；
b)利用PDMS固定环模具制备固定环；
c)将所述基片支架与固定环结合；
d)通过静电纺丝，在所述基片支架表面形成单层纳米纤维层，得到单层纳米纤维基片。
具体的，首先制备步骤a)与步骤b)中的模具
根据单层纳米纤维基片中基片支架直通孔的横截面的图形，用微图形发生器制作带有与所述直通孔形状结构相对应的Cr掩膜。使用AZ40XT光胶通过UV光刻法在Cr掩膜板上生成支架的光胶母版：首先，在500～1000rpm的条件下在掩模上旋涂5～10s，1500～2000rpm下旋涂10～30s形成50μm左右的AZ40XT光胶层。然后在65℃、95℃和126℃下对抗蚀剂进行梯度预烘烤10～15min。冷却至室温后，用UV光对掩模进行背曝光，随后进行后烘烤工艺(在分别在65℃(30s-1min)、95℃(30s-1min)和105℃(2min左右)下进行梯度烘烤)。然后用AZ319MIF显影1-3分钟，得到AZ40XT母模。接着，将模具用TMCS进行防粘表面处理1-10分钟。将PDMS溶液浇于模具上，在80℃中固化1-4小时，随后将PDMS模具剥离，得到步骤a)中所述的基片支架PDMS模具。其中PDMS溶液是用Ge RTV 615的a和b组分以10：1的比例混合而来。
步骤b)的所述的固定环PDMS模具的制备方法为：根据单层纳米纤维基片中固定环的横截面的图形，用微图形发生器制作带有与所述固定环形状结构相对应的Cr掩模。使用SU8-3050光胶在硅片上进行UV光刻：首先，在500rpm的条件下在硅片上旋涂10s左右，1000rpm下旋涂30s左右形成100μm左右的SU8-3050光胶层。然后在65℃、95℃下对光胶进行梯度预烘烤30-45min。冷却至室温后，用UV光通过掩模对光胶曝光30秒左右，随后进行后烘烤工艺(在分别在65℃(30s-1min)、95℃(5min左右)梯度下烘烤)。然后用SU8显影液进行10-15分钟显影，得到固定环的SU8母版。接着用TMCS试剂进行防粘表面处理1-10分钟。将PDMS溶液浇于母版上，在80℃中固化1-4小时，随后将PDMS模具剥离，得到步骤b)中所述的固定环PDMS模具。其中PDMS溶液是用Ge RTV 615的a和b组分以10：1的比例制备而来。
得到步骤a)与步骤b)中的模具后，进行单层纳米纤维基片的制备，具体如下：
1、基片支架的制备
先将PDMS基片支架模具放在载玻片上，然后将PDMS-载玻片组件放在干燥器中脱气15分钟。同时，配制好PEGDA预溶液，并用于填充PDMS模具-载玻片组件上的空隙以制备具有若干个直通孔的基片支架并除去脱气产生的微小吸入物。当PDMS-载玻片组件的空隙被充分填满之后，用紫外线照射组件照射30～50s，获得坚固的具有若干个直通孔的基片支架。
2、固定环的制备
将软光刻技术制成的PDMS固定环模具放在一个玻璃片上。然后，将PEGDA预溶液添加至模具里面并用紫外光照射固化30～50s，得到固定环。
3、将基片支架与固定环结合
将固定环通过PEGDA预溶液镶嵌在PEGDA基片支架上，用紫外线照射组件照射30～60s进行固化，然后将整个框架浸没在异丙醇溶液中进行超声洗涤10分钟并用去离子水超声洗涤10分钟以去除残留的未反应的PEDGA预溶液以及光引发剂。
在本发明中，所述PEGDA预溶液中的各成分的含量范围为：2wt％～8wt％的光引发剂，92wt％～98wt％的PEGDA。
通过静电纺丝，在所述基片支架表面形成单层纳米纤维层，得到单层纳米纤维基片。
具体的，静电纺丝的步骤为：
第一步：调节操作室内环境温湿度，确保纺丝环境温度在20℃～30℃，湿度在40％～60％的范围内。
第二步：取铝箔一块，将铝箔粘贴在滚筒收集器上，完全覆盖滚筒收集器，滚筒收集器的直径为6～15cm，将表面镀有金层的基片粘附在铝箔表面。
第三步：取一根0.2～1mm内径的硅胶管，在一端套入与所述硅胶管内径相匹配的针头，在另一端套上去掉底座的与所述硅胶管内径相匹配的针头。
第四步：用1～5mL注射器吸取适量的纺丝溶液，将注射器连接有底座的针头。用手慢慢推动注射器，直到有少许的纺丝液从针头溢出即可。
第五步：将装有纺丝液的注射器安装在推进器上，注意推进器要顶住注射器的末端。
第六步：将滚筒注射器置于注射泵和高压直流电源之间，无底座的针头距离铝箔10～15cm。高压直接电源的正极接无底座的针头，负极接滚筒收集器。
第七步：打开注射泵电源，调节纺丝速度为0.02ml/h～0.4ml/h。
第八步：打开高压直流电源，旋转调压旋钮，调节电压11～23kV。
第九步：开启滚筒收集器旋转按钮，滚筒转动速率为0.5r/s～1.0r/s。
第十步：静电纺丝10min～1h。
第十一步：纺丝结束时，先将高压直流电源的电压调到零，然后关闭高压直流电源，接着关闭注射泵，拔下二者电源插头。取下纺有纳米纤维敷料的铝箔。
静电纺丝后，将聚集了纳米纤维的PEDGA基片置于真空中干燥以除去残留的溶剂。事先准备好用EDC以及NHS在乙醇溶液中充分溶解的交联试剂，EDC和NHS的浓度均为0.02M～2M溶于乙醇溶液中。将支架置于交联试剂中交联2～8小时。交联完成后，样品用乙醇漂洗三次并在真空中干燥以除去残留的化学药品。
将制备好的单层纳米纤维基片浸泡在PBS中，恒温培养箱中放置过夜，取出后紫外光下照射30min灭菌处理。
参见图1，图1为本发明制备的单层纳米纤维基片的示意图。
根据所要构建的生物屏障模型，培养所需的特定细胞，待特定细胞培养至对数期后，按照人体内屏障中细胞的分布，将细胞合理接种至纳米纤维基片上，必要时可以将多个纳米纤维基片用生物相容性的夹子连在一起，模拟生物屏障在体内的生存状态。
在本发明中，所述生物屏障模型选自人体皮肤屏障模型、人体气血屏障模型或人体血脑屏障模型；
所述人体皮肤屏障模型的构建方法为：
A)将培养至对数期的成纤维细胞分别接种在两个单层纳米纤维基片的基片支架的一侧后，将所述两个单层纳米纤维基片叠加，进行所述成纤维细胞培养，叠加后的两个单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层分别在两侧；
B)将表皮细胞接种至第三个单层纳米纤维基片的基片支架的一侧进行培养；
C)将步骤B)的单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层与步骤A)中叠加后的两个单层纳米纤维基片的任意一侧的单层纳米纤维层贴合后叠加，使所述成纤维细胞与表皮细胞共培养，得到人体皮肤屏障模型；
所述人体气血屏障模型的构建方法为：
将血管内皮细胞接种至单层纳米纤维基片的基片支架的一侧进行培养后，再在单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层的一侧接种肺泡上皮细胞，使所述血管内皮细胞与肺泡上皮细胞共培养，得到人体气血屏障模型；
所述人体血脑屏障模型的构建方法为：
将血管内皮细胞与胶质细胞分别接种于两个单层纳米纤维基片的基片支架的一侧进行培养，将所述两个单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层贴合后叠加，使血管内皮细胞与胶质细胞共培养，得到血脑屏障模型。
本发明还提供了一种微流控芯片，其特征在于，包括上述基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障模型。
具体的，所述微流控芯片包括：
基板，所述基片上具有与单层纳米纤维基片形状相匹配的凹槽，在所述凹槽的两侧分别开设有进液流道以及出液流道，所述进液流道与出液流道与所述凹槽相连通；
生物屏障模型，所述生物屏障模型置于所述基板上的凹槽处；
与基板相匹配的盖板，所述盖板上开设有与进液流道相连通的进液口以及与出液流道相连通的出液口。
将所述微流控芯片组装后，将细胞培养液采用流动的形式通过构建好的生物屏障模型，从而可以更好的模拟生物屏障模型在体内的形态。
与传统的共培养构建方法相比：第一，该方法采用的单层纳米纤维培养基片渗透性强，细胞在上面更容易增殖分化，细胞更接近其在体内的生存环境。第二，培养基片可随意组合这一功能是得该方法适合多种生物屏障模型的构建，证明该模型方便灵活，操作性强。第三，该方法构建的生物屏障模型可应用于微流控芯片中，为模型在动态环境下的研究提供重要依据，也拓宽了模型的应用范围。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障及其方法以及一种微流控芯片进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
1、基片支架的制备
先将PDMS基片支架模具放在载玻片上，然后将PDMS-载玻片组件放在干燥器中脱气15分钟。同时，配制好PEGDA预溶液，并用于填充PDMS模具-载玻片组件上的空隙以制备具有若干个直通孔的基片支架并除去脱气产生的微小吸入物。当PDMS-载玻片组件的空隙被充分填满之后，用紫外线照射组件照射30s，获得坚固的具有若干个直通孔的基片支架。
基片支架的厚度为50μm，所述若干个直通孔为阵列排布，所述直通孔的孔径为500μm，所述直通孔的横截面为正六边形。固定环的厚度为100μm,所述单层纳米纤维层的孔径为25μm，厚度为400nm。
2、固定环的制备
将软光刻技术制成的PDMS固定环模具放在一个玻璃片上。然后，将PEGDA预溶液添加至模具里面并用紫外光照射固化30～50s，得到固定环。
3、将基片支架与固定环结合
将固定环通过PEGDA预溶液镶嵌在PEGDA基片支架上，用紫外线照射组件照射30～60s进行固化，然后将整个框架浸没在异丙醇溶液中进行超声洗涤10分钟并用去离子水超声洗涤10分钟以去除残留的未反应的PEDGA预溶液以及光引发剂，得到PEGDA基片。
所述PEGDA预溶液中的各成分的含量范围为：4wt％的光引发剂，96wt％的PEGDA。
接着，在所述PEGDA基片表面镀金层。
4、静电纺丝，得到单层纳米纤维基片
通过静电纺丝，在所述基片支架表面形成单层纳米纤维层，得到单层纳米纤维基片。
具体的，静电纺丝的步骤为：
第一步：调节操作室内环境温湿度，确保纺丝环境温度在20℃±3℃，湿度在40±5％的范围内。
第二步：取铝箔一块，将铝箔粘贴在滚筒收集器上，完全覆盖滚筒收集器，滚筒收集器的直径为10cm，将表面镀有金层的PEGDA基片粘附在铝箔表面。
第三步：取一根0.5mm内径硅胶管，在一端套入0.6mm内径针头，在另一端套上去掉底座的0.6mm内径针头。
第四步：用1mL注射器吸取1mL纺丝溶液，将注射器连接有底座的针头。用手慢慢推动注射器，直到有少许的纺丝液从针头溢出即可。
纺丝液为明胶的质量比为：10wt％明胶溶于体积比为21:14:10的乙酸、乙酸乙酯和蒸馏水的混合溶液中。
第五步：将装有纺丝液的注射器安装在推进器上，注意推进器要顶住注射器的末端。
第六步：将滚筒注射器置于注射泵和高压直流电源之间，无底座的针头距离铝箔12cm。高压直接电源的正极接无底座的针头，负极接滚筒收集器。
第七步：打开注射泵电源，调节纺丝速度为0.2ml/h。
第八步：打开高压直流电源，旋转调压旋钮，调节电压15kV。
第九步：开启滚筒收集器旋转按钮，滚筒转动速率为0.9r/s。
第十步：静电纺丝15min。
第十一步：纺丝结束时，先将高压直流电源的电压调到零，然后关闭高压直流电源，接着关闭注射泵，拔下二者电源插头。取下纺有纳米纤维敷料的铝箔。
静电纺丝后，将聚集了纳米纤维的PEDGA基片置于真空中干燥一夜以除去残留的溶剂。
参见图2和图3，图2为不同倍数条件下聚集了纳米纤维的PEDGA基片的扫描电镜图。图3为聚集了纳米纤维的PEDGA基片的纳米纤维层的孔径分布图(c)以及纳米纤维的直径分布图(d)。
事先准备好用EDC以及NHS在乙醇溶液中充分溶解的交联试剂(EDC和NHS的浓度均为0.02M溶于乙醇溶液中)。将明胶支架置于交联试剂中交联4小时。交联完成后，样品用乙醇漂洗三次并在真空中干燥一整夜以除去残留的化学药品。
将制备好的单层纳米纤维基片浸泡在PBS中，恒温培养箱中放置过夜，取出后紫外光下照射30min灭菌处理。图4为实施例1制备的单层纳米纤维基片光学照片。图5为实施例1制备的单层纳米纤维基片交联前(a)与交联后(b)的扫描电镜图。
实施例2
本实施例着重介绍一种人体皮肤屏障模型的构建方法步骤：
皮肤屏障模型是由表皮层的角质细胞及真皮层的成纤维细胞构成的。因此，在本实例中，将真皮成纤维细胞在基片上培养，上面覆盖表皮细胞形成的皮肤模型来取代正常结构组织的皮肤。
步骤一、HaCat细胞培养
取出装有Hacat细胞的冷冻管，水浴融化，离心，用含1％双抗，10％胎牛血清的高糖DMEM培养液培养Hacat细胞，每2天换一次液。待细胞铺满瓶底85％时，用胰蛋白酶进行消化传代，在显微镜中观察细胞至细胞外形呈椭圆状，即将脱壁分离时，终止消化。取细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养液后分瓶培养，在37℃，5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。
步骤二、3T3细胞的培养
取出装有3T3细胞冷冻管，水浴融化，离心，用含1％双抗，15％胎牛血清的高糖DMEM培养液培养3T3细胞，每两天换一次液。待细胞铺满瓶底85％时，用胰蛋白酶进行消化传代，在显微镜中观察细胞至细胞外形呈椭圆状，即将脱壁分离时，终止消化。取细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养液后分瓶培养，在37℃，5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。
步骤三、屏障模型的构建
A)将培养至对数期的3T3成纤维细胞分别接种在两个单层纳米纤维基片的基片支架的一侧后，将所述两个单层纳米纤维基片叠加，进行所述3T3成纤维细胞培养，叠加后的两个单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层分别在两侧；
B)将HaCat细胞接种至第三个单层纳米纤维基片的基片支架的一侧进行培养；
C)将步骤B)的单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层与步骤A)中叠加后的两个单层纳米纤维基片的任意一侧的单层纳米纤维层贴合后叠加，使所述成纤维细胞与表皮细胞共培养，得到人体皮肤屏障模型，结构示意图参见图6，图6为人体皮肤屏障模型的截面结构示意图。待角质细胞生长至融合状态弃掉培养基(培养一周)，使细胞处于气-液交界面上。显微镜下观察共培养细胞形态。
结果见图7，图7为人体皮肤屏障模型免疫荧光图。由图7可知，角质层分化完全，真皮层成纤维细胞生长状态良好，有胶原分泌，因此，本专利所述的在体外构建生物屏障模型的方法是可行的。。
实施例3
本实施例着重介绍一种人体气血屏障模型的构建方法步骤：
人体气血屏障主要由内皮和上皮细胞层组成。因此，在本实例中，将人气静脉内皮细胞(HUVEC)基片上培养，上面接种肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)构建人体气血屏障模型来取代正常结构组织的人体气血屏障。
步骤一、A549细胞培养
取出装有A549细胞的冷冻管，水浴融化，离心，用含1％双抗，10％胎牛血清的高糖DMEM培养液培养A549细胞，每2天换一次液。待细胞铺满瓶底75％-80％时，用胰蛋白酶进行消化传代，在显微镜中观察细胞至细胞外形呈椭圆状，即将脱壁分离时，终止消化。取细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养液后分瓶培养，在37℃，5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养.
步骤二、HUVEC细胞培养
取出装有HUVEC细胞的冷冻管，水浴融化，离心，用含1％双抗，10％胎牛血清的高糖DMEM培养液培养HUVEC细胞，每3天换一次液。待细胞铺满瓶底75％-80％时，用胰蛋白酶进行消化传代，在显微镜中观察细胞至细胞外形呈椭圆状，即将脱壁分离时，终止消化。取细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养液后分瓶培养，在37℃，5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。
步骤三、人体气血屏障模型的构建
将培养至对数期的HUVEC接种至单层纳米纤维基片的基片支架的一侧进行培养至最好的状态后，再在单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层的一侧接种肺泡上皮细胞A549，使所述血管内皮细胞与肺泡上皮细胞共培养，得到人体气血屏障模型，参见图8，图8为人体气血屏障模型截面的结构示意图。观察不同阶段共培养细胞的细胞形态。结果见图9和图10，图9为人体气血屏障模型免疫荧光图。由图9可知，可以看到肺泡上皮细胞和血管内皮细胞生长状态良好，上皮细胞形成紧密连接。图10为肺泡上皮细胞和血管内皮细胞在基片上共培养一天后的三维荧光图。其中，绿色：肺泡上皮细胞由Cell Tracker Green CMFDA标记，红色：血管内皮细胞由Cell Tracker CM-Dil标记。由图10可知，肺泡上皮细胞和血管内皮细胞生长状态良好，虽然并不很明显，但依然可以看到就有分层。
实施例4
血脑屏障模型的构建
研究发现，形成血脑屏障并非脑微血管内皮细胞的固有特性，而是星形胶质细胞诱导所致。星形胶质细胞可诱导非脑微血管内皮细胞在不同程度上形成血脑屏障。因此，在本实例中，我们将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)基片上培养，在另一个基片上培养星形胶质细胞(C6)构建血脑上皮屏障模型来取代正常结构组织的血脑上皮屏障。
步骤一、HUVEC细胞培养
取出装有HUVEC细胞的冷冻管，水浴融化，离心，用含1％双抗，10％胎牛血清的高糖DMEM培养液培养HUVEC细胞，每3天换一次液。待细胞铺满瓶底75％-80％时，用胰蛋白酶进行消化传代，在显微镜中观察细胞至细胞外形呈椭圆状，即将脱壁分离时，终止消化。取细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养液后分瓶培养，在37℃，5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。
步骤二、C6胶质细胞培养
取出装有C6胶质细胞的冷冻管，水浴融化，离心，用含1％双抗，10％胎牛血清的高糖DMEM培养液培养C6细胞，每3天换一次液。待细胞铺满瓶底75％-80％时，用胰蛋白酶进行消化传代，在显微镜中观察细胞至细胞外形呈椭圆状，即将脱壁分离时，终止消化。取细胞悬液离心，弃上清液，加入适量新鲜的培养液后分瓶培养，在37℃，5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。
步骤三、血脑屏障模型构建
将培养至对数期的HUVEC和C6细胞分别接种到两个单层纳米纤维基片的基片支架的一侧后，将所述两个单层纳米纤维基片叠加，叠加后的两个单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层分别在两侧，待细胞稳定后将两个Patch用生物相容性的夹子连在一起实现细胞间的相互作用，构建共培养体系
参见图11，图11为血脑屏障模型截面的结构示意图。结果见图11，图11为血脑屏障模型免疫荧光图。
经过共培养之后，血管内皮细胞能形成紧密连接，组成一道生物屏障，可在体外构建一种用于药物筛选和药物输送过程研究的有效模型。
实施例5
本实施例提供了一种微流控芯片，所述微流控芯片包括：
基板，所述基片上具有与单层纳米纤维基片形状相匹配的凹槽，在所述凹槽的两侧分别开设有进液流道以及出液流道，所述进液流道与出液流道与所述凹槽相连通；
将实施例3提供生物屏障模型置于所述基板上的凹槽处，参见图12，图12为微流控芯片组装时按照生物屏障模型的照片。
与基板相匹配的盖板，所述盖板上开设有与进液流道相连通的进液口以及与出液流道相连通的出液口。
将所述微流控芯片组装后，将细胞培养液采用流动的形式通过构建好的生物屏障模型，从而可以更好的模拟生物屏障模型在体内的形态。参见图13～14，图13～14为微流控芯片的照片。
图15为微流控芯片与外接泵相连后的照片。
对比例1
参见图15，图15为市售Trans-well生物屏障模型的结构示意图。
但由于Trans-well装置中的聚碳酸酯膜生物相容性较差，细胞共培养生长的结果为：细胞在其膜上并不能达到最好的生长状态。并且，Trans-well装置本身无法提供动态的微环境，也无法与现有的微流控装置匹配，因此Trans-well装置不能为细胞提供其在体内的动态环境，不能构建有效的用于替代体内屏障的体外屏障模型。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障模型，其特征在于，包括一个或多个叠加的单层纳米纤维基片以及在所述单层纳米纤维基片两侧分别培养的不同种类的细胞；
所述单层纳米纤维基片包括：
具有若干个直通孔的基片支架，所述直通孔与所述单层纳米纤维基片的平面垂直；
用于固定所述基片支架并环绕于所述基片支架外围的固定环；
复合于所述基片支架的单层纳米纤维层，所述单层纳米纤维层由纺丝液通过静电纺丝制备而成，所述纺丝液包括明胶、卵磷脂、壳聚糖、胶原蛋白和海藻酸钠中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的生物屏障模型，其特征在于，所述基片支架的厚度为20～100μm，所述若干个直通孔为阵列排布，所述直通孔的孔径为200～1000μm，所述直通孔的横截面为三角形、四边形、五边形、六边形或圆形；
所述固定环的厚度为20～200μm；
所述单层纳米纤维层的孔径为5～30μm，厚度为300～500nm。
3.根据权利要求1所述的生物屏障模型，其特征在于，所述基片支架以及固定环为PEDGA材料。
4.根据权利要求1所述的生物屏障模型，其特征在于，所述生物屏障模型选自人体皮肤屏障模型、人体气血屏障模型或血脑屏障模型。
5.根据权利要求1所述的生物屏障模型，其特征在于，所述单层纳米纤维基片中，所述基片支架与单层纳米纤维层之间还包括一层金。
6.根据权利要求1所述的生物屏障模型，其特征在于，所述纺丝液中，明胶、卵磷脂、壳聚糖、胶原蛋白和海藻酸钠中的一种或多种的质量浓度为5wt％～20wt％。
7.一种如权利要求1～6任意一项所述的基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
根据人体内生物屏障中细胞的分布，将细胞接种至一个或多个叠加的单层纳米纤维基片上，得到生物屏障模型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生物屏障模型选自人体皮肤屏障模型、人体气血屏障模型或人体血脑屏障模型；
所述人体皮肤屏障模型的构建方法为：
A)将培养至对数期的成纤维细胞分别接种在两个单层纳米纤维基片的基片支架的一侧后，将所述两个单层纳米纤维基片叠加，进行所述成纤维细胞培养，叠加后的两个单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层分别在两侧；
B)将表皮细胞接种至第三个单层纳米纤维基片的基片支架的一侧进行培养；
C)将步骤B)的单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层与步骤A)中叠加后的两个单层纳米纤维基片的任意一侧的单层纳米纤维层贴合后叠加，使所述成纤维细胞与表皮细胞共培养，得到人体皮肤屏障模型；
所述人体气血屏障模型的构建方法为：
将血管内皮细胞接种至单层纳米纤维基片的基片支架的一侧进行培养后，再在单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层的一侧接种肺泡上皮细胞，使所述血管内皮细胞与肺泡上皮细胞共培养，得到人体气血屏障模型；
所述人体血脑屏障模型的构建方法为：
将血管内皮细胞与胶质细胞分别接种于两个单层纳米纤维基片的基片支架的一侧进行培养，将所述两个单层纳米纤维基片的单层纳米纤维层贴合后叠加，使血管内皮细胞与胶质细胞共培养，得到血脑屏障模型。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述单层纳米纤维基片的制备方法为：
a)利用PDMS模具制备具有若干个直通孔的基片支架；
b)利用PDMS模具制备固定环；
c)将所述基片支架与固定环粘结；
d)通过静电纺丝，在所述基片支架表面形成单层纳米纤维层，得到单层纳米纤维基片。
10.一种微流控芯片，其特征在于，包括权利要求1～6任意一项所述的基于单层纳米纤维基片共培养技术构建的生物屏障模型。
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