CN113293097A - 一种人工基底膜及包含其的细胞培养装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人工基底膜及包含其的细胞培养装置,人工基底膜包括:核心层,核心层包括纳米丝网支架及生物膜件;生物膜件填充所述纳米丝网支架的缝隙,生物膜件由细胞外基质蛋白为材质制备而成。与现有技术相比,人工基底膜是一种生物基底膜的仿真结构,具有与生物细胞基底膜相对应的厚度及分子渗透特性。这种人工基底膜呈现出完整的生物活性,同时保证基底膜两边细胞间的相互作用,由此优化区室化细胞培养或细胞共培养,为体外生理学和病理学研究及新药筛选提供先进的3D组织模型。包含该人工基底膜细胞培养装置适用于上皮细胞层、内皮细胞层及相应细胞组织的培养和共培养,特别是屏障结构的构建,如血脑屏障,血气屏障,肾小球基底膜。
Description
技术领域
本发明属于组织及细胞培养领域,具体涉及一种人工基底膜、细胞培养装置、细胞培养系统及培养细胞的方法。
背景技术
基底膜支撑上皮细胞,内皮细胞等组织结构的胞外基质薄膜,其厚度约为100纳米,主要由IV型胶原蛋白(Type IV Collagen)、层粘连蛋白(Laminin)、巢蛋白(Nidogen)和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan)组成,其中IV型胶原蛋白和层粘连蛋白分别形成两个独立的聚合体网络,其余基底膜蛋白使胶原蛋白和层粘连蛋白相互交联和稳定。
基底膜与上皮及内皮等组织结构细胞膜上的细胞粘附分子和硫酸化的糖脂耦合发生作用,基底膜同时具有超薄特性及分子可渗透性,使其同时兼具屏障和分子渗透的作。尽管人们早已认识到基底膜的重要性,也提出了人工基底膜的各种方法,但迄今为止,还没有方法可以制作在组成成分和厚度两个方面可与生物基底膜类似的人工制品。例如,Hozumi等肽-壳用聚糖制作膜材料,然后用层粘连蛋白对培养基底进行表面处理。罗西等用静电纺丝技术生产具有特定肽序列的聚酯网以共培养皮肤细胞。Nishiguchi等使用聚酯和聚乙二醇混合物生产电纺纳米纤维以供肺泡-毛细血管共培养。上述研究均采用天然胞外基质蛋白和合成聚合物生产用于细胞培养的2D和3D矩阵,但目前所报导的大多数结构要么厚度过厚,要么分子无法渗透,实质无法模拟基底膜功能,对特殊细胞的培养造成障碍。而普通的塑料或弹性膜被广泛用于插入式细胞培养皿(穿透小室)及微流控器官芯片,由于其不连续性和非均匀通透性,更加无法模拟人工基底膜的功能。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供一种人工基底膜、细胞培养装置、细胞培养系统及培养细胞的方法。
具体技术方案如下:
一种人工基底膜,包括:
核心层,所述核心层包括纳米丝网支架及生物膜件;
所述生物膜件填充所述纳米丝网支架的缝隙,所述生物膜件由生物基底膜胞外基质蛋白制备而成;所述人工基底膜的厚度小于1μm。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于,采用纳米丝网支架为骨架,细胞外基质蛋白作为细胞填充,可以实现人工基底膜起到隔离的同时,满足超薄及分子渗透性的要求,呈现出完整的生物活性,不仅在人工基底膜的单面进行培养细胞,而且还可以在双面同时接种不同或相同的细胞,保证基底膜两边细胞间的相互作用,由此优化区室化细胞培养或细胞共培养,为体外生理学和病理学研究及新药筛选提供先进的3D组织模型。
进一步,所述纳米丝网支架由水凝胶或/掺杂纳米材料的水凝胶制备而成。
进一步,所述纳米丝网支架由明胶,胶原蛋白,聚乳酸或聚已内脂制备而成。
进一步,所述纳米丝网支架采用PEGDA水凝胶制备。
采取上述进一步技术方案的有益效果在于:上述材料具有生物兼容性,仿生性能更佳。
进一步,所述细胞外基质蛋白为IV型胶原蛋白。
采取上述进一步技术方案的有益效果在于:采用由IV型胶原蛋白尽可能模拟生物基底膜的成分,实现生物模拟的目的。
进一步,所述核心层包括相对设置的核心层第一面与核心层第二面,核心层第一面修饰有第一层粘连蛋白层;所述核心层第二面修饰有第二层粘连蛋白层;所述第一层粘连蛋白层及第二层粘连蛋白层采用相同或不同类型的层粘连蛋白。
进一步,所述第一层粘连蛋白层为L111和L211型层粘连蛋白,所述第二层粘连蛋白层为L411和L511型层粘连蛋白。
一种细胞培养装置,其不同之处在于,包括:
支撑层,所述支撑层包括支撑层本体及开设在所述支撑层本体上的若干通孔,所述通孔包括相对设置且连通的第一开口及第二开口;其中,上述人工基底膜将所述第一开口覆盖。
与现有技术相比,该细胞培养装置不仅可实现单细胞的培养,还可以实现上皮细胞层、内皮细胞层及相应细胞组织的培养和共培养。
进一步,所述通孔结构相同为正多边形,所述通孔的通孔壁的厚度为50~500um,所述支撑层的厚度为10~100um,相邻所述通孔的间距为100~1000um。
进一步,所述通孔为正六边形。
进一步,所述的支撑层包含光敏或热固化胶或由光敏或热固化胶制成。
进一步,所述支撑层本体包括相对设置的支撑层本体第一面与支撑层本体第二面,所述第一开口开设在所述支撑层本体第一面,所述第二开口开设在所述支撑层本体第二面,所述的支撑层中所有第一开口的面积之和占所述支撑层本体第一面的面积比例不少于50%,所述第一开口与所述第二开口的面积相同。
进一步,所述第二开口由所述纳米丝网支架覆盖。
采取上述进一步技术方案的有益效果在于:将纳米丝网支架将第二开口覆盖后,后续在第二开口的纳米丝网支架上种植细胞,由第二开口透过纳米丝网支架的空隙朝向第一开口方向进行生长,以此模拟延伸生长的细胞与种植在人工基底膜上的细胞的相互作用,通过该装置可构建血脑屏障、血气屏障及肾小球基底膜。
进一步,沿所述支撑层本体的边沿设有将所述支撑层本体的边沿包覆的加固环。
进一步,在所述通孔的边沿处,设有连接所述支撑层及所述纳米丝网支架的结合层。
进一步,所述结合层由纳米金制备。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于:采用结合层,可以使纳米丝沉积在支撑层表面。
一种制造上述细胞培养装置的方法,其不同之处在于,包括:
步骤S1:通过软光刻生产由生物相容性聚合物制成的支撑层;
步骤S2:通过溅射将结合剂沉积在所述第一开口边沿,制备结合层;
步骤S3:通过静电纺丝制备纳米丝网支架将所述第一开口覆盖,是所述纳米丝网支架的纤维两端与所述结合层连接;
步骤S4:通过液体薄膜成形工艺在纳米丝网支架的缝隙中沉积包括细胞外基质蛋白的溶液,将所述细胞外基质蛋白交联以形成人工基底膜核心层。
进一步,所述步骤S1中,生物相容性聚合物选自明胶,胶原蛋白,聚乳酸或聚已内脂中的一种。
进一步,还包括步骤S5:在所述核心层第一面上修饰L111和L211型层粘连蛋白,在核心层第二面上修饰L411和L511型层粘连蛋白。
进一步,所述步骤S2中,所述第二开口的边沿处也制备结合层;还包括步骤S5:在所述核心层第一面上修饰L111和L211型层粘连蛋白,在核心层第二面上修饰L411和L511型层粘连蛋白,最后采用静电纺丝制备所述纳米丝网支架将所述第二开口覆盖。
上述细胞装置在细胞培养或制造细胞培养装置上的用途。
一种细胞培养系统,其不同之处在于,包括上述细胞培养装置、内培养基容器及外培养基容器,所述内培养基容器与所述外培养基容器通过所述细胞培养装置进行隔离。
进一步,所述核心层第一面或第一层粘连蛋白层与所述外培养基容器内的培养基接触,所述核心层第二面或所述第二开口的所述纳米丝网支架与所述内培养基内的培养基接触。
进一步,所述细胞培养系统还包括与内培养基容器连接的悬挂件,所述悬挂件将所述内培养基容器悬挂在所述外培养基容器内。
进一步,所述细胞培养系统还包括盖体,所述盖体表面设有第一培养基进口、第二培养基进口、第一培养基出口及第二培养基出口,所述外培养基容器、所述内培养基容器与所述外培养基容器均设于所述盖体内,所述外培养基容器与第一微通道连通,所述内培养基容器与第二微通道连通。
利用上述人工基底膜、上述细胞培养装置、利用上述细胞培养系统同时培养不同细胞的方法,将两种不同的细胞分别种植在所述核心层的两侧,再利用培养基进行培养。
进一步,将第一种细胞接种至核心层第一面,依靠所述外培养基容器内的培养基培养;将第二种细胞接种至核心层第二面,依靠所述内培养基容器内的培养基培养。
采取上述进一步技术方案的有益效果在于:适用于上皮细胞层、内皮细胞层及相应细胞组织的培养和共培养。
进一步,将第一种细胞接种至第一层粘连蛋白层,依靠所述外培养基容器内的培养基培养,将第二种细胞接种至第二开口的纳米丝网支架,依靠所述内培养基内的培养基培养。
采取上述进一步技术方案的有益效果在于:可以进行屏障结构的构建,如血脑屏障,血气屏障,肾小球基底膜。
附图说明
图1为支撑层结构图;
图2为细胞培养装置俯视图;
图3为通孔单元及人工基底膜组装图;
图4为人工基底膜剖视图;
图5为通孔及人工基底膜组装另一情况示意图;
图6为图5的人工基底膜剖视图;
图7为实施例2细胞培养装置的示意图;
图8为实施例2一个通孔单元的放大图;
图9为实施例2另一面对人工基底膜的观测;
图10为实施例2人工基底膜厚度测量图;
图11为实施例3细胞培养系统示意图;
图12为实施例4细胞培养系统示意图;
图13为实施例7的xy平面的MDCK细胞培养情况;
图14为实施例7的xz平面的MDCK细胞培养情况;
图15为对比例1的人工基底膜的微观图;
图16为对比例2的人工基底膜的微观图;
附图中,各标号所代表的部件列表如下:
A-细胞培养装置,1-支撑层,101-支撑层本体,102-通孔,2-人工基底膜,201-核心层,201a-核心层第一面,201b-核心层第二面,202-第一层粘连蛋白层,203-第二层粘连蛋白层,1021-第一开口,1022-第二开口,2011-纳米丝网支架,2012-生物膜件,3-加固环,B-内培养基容器,B1-悬挂件,C-外培养基容器,D-盖体,D1-第一培养基进口,D2-第二培养基进口,D3-第一培养基进口,D4-第二培养基出口,D5-微通道,D6-上盖本体,D7-下盖本体,D8-软膜层,D801-上软膜层,D802-下软膜层,D9-鲁尔母口,13A-DAPI染色图,13B-E-cadherin染色图,13C-ZO1染色图,13D-DAPI、E-cadherin及ZO1的融合图,14A-ZO1染色图,14B-E-cadherin染色图,14C--DAPI、E-cadherin及ZO1的融合图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
本发明供一种人工基底膜,包括:核心层,核心层包括纳米丝网支架及生物膜件;
生物膜件填充所述纳米丝网支架的缝隙,生物膜件由细胞外基质蛋白为材质制备而成,所述细胞外基质蛋白为IV型胶原蛋白,人工基底膜的厚度小于1μm,上述人工基底膜可以实现内皮细胞与上皮细胞的双面接种。
进一步,所述核心层包括相对设置的核心层第一面与核心层第二面,核心层第一面修饰有第一层粘连蛋白层,核心层第二面修饰有第二层粘连蛋白层,第一层粘连蛋白层及第二层粘连蛋白层采用相同或不同类型的层粘连蛋白。第一层粘连蛋白层为L111和L211型层粘连蛋白,第二层粘连蛋白层为L411和L511型层粘连蛋白,经过表面修饰后的核心层可用于构建血脑屏障。
血脑屏障是一种典型的基底膜,具体指脑毛细血管内皮细胞,周细胞与神经星型胶质细胞所形成的血浆与脑细胞之间的屏障,同时也是由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障,这些屏障不仅阻止血液中有害物质进入脑组织,也调节脑毛细血管与脑组织间的动态平衡,以保持脑组织内环境的稳定和维持中枢神经系统的功能。
实施例1
本实施例提供一种细胞培养装置的方法,具体操作如下:
步骤S1:通过软光刻生产由生物相容性聚合物制成的支撑层1,具体操作如下:正由微型图案生成器(μPG101,海德堡仪器公司)制造。在x-y平面上制造正六边形通孔,相邻通孔的中心的距离为500μm,通孔壁的厚度为50μm,在本发明中,通孔壁为将两相邻通孔隔开的间隔厚度。之后,将PDMS-玻璃组件置于干燥器中进行除气15分钟。
将PEGDA溶液与1v/v%的光引发剂2959溶液混合。溶液倒入中玻璃载玻片上的PDMS开口处并通过除气引起的微吸气吸,然后是UV光以9.1mW/cm2曝光30s。PDMS模具剥离,而PEGDA网络固化。整个支撑层的厚度(相对于x-y平面垂直的z方向)约100μm厚,加固环采用类似的方式制备,最后含加固环的支撑层外径为13毫米,不含加固环的内径为9毫米。
支撑层的结构如图1所示,包括支撑层本体101及开设在支撑层本体101上的若干通孔102,通孔包括相对设置且连通的第一开口1021及第二开口1022。
步骤S2:在第一开口的边沿溅射约10nm厚的Au作为结合层(图中未示出)以增强明胶纳米纤维在通孔上的粘附。
步骤S3:静电纺丝前16小时制备溶液,将10wt%明胶粉末(G2625,Sigma-Aldrich,法国)的溶液溶解于乙酸,乙酸乙酯和蒸馏水的混合物,体积比为21:14:10。开始静电纺丝时,将明胶溶液装入注射器中,通过使用注射泵(KD Scientific),在距离所述收集器在约10cm处,以0.2ml/h的速度通过喷丝头不锈钢23号针头排出溶液。喷丝头连接到高压电源的阳极(TechDempaz,日本),偏置电压为11KV,待制造纳米丝网支架的通孔连接到负极,最终将纳米丝网支架将第一开口覆盖。
此步骤中,纺丝时间为5min。
步骤S4:配置0.1%wt的Collagen IV溶液,取30~50ul滴在纳米丝网支架上,置于37℃恒温箱中过夜,溶液挥发自组装成膜,形成人工基底2的膜核心层201。
步骤S5:取含100ug/ml的L111型层粘蛋白与100ug/ml的L211型层粘蛋白组成的混合液30ul~50ul在核心层第一面201a上进行修饰,形成第一层粘连蛋白层202;取含100ug/ml的L411和100ug/ml的L511型层粘连蛋白组成的混合液30ul~50ul在核心层第二面201b上进行修饰,形成第二层粘连蛋白层203;最后重复步骤S3的操作,将第二开口1022采用纳米丝网支架2011进行封口。
上述步骤制造的细胞培养装置如图2~图3所示,人工基底膜如图4所示,由于步骤S4与步骤S5为自组装成膜,可能出现图5的情况,对应的人工基底膜如图6所示,图3情况为刚好Collagen IV将纳米丝网支架的间隙填充完整,而图5则是将Collagen IV有溢出现象,纳米丝网支架在Collagen IV形成的自组装膜层之中形成支撑骨架。
实施例2
本实施例提供一种细胞培养装置的方法,具体操作与实施例1相同,与实施例1不同的是,无步骤S5。
对本实施例的细胞培养装置进行微观检测,其结构如图7~图10所示。
图7中,可以明显看出细胞培养装置包括蜂窝状的支撑层结构,且第一开口处覆盖人工基底膜。
图8中,放大了一个通孔,可以明显看出,人工基底膜中的纳米丝网支架。
图9中,从人工基底膜的另一面进行了观测。
图10为人工基底膜实物,经检测,人工基底膜的最厚处为203nm。
实施例3
本实施例提供一种细胞培养系统,具体结构如图11所示。
细胞培养系统包括外培养基容器C、内培养基容器B及悬挂件B1,外培养基容器C与内培养基容器B均内置培养基(B1/C1),其选择取决于细胞培养的需求,悬挂件与B1内培养基容器B连接,实施例1或实施例2的细胞培养装置A设置在内培养基容器B的底部,使用时,悬挂件B1将内培养基容器悬挂在外培养基容器C的开口边沿,核心层第一面201a或第一层粘连蛋白层202与外培养基容器C内的培养基接触,核心层第二面201b或第二开口的纳米丝网支架2011与所述内培养基容器内的细胞培养基接触。
实施例4
本实施例提供一种细胞培养系统,具体结构如图12所示。
细胞培养系统,包括盖体D、腔体部、第一培养基进口D1、第二培养基进口D2、第一培养基出口D3及第二培养基出口D4,腔体部设于盖体内部,第一培养基进口D1及第二培养基进口D2设于盖体表面。
设于腔体部内部的实施例1~实施例3任一选择的细胞培养装置A,其选择取决于细胞培养的需求,细胞培养装置将腔体部为内培养基容器B及外培养基容器C,核心层第一面201a或第一层粘连蛋白层202与外培养基容器C内的培养基接触,核心层第二面201b或第二层粘连蛋白层203与所述内培养基容器内的细胞培养基接触。第一培养基进口D1、第一培养基出口D3与内培养基容器B通过微通道D5连通,第二培养基进口D2、第二培养基出口D4与外培养基容器D5通过微通道连通。
为加大制造微流控芯片的便利性及后续的可重复使用,盖体D包括相互配合上盖本体D6与下盖本体D7,上盖本体D1及下盖本体D2的内部各包含腔体部的一部分,在本实施例中,内培养基容器设置于上盖本体D6内部,外培养基容器设置于下盖本体D7内部,细胞培养装置也设置于下盖本体D7的内部,为增加上盖本体D6与下盖本体D7的密封性,上盖本体D6与下盖本体D7之间在设有软膜层D8,软膜层D8设置在腔体部两侧且包括上软膜层D801与下软膜层D802,上软膜层与上盖本体1015连接,下软膜层D802与下盖本体D7连接。
为后续操作操作方便,在第一培养基进口D1、第二培养基进口D2、第一培养基出口D3及第二培养基出口D4出安装鲁尔母口D9,后续可以连接培养基容器。
实施例5
本实施例提供上皮细胞与内皮细胞层的共培养方法,具体步骤包括:
采用实施例2的细胞培养装置、含实施例2细胞培养装置的实施例3细胞培养系统或含实施例2细胞培养装置的实施例4培养系统,将内皮细胞种植在细胞培养装置人工基底膜的核心层第一面,将上皮细胞种植在细胞培养装置人工基底膜的核心层第二面。
实施例6
本实施例提供血脑屏障构建方法,具体操作步骤如下:
采用实施例1的细胞培养装置,实施例3细胞培养系统,或实施例4细胞培养系统,实施例3或实施例4细胞培养系统均含有实施例1的细胞培养装置。
将内皮细胞和周细胞种植在细胞培养装置人工基底膜的第一层粘连蛋白层202,在星型神经胶质细胞种植在细胞培养装置人工基底膜的第二开口的纳米丝网支架2011。
实施例7
本实施例提供一种MDCK(Madin-Darby Canine Kidney cells)细胞的培养方法,具体操作如下:
含将MDCK细胞以3X103/mm2的密度铺在实施例2细胞培养装置的人工基底膜的核心层第二面,用MEM培养液持续培养4天,每2天换一次液。4天后,将细胞用PFA固定,然后用免疫荧光染色法给细胞染色。如图13~图14所示,细胞在ABM上极化并形成均匀分布的单层平铺结构。MDCK上皮细胞之间形成紧密连接,并在连接处精确表达上皮型钙粘蛋白E-cadherin,紧密连接蛋白ZO和DAPI。
对比例1
本对比例按实施例2方法制备了一种细胞培养装置的方法,除了将纺丝时间修改为3min,Collagen IV溶液的浓度为0.05%wt,其余操作均相同,人工基底膜如图15所示,图15显示,纳米丝网支架的间隙未填充完全。
对比例2
本对比例按实施例2方法制备了一种细胞培养装置的方法,除了将纺丝时间修改为3min,Collagen IV溶液的浓度为0.1%wt,其余操作均相同,人工基底膜如图16所示,图16显示,纳米丝网支架的间隙已经被填充完全。
实施例2与对比例1相比,其区别为纺丝时间较长,Collagen IV溶液的浓度较低,相较于对比例1,纳米丝网支架的间隙填充的更加完全。
实施例2与对比例2相比,其区别为纺丝时间短,相较于对比例1,纳米丝网支架的间隙填充的更加完全,因此纺丝时间与Collagen IV的浓度均是人工基底膜是否制备成功的重要因素。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种人工基底膜,其特征在于,包括:
核心层,所述核心层包括纳米丝网支架及生物膜件;
所述生物膜件填充所述纳米丝网支架的缝隙,所述生物膜件由生物基底膜胞外基质蛋白制备而成;
所述人工基底膜的厚度小于1μm。
2.根据权利要求1所述的人工基底膜,其特征在于,所述核心层包括相对设置的核心层第一面与核心层第二面,核心层第一面修饰有第一层粘连蛋白层;所述核心层第二面修饰有第二层粘连蛋白层,所述第一层粘连蛋白层及第二层粘连蛋白层采用相同或不同类型的层粘连蛋白。
3.一种细胞培养装置,其特征在于,包括:
支撑层,所述支撑层包括支撑层本体及开设在所述支撑层本体上的若干通孔,所述通孔包括相对设置且连通的第一开口及第二开口,在所述通孔的边沿处,设有连接所述支撑层及所述纳米丝网支架的结合层;其中,权利要求1~2任一项所述的人工基底膜将所述第一开口覆盖。
4.根据权利要求3所述的细胞培养装置,其特征在于,所述第二开口由所述纳米丝网支架覆盖。
5.一种制造权利要求3所述的细胞培养装置的方法,其特征在于,包括:
步骤S1:通过软光刻生产由生物相容性聚合物制成的支撑层;
步骤S2:通过溅射将结合剂沉积在所述第一开口边沿,形成结合层;
步骤S3:通过静电纺丝制备纳米丝网支架将所述第一开口覆盖,将所述纳米丝网支架的纤维两端与所述结合层连接;
步骤S4:通过液体薄膜成形工艺在纳米丝网支架的缝隙中沉积包括细胞外基质蛋白的溶液,将所述细胞外基质蛋白交联以形成人工基底膜核心层。
6.根据权利要求5所述的制造细胞培养装置的方法,其特征在于,还包括:
步骤S5:在所述核心层第一面上修饰层粘连蛋白,使其形成第一层粘连蛋白层;在所述核心层第二面上修饰层粘连蛋白,使其形成第二层粘连蛋白层。
7.根据权利要求5所述的制造细胞培养装置的方法,其特征在于,所述步骤S2中,所述第二开口的边沿处也制备结合层;还包括步骤S5:在所述核心层第一面上修饰层粘连蛋白,在核心层第二面上修饰层粘连蛋白,最后采用静电纺丝制备所述纳米丝网支架将所述第二开口覆盖。
8.权利要求3或4所述的细胞培养装置在细胞培养或在制造细胞培养设备中的用途。
9.一种细胞培养系统,其特征在于,包括权利要求3或4所述的细胞培养装置、内培养基容器及外培养基容器,所述内培养基容器与所述外培养基容器通过所述细胞培养装置进行隔离。
10.根据权利要求所述的细胞培养系统,其特征在于,所述核心层第一面或第一层粘连蛋白层与所述外培养基容器内的培养基接触,所述核心层第二面或所述第二开口的所述纳米丝网支架与所述内培养基内的培养基接触。
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Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110130813A1 (en) * | 2005-05-26 | 2011-06-02 | Kinaptic, LLC | Thin film energy fabric for self-regulating heated wound dressings |
CN105925480A (zh) * | 2016-05-12 | 2016-09-07 | 大连理工大学 | 用于血脑屏障药物通透性高通量筛选的微流控芯片及制备方法 |
CN106459898A (zh) * | 2013-12-20 | 2017-02-22 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 低剪切微流控装置及其使用方法和制造方法 |
CN108893440A (zh) * | 2018-07-19 | 2018-11-27 | 广东工业大学 | 一种基于单层纳米纤维基片共培养技术构建生物屏障的方法 |
CN109415692A (zh) * | 2016-06-24 | 2019-03-01 | 株式会社资生堂 | 三维培养皮肤片、用于其制造的细胞培养容器和该三维培养皮肤片的制造方法 |
US20190086414A1 (en) * | 2016-05-20 | 2019-03-21 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Three-dimensional platform for testing therapeutic responses |
CN109837237A (zh) * | 2017-11-28 | 2019-06-04 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于硝酸纤维素基底膜的微流控肠芯片及其应用 |
CN112752836A (zh) * | 2018-10-01 | 2021-05-04 | 株式会社片冈制作所 | 细胞培养器具和细胞培养器具的制造方法 |
-
2021
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Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110130813A1 (en) * | 2005-05-26 | 2011-06-02 | Kinaptic, LLC | Thin film energy fabric for self-regulating heated wound dressings |
CN106459898A (zh) * | 2013-12-20 | 2017-02-22 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 低剪切微流控装置及其使用方法和制造方法 |
CN105925480A (zh) * | 2016-05-12 | 2016-09-07 | 大连理工大学 | 用于血脑屏障药物通透性高通量筛选的微流控芯片及制备方法 |
US20190086414A1 (en) * | 2016-05-20 | 2019-03-21 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Three-dimensional platform for testing therapeutic responses |
CN109415692A (zh) * | 2016-06-24 | 2019-03-01 | 株式会社资生堂 | 三维培养皮肤片、用于其制造的细胞培养容器和该三维培养皮肤片的制造方法 |
CN109837237A (zh) * | 2017-11-28 | 2019-06-04 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于硝酸纤维素基底膜的微流控肠芯片及其应用 |
CN108893440A (zh) * | 2018-07-19 | 2018-11-27 | 广东工业大学 | 一种基于单层纳米纤维基片共培养技术构建生物屏障的方法 |
CN112752836A (zh) * | 2018-10-01 | 2021-05-04 | 株式会社片冈制作所 | 细胞培养器具和细胞培养器具的制造方法 |
Also Published As
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