KR102036843B1 - 폐 모방 칩 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐 모방 칩 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 적어도 하나의 관통 영역, 및 상기 관통 영역에 배치되며, 일 면에 상피세포가 배양된 상피세포층 및 타면에 내피세포가 배양된 내피세포층이 구비된 나노섬유 네트워크로 이루어진 지지체를 포함하는 폐 조직 모사 층; 상기 폐 조직 모사 층의 내피세포층 측에 형성된 액체 채널; 상기 내피세포층 측에 배치되는 제1 커버층; 상기 폐 조직 모사 층의 상피세포층 측에 형성된 기체 채널; 상기 상피세포층 측에 배치되는 제2 커버층; 상기 폐 조직 모사 층과 제1 커버층을 접합하며, 채널을 형성하는 채널 형성부를 포함하는 제1 접합층; 및 상기 폐 조직 모사 층과 제2 커버층을 접합하며, 채널을 형성하는 채널 형성부를 포함하는 제2 접합층을 포함하는 폐 모방 칩, 그리고 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

폐 모방 칩 및 이의 제조방법{CHIP FOR SIMULATING LUNG AND METHOF FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 폐 모방 칩 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유체 채널로의 지속적인 유체 공급이 가능하고, 폐 상피세포에서 내피세포 방향으로 폐 호흡 운동의 모사가 가능한 폐 모방 칩 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

조직공학 분야는 공학과 생명과학의 주요 요소 즉, 생체 세포, 공학, 재료 및 적절한 생화학적/생리-화학적 인자 등을 복합적으로 사용하여 임상적 치료를 수행하기 위한 응용과학분야이다. 특히 조직공학에서는 세포, 세포가 부착되어 자랄 수 있는 지지체(scaffold) 및 세포의 성장 및 분화를 조절할 수 있는 각종 인자를 적절히 이용하여 손상된 조직의 재생과 장기의 복구에 관한 연구가 중점적으로 수행되고 있다.

디지털 헬스케어 산업의 비약적인 발전과 더불어 의생명과학은 질병의 치료로부터 예방과 건강관리로 그 패러다임의 전환이 가속화되고 있다. 재원이 열악한 지역의 감염 병 진단을 위한 효과적이고 경제적인 현장 진단 검사법, 생활환경 유해인자의 검출, 질병 및 건강관리를 위한 일상적 진단 검사에 이르기까지 간편하고, 정확하고, 경제적이며, 사용자 편의성이 증대된 진단 기기의 발달은 미세유체공학 기반 랩온어칩(Lab-on-a-chip) 기술의 발전과 함께 실현되고 있다. 랩온어칩 기술은 세포생물학 및 생체적합성 재료 개발의 발전으로 생체모방 장기칩(organ-on-a-chip)의 개념으로 확장되고 있기도 하다. 시험관에서 인체 생리활성에 근접한 정량적 분석 결과를 제공할 수 있는 수준으로 발전되면서 약물반응 시험의 새로운 플랫폼으로 적용 가능한 잠재성을 보여주고 있다. 체외 진단기기 및 신약 스크리닝 플랫폼으로서의 미세유체 기반 랩온어칩 기술은 디지털 헬스케어 산업을 견인하고 새로운 부가가치 창출의 주요 핵심 기술로 활용될 것으로 전망된다.

이에, 최근 많은 연구자들이 미세유체 기술 활용하여, 특정 목적에 부합하는 설계 최적화 연구를 활발히 진행하고 있다. 이 기술은 각기 다른 장기의 성질과 기능을 마이크로 단위 칩 위에 구현하고, 세포와 주위 미세환경 간 상호 작용을 모사함으로써, 약물 스크리닝, 약물 전달시스템에 대한 정량적 정보를 제공해 줄 수 있다. 따라서, 미세유체 시스템을 기반으로 한 생체모방 장기 칩(organ-on-a-chip)은 비용, 시간, 윤리 문제, 인간 적합성 등 동물 실험이 가진 한계를 극복할 수 있는 주요 대안으로써, 신약 개발의 전임상 과정에서 유용하게 적용될 가능성을 지닌 플랫폼이다.

이를 위해, 생체 내 각 장기를 모사하기 위한 다양한 접근과 기술개발이 이루어지고 있는데, 예를 들어 한국공개특허 제10-2011-0044226호는 마이크로채널을 갖는 기관 모방 장치 및 그 사용 및 제조 방법에 관한 것으로, 역학적 힘에도 반응할 수 있는 칩을 개시하고 있으나, 이 경우 압력이 멤브레인 평면을 기준으로 멤브레인 양 옆에서 발생하는 점에서 압력이 멤브레인의 수직 방향으로 인가되는 실제 폐와는 상이한 문제가 있다.

이에 종래의 생체 모방 장기 칩이 갖는 문제점을 해결하고, 인체 조직을 보다 유사하게 모방할 수 있는 기술이 개발되는 경우, 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명의 한 측면은, 새로운 폐 모방 칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 본 발명의 폐 칩의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 견지에 의하면, 적어도 하나의 관통 영역, 및 상기 관통 영역에 배치되며, 일 면에 상피세포가 배양된 상피세포층 및 타면에 내피세포가 배양된 내피세포층이 구비된 나노섬유 네트워크로 이루어진 지지체를 포함하는 폐 조직 모사 층; 상기 폐 조직 모사 층의 내피세포층 측에 형성된 액체 채널; 상기 내피세포층 측에 배치되는 제1 커버층; 상기 폐 조직 모사 층의 상피세포층 측에 형성된 기체 채널; 상기 상피세포층 측에 배치되는 제2 커버층; 및 상기 폐 조직 모사 층과 제1 커버층을 접합하며, 채널을 형성하는 채널 형성부를 포함하는 제1 접합층; 및 상기 폐 조직 모사 층과 제2 커버층을 접합하며, 채널을 형성하는 채널 형성부를 포함하는 제2 접합층을 포함하는 폐 모방 칩이 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 일면에 상피세포가 배양된 상피세포층, 및 타면에 내피세포가 배양된 내피세포층이 구비된 나노섬유 네트워크를 형성하는 단계;

상기 나노섬유 네트워크를 적어도 하나의 관통 영역을 포함하는 폐 조직모사 층의 관통 영역에 배치하는 단계;

폐 조직 모사 층과 제1 커버층을 접합하며 채널을 형성하는 채널 접합부를 포함하는 제1 접합층 형성 단계; 폐 조직 모사 층과 제2 커버층을 접합하며 채널을 형성하는 채널 접합부를 포함하는 제2 접합층 형성 단계; 및 폐 조직모사층 양 면에 상기 제1 커버층 및 상기 제2 커버층을 접합하는 단계를 포함하는, 폐 조직 모방 칩의 제조 방법이 제공된다.

본 발명에 의하면, 유체 채널로의 지속적인 유체 공급이 가능하고, 폐 상피세포에서 내피세포 방향으로 폐 호흡 운동의 모사가 가능한 폐 모방 칩이 제공되어, 폐와 관련한 약물 시험 등 관련 분야에서 널리 활용될 수 있다.

도 1은 폐암 상피세포(Lung cancer epithelial cells) 및 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)를 실시예 1의 지지체를 이용하여 각각 배양한 후에 세포가 배양된 두 지지체를 접합하여 3일에서 6일 정도 공배양 후 공 초점 현미경(Confocal microscopy)을 이용하여 폐암 상피세포(2번의 동일 조건 실험 결과인 도 1(a)의 좌측 및 우측)와 제대정맥 내피세포(2번의 동일 조건 실험 결과인 도 1(b)의 좌측 및 우측)를 확인한 것이다. 상피세포와 내피세포들이 지지체 표면 및 지지체를 구성하는 나노섬유 사이 내부에 존재하는 것을 확인할 수 있다.
도 2(a)는 비교예 1의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 세포배양 첫날과 배양 4일 후, 도립현미경(Inverted microscope)로 확인하여 나타낸 결과이며, 도 2(b)는 실시예 1의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 배양 첫날과 배양 4일 후 도립현미경(Inverted microscope) 로 확인한 결과로 세포 배양이 잘 이루어 진 것을 확인할 수가 있다.
도 3 (a)는 비교예 3의 포어 사이즈가 10 um 인 지지체를 이용하여 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)를 4일간 배양 후 도립현미경(Inverted microscope)와 공 초점 현미경(Confocal microscopy)으로 확인 한 세포 배양 상태로 세포 배양이 원활하게 이루어지지 않았으며, 도 3 (b)는 실시예 1의 포어 사이즈가 5 um인 지지체를 이용하여 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)를 4일간 배양 후 도립현미경(Inverted microscope)와 공 초점 현미경(Confocal microscopy)으로 확인 한 세포 배양 상태로서 세포 배양이 잘 된 것으로 확인이 되었다.
도 4는 비교예 3의 지지체를 이용하여 HK-2 콩팥 상피세포(HK-2 kidney epithelial cells)(도 4(a)), 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells) (도 4(b))를 배양한 결과를 도립현미경(Inverted microscope)과 공 초점 현미경(Confocal microscopy)을 이용하여 확인한 것이다.
도 5는 예시적인 본 발명의 폐 모방 칩의 분해도를 나타낸 것이다.
도 6은 예시적인 본 발명의 폐 모방 칩의 단면도를 나타낸 것이다.
도 7은 예시적인 본 발명의 인체 조직 모방 칩의 조립 공정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 8(a)는 비교예 4의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 세포배양 48시간 후, 도립현미경(Inverted microscope)로 확인하여 나타낸 결과이며, 도 8(b)는 비교예 5의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 세포배양 48시간 후 후 도립현미경(Inverted microscope)로 확인하여 나타낸 결과로, 두 지지체는 세포 배양이 원활히 이루어 지지 않음을 확인했다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 인체 조직, 특히 폐를 유사하게 모방할 수 있는 폐 모방 칩이 제공된다.

보다 상세하게 본 발명의 폐 모방 칩은, 적어도 하나의 관통 영역, 및 상기 관통 영역에 배치되며, 일 면에 상피세포가 배양된 상피세포층 및 타면에 내피세포가 배양된 내피세포층이 구비된 나노섬유 네트워크로 이루어진 지지체를 포함하는 폐 조직 모사 층; 상기 폐 조직 모사 층의 내피세포층 측에 형성된 액체 채널; 상기 내피세포층 측에 배치되는 제1 커버층; 상기 폐 조직 모사 층의 상피세포층 측에 형성된 기체 채널; 상기 상피세포층 측에 배치되는 제2 커버층; 상기 폐 조직 모사 층과 제1 커버층을 접합하며, 채널을 형성하는 채널 형성부를 포함하는 제1 접합층; 및 상기 폐 조직 모사 층과 제2 커버층을 접합하며, 채널을 형성하는 채널 형성부를 포함하는 제2 접합층을 포함하는 것이다.

도 5는 본 발명의 폐 모방 칩(100)의 예시적인 분해도를 나타낸 것으로, 일 실시 형태에 따라 직선 형태의 유체채널(140)을 갖는 폐 모방 칩을 도시한 것이다. 도 5에 개시된 유체채널(140)은 단지 예시적인 것으로, 필요에 따라 분지형 등 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로 도 5에 도시된 구성으로 한정되지 않는다.

폐 모방 칩을 구성하는 각 층은 연성 재료 또는 비연성 재료로 만들어질 수 있다. 예를 들어 상기 연성 생체적합성 재료는 폴리디메틸 실록산(PDMS), 폴리이미드, 폴리에틸렌글라이콜(Polyethylene glycol)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으며, 상기 비연성 생체적합성 재료는 유리, 규소, 경질 플라스틱, 석영, 실리콘으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명에 사용되는 세포의 지지체(111)는 적어도 하나의 관통 영역을 포함하는 생체 조직 모사 층(110)의 상기 관통 영역 상에 배치되어 세포 배양 챔버(160)를 형성할 수 있으며, 적어도 일 면에 제1 세포가 배양된 제1 세포층이 구비되는 것으로, 나노섬유 네트워크로 이루어진 것이다.

상기 지지체를 구성하는 나노섬유는 콜라겐, 폴리카프로락톤, 이들의 혼합물, 또는 폴리카프로락톤으로 이루어진 코어부와 콜라겐으로 이루어진 시스(sheath)부의 이중층으로 이루어지며, 세포 배양이 가능한 세포 배양용 나노섬유일 수 있다.

본 발명의 나노섬유는 특히 콜라겐으로 이루어진 시스부에 의해 나노파이버 멤브레인에 세포 부착 및 세포 성장의 효과를 획득할 수 있고, 폴리카프로락톤으로 이루어진 코어부에 의해 생체적합성 재료로 세포에 무해한 효과와 세포 부착 및 성장에 적합한 지지체를 획득할 수 있다. 한편, 콜라겐이 코어부, 폴리카프로락톤이 시스부로 형성되는 경우에는 나노섬유 지지체가 형성이 어려우며, 세포 부착 및 세포 성장의 문제가 있고, 이들 성분을 구분되는 층으로 구성하지 않고 혼합물로 섬유를 제조하는 경우에는 콜라겐 및 폴리카프로락톤의 분산성이 낮아서 나노섬유 제조 시 토출이 원활하게 이루어 지지 않으며, 나노섬유에 콜라겐이 코팅을 구현할 수 없고, 콜라겐의 입자가 포어를 막는 현상이 발생하여 세포 안착 및 성장 효율이 떨어지는 문제가 있다.

예를 들어, 상기 나노섬유의 직경은 50nm 내지 500nm 이하인 것이며, 바람직하게는 50nm 내지 300nm인 것이다. 상기 나노섬유의 직경이 50nm 미만인 경우에는 나노섬유의 직경이 과도하게 얇아 원하는 포어 사이즈 확보를 위한 공정 시간이 증가하고, 수 um급 기공도 제어의 문제가 있으며, 500nm를 초과하는 경우에는 나노섬유의 막 두께가 증가하고 미세한 포어 사이즈 (5~10um 미만) 제작에 문제가 있다.

이때, 상기 나노섬유의 코어부의 직경은 전체 나노섬유 직경의 30 내지 90%인 것이 바람직하며, 60 내지 80%인 것이 보다 바람직하고, 30% 미만인 경우에는 요구되는 지지체의 포어 사이즈 조절에 문제가 있으며, 90%를 초과하는 경우에는 셀 배양의 효율에 문제가 있다.

본 발명의 세포 배양용 나노섬유의 제조 방법은 특히 제한되는 것은 아니나, 상기 이중층 나노 섬유는 동축 전기 방사에 의해 형성되는 것일 수 있다.

보다 상세하게, 본 발명의 세포 배양용 나노섬유의 제조 방법은 콜라겐을 제1 용매에 용해시켜 시스부 방사액을 제조하는 단계; 폴리카프로락톤을 제2 용매에 용해시켜 코어부 방사액을 제조하는 단계; 및 내부 노즐을 통해 코어부 방사액을, 외부 노즐을 통해 시스부 방사액을 동시에 동축전기방사 하여 나노섬유를 제조하는 단계를 포함하는 것이다.

이때, 상기 제1 용매는 아세트산 및 물로부터 선택되는 적어도 하나인 것으로, 바람직하게는 아세트산 수용액, 예를 들어 아세트산과 탈이온수의 혼합물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 아세트산 수용액은 아세트산이 0.05 몰 내지 0.2몰 농도로 포함된 것일 수 있다.

한편, 상기 제2 용매는 메탄올(methanol), 클로로포름(Cloroform) 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있으며, 메탄올과 클로로포름의 혼합물을 사용하는 경우 예를 들어 상기 메탄올과 클로로포름을 1:3 내지 1:1의 중량비로 혼합할 수 있다.

나아가, 상기 제1용매 및/또는 제2 용매의 전기적 특성 확보를 위해 소량의 LiCl(LiThum choloride), 그래핀, CNT 등을 첨가제로 첨가하여 사용할 수 있으며, 상기와 같은 첨가제를 추가로 포함하는 경우 균일한 코팅을 획득할 수 있다.

상술한 제1용매 및 제2용매를 사용하는 경우 콜라겐과 PCL의 분산성 및 방사 효율을 현저하게 향상시킬 수 있다.

상기 시스부 방사액은 0.1 내지 5 중량%의 콜라겐 용액인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.3 내지 3 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.5 중량%의 콜라겐 용액인 것이다. 상기 콜라겐 용액의 농도가 0.1 중량% 미만인 경우에는 콜라겐의 코팅이 잘 이루어지지 않아 나노섬유 지지체에 대한 세포부착 및 세포배양에 문제가 있고, 5중량%를 초과하는 경우에는 콜라겐 코팅이 심하게 생겨서 지지체 포어 사이즈의 확보가 어려우며, 나노섬유가 굳어지는 현상이 발생하여 지지체를 접어서 진행하는 공배양 방식을 수행하는 경우 접합 등에 문제가 있을 수 있다.

상기 코어부 방사액은 5 내지 40 중량%의 폴리카프로락톤 용액인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 10 내지 30 중량%의 폴리카프로락톤 용액인 것이다. 상기 폴리카프로락톤 용액의 농도가 5 중량% 미만인 경우에는 나노섬유 직경이 작아지며 이로 인하여 요구되는 지지체 포어 사이즈 확보를 위해 장시간 공정이 요구되며, 또한 정확한 포어 사이즈 확보가 어렵고, 심한 경우 방사 토출이 이루어지지 않아 나노섬유 형성이 수행되지 않는 문제가 있고, 40 중량%를 초과하는 경우에는 나노 섬유의 직경이 크게 형성이 되어 원하는 지지체 포어 사이즈와 두께를 확보하는데 문제가 있다.

동축전기방사 시 멤브레인 회전속도는 1 RPM 내지 20 RPM, 및 유량은 0.5 내지 2 ml/hr, 온도 범위 15 ~ 40℃, 습도 10~ 60% 범위를 조건으로 하여 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게 회전속도는 3 내지 10 RPM, 및 유량은 1 내지 1.5 ml/hr, 온도 범위 20 ~ 25℃, 습도 20~ 40% 범위의 조건으로 하여 수행되는 것이다.

상기 동축전기방사 시 회전속도가 1 RPM 미만인 경우에는 지지체의 포어 사이즈가 너무 커지는 문제가 있으며, 20RPM 을 초과하는 경우에는 지지체의 포어 사이즈가 너무 작아지고, 두께가 너무 커지는 문제가 있다. 한편, 유량이 0.5 mm/s 미만인 경우에는 방사 토출 공정 조건 형성이 안되는 문제가 있으며, 2 ml/hr 를 초과하는 경우에는 방사 토출과 액체 상태가 동사에 토출되는 문제가 있다.

또한, 동축전기방사 시 온도가 15℃ 미만인 경우에는 방사된 나노섬유의 콜라겐이 미리 굳어져서 기공 형성에 문제가 있으며, 40℃를 초과하는 경우에는 용매의 건조속도가 빨라져서 나노 섬유 형성에 문제가 있다. 한편, 습도가 10% 미만인 경우에는 용매의 건조 속도가 빨라져서 나노섬유 형성에 문제가 있으며, 60%를 초과하는 경우에는 용매가 건조되는 속도가 늦어서 나노섬유 형성 후 용매의 건조로 인한 나노섬유의 포어 사이즈 확보에 문제가 있다. 이때 습도는 상대습도를 의미한다.

세포 배양에 적합한 나노 섬유를 제조하기 위해 동축전기방사 시 사용되는 내부 노즐의 내부 직경은 18 내지 26 G이고, 바람직하게는 20 내지 24 G인 것이다. 내부 노즐의 내부 직경이 18 G 미만인 경우에는 나노섬유의 직경이 커져서 지지체의 포어 사이즈가 작아지고 두께가 두꺼워지는 문제가 있으며, 26 G를 초과하는 경우에는 나노 섬유의 직경이 너무 작게 형성이 되어 적절한 지지체의 포어 사이즈 확보가 어려우며, 심한 경우 토출이 어려워지는 문제가 있다.

한편, 세포 배양에 적합한 나노 섬유를 제조하기 위해 동축전기방사 시 사용되는 외부 노즐의 내부 직경은 12 G 내지 20 G이고, 바람직하게는 14 내지 18 G인 것이다. 외부 노즐의 내부 직경이 12 G 미만인 경우에는 콜라겐의 분사가 균일하지 않아서 지지체의 균일한 콜라겐 코팅이 형성되지 않아 셀 배양능이 떨어지는 문제가 있으며, 20 G를 초과하는 경우에는 콜라겐 분사 토출 공정이 원활하게 수행되지 않는 문제가 있다.

상기 범위 내에서 외부 노즐의 직경은 내부 노즐의 직경에 비하여 크게 설정하며, 예를 들어 2G 내지 7G 정도 큰 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 4G 내지 6G, 예를 들어 5G 정도 큰 것이 바람직하다.

이때, 동축전기 방사는 노즐을 멤브레인으로부터 5 내지 20cm 이격하여 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 10 내지 15 cm 이격하여 수행되는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

동축전기 방사는 노즐에 5 KV 내지 20 KV의 전압을 부여하여 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 8 내지 12 kV의 전압을 부여하여 수행되는 것으로, 인가 전압이 5kv 미만일 경우 나노섬유의 토출 모드가 형성이 안되면서 나노 파이버의 직경 크기가 일정하지 않는 문제가 있다. 인가 전압이 20KV를 초과하는 경우에는 안정적인 토출 모드가 변경되어 토출이 원활이 이루어지지 않고 고전압으로 인해 용매가 빠르게 증발하여 노즐 막힘 및 스파크 현상이 일어나는 문제가 있다.

동축 전기 방사 시 기판은 특히 제한되지 않으나, 나노 섬유 및 지지체가 포함되는 최종 제품의 필요에 따라 예를 들어 유기 기판인 멤브레인 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 의하면, 상술한 바와 같은 본 발명의 나노 섬유가 네트워크를 형성하여 제조된 세포 배양용 지지체가 사용될 수 있으며, 상기 세포 배양용 지지체는 나노섬유 제조 공정에 연속적으로 나노섬유를 적층하여 수행될 수 있다.

상기 지지체는 배양이 예정된 세포의 크기에 따라 평균 포어 사이즈를 조절할 수 있으며, 예를 들어 배양이 예정된 세포의 크기(평균 직경)를 기준으로 50% 내지 150%, 바람직하게는 70% 내지 130%의 평균 직경을 갖는 포어 사이즈인 것이 바람직하다. 예를 들어 2μm 내지 10μm 미만, 바람직하게는 3μm 이상 내지 9μm의 평균 포어 사이즈를 가질 수 있다.

상기 포어 사이즈가 배양이 예정된 세포의 크기(평균 직경)를 기준으로 50 % 미만인 경우에는 세포가 지지체 내부로 유입되지 못하고 표면에서 대부분 이탈되는 문제가 발생할 수 있으며, 150%를 초과하는 경우에는 구멍의 크기가 커지므로 배양이 예정된 세포가 지지체를 통과하여 빠져나가는 문제가 있다.

한편, 상기 지지체는 5 내지 500 μm의 평균 두께를 갖는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 10 내지 100μm의 평균 두께를 갖는 것이다. 두께가 5μm 미만인 경우에는 세포가 지지체의 밑면까지 도달하여 세포 배양에 문제가 있으며, 500 μm 초과인 경우에는 세포 배양 후 공배양 단계에서 동기화 문제가 발생할 가능성이 있다.

한편, 상기와 같은 지지체를 이용하여 제조된 본 발명의 폐 모방 칩은 폐 조직을 구성하는 세포층을 효과적으로 장치 내에 구현할 수 있다. 특히, 본 발명의 폐 모방 칩은 폐 조직의 모방을 위해 일 면에 상피세포가 배양된 상피세포층 및 타면에 내피세포가 배양된 내피세포층이 구비된 나노섬유 네트워크로 이루어진 지지체를 사용한다.

한편, 상기 상피세포층 및 내피세포층은 단일 지지체 층의 양면에 각각 형성되거나, 또는 별도의 지지체 상 각 일면에 형성되어 지지체가 서로 접합될 수 있는 것으로, 본 발명의 폐 모방 칩은 생체 조직 모사 층의 관통 영역의 일 면에 배치된 제1 지지체에 추가로, 상기 생체 조직 모사 층의 관통 영역의 타 면에 배치된 제2 지지체를 포함할 수 있으며, 상기 제2 지지체는 일 면에 제2 세포가 배양된 제2 세포층이 구비된 것일 수 있는 것이다.

한편, 본 발명의 지지체는 상피세포층 및 내피세포층이 별도의 지지체 상 각 일면에 형성되어 지지체가 서로 접합되는 경우, 상피세포층이 형성된 지지체와 내피세포층이 형성된 지지체는 각 세포층이 외부를 향하도록 배치되어 접합되는 것일 수 있다.

즉, 본 발명의 지지체는 단일의 지지체의 일면 또는 양면에 세포가 배양된 것일 수도 있고, 나아가 일면에 세포가 배양된 다수의 지지체가 함께 사용될 수 있는 것이다.

이때, 상기와 같이 복수의 지지체가 접촉하여 배치되는 경우 복수층의 지지체는 접합을 위해 세포가 각각 배양된 지지체 두 개를 키트 시스템을 이용하여 정확히 배양된 위치를 맞추어 두 지지체를 붙이는 등의 방식으로 접착될 수 있다.

한편, 각각의 지지체 혹은 접합된 지지체는 생체 조직 모사 층의 관통 영역에 배치한 후 압력을 가하는 등의 방식으로 부착될 수 있다.

본 발명의 지지체에서 배양될 수 있는 세포는 포유류 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 일종일 수 있으며, 폐 조직의 구현을 위한 목적에 적합한 세포를 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 제1 세포는 모세혈관 내피세포, 폐혈관 내피세포 등의 내피세포이고, 제2 세포는 폐포 상피 세포 등의 상피세포일 수 있다. 상피는 신체 전체를 통하여 구조물의 강(cavity) 및 표면의 내막을 형성하는 세포로 구성된 조직이다. 한편, 내피는 혈관의 내부 표면의 내막을 형성하는 세포들의 얇은 층으로, 루멘 내에서와 혈관벽의 나머지 부분 내에서 순환하는 혈액 사이의 계면을 형성할 수 있다.

이때, 상기 세포는 각각의 지지체에 5000 내지 20000 세포 수 범위로 배양된 것이 바람직하다. 한편, 각 세포의 배양 방법은 특히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 배지, 배양 조건 등의 배양 기술을 적용할 수 있다.

한편, 도 6을 참고하여 본 발명의 폐 모방 칩에 포함되는 상기 제1 커버층(120)은 제1 유체 채널의 일단과 타단에 각각 연결되는 제1 유체 유입구와 제1 유체 배출구가 서로 이격되어 형성된 것이 바람직하며, 유체 유입구를 통해 유입된 유체가 유체 채널을 유동한 다음 유체 배출구로 배출될 수 있다. 이때 상기 제1 유체는 액체일 수 있으며, 이때 액체는 혈액, 혈액 유사 용액, 체액 등일 수 있다.

나아가, 제2 유체 채널은 제1 유체 채널과 마찬가지로 유체 유입구와 유체 배출구를 포함할 수 있으며, 예를 들어 상기 제1 커버층에 제2 유체 채널의 일단과 타단에 각각 연결되는 제2 유체 유입구와 제2 유체 배출구가 서로 이격되어 추가로 형성되거나, 또는 제2 커버층에 제2 유체 채널의 일단과 타단에 각각 연결되는 제2 유체 유입구와 제2 유체 배출구가 서로 이격되어 추가로 형성될 수 있다. 또는, 도 6에 도시된 바와 같이 상기 제2 유체 유입구와 제2 유체 배출구가 일체로 형성될 수 있다. 이때 상기 제2 유체는 기체일 수 있으며, 이때 기체는 공기 등일 수 있다.

나아가, 유체 채널은 이에 제한되는 것은 아니며, 필요에 따라 폐 모방 칩에 추가의 유체 채널을 구성할 수 있다.

한편, 본 발명의 "접합층"은 상기 생체 조직 모사 층과 커버층을 접합하는 것으로, 상기 접합층은 이와 같이 생체 조직 모사 층과 커버층 사이에 층을 결합시키기 위한 구조를 포괄적으로 지칭하는 것이다. 구체적으로, 생체 조직 모사 층과 커버층을 접합하며, 유체 채널을 형성하는, 유체 채널 형성부(170)를 포함할 수 있고, 나아가 도 5에 도시된 바와 같이 생체 조직 모사 층과 커버층을 접합하며 유체 채널을 형성하지 않는 추가의 접합부(180)를 포함할 수 있다.

상기 접합층은 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 실리콘 및 폴리카보네이트우레탄(예를 들어chrono flex AR)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 재료로 형성될 수 있으며, 예를 들어 유체 채널 형성부는 폴리카보네이트우레탄으로 이루어지고, 상기 추가의 접합부는 폴리우레탄을 재료로 하여 형성될 수 있다. 상기 추가의 접합부는 생체칩에 압력을 가할 시 생기는 칩의 파손을 방지할 수 있는 재료라면 특히 제한되지 않으며, 다만 상기 유체 채널 형성부에 사용되는 재료는 생체적합성 특성을 가지며, 마이크로채널 및 세포 배양 챔버를 제작하기에 적합한 소재를 사용하여 세포배양 챔버에서 세포 소재 독성에 의한 영향을 방지할 수 있는 것이 바람직하며, 역시 이러한 목적을 달성할 수 있다면 그 재질이 특히 제한되는 것은 아니다.

지지체는 실질적인 인체 조직-조직 계면 시뮬레이션 영역에 해당하는 것으로, 여기서 세포 거동 및/또는 기체, 화학물질, 분자, 미립자 및 세포의 통과가 모니터링 될 수 있다.

본 발명에 있어서 유체 채널을 통과하는 유체 유동의 특성, 예를 들어 유량 등은 유체 채널 별로 독립적으로 제어가 가능하다.

이때, 유체로써 기체가 사용되는 경우, 기체의 유입 또는 배출 시에 압력 공급원에 연결된 하나 이상의 압력관을 유입구 또는 배출구와 연결하여 양압 또는 음압을 제공할 수 있다.

본 발명에 의하면, 상술한 폐 모방 칩의 제조 방법이 제공된다.

하기 폐 모방 칩의 제조 방법에 관한 기술 중 상기 폐 모방 칩과 관련한 모든 내용은 동일하게 적용되며, 하기에서는 폐 모방 칩의 제조 방법과 관련한 공정을 중심으로 기술한다.

본 발명의 인체 조직 모방 칩의 제조 방법은, 일면에 상피세포가 배양된 상피세포층, 및 타면에 내피세포가 배양된 내피세포층이 구비된 나노섬유 네트워크를 형성하는 단계; 상기 나노섬유 네트워크를 적어도 하나의 관통 영역을 포함하는 폐 조직모사 층의 관통 영역에 배치하는 단계; 폐 조직 모사 층과 제1 커버층을 접합하며 채널을 형성하는 채널 접합부를 포함하는 제1 접합층 형성 단계; 폐 조직 모사 층과 제2 커버층을 접합하며 채널을 형성하는 채널 접합부를 포함하는 제2 접합층 형성 단계; 및 폐 조직모사층 양 면에 상기 제1 커버층 및 상기 제2 커버층을 접합하는 단계를 포함하는 것이다.

이때, 제1 접합층은 유체 채널 접합부와 함께, 유체 채널 접합부 외부에 형성되어 생체칩에 압력을 가할 시 생기는 칩의 파손을 방지하는 등 침의 구조에 안정성을 추가할 수 있도록 형성된 추가의 접합부를 구비할 수 있다. 상기 유체 채널 접합부 및 추가의 접합부는 3차원(3D) 프린팅 공정 기술을 이용하여 원하는 형태로 구현할 수 있다.

상기 나노섬유 네트워크를 형성하는 단계는, 나노섬유 네트워크의 일 면에 상피세포가 배양된 상피세포층을 형성하는 단계; 및 나노섬유 네트워크의 타 면에 내피세포가 배양된 내피세포층을 형성하는 단계를 포함하며, 상기 상피세포층을 형성하는 단계와 내피세포층을 형성하는 단계는 동시에 수행되는 것이 바람직하다.

택일적으로, 상기 나노섬유 네트워크를 형성하는 단계는, 나노섬유 네트워크의 일 영역에 상피세포가 배양된 상피세포층을 형성하는 단계; 나노섬유 네트워크의 타 영역에 내피세포가 배양된 내피세포층을 형성하는 단계; 및 상피세포층이 형성된 나노섬유 네트워크와 내피세포층이 형성된 나노섬유 네트워크를 각 세포층이 외부를 향하여 상기 일 영역과 타 영역을 대응하는 위치에 배치하여 접합하는 단계를 포함하며, 상기 상피세포층을 형성하는 단계와 내피세포층을 형성하는 단계는 동시에 수행되는 것일 수 있다.

즉, 생체 조직 모사 층과 커버층의 접합은 서로의 접합을 획득함과 동시에 유체채널을 형성할 수 있도록 수행될 수 있으며, 예를 들어 도 7(a)에 나타난 바와 같이 접합층으로 접착력을 갖는 고분자 수지 등을 이용하여 형성한 후 압력을 가하는 방식에 의해, 공배양 키트 시스템에서 획득된 세포가 배양된 지지체를 내부에 삽입하고 양 커버층에 압력을 가하여 제작되는 공정에 의해 수행되거나, 도 7(b)에 나타난 바와 같이 접착제를 이용하는 방식으로 접착제 소재를 3차원(3D) 프린팅 공정 기술을 이용하여 생체칩의 각 접착제층을 형성하고, 생체칩을 조립한 후 열, UV 레이저 등을 이용하여 접착제를 경화시켜 제작하는 공정 등에 의해 수행될 수 있으나, 그 방식이 특히 제한되는 것은 아니다.

상기 공정 중 도 7(b) 와 관련한 공정에서 사용되는 접착제 소재는 생체칩을 고정 시키기 위한 역할을 할 수 있는 것으로, 예를 들어 에폭시 접착체, 폴리우레탄 접착제, UV 경화형 접착제, 내열성 접착제 등의 소재를 사용할 수 있으며, 그 소재가 특히 제한되는 것은 아니다.

추가의 접합부(180)는 층 간의 접착을 수행할 뿐만 아니라 압축 등 외력이 가해지는 경우 힘의 불균형에 의한 생체칩의 파손을 방지하는 역할도 수행하도록 형성될 수 있다.

이때, 상기 나노섬유 네트워크를 형성하는 단계는 인체 조직 모방 칩에서 상술한 바와 같이 전기 방사 공정에 의해 수행되는 것이 바람직하며, 예를 들어 상기 나노섬유 네트워크를 형성하는 단계는 콜라겐을 제1 유기용매에 용해시켜 시스부 방사액을 제조하는 단계; 폴리카프로락톤을 제2 유기용매에 용해시켜 코어부 방사액을 제조하는 단계; 및 내부 노즐을 통해 코어부 방사액을, 외부 노즐을 통해 시스부 방사액을 동시에 동축전기방사 하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.

보다 상세하게, 본 발명의 세포층이 구비된 나노섬유 네트워크를 형성하는 단계는 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체의 일 영역에 제1 세포를 배양하는 단계; 및 상기 제1 세포를 배양하는 단계와 동시에, 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체의 타 영역에 제2 세포를 동시 배양하는 단계; 및 상기 두 지지체를 적층하는 단계를 포함할 수 있다.

즉, 본 발명의 지지체는 제1 세포를 지지체 상에서 배양함과 동시에 제2 세포를 동일 지지체의 다른 영역 또는 별도의 지지체 상에서 배양한 후 각각의 세포층이 예를 들어 외부를 향하도록 적층하여 획득할 수 있으며, 바람직하게 상기 일 영역과 타 영역은 단일 지지체 상에서 이격된 영역인 것이다.

상기 일 영역과 타 영역이 단일 지지체 상에서 이격된 영역인 경우, 상기 일 영역과 타 영역은 일 영역과 타 영역 사이의 임의의 직선을 기준으로 대칭이 되도록 형성되는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 적층하는 단계는 일 영역과 타 영역 사이에 형성된 상기 임의의 직선을 기준으로 제1 세포가 배양된 지지체와 제2 세포가 배양된 지지체를 각각 세포가 배양된 세포층이 외부를 향하여 대칭이 되도록 접어서(folding) 수행될 수 있다.

예를 들어 단일 지지체 상에서 이격된 일 영역과 타 영역에서 각각 제1 세포와 제2 세포를 배양하고, 일 영역과 타 영역 사이에 형성된 상기 임의의 직선을 기준으로 제1 세포가 배양된 지지체와 제2 세포가 배양된 지지체를 각각 세포가 배양된 세포층이 외부를 향하여 대칭이 되도록 접는 단계를 수행할 수 있으며, 상기 접는 단계는 지지체의 기준 선 아래에 봉을 배치한 후 봉을 상부로 들어올려 수행될 수 있다.

한편, 상기 적층하는 단계는 제1 세포가 배양된 지지체와 제2 세포가 배양된 지지체를 각각의 세포가 배양된 세포층이 외부를 향하도록 배치한 후, 정확히 두 세포의 배양된 위치를 맞추어서 지지체를 서로 접합하는 단계를 추가로 포함하여 수행될 수 있다.

이러한 공정에 의하면, 세포를 동시에 배양하여 사용할 수 있으므로, 인체 조직 모방 칩의 제조 수율이 현저하게 향상될 수 있으며, 종래 디쉬 기반의 세포 배양 기술의 활용이 가능하므로 종래 세포 배양 기술의 노하우를 활용할 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 나노 섬유 및 세포 배양용 지지체의 제조

실시예 1

(1) 나노 섬유 및 세포 배양용 지지체의 제조

콜라겐을 아세트산이 0.1몰 농도로 포함된 탈이온수에 용해시켜 0.5 wt%의 농도를 갖는 시스부 방사액을 제조하였다. 한편, 폴리카프로락톤을 메탄올 중량 25%, 클로로포름 중량 75%의 혼합 용매에 용해시켜 15wt%의 농도를 갖는 코어부 방사액을 제조하였다. 상기 제조된 방사액을 이용하여 전기방사법에 의해 섬유를 제조하였다.

전기 방사기는 Trek사(미국)에서 제조한 고전압 발생기(모델명: 10/10B-HS) 를 사용하였고, 이때 내부 노즐의 내부 직경은 22G (0.41mm), 외부 노즐의 내부 직경은 16G (1.26mm)인 노즐을 사용하였으며, 전기 방사의 자세한 방법은 하기와 같다.

상기의 농도를 갖는 코어부 및 시스부 방사액을 각각 별도의 방사액 저장소에 충전하였다. 방사 시 방사액의 방출 속도는 1 mm/s로 조절하였다. 전압은 10 kV로 조절하였으며, 노즐을 유기 기판인 멤브레인으로부터 100mm 거리로 이격되도록 조절하였다. 원하는 섬유를 제조하기 위해서는 컬렉터 상에 섬유가 집적되기 전에 용매가 전부 휘발되어야 하므로 적절한 온도와 습도의 유지가 중요므로, 온도는 약 20℃, 습도는 약 25%로 설정하였다. 여기서 얻은 나노섬유의 직경은 약 300 nm인 것을 확인하였다.

상기에서 설정된 조건으로 나노섬유를 제조하면서 나노섬유를 적층하여 평균 약 5 μm 의 포어 사이즈 및 300 nm의 평균 두께를 갖는 지지체를 제조하였다.

비교예 1

폴리카프로락톤을 메탄올 중량25%, 클로로포름 중량 75%의 혼합 용매에 용해시켜 15wt%의 농도를 갖는 방사액을 제조하여 단독 방사하여 나노섬유를 제조한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건 하에서 세포 배양용 지지체를 제조하였다.

비교예 2

콜라겐을 아세트산이 0,1 몰 농도로 포함된 탈이온수에 용해시켜 0.5 wt%의 농도를 갖는 방사액을 제조하여 단독 방사하여 나노섬유를 제조한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건 하에서 나노섬유 및 세포 배양용 지지체를 제조하는 경우에는 나노섬유를 형성하는 섬유의 방사가 없기 때문에 지지체 매트리스의 제조가 불가능하였다.

비교예 3

실시예 1과 동일한 조건 하에서 나노 섬유를 제조하되, 멤브레인의 회전속도를 8 RPM에서 3 RPM으로 변경하여 평균 포어 사이즈를 평균 약 10 μm으로 형성한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건 하에서 세포 배양용 지지체를 제조하였다. 도 3(a)에 상기 조건으로 지지체를 제조 후 내피 세포를 배양한 결과 사진이 나타나 있다.

비교예 4

콜라겐을 5wt% 포함하는 제 1용매와 폴리카프로락톤을 15wt% 포함하는 제 2용매를 4:6의 중량비로 분산하여 실시예 1 과 동일한 조건 하에서 단독 방사하여 두 성분이 단순히 혼합된 나노섬유 및 세포 배양용 지지체를 제조하였다.

비교예 5

실시예 1에서 제조된 콜라겐을 아세트 산과 증류수(DI water) 용액 0.1㎖에 용해시켜 0.5 wt%의 농도를 갖는 방사액을 시스부 방사액으로 이용하고, 한편 폴리카프로락톤을 DMF, DMSO, 아세톤 용액을 2.5:2.5:5 비율로 혼합한 20 ㎖에 용해시켜 15wt%의 농도를 갖는 방사액을 제조하여 코어부로 이용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건 하에서 세포 배양용 지지체를 제조하였다.

2. 세포 부착 및 배양 실험

상기 1.에서 각각 제조된 세포 배양용 지지체를 이용하여, 세포를 배양하고 그 결과를 확인하였다.

실험예 1

폐암 상피세포(Lung cancer epithelial cells)(도 1(a)) 및 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)(도 1(b))를 실시예 1의 지지체에 각각 세포를 동시 배양을 한 후, 두 지지체를 접합하여 4일 동안 공배양을 한 후, 두 지지체를 분리하여 각 세포를 70% 에탄올을 사용하여 -20 ℃에서 1시간 동안 세포를 지지체에 유지시켰다. 지지체를 30분 내 각각 1xDPBS로 3회 세척하였고, DAPI 핵 염색액을 지지체 첨가하였다. 지지체를 1시간 동안 암실에서 배양하고, 30분 동안 1xDPBS 용액으로 3회 세척하고 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득 하였다.

그 결과, 도 1에서 확인 할수 있는 바와 같이 두 번의 동일한 조건에서 실험을 수행한 결과 내피 세포와 상피 세포의 공배양이 원활하게 이루어진 것을 확인 할 수 있었다.

비교실험예 1

비교예 3의 포어 사이즈가 10 um 인 지지체를 이용하여 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)를 세포배양 첫날과 배양 4후, 도립현미경(Inverted microscope)과 공 초점 현미경(Confocal microscopy)으로 확인하여 도 3(a)에 나타내었으며, 도 3(a)에서 나타난 바와 같이, 세포의 부착 및 배양이 이루지지 않는 것을 확인할 수 있었다.

비교실험예 2

비교예 1의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 세포배양 첫날과 배양 4일 후, 도립현미경(Inverted microscope)으로 확인한 결과, 도 2(a)에 나타난 바와 같이 세포의 부착 및 배양이 이루지지 않는 것을 확인할 수 있었다.

비교실험예 3

비교예 3의 지지체를 이용하여 HK-2 콩팥 상피세포(HK-2 kidney epithelial cells)를 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2, 48시간 동안 배양하고 도립현미경(Inverted microscope)과 공 초점 현미경(Confocal microscopy)으로 확인하여 도 4(a)에 나타내었다. 세포의 부착 및 배양이 이루지지 않는 것을 확인할 수 있었다.

비교실험예 4

비교예 3의 지지체를 이용하여 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)를 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2, 48 시간 동안 배양하고 도립현미경(Inverted microscope)과 공 초점 현미경(Confocal microscopy)으로 확인하여 도 4(b)에 나타내었다. 세포의 부착 및 배양이 이루지지 않는 것을 확인할 수 있었다.

비교실험예 5

비교예 4 의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 세포배양 48시간 후, 도립현미경(Inverted microscope)로 확인하여 도 8(a)에 나타내었다. 그 결과 세포 배양이 원활하게 이루지지 않는 것을 확인할 수 있었다.

비교실험예 6

비교예 5 의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 세포배양 48시간 후 후 도립현미경(Inverted microscope)로 확인하여 도 8(b)에 나타내었다. 그 결과 세포 배양이 원활하게 이루지지 않는 것을 확인할 수 있었다.

3. 인공 생체막의 제조

상기 실험예 1 및 실험예 2에서 수행한 공정과 동일하게, 실시예 1의 지지체를 이용하여 일 영역에는 폐암 상피세포(Lung cancer epithelial cells)를 인큐베이터에서 37℃, 5% CO₂, 48 시간 동안 배양하고 이와 동시에 동일한 지지체를 이용하여 다른 영역에는 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)를 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2, 48 시간 동안 배양하였다.

내피 세포와 상피 세포의 배양이 완료된 후에는 상기 일 영역과 타 영역 사이의 지지체 하부에 직경 2 내지 5 mm, 길이 10 cm의 스테인레스 재질의 막대를 배치하고, 이를 상부로 들어올려 내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체가 각각의 세포층이 외부를 향하도록 배치되어 적층된 형태를 획득하였다. 이때 접촉된 지지체는 끝 단에서 누르는 압력에 의해 서로 접합하였다.

4. 인체 조직 모방 칩의 제조

상기 3.에서 획득된 인공 생체막을 마련하고, 생체 조직 모사층, 제1 커버층 및 제2 커버층을 유리로 도 6과 같이 제작하였다. 그 후 3D 프린팅 공정에 의해 생체 조직 모사층과 제1 커버층 및 제2 커버층 사이에 각각 폴리카보네이트우레탄(chrono flex AR)으로 이루어진 접착층을 배치하고, 생체적합성 고분자 우레탄을 이용하여 파손 방지를 위한 외곽 라인에 추가의 접합부를 형성하였다. 생체 조직 모사층의 관통 영역에 상기 3.에서 획득된 인공 생체막을 배치하고 생체 조직 모사층, 제1 커버층 및 제2 커버층을 조립하여 생체칩을 제조하였다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

100: 폐 모방 칩
110: 생체 조직 모사 층
111: 세포의 지지체(나노섬유 네트워크)
120: 제1 커버층
130: 제2 커버층
140: 유체채널
170: 유체 채널 형성부
180: 추가의 접합부

Claims (18)

1. 적어도 하나의 관통 영역, 및 상기 관통 영역에 배치되며, 일 면에 상피세포가 배양된 상피세포층 및 타면에 내피세포가 배양된 내피세포층이 구비된 나노섬유 네트워크로 이루어진 지지체를 포함하는 폐 조직 모사 층;
   상기 폐 조직 모사 층의 내피세포층 측에 형성된 액체 채널;
   상기 내피세포층 측에 배치되는 제1 커버층;
   상기 폐 조직 모사 층의 상피세포층 측에 형성된 기체 채널;
   상기 상피세포층 측에 배치되는 제2 커버층; 및
   상기 폐 조직 모사 층과 제1 커버층을 접합하며, 액체 채널을 형성하는 유체 채널 형성부를 포함하는 제1 접합층; 및
   상기 폐 조직 모사 층과 제2 커버층을 접합하며, 기체 채널을 형성하는 유체 채널 형성부를 포함하는 제2 접합층
   을 포함하는 폐 모방 칩.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1 커버층은 채널의 일단과 타단에 각각 연결되는 액체 유입구와 액체 배출구가 서로 이격되어 형성된, 폐 모방 칩.
3. 제1항에 있어서, 상기 상피세포층 및 내피세포층은 단일 지지체 층의 양면에 각각 형성되거나, 또는 별도의 지지체 상 각 일면에 형성되어 지지체가 서로 접합되는, 폐 모방 칩.
4. 제3항에 있어서, 상피세포층 및 내피세포층이 별도의 지지체 상 각 일면에 형성되어 지지체가 서로 접합되는 경우, 상피세포층이 형성된 지지체와 내피세포층이 형성된 지지체는 각 세포층이 외부를 향하도록 배치되어 접합되는, 폐 모방 칩.
5. 제1항에 있어서, 상기 제2 커버층에 채널의 일단과 타단에 각각 연결되는 유체 유입구와 유체 배출구가 서로 이격되어 형성되거나, 또는 상기 유체 유입구와 유체 배출구가 일체로 형성되는, 폐 모방 칩.
6. 제1항에 있어서, 상기 내피세포는 폐혈관 내피세포이고, 상기 상피세포는 폐포 상피 세포인, 폐 모방 칩.
7. 제1항에 있어서, 상기 폐 조직모사 층 및 각 커버층은 연성 생체적합성 재료 및 비연성 생체적합성 재료로부터 독립적으로 선택된 재료로 형성되는, 폐 모방 칩.
8. 제7항에 있어서, 상기 연성 생체적합성 재료는 폴리디메틸 실록산(PDMS), 폴리이미드, 폴리에틸렌글라이콜(Polyethylene glycol) 및 실리콘으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나이며, 상기 비연성 생체적합성 재료는 유리, 규소, 경질 플라스틱 및 석영으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, 폐 모방 칩.
9. 제1항에 있어서, 상기 지지체를 구성하는 나노섬유는 콜라겐, 폴리카프로락톤, 이들의 혼합물, 또는 폴리카프로락톤으로 이루어진 시스(sheath)부와 콜라겐으로 이루어진 코어부의 이중층으로 이루어진 나노섬유인, 폐 모방 칩.
10. 제1항에 있어서, 상기 나노섬유는 평균 직경이 50 내지 500 nm인, 폐 모방 칩.
11. 제1항에 있어서, 상기 지지체는 2μm 내지 10μm 미만의 평균 포어 사이즈를 갖는, 폐 모방 칩.
12. 제1항에 있어서, 상기 제1 접합층 및 제2 접합층 중 적어도 하나는 상기 폐 조직모사 층과 커버층을 접합하며 유체 채널을 형성하지 않는, 추가의 접합부를 포함하는, 폐 모방 칩.
13. 제1항에 있어서, 상기 제1 접합층 및 제2 접합층은 각각 독립적으로 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 실리콘 및 폴리카보네이트우레탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, 폐 모방 칩.
14. 일면에 상피세포가 배양된 상피세포층, 및 타면에 내피세포가 배양된 내피세포층이 구비된 나노섬유 네트워크를 형성하는 단계;
    상기 나노섬유 네트워크를 적어도 하나의 관통 영역을 포함하는 폐 조직모사 층의 관통 영역에 배치하는 단계;
    폐 조직 모사 층과 제1 커버층을 접합하며 액체 채널을 형성하는 유체 채널 접합부를 포함하는 제1 접합층 형성 단계;
    폐 조직 모사 층과 제2 커버층을 접합하며 기체 채널을 형성하는 유체 채널 접합부를 포함하는 제2 접합층 형성 단계; 및
    폐 조직모사층 양 면에 상기 제1 커버층 및 상기 제2 커버층을 접합하는 단계를 포함하는, 폐 조직 모방 칩의 제조 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 제1 커버층은 채널의 일단과 타단에 각각 연결되는 유체 유입구와 유체 배출구가 서로 이격되어 형성된, 폐 조직 모방 칩의 제조 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 제2 커버층에 유체 채널의 일단과 타단에 각각 연결되는 유체 유입구와 기체 배출구가 서로 이격되어 형성되거나, 또는 상기 유체 유입구와 기체 배출구가 일체로 형성되는, 폐 조직 모방 칩의 제조 방법.
17. 제14항에 있어서, 상기 나노섬유 네트워크를 형성하는 단계는, 나노섬유 네트워크의 일 면에 상피세포가 배양된 상피세포층을 형성하는 단계; 및
    나노섬유 네트워크의 타 면에 내피세포가 배양된 내피세포층을 형성하는 단계를 포함하며,
    상기 상피세포층을 형성하는 단계와 내피세포층을 형성하는 단계는 동시에 수행되는, 폐 조직 모방 칩의 제조 방법.
18. 제14항에 있어서, 상기 나노섬유 네트워크를 형성하는 단계는, 나노섬유 네트워크의 일 영역에 상피세포가 배양된 상피세포층을 형성하는 단계;
    나노섬유 네트워크의 타 영역에 내피세포가 배양된 내피세포층을 형성하는 단계; 및
    상피세포층이 형성된 나노섬유 네트워크와 내피세포층이 형성된 나노섬유 네트워크를 각 세포층이 외부를 향하여 상기 일 영역과 타 영역을 대응하는 위치에 배치하여 접합하는 단계를 포함하며,
    상기 상피세포층을 형성하는 단계와 내피세포층을 형성하는 단계는 동시에 수행되는, 폐 조직 모방 칩의 제조 방법.
    

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